（法医学专业论文）家兔唾液和尿液中氯胺酮浓度与血药浓度相关性研究.pdf

山西医科大学颈士学位培文 家兔唾液和尿液中氯胺酮浓度与血药浓度相关性研究 摘要 目的建立急性中毒家兔唾液中氯胺酮及其代谢产物去甲氯胺酮的定性定量分析 方法。研究灌胃组和静脉注射组家兔唾液和尿液中氯胺酮及去甲氯胺酮浓度与血药浓度的 相关性。 方法唾液样品分析方法：急性中毒家兔分为毛果芸香碱刺激组和非刺激组，于给 药后不同时间点无菌唾液收集管收集唾液，t 检验比较研究两组氯胺酮和去甲氯胺酮检出 量有无显著性差异。唾液样品中加入内标物s k f 5 2 5 a 后碱化，乙酸乙酯萃取，气相色谱质 谱联用( g c m s ) 全扫描定性，气相色谱( g c ) 定量分析。相关性研究：家兔以半数致 死量( l d 5 0 ) 分别灌服和静脉注射氯胺酮，给药后不同时间点收集血液、唾液及尿液标本 ( 颈动脉采血，分离血浆；无菌唾液收集管收集唾液；导尿管收集尿液) ，g c 法测定各时 间点药物浓度，采用双变量p e a r s o n 相关分析研究唾液和血液、血液和尿液间氯胺酮及去 甲氯胺酮浓度的相关性。 结果1 建立了唾液中氯胺酮及其代谢产物去甲氯胺酮的定性定量分析方法。氯胺 酮及去甲氯胺酮在唾液中检测线性范围为0 0 1 1 0 1 s g m l ，最低检出限均为o 0 0 5 1 t g m l ， 方法回收率为9 5 0 3 1 0 5 3 5 。r s d 均小于1 0 。对于同一时间点毛果芸香碱刺激组和 非刺激组之间氯胺酮和去甲氯胺酮在唾液中的检出量无显著性差异( p o 0 5 ) 。2 灌胃组 给药后各时间点氯胺酮及去甲氯胺酮在唾液和血液中的浓度均有相关性，相关系数r 达到 高度相关水平，分别在0 8 8 0 9 5 ，0 8 6 o 9 6 之间，平均为0 9 1 2 和0 + 9 1 4 ，3 0 6 0 m i n 相关度最好；静脉注射组氯胺酮及去甲氯胺酮唾液和血液中的浓度也有良好的相关性，相 关系数r 分别在0 8 0 9 6 ，o 8 6 o 9 5 之间，平均为0 8 9 9 和o 9 1 2 。两实验组氯胺酮及去 甲氯胺酮在血液和尿液中的浓度也存在相关性，灌胃组于给药后2 4 0 m i n 内达到中度相关 水平，平均为0 5 9 6 和o 6 0 6 ，给药2 4 0 m i n 后r 值低于0 5 ；静脉注射组1 8 0 m i n 内氯胺酮 及去甲氯胺酮在血液和尿液的相关系数r 均达到中度相关水平，平均为o 6 1 5 和0 6 2 0 ，给 药1 8 0 m i n 后r 值低于0 5 。 结论1 建立的急性中毒家兔唾液收集和唾液中氯胺酮及去甲氯胺酮的分析方法 简便、灵敏、快捷，适用于氯胺酮中毒与滥用案例唾液的快速检验鉴定。用毛果芸香碱刺 激唾液的分泌，不会影响唾液中药物的浓度，可用于唾液的分析研究。2 灌胃组和静脉 注射组唾液和血液之间均存在很好的相关性，血液和尿液分别在2 4 0 m m 和1 8 0 m i n 内存在 1 中度相关性，之后随时间变化r 值小于o 5 。因此唾液可作为氯胺酮滥用案件的生物检材， 可根据唾液药物浓度推断血药浓度，并用于法医学案件的鉴定分析和临床药物监测。与唾 液和血液相比，氯胺酮在家兔尿液和血液中的相关度较差，尿液中药物浓度并不能直接反 映血药浓度，因此用尿液药物浓度推断血药浓度时应谨慎考虑。 关键词氯胺酮，唾液，血液，尿液，相关性 山西医科大学硕士学位论文 。 c o r r e l a t i o no fp l a s m ak e t a m i n ec o n c e n t r a t i o n sw i t hs a l i v aa n d u r i n ec o n c e n t r a t i o n so nr a b b i t s a b s t r a c t o b j e c t i v e t od e v e l o paq u a l i t a t i v ea n dq u a n t i t a t i v em e t h o df o r t h es i m u l t a n e o u s d e t e r m i n a t i o no fk e t a m i n ea n di t sm a i na c t i v em e t a b o l i t en o r k e t a m i n ei ns a l i v ab yg ca n d g c m s s t u d i e so ft h ec o r r e l a t i o no fp l a s m ac o n c e n t r a t i o n so fk e t a m i n ea n di t sm e t a b o l i t ew i t h s a l i v aa n du r i n ec o n c e n t r a t i o n si na c u t et o x i cr a b b i t sa f t e ri n t r a g a s t r i ca d m i n i s t r a t i o n ( i g ) a n d i n t r a v e n o u si n j e c t i o n ( i v ) o fk e t a m i n e m e t h o d s 1 a n a l y t i c a lm e t h o do fs a l i v as a m p l e s ：t h ea c u t et o x i cr a b b i t sw e r ed i v i d e d i n t ot w og r o u p so fp i l o c a r p i n es t i m u l a t i n gg r o u pa n dn o ns t i m u l a t i n gg r o u p c o l l e c t e dt h e i r s a l i v aa td i f f e r e n tt i m ep o i n t sa f t e rd r u ga d m i n i s t r a t i o n c o m p a r e dt h ec o n c e n t r a t i o n so f k e t a m i n ea n dn o r k e t a m i n eb e t w e e nt w og r o u p sb yt - t e s t s a l i v as a m p l e sw e r ea l k a l i z e da n d e x t r a c t e dw i t he t h y la c e t a t ea f t e ra d d i n gs k f 5 2 5 a ( i n t e r n a ls t a n d a r d ，i s ) t h ee x t r a c t sw e r e q u a l i t a t e db yg c m sf u l ls a c nm e t h o da n dq u a n t i t a t e db yg ca n a l y s i s 2 c o r r e l a t i o ns t u d y ：t h er a b b i t sw e r eg i v e nh y d r o c h l o r i d eo fk e t a m i n ew i t had o s e o fl d s o b yi g a d m i n i s t r a t i o na n di v i n j e c t i o n t oc o l l e c tt h e i rs a l i a v a ，p l a s m aa n du r i n ea td i f f e r e n t t i m ep o i n t sa f t e rd r u ga d m i n i s t r a t i o n t h ec o n c e n t r a t i o n so fk e t a m i n ea n dn o r k e t a m i n ew e r e d e t e r m i n e db yg c a n a l y s i so ft h ec o r r e l a t i o no fp l a s m ac o n c e n t r a t i o n so fk e t a m i n ea n di t s m e t a b o l i t ew i t hs a l i v aa n du r i n ec o n c e n t r a t i o n sb yb i v a r i a t ec o r r e l a t i o na n a l y s i sm e t h o d s r e s u l t s1 t h eq u a l i t a t e da n dq u a n t i t a t e dm e t h o d so fk e t a m i n ea n dn o r k e t a m i n ei ns a l i v a w e r ee s t a b l i s h e d t h el i n e a rr a n g ef o rk e t a m i n ea n dn o r k e t a m i n ei ns a l i v aw a so ，0 1 10 1 t g m l t h el i m i to fd e t e c t i o nw a s0 0 0 5 i t g m l ，t h ea n a l y t i c a lr e c o v e r yw a s9 5 0 3 1 0 5 3 5 t h e i n t e r - a n di n t r a d a yr e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n so fp r e c i s i o n sw e r el e s st h a n1 0 0 t h e r ew a s s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c eb e t w e e n p i l o c a r p i n es t i m u l a t i n gg r o u p a n dn o n s t i m u l a t i n g g r o u p ( p 0 0 5 ) 2 i ni g a d m i n i s t r a t i o ng r o u p t h ec o n c e n t r a t i o n so fk e t a m i n ea n dn o r k e t a m i n ei np l a s m a h a dh i g hc o r r e l a t i o nw i t ht h a ti ns a l i v a t h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t ( r ) w a s0 8 8 t 0 9 5 ，0 8 6 - - o 9 6 。r e s p e c t i v e l y t h ea v e r a g e o ft h a tw a so 9 1 2a n do 9 1 4 i n i v m j e c t i o ng r o u p ，t h e c o n c e n t r a t i o n so fk e t a m i n ea n dn o r k e t a m i n ei np l a s m ah a dc o r r e l a t i o nw i t ht h a ti ns a l i v at o o t h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t ( r ) w a so 8 0 9 6 ，o 8 6 o ，9 5 ，r e s p e c t i v e l y t h ea v e r a g eo ft h a tw a s o 8 9 9a n d0 9 1 2 i ni g a d m i n i s t r a t i o ng r o u p t h ec o n c e n t r a t i o n so fk e t a m i n ea n dn o r k e t a m i n ei n p l a s m ah a dm i d r a n g ec o r r e l a t i o nw i t ht h a ti nu r i n eb e f o r e2 4 0 m i n t h ea v e r a g eo fc o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n tw a s0 5 9 6a n d0 6 0 6b e f o r e2 4 0 m i na n dl o w e rt h a n0 5a f t e r2 4 0 r a i n i ni v i n j e c t i o n g r o u p ，t h ec o n c e n t r a t i o n so fk e t a m i n ea n dn o r k e t a m i n ei np l a s m ah a dm i d r a n g ec o r r e l a t i o nw i t h i l 山西医科大学硕士学位论文 t h a ti nu r i n eb e f o r e1 8 0 m i n t h ea v e r a g eo fc o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n tw a s0 6 1 5a n d0 6 2 0b e f o r e 1 8 0 m i na n dl o w e rt h a n0 5a f t e rl8 0 m i n c o n c l u s i o n1 t h eg c m sa n dg cm e t h o d se s t a b l i s h e df o rt h es i m u l t a n e o u s d e t e r m i n a t i o no fk e t a m i n ea n di t sm e t a 、b o l i t en o r k e t a m i n ei ns a l i v ap r o v e dt ob es i m p l e ，s e n s i t i v e a n dr e p m d u c i b l ea n dc o u l db ea p p l i e dt oa n a l y s ei nt o x i c a t i o na n da b u s ec a s e so fk e t a m i n e r a p i d l y 2 t h ec o n c e n t r a t i o n so fk e t a m i n ea n dn o r k e t a m i n ei np l a s m ah a dh i g hc o r r e l a t i o nw i t ht h a t i ns a l i v ai nt w og r o u p s i ni g a d m i n i s t r a t i o ng r o u pa n di v i n j e c t i o ng r o u p ，t h ec o n c e n t r a t i o n so f k e t a m i n ea n dn o r k e t a m i n ei np l a s m ah a dm i d r a n g ec o r r e l a t i o nw i t ht h a ti nu r i n eb e f o r e2 4 0 m i n a n d1 8 0 r a i nr e s p e c t i v e l y , a n dt h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n tw a sl o w e rt h a n0 5a f t e r2 4 0 m i na n d 1 8 0 m i nr e s p e c t i v e l y s a l i v aa n a l y s i sc o u l db eu s e di nc a s eo fk e t a m i n ea b u s e da n dc o n c l u d i n g t h ek e t a m i n ec o n c e n t r a t i o ni np l a s m ai nc l i n i c a ld r u gm o n i t o r i n ga n df o r e n s i cm e d i c i n e t h e c o r r e l a t i o nb e t w e e n p l a s m a c o n c e n t r a t i o n so fk e t a m i n ea n dn o r k e t a m i n ea n du r i n e c o n c e n t r a t i o n sw e r el o w e rt h a n p l a s m ac o n c e n t r a t i o n s a n ds a l i v ac o n c e n t r a t i o n s u r i n e c o n c e n t r a t i o n so fk e t a m i n ea n dn o r k e t a m i n ec o u l d n tr e f l e c td i r e c t l yp l a s m ac o n c e n t r a t i o n s ，s oi t s h o u l db ec o n s i d 【e r e d c a r e f u l l yw h e nc o n c l u d i n gp l a s m ac o n c e n t r a t i o n s o fk e t a m i n ea n d n o r k e t a m i n eb yu r i n ec o n c e n t r a t i o n s k e yw o r d s ：k e t a m i n e ，s a l i v a ，p l a s m a ，u r i n e ，c o r r e l a t i o n i l l 前言 氯胺酮( k e t a m i n e ) 是苯环己哌啶( p c p ) 的衍生物化学名称2 一氯苯2 一甲基胺环己 酮，属于n 甲基一d 一天门冬氨酸( n m d a ) 受体拮抗剂。临床上多用其盐酸盐作为麻醉剂， 主要用于手术麻醉和小儿麻醉以及复合麻醉，也可以作为其它麻醉剂的诱导剂，兽医用于 动物手术诱导麻醉。氯胺酮以“舞会药”、“娱乐使用药”在欧美流行，市面上俗称k 粉、k 仔，滥用人群主要是青少年。k 也有“迷奸药”之称，是一些不法分子用于迷奸女性的工具 。国际上氯胺酮的滥用已有3 0 多年的历史，上个世纪七十年代美国就有了氯胺酮滥用的 案例报道。上世纪9 0 年代，亚洲国家也出现了氯胺酮滥用的报道1 2 1 。近年来，随着新型毒 品滥用现象的日益突出，许多城市发现氯胺酮滥用且日趋严重1 3 - 4 1 。2 0 0 4 年7 月氯胺酮被 国家列为一类管制精神药品。氯胺酮滥用一般是鼻吸、口服、静脉、肌注进入体内，多数 滥用者鼻吸在5 一l o 分钟起效 5 - 7 1 。 目前氯胺酮的法医学研究多集中在血液、尿液和脏器的测定方面【s 。”。传统血液采集 最主要的缺点是皮肤穿刺必然引起受试者的痛苦和恐惧感，同时还增加了感染及经血传播 疾病，如：肝炎、艾滋病等传染的可能性。另外，取血操作有一定场所限制并且采血人员 必须具备一定的专业知识和技术等。尿液是另外一种常用测定药物浓度的体液，虽属非创 伤性操作，但尿液内药物浓度反映的是最后一次排空后膀胱内贮积尿液的药物浓度，其改 变往往与血药浓度不平行，而且尿液中药物成分也以代谢产物为主，故其应用有一定的局 限性。而唾液取样具有无创伤、经济简便、可反复采取的特点，因此可用于现场快速检测 1 1 6 - 1 9 1 , 许多药物唾液中的浓度可反映其在血浆中的游离药物浓度，与血药浓度有一定相关 性。药物的药理、毒理作用取决于血浆中游离药物浓度的水平，血液中游离态药物可跨膜 转运至唾液，同时因唾液中的蛋白含量较低( 仅为血浆蛋白的1 左右) ，唾液药物浓度基 本可代表有生物活性的游离态药物浓度，因此可以考虑用唾液中的药物水平来推断血药浓 度，作为药物检测的样本。目前国内外关于唾液的研究甚少，国内尚未见系统的利用动物 实验研究唾液【4 ”j 。对于氯胺酮及其代谢物在唾液和血液、血液和尿液相关性方面的研究 在国内外均鲜有报道。 本课题建立了急性中毒家兔唾液的收集和检测分析方法，研究了氯胺酮及去甲氧胺酮 在家兔唾液和血液、血液和尿液中的相关性，为氯胺酮中毒与滥用案例的检材采取，现场 快速检测和推断服毒量以及服毒时间的法医学鉴定提供理论依据，奠定实验基础。 山西医科大学硬士拿位论文 第一章家兔唾液、血液和尿液的收集及分析方法的建立 唾液样品收集的简单易行和唾液药物浓度反映血液浓度的可能性使得唾液在临床和 法医学中成为很有潜在价值的样品，但唾液收集方法的不同会影响唾液中药物浓度，因而 在药物检测中应加以重视1 2 4 。唾液的收集方法和收集装置多种多样【甥，收集方法以是否刺 激及刺激方式，可分为非刺激法( 自然取样法) 和刺激法。收集装置主要有棉花卷2 6 1 或者专 门的唾液收集管2 7 1 以及口腔唾液采集设备。本实验用毛果芸香碱刺激家兔唾液分泌，对刺 激和非刺激唾液中氯胺酮及其代谢物的浓度进行比较，建立了唾液的收集和g c 定量以及 g c m s 定性分析方法，能够快速准确收集和定性定量分析唾液中氯胺酮( k e ) 及去甲氯胺 酮( n k ) 成分。 1 1 材料 1 1 1 药品与主要试剂 盐酸氯胺酮、去甲氯胺酮、丙基解痉素( s k f 5 2 5 n ) 对照品( 公安部二所) 盐酸氯胺酮注射液( 福建古田药业有限公司，批号为国药准字h 3 5 0 2 0 1 4 8 ) 硝酸毛果芸香碱注射液( 天津金耀氨基酸有限公司，批号为国药准字h 1 2 0 2 1 2 3 9 ) 甲醇为色谱纯，乙酸乙酯、氢氧化钠均为分析纯 1 1 2 溶液配制 氯胺酮、去甲氯胺酮标准溶液的配制： 精密称取氯胺酮、去甲氯胺酮标准品适量，分别用甲醇溶解并稀释制成4 0g - l - 1 的储 备液。分别精密量取上述储备液适量，用甲醇稀释成浓度为4 0 0 ，2 0 0 ，1 0 0 ，4 0 ，2 0 ， 1 6 ，0 8 ，0 4 ，0 2 ，0 1 6 ，o 0 8 ，0 0 1 ，o 0 0 1 9 l 1 的氯胺酮、去甲氯胺酮系列标准溶液， 置4 c 冰箱保存。 内标储备液的配制： 精密称取丙基解痉素( s k f s 2 5 a ) 适量，用甲醇溶解并稀释制成1 0g l 1 的储备液，置 4 冰箱保存。 1 1 3 主要仪器 t r a c ed s q 气，质联用仪( g c , r m s ) t r a c e 2 0 0 0 气相色谱仪( g c ) b p 2 1 1 d 型电子分析天平 l 4 2 0 台式低速大容量自动平衡离心机 华普达h y - 3 多功能振荡器 k l 5 1 2 j 氮吹仪 q l 9 0 1 涡旋混合器 无菌唾液收集管 r e 1 0 a 型婴儿秤 美国t h e r m of i n n i g a n 公司 美国t h e r m of i n n i g a n 公司 英国s a r t o r i u s 公司 长沙湘仪离心机仪器有限公司 常州市华普达教学仪器有限公司 北京康林科技有限责任公司 江苏海门市麟麒医用仪器厂 长春博研科学仪器有限责任公司 无锡市衡器厂 山西医辩大学磺士学位论文 1 1 4 实验动物 健康白色家兔，雌雄兼用，体重2 0 如1 k g ，由山西医科大学实验动物中心提供。 1 2 方法 1 2 1 标准曲线的制备 取系列标准溶液分别与等体积的1 0g - l - 1 的内标溶液混匀，即配制成氯胺酮、去甲氯 胺酮浓度为2 0 0 ，1 0 0 ，5 0 ，2 0 ，1 0 ，0 5 ，0 2 ，0 1 ，o 0 5 ，o 0 2 ，o 0 1 9 l 一，内标均为 0 5g - l 1 的系列标准溶液，分别直接进样l l a l 。以待测物与内标物的峰面积比值为横坐标， 待测物浓度为纵坐标作图，求得氯胺酮线性范围为o o l 2 0 叩g ，直线回归方程为 y = 1 0 2 0 1 x 1 0 6 + 1 0 6 7 0 x 1 0 7 x ( r 2 = 0 9 9 9 6 ) ，最低检测限为0 0 0 1 p g ：去甲氯胺酮线性范围为 o 0 1 2 0 0 l a g ，直线回归方程为y = 1 5 4 0 3 x 1 0 6 + 1 0 7 5 9 x 1 0 7 x ( r 2 = 0 9 9 9 3 ) ，最低检测限为 0 0 0 1 p g 1 2 2 家兔的分组、染毒与样品的采集 健康白色家兔1 8 只，雌雄兼用，随机分实验组和对照组。隔夜禁食，实验期间可补 充生理盐水。实验组又可分为刺激组( 6 只) 和非刺激组( 6 只) ，两组家兔均以o 1 5 9 k 9 1 ( 半数致死量) 灌服盐酸氯胺酮水溶液，同时插导尿管和动脉插管，刺激组于毛果芸香碱 刺激条件下收集唾液进行研究，非刺激组于静息状态下收集唾液进行研究。对照组( 6 只) 实验动物也分为刺激组( 3 只) 和非刺激组( 3 只) ，以等体积的生理盐水灌胃，余同前处 理。 分别于给药后1 5 ，3 0 ，4 5 ，6 0 ，9 0 ，1 2 0 ，2 4 0 ，3 6 0 ，4 8 0 m i n 唾液收集管收集唾液、 颈动脉取血，给药后3 0 ，6 0 ，9 0 ，1 2 0 ，2 4 0 ，3 6 0 ，4 8 0 m i n 导尿管取尿。刺激组在收集唾 液前十分钟给予毛果芸香碱o 5 m g k 9 1 刺激唾液分泌，皮下注射( 因其起效时问为1 0 m i n ， 半衰期为3 0 r a i n ) 。唾液收集管置于离心机中离心1 0 m i n ( 3 0 0 0 r m i n - 1 ) 分离唾液，精密吸 取1 i i l l 转移至离心管中，于一2 0 。c 冰箱中保存待检；血样置于离心试管中离心1 0 r a i n ( 3 0 0 0 r m i n ，) ，分离血浆，于一2 0 。c 冰箱中保存待检；尿样加入一滴防腐剂( 甲苯) 后直接 放入2 0 冰箱中保存待检。 1 2 3 唾液、血液和尿液样品的预处理 精密吸取唾液、血液、尿液样品1m l ，分别置于l om l 具塞离心试管中，加入1 0g l 1 的内标溶液( s l 吧2 5 a ) 5 1 a l ，2 t 0 0 1 l - n a o h 溶液调节p h 至1 3 0 ，乙酸乙酯5 m l 提取2 次，振荡混匀，3 0 0 0 r m i n 。离心1 0 r a i n ，分离有机层，合并两次萃取液，8 0 c 水浴下氮气 流吹干，残渣以2 0 1 a l 甲醇定容，涡旋混匀，取l g l 进样。利用保留时间结合特征离子峰 ( 气，质联用) 定性，内标法和标准曲线法( 气相色谱) 定量。 1 2 4 仪器条件 气相色谱分析条件： 载气：氮气，恒流模式，流速1 5 m l r a i n 。 进样条件：进样口温度2 8 0 c ，空气6 0 k p a , 氢气2 j 3k p a ，不分流进样。 1 山西医科大学硕士学位沁文 色谱柱：d b 一5 ( 3 0 r e x 0 2 5 m i n x 0 2 5p m ) 毛细管柱。 柱温：1 5 0 c ( 1 m i n ) _ 1 2 * c m i n - - 2 7 0 。c ( 1 m i n ) 。 检测器：n p d ，温度3 0 0 。 气相色谱，质谱联用分析条件： 载气：高纯氦气( 9 9 9 9 9 ) ，流速1 0 m l m i n 。 色谱条件：色谱柱为d b 一5 m s ( 3 0m x 0 2 5m m x o 2 5l a m ) 毛细管柱，其余条件同上。 质谱条件：传输线温度2 5 0 。电子轰击电离源( e i ) ，电子能量7 0 e v ，离子源温度 2 0 0 。c 。自动调谐方式，发射电流强度1 0 0 u a 。扫描起始时间3 m i n ，扫描范围5 0 6 5 0 a m u 。 1 2 5 数据处理 检材分别提取后测定氯胺酮及其主要代谢产物去甲氯胺酮的含量，结果以均数标准 差( 膏s ) 表示，采用s p s s l l 5 统计软件进行数据处理。 1 3 结果 1 3 1 唾液样品中g c ，m s 定性分析结果 家兔空白唾液样品加入一定浓度氯胺酮、去甲氯胺酮标准溶液及内标液，g c m s 定性 分析获得唾液中标准品的总离子流图( 图l 1 ) ：用药后家兔唾液样品总离子流图( 图1 2 ) ； 氯胺酮、去甲氯胺酮和s k f 5 2 5 a ( i s ) 的结构和标准质谱图( 图1 3 、图l _ 4 和图l 一5 ) 。 5 翟。 _ l t m 0 n h ) 图1 - i 唾液中标准品总离子流图 f i g 1 一l t o t a l i o nc u r r e n t c h r o m a t o g r a m s o f k e t a m i n ea n dn o r k e t a m i n e i ns a l i v a ( t i c ) 1 去甲氯胺酮，2 氯胺酮，3 $ k f 口a 4 m 善t兰藿 坐苎垦型查兰璺主兰堡丝三一 图1 2 用药后家免唾液样品总离子流图 f i g 1 2 t o t a li o nc u f r e n t c h r o m a t o g r a m s o f s a l i v a a f t e r a d m i n i s t r a t i o n o f k e t a m i n e ( t i c ) 1 去甲氯胺酮，2 氯胺酮，3 s k r 签 姆 i ：f ，5 1，i 哆f j ：cj i 杆 l i 。l ，i 哆r t 鬯。1i ：j i 罕 = z 图1 - 3 氯胺酮的结构及标准质谱图 f i g i 3f u l l s c a n m a s ss p e c t r aa n dc h e m i c a ls t r u c t u r eo fs t a n d a r dk e t a m i n e 5 -羞ij2。 ；_j皇t；日 山西医科大学硕士学位论文 必 1 9 5 i 。量j，j 哆f 一盖卜 l_+ l2 2 3 - ，z 圈l - 4 去甲氯胺酮结构及标准质谱图 f i g 1 4 f u l l - $ c i t l l m a s ss p e c t r a a n d c h e m i c a ls t r u c t u r eo f n o r k e t a m i n e h f7 翟佩邺。南u o ，z 图1 - 5s k f s 2 5 ( i s ) 结构及标准质谱图 f i g i - 5 f u l l s c a n m a s ss p e c t r aa n d c h e m i c a ls t r u c t u r e o f s k f 5 2 5 a ( i s ) 1 3 2g c 分析方法的特异性 家兔空白唾液样品中不加内标溶液，其余按“唾液样品预处理”操作，获得空白样品色 谱图( 图1 6 ) ：将一定浓度氯胺酮、去甲氯胺酮标准溶液及内标液加入空白唾液，同法操 作，获得相应色谱图( 图l 一7 ) ；给药后家兔唾液样品图( 图l 一8 ) 。通过空白样品、标准品 以及用药后的样品气相总离子流色谱图，结果表明唾液中内源性物质不干扰样品及内标物 的测定。 ；_目皇：11三五 u牙口旦=日 山西医科大学碰士学位论文 弋。严池一 m l m 图l - 6 空白唾液色谱图 f i g i 一6c h r o m a t o g r a mo f b l a n ks a l i v as a m p l e 掣。 ，品 。避，l ，。，。， 图1 7 唾液中标准品色谱图 f i g 1 - 7 c h r o m a t o g r a m s o f k e t a m i a e a n t in o r k e t a m i n e j n s a l i v a s a m p l e 1 去甲氯胺酮2 氧肫酮3s k r 3 图1 8 用药后唾液中样品色谱囝 f i g i 一8c h r o m a t o g r a m so fs a l i v as a m p l ea f t e ro r a la d m i n i s t r a t i o no fk c t a m i a e 1 去甲氯胀酮，2 氯腹酮3s k f 5 j 7 山西医科大学硕士学位论文 1 3 3 工作曲线和线性范围 取1 0 份空白家兔唾液各1 m l ，分别加入内标溶液5 t a g ，氯胺酮、去甲氯胺酮0 0 0 1 ， 0 0 0 5 ，0 0 l ，0 0 5 ，0 1 ，0 5 ，1 0 ，3 0 ，5 0 ，1 0 0 l a g ，即配制成氯胺酮、去甲氯胺酮标准 系列的唾液样品；取l o 份lm l 空白家兔血液，分别加入氯胺酮、去甲氯胺酮0 0 5 ，0 1 ， o 5 ，1 0 ，3 0 ，5 0 ，1 0 0 ，1 5 0 ，2 0 0 ，4 0 o l a g ，即配制成氯胺酮、去甲氯胺酮标准系列的 血液样品；取1 0 份lm l 空白家兔尿液，分别加入氯胺酮、去甲氯胺酮1 0 ，5 0 ，1 0 ，5 0 ， 1 0 0 ，1 5 0 ，2 0 0 ，3 0 0 ，4 0 0 ，5 0 0 l a g 即配制成氯胺酮、去甲氯胺酮标准系列的尿液样品。各 标准样品按1 2 3 项方法操作。以待测物浓度为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为 纵坐标作图，求得直线回归方程、线性范围及最低检出限( 表1 1 ) 。结果见表l 一1 。 表l 一1 直线回归方程及最低检出限 t a b 1 1l i n e a rr e g r e s s i o ne q u a t i o na n dt h el i m i to fd e t e c t i o n 1 3 4 精密度与回收率 取3 份1m l 家兔空白唾液，分别加入氯胺酮、去甲氯胺酮0 5 ，2 ，1 0 l a g ，每一浓度 进行6 样本分析，连续测定3 天。以工作曲线法计算样品的浓度，与实际配制浓度对比， 求得精密度( q c 样品测定值的相对标准偏差) 和准确度即相对回收率( q c 样品测定均值 对真实值的相对误差，即方法回收率) 。结果见表1 2 。 表i - 2 唾液中k e 和n k 的精密度和相对回收率( n 巧) t a b i - 2 a c c u r a c ya n dp r e c i s i o no f k e t a m i n ea n dn o r k e t a m i n ei ns a l i v a ( n = 6 ) 山西医科大学硕士学位论文 1 3 5 样品稳定性 取3 份lm l 家兔空白唾液，分别加入氯胺酮、去甲氯胺酮0 5 ，2 ，l o p g 配制成三个 不同浓度样品，经反复3 次一2 0 冷冻，室温溶解后，测定样品浓度，以考察样品在冷冻和 冻融条件下的稳定性，每浓度进行3 样本分析。3 个浓度下唾液样品氯胺酮、去甲氯胺 酮的测定均值与加入值之间的相对误差分别为一2 7 ，4 3 ，一1 5 ，表明唾液样品在冷冻- 溶融循环三次实验中无明显降解。 同法配制浓度分别为0 5 ，2 ，1 0 p g m l 。的唾液样品，样品经液- 液萃取处理后，室温 下( 约2 0 ) 放置2 4 h 测定，以考察处理后的氯胺酮、去甲氯胺酮唾液样品在室温下的稳 定性，每一浓度进行3 样本分析。3 个浓度下唾液样品氯胺酮、去甲氯胺酮的测定均值与 加入值之间的相对误差分别为4 2 ，2 8 3 5 ，表明唾液样品处理后在室温下至少可 稳定存放2 4 h 。 1 3 6 刺激与非刺激条件下唾液、血液和尿液中氯胺酮及其代谢产物含量 家兔灌胃( i g ) 刺激组和非刺激组不同时间点收集的唾液、血液和尿液中氯胺酮及其 代谢产物去甲氯胺酮的平均药物浓度分别见表1 3 ，表1 4 和表l 一5 。 表i 3 家兔灌胃刺激组和非刺激组的平均唾液药物浓度( n = 6 ) t a b 1 - 3m e a nc o n c e n t r a t i o n so f k e t a m i n ea n dn o k e t a m i n ei ns a l i v aa f t e r i g a d m i n i s t r a t i o n t or a b b i t s i n t h es t i m u l a t i n g g r o u pa n dn o ns t i m u l a t i n gg r o u p ( n = 6 ) 刺激组c a sq a g - m l 1 )非刺激组c b j ( p - g “1 ) t ( m i n ) k en kk en k 9 山西医科大学颈士学位论文 表1 _ 4 家免灌胃刺激组和非刺激组的平均血药浓度( n - - - 6 ) 1 h b 1 _ 4m e a nc o n c e n t r a t i o n so fk e t a m i n ea n dn o k e t a m i n ei np l a s m aa f t e r i g a d m i n i s t r a t i o n t or a b b i t s i n t h es t i m u l a t i n gg r o u pa n dn o ns t i m u l a t i n g g r o u p ( n = 6 ) 刺激组c s ( , t g m l 1 )非刺激组c 日s ( i t g m l 1 )1 y r a i n ) k e n kk en k 表i - 5 家兔灌胃刺激组和非刺激组的平均尿药浓度( n ：6 ) t 曲1 5m e a nc o n c e n t r a t i o n so f k e m m i n ea n dn o k e t a m i n ei nu r i n ea f t e r i g a d m i n i s t r a t i o nt or a b b i t si nt h es t i m u l a t i n gg r o u pa n dn o ns t i m u l a t i n gg r o u p ( n - - 6 ) 刺激组c a j ( t a g m l )非刺激组c 口s ( 鹏m l - 1 )t ( m i n ) 、 k e n k k e n k 1 3 7 统计学处理 采用s p s s l l 5 统计软件对刺激组和非刺激组之问唾液、血液和尿液平均药物浓度进行 分析，经配对t 检验，结果表明：刺激组和非刺激组之间氯胺酮及去甲氯胺酮在唾液、血 液和尿液中平均检出量均无显著性差异( p o 0 5 ) 。 0 山西医科大学颈士学位论文 1 4 讨论 1 4 1 动物模型的建立 收集资料显示，兔、狗和猫的唾液腺都很发达，兔除具有一般哺季l 动物所具有的三对 唾液腺( 腮腺、颌下腺、舌下腺) 外，还有一对眶下腺，此外还有一些分散的小腺体，唾 液就是由这些腺体分泌液混合组成的。然而家兔比较温顺，唾液腺也发达，易于采集，唾 液成分也比较简单，结合有关文献报道 2 8 , 2 9 ，所以选择家兔作为实验动物。 查阅了氯胺酮药效学及毒理学文献所给出的信息，结合药物与化学物质毒性数据 1 3 0 l ，经不同种属动物体型系数推算，在预实验的基础上确定以l d 5 0 作为染毒量。 1 4 2 收集方法的选撵 唾液的采集分为刺激法和非此激法，非刺激法要求静息状态下采集唾液，流速慢，所 需时间至少1 0 m i n 。刺激法分为物理刺激法和化学刺激法：物理刺激法是放置固体石蜡、 橡皮条或棉球等物质于口腔中，刺激唾液分泌，流速为1 3 m l _ m i n ：化学刺激法是用酸刺 激味觉或者毛果芸香碱刺激唾液分泌，获得的流速可达5 1 0 m l m i n 。毛果芸香碱起效快， 半衰期长。家兔自然分泌唾液量少，很难多次采集，而刺激法可以增加唾液分泌，易采集 且增加采集次