（应用化学专业论文）可体内降解的新型交联聚乙烯亚胺的设计、合成与性能研究.pdf

硕士学位论文可体内降解的新型交联聚乙烯亚胺的设计、合成及性能研究 摘要 本文主要合成可生物降解、水溶性好的多羟基阳离子聚合物基因载体，并评价其基 因转染性能。阳离子聚合物聚乙烯亚胺( p e i ) 被认为是转染效率最高的聚合物基因载 体之一，高分子量的p e i 转染效率高，但细胞毒性也大，而小分子量的p e i 细胞毒性小， 但转染效率也低。本课题组前期的交联p e i 衍生物实现了可降解，提高了转染效率，但 水溶性较差。为了提高水溶性以及降低细胞毒性，本论文主要设计和合成了三种多羟基 的交联剂( l d l t 、d m d g 和d a t d ) 以及两种环氧类交联剂( e g a e p 和e g d e p ) ， 并分别和两种小分子量的p e i 交联，合成出了8 9 种可体内降解的、水溶性明显改善的 p e i 衍生物。以h e k 2 9 3 细胞为受体细胞，增强绿色荧光蛋白质粒( e g f p ) 为报告基因 对其中能溶于的水的聚合物进行了细胞转染实验，根据交联剂种类的不同，筛选出四种 转染效率高的新型聚合物。其中一种聚合物转染效率高达9 1 。再以a 5 4 9 细胞为评价 对象，发现这四种聚合物的转染效率比b p e l 2 5 k d a 高2 5 倍，且细胞毒性明显比 b p e l 2 5 k d a 小，这四种聚合物与d n a 形成的复合物的粒径大小均在7 0 1 5 0 n m 之间，且 有与b p e l 2 5 k d a 相似的包裹d n a 的能力。结果表明：这些含羟基的交联p e i 衍生物具 有进一步开发为低毒、高转染效率的阳离子聚合物基因载体的潜力。 关键词：基因传递，非病毒载体，聚乙烯亚胺，可降解，细胞毒性 硕士学位论文 a b s t r a c t s o m em u l t i - h y d r o x y lc a t i o n i cp o l y m e r sf o rg e n ed e l i v e r ys y s t e m sw i t hg o o d b i o d e g r a d a b i l i t ya n dw a t e r - s o l u b i l i t yw e r es y n t h e s i z e di nt h i sp a p e r , a n dt h eg e n et r a n s f e c t i o n e f f i c i e n c yo fw h i c hw a sa l s oe v a l u a t e d p o l y e t h y l e n i m i n e ( p e i ) h a sb e e nk n o w na se f f i c i e n t g e n ec a r r i e r 诚t l lt h eh i g h e s tc a t i o n i cc h a r g ep o t e n t i a l h i g l lt r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c yo fp e i ， a l o n g 、丽t l li t sc y t o t o x i e i t y , s t o n g l yd e p e n d so ni t sm o l e c u l a rw e i g h t s m a l lp e ii su s u a l l y n o n - c y t o t o x i cb u tl e s se f f i c i e n t i no r d e rt oe n h a n c et h ew a t e r - s o l u b i l i t ya n dm i n i m i z e c y t o t o x i c i t yo fp e i ，w ed e s i g n e da n ds y n t h e s i z e dt h r e ep o l y h y d r o x y l a t e dc r o s s l i n k e r s ( l d l t , d m d c 写d a t d ) a n dt w oe p o x y b a s e dc r o s s l i n k e r s ( e g a e p a n de g d e p ) 8 9 w a t e r - s o l u b i l i t yi m p r o v e dp o l y m e r sw e r ep r e p a r e db yn o n - e y t o t o x i cs m a l l e rp e ir e a c t i n g w i t l ld i f f e r e n tp o t e n t i a l l yb i o d e g r a d a b l ee r o s s l i n k e r sw eh a v es y n t e s i z e d t h ep o l y m e r st h a t a r es o l u b l ei nw a t e rw e r ea s s e s s e dw h e nh e k 2 9 3c e l l sw e r eu s e da sr e c e p t o rc e l la n d e n h a n c e dg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ( e g f p ) w a su s e da sg e n er e p o r t e r t h e nw ep i c k e do u t f o u rn e wp o l y m e r s 诵t l ll l i g ht r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c yi nt h ep r o d u c t s ，a n dt h eh i g h e s tg f p p o s i t i v er a t i oi s91 a m o n go ft h ef o u rp o l y m e r s ；t h et r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c yo ft h ef o u r p o l y m e r sw a sa l s oi n v e s t i g a t e di na 5 4 9c e l l ，r e s u l t ss h o w e dt h a tt h e i rt r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c y a r e2 - 5t i m e sm o r ee f f i c i e n tt h a nt h a to fb p e l 2 5 k d a , a d d i t i o n a l l y , t h e s ep o l y m e r se x h i b i t m u c hl o w e rc y t o t o x i c i t yt h a nb p e l 2 5 k d ai n2 9 3 a n da 5 4 9c e l l s t h ef o u re f f i c i e n tp o l y m e r s a r es i m i l a r 、) i ，i t l lb p e l 2 5 k d ai nt h e i rc o n d e n s i n gd n ai n t on a n o p a r t i c l e s t h er e s u l t si n d i c a t e d t h a tt h eb i o d e g r a d a b l ec r o s s l i n k e dp e i si n c l u d i n gh y d r o x y lh a v ee x c e l l e n tp r o p e r t i e sf o rt h e d e v e l o p m e n to fh i g h l yp o t e n ta n dn o n t o x i cp o l y m e r i cg e n ec a r r i e r s k e y w o r d s ：g e n ed e l i v e r y , n o n - v i r a l ，p o l y e t h y l e n i m i n e ( p e o ，d e g r a d a b l e ，c y t o t o x i c i t y 声明户明 本学位论文是我在导师的指导下取得的研究成果，尽我所知，在 本学位论文中，除了加以标注和致谢的部分外，不包含其他人已经发 表或公布过的研究成果，也不包含我为获得任何教育机构的学位或学 历而使用过的材料。与我一同工作的同事对本学位论文做出的贡献均 已在论文中作了明确的说明。 2 ，噼7 月ie l 学位论文使用授权声明 南京理工大学有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅 或上网公布本学位论文的部分或全部内容，可以向有关部门或机构送 交并授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的部分或全部内容。对 于保密论文，按保密的有关规定和程序处理。 研究生签名： 厶蜱7b ，日 硕士学位论文可体内降解的新型交联聚乙烯亚胺的设计、合成及性能研究 1 绪论 随着分子生物学，细胞生物学，免疫生物学等相关学科的发展和交叉渗透，在过 去的十年里，基因治疗研究取得了重大的进展并已经成为新的治疗方法的最前沿领域 正在孕育着对传统医疗方法的一场革命i l 】。目前基因治疗已为广大学者所接受并已从实 验研究及基础研究过渡到临床试用阶段。基因治疗是指将外源基因转入细胞内部，通过 恢复或增添基因表达以纠正人自身基因结构或功能上的错乱，阻止病变的发展，杀灭病 变的细胞，或抑制外源病原体遗传物质的复制，从而达到治病的目的。基因治疗包括三 个重要的环节，即治疗性基因，转基因载体和靶细胞。安全高效地将核酸转移到特定的 细胞中是基因治疗的技术核心，也是基因表达调控，突变分析，蛋白质结构与功能分析 等研究中的重要技术环节，因此是现代生物技术中最有价值和最经常使用的技术之一。 1 1 基因治疗的载体 如何成功地使足够量的外源核酸( d _ n a ，r n a 等) 转移到要治疗研究的宿主细胞 中是当今生命科学研究中急待解决的问题。以往的方法是将核酸整合到病毒载体中，尤 其是逆转录病毒、腺病毒或腺相关病毒中。这些系统利用了病毒进入细胞的机制和它们 对抗降解的保护作用。由于病毒载体转染效率高，所以目前的文献报道中，许多的基因 传递实验是由病毒载体实施的，截止2 0 0 8 年底已经批准的基因治疗临床实验方案中6 9 是采用病毒载体的【2 j 。但是，这些方法有一些严重的缺陷，例如，病毒载体的开发与 制备需要使用缺陷病毒和互补细胞系的复杂技术，因此制备复杂且价格较高。易产生能 够在宿主机体中传播的感染性病毒颗粒的风险，而且，对于逆转录载体，还有插入突变 的风险，因此有潜在的安全危险。此外，将治疗性的或疫苗性的基因插入到病毒基因组 中的能力仍然有限，因此病毒载体的包装容量有限。所以人工合成的非病毒载体受到了 极大的关注p j ，合成载体具有安全性高，免疫原性低，易于d n a 进行操作等优点，所 以近来人们越来越重视人工合成的非病毒载体的研究【4 】，而且由于合成载体的转染效率 的提高，最近的研究表明非病毒的合成载体使基因治疗前景光明【5 】。合成载体主要是指 聚合物载体( 包括聚合多肽) 和脂质体。目前已经合成了多种非病毒载体，其中聚合物 基因载体占有重要的地位。研究较多的聚合物基因治疗体系主要有阳离子多聚物型载 体、非缩聚型聚合物体系、可生物降解的聚合物体系、多复合脂质体体系、热p h 敏感 聚合物体系及聚合型胶束体系等。 在非病毒载体研究的早期，人们的主要兴趣放在脂质体上，并且使得阳离子脂质体 广泛地用在体内和体外的基因转染实验中。但是近年来的研究发现，阳离子型的脂质体 基因载体也有一些结构上的缺点。比如：脂质体的疏水基团决定了它的形状，大小，在 1 绪论硕士学位论文 水相的稳定性以及同其他脂质体、细胞膜、d n a 等的相互作用。这最终就影响了脂质 体聚合物的转染效率【6 】。目前脂质体特别是阳离子脂质体作为基因载体具有一定潜力， 但基因表达效率低，体内不稳定一直是困扰医学界的难题。由于病毒载体以及阳离子脂 质体所存在的局限性，同时由于阳离子聚合物具有安全性高，免疫原性低，易于对d n a 进行操作，价格低，特别是其结构易于改造等优点。人们对阳离子聚合物作为基因载体 的兴趣越来越高。其结构特点为：这些聚合物的主链或侧基上均包含有各种伯、仲、叔 胺基或正电性的脒基等正电性基团，可以是线性、分枝或树枝状结构。由于这些聚合物 结构上改造容易，所以它们可以提供有效基因传递所要求功能【_ 丌。结果是尽管目前它们 的体内转染效率并没有完全满足需要，但日益增加的研究报道表明它们具有极大的临床 应用潜力。 1 2 阳离子聚合物基因载体 这类聚合物材料主要有聚赖氨酸( p l l ) 【8 、聚乙烯亚胺( p e i ) b o , 11 1 、聚甲基丙烯酸 n n 二甲氨基乙酯( p d m a e m a ) b 2 、聚丙烯亚胺( p p i ) 1 3 , 1 4 、聚氨基葡糖( 壳聚糖) 【1 5 】 和树枝状聚合物【1 6 1 ，由于这些聚合物最初是用于其它领域的，不是专门为基因传递设计 的，所以它们的转染效率和细胞毒性只能是凭天由命了。为了改善其性能，它们本身和 其结构修饰后的衍生物得到了广泛的研究，这些研究是目前非病毒载体研究的主要部分 也是文献报道的绝大多数内容。 1 2 1 聚赖氨酸 聚赖氨酸( p l l ) 是最早用于现代基因传递的阳离子聚合物之一b t , l s 。它的转染效率 低且需要氯喹帮助【1 9 1 ，为了提高其转染效率，科学家对其进行了各种修饰和改造，这些 研究包括将其与其他聚合物接枝、嵌段或共聚，偶联各种靶向分子例如p e g ( 聚乙二 醇) 2 0 1 、糖【2 、叶酸【2 2 】、多肽固】和抗体等。由于其与d n a 形成的转染复合物在被胞 吞后，d n a 较难从中逃逸至细胞浆中【2 4 】，因此近来的研究表明聚赖氨酸类的聚合物进 行临床应用取得成功的前景并不乐观。 1 2 2 树枝状聚合物 树枝状聚合物具有高度支化和规整的结构。它的分子大小和表面电荷可以通过控制 合成它的代数得到准确的控制。19 9 3 年h a e n s l e r 和s z o k a 2 5 】首先报道了聚酰胺胺树枝 状高分子( p a m a m ) 用作基因转染剂。5 代以上的p a m a m 树状大分子能将d n a 高 效转染到不同的哺乳动物细胞中，转染效率高于脂质体。转染效率主要取决于树状大分 子与d n a 比例及树状大分子的大小。目前已被合成的商品化的s t a r b u r s t 刑( p a m a m ) 分子有0 l o 代。这些分子的特定结构和表面大量的氨基基团有利于它们与核酸通过静 电作用形成稳定的复合物，因此被广泛地应用于基因转染领域。研究实验表明，第五至 2 硕士学位论文 可体内降解的新型交联聚乙烯亚胺的设计、合成及性能研究 第十代的树状高分子可携带d n a 进入细胞膜而获得高效的基因表达，且对宽范围的哺 乳动物细胞系仅呈现较低的毒性。有些树枝状聚合物甚至可以在第二至第三代就取得较 高的基因转染效率 2 6 1 。树枝状聚合物偶联精氨酸和环糊精等可以进一步地提高其转染 效率2 7 捌。可降解的树枝状聚合物也比其本身有更高的转染效率【2 9 1 。由于它们有较高的 转染效率和良好的生物相容性，所以近年来树枝状聚合物已经被用于一些体内的基因传 递实验【3 0 3 1 1 。 1 2 3 含有糖基和环糊精的聚合物基因载体 有质子海绵性质的聚合物例如p e i ，聚酰胺胺树枝状高分子( v a m a m ) 有较高的 转染活性，但细胞毒性较大。壳聚糖的毒性低，但转染效率低。研究表明在阳离子聚合 物侧基上偶联各种糖基或环糊精常常可以抑制p o l y p l e x ( 在水溶液中，聚合物包裹d n a 后所形成的纳米级复合物) 颗粒的聚集、降低其细胞毒性却增加转染效率。r e i n e k e 研 究了糖的结构、大小及糖与阳离子聚合物正电中心的距离等对所修饰的聚合物基因转染 性能的影响【1 1 8 1 。糖分子修饰阳离子聚合物可以提高其水溶性抑制其p o l y p l e x 的聚集以 及它们与血液中其他蛋白的相互作用，同时由于细胞膜上有糖蛋白的受体可以增加聚合 物对细胞的亲和性和靶向性 3 2 1 。将阳离子聚合物的侧基上带上环糊精( c d ) 可以明显 地改善其基因传递的性质，聚酰胺胺树枝状高分子( p a m a m ) 接枝c d ( a ，p a n dy - c d ) 得到p a m a md e n d r i m e r - c d ( g 2 ，g 3a n dg 4 ) ，其中g 3p a m a md e n d r i m e r s 在体内和 体外转染效率得到了提高，但毒性有所下斛1 1 0 】。c d 接枝p e i ( c d p e i ) 也明显地提高 了转染效率却降低了毒性【3 引。目前c d p a m a m 和c d p e i 已经成功地用作体内基因 传递载体 3 3 , 1 1 5 j 。因此将各种糖结构引入p e i 或p a m a m 是非常有意义的。 1 2 4 聚乙烯亚胺( p e i ) p e i 被广泛的用于水处理和造纸工业中，p e i 存在分枝型和线型聚合物两种，基于 线型的p e i 聚合物的转染试剂已经商业化0 4 1 。聚乙烯亚胺是迄今为止转染效率最高的聚 合物载体之一，它不需要任何外界的内涵体离解剂就能取得较高的转染效率，它的转染 效率是基于溶酶体保护，使d n a 免于核酸酶降解，随后溶酶体溶胀与破裂提供了 p e i d n a 粒子逃脱机制。它容易与各种靶向分子例如半乳糖，甘露糖，转铁蛋白和抗 体等偶联从而使其具有靶向性。目前聚乙烯亚胺已经成功地用于体内各种组织例如中枢 神经系统、肾、肺和肿瘤等的基因传递。但聚乙烯亚胺往往有较高的细胞毒性，它的高 转染活性主要是得益于它的质子海绵结构所导致的p e i 基因复合物易于从内涵体和溶 酶体中逃离网。但由于它不是专门为基因传递而生产的聚合物，所以它的基因传递性能 并没有处于最佳状态。但在设计更复杂的基因载体时，p e i 经常做为核心组成成分【3 6 1 。 市场上可以得到从小于1 0 0 0 d a 一- i 6 x1 0 3 k d a 不同分子量的p e i 。而分子量在5 - 2 5 k d a 的p e i 被认为是最适合做基因传递的载体。高分子量的p e i 能导致细胞毒性网，可能是 3 l 绪论 硕士学位论文 因为细胞膜外层积聚了巨大的聚阳离子束层p 嚣j 。相反，低分子量p e i 在细胞中被证实了 很小的细胞毒性【3 9 , 4 0 1 ，f o r r e s t 等人利用小分子量的双丙烯酸酯交联剂交联小分子量的 p e l 8 0 0 d a 形成了分子量为1 0 - - 3 0 k d a 的聚合物，这种聚合物同小分子量一样具有极低 的细胞毒性，而且具有较高的转染效率。这种聚合物的降解行为是与酯键能够在生理条 件下和细胞环境中水解的行为相关联的。具有小的降解半周期的聚合物显示出了低的细 胞毒性，并且在整个过程中没有发现对细胞有害的降解产物【4 1 1 。 d i c k 和h a m 从理论上根据酸催化聚合机理提出了分枝性的p e i 的伯胺，仲胺和叔 胺的n 原子数目比例是l ：2 ：1 1 4 2 j ，然而利用乃c 核磁共振光谱对大多数商业中可得到 的p e i 进行定量测定却发现分枝型p e i 胺基的比例是1 ：l ：1 【4 3 1 。这可能是合成方法和 条件等因素使得实际值和理论值产生了偏差。分枝型p e i 聚合度的增加同时也会导致细 胞毒性的增加和血红球的溶解1 4 4 。k r a m e r 等人综合了研究成果得出了最低细胞毒性时 分枝型p e i 的聚合度大约是6 0 t 4 5 1 ，所以建立更详尽的结构与功能的关系的先决条件就 是对聚合物结构的透彻研究，这也有利于最大程度上优化细胞毒性和生物相溶性之间的 关系。 p e i 最突出的特点就是它的高阳离子电荷密度，每隔两个碳原子就有一个氮原子可 以被质子化，这导致了极高的阳离子电荷密度，大约每克含有2 0 - 2 5 微当量的电荷m 。 因为p e i 不含有季胺，阳离子电荷是在生理环境下由胺基质子化而产生，所以导致了环 境中的p h 和阳离子电荷密度之间的某些关联，比如在p n 为7 4 时p e i 被质子化的比例 是大约是2 0 ，而在p h 为5 时大约是4 5 1 4 7 。宽范围的表观p k 值导致了p e i 高效的 缓冲能力。 细胞毒素和红细胞浆质的释放是与电荷密度和缓冲能力有关系的。最近的一个研究 结果显示：最高效时的缓冲能力的p h 值范围大约在8 - 1 0 之间。这也是聚胺类和多胺 类化合物的一个典型酸碱范围【4 3 删。碱性和质子化作用都受p e l 分子量和分支化度的影 响。聚合物的p k a 值在p h 为8 - - - 1 0 之间会减小，同时分子量在增i l f i 4 3 1 。p k a 为9 、8 5 、 8 3 时的p e l 分子量分别为2 k d a 、2 5 k d a 和1 5 0 k d a l 4 8 。p h 大于7 时的高的缓冲能力归 结于分枝型p e i 上仲胺基，线型的p e i 也具有同样的结果1 4 引。研究使用不同的分支化度 的p e i ，结果显示高数量的伯胺和仲胺与高的p k a 值相关联，原因是他们的高度质子化， 高数量和高电荷密度i 删。 高分子量的p e i 虽然转染效率高，但不可降解，且细胞毒性相当大；而小分子量的 p e i 细胞毒性虽然很小，但转染效率相当低。为了解决这两者之间的矛盾，科学家们采 用生理条件下可降解的交联剂交联小分子量的p e i 成高分子量的聚合物，使其具有和高 分子量的p e i 相当甚至更高的转染效率，又因其在生理条件下可生物降解而具有相当低 的细胞毒性，生物相容性好。因此，研究基于p e i 骨架的聚合物基因载体的重点就是研 究水溶性好、生物可降解的多功能化的交联剂和交联策略。 4 硕士学位论文可体内降解的新型交联聚乙烯亚胺的设计、合成及性能研究 1 3 交联剂和p e i 交联策略 p e i 上有许多伯胺基和仲胺基，原则上只要可与伯胺和仲胺发生反应的基团都可以 作为交联剂的官能团，这些官能团主要有异氰酸酯、双键、环氧、羧酸酯类等。以下我 们主要从交联剂的官能团角度归纳交联剂的种类。 1 3 1 双键类交联剂 这类交联剂以双键与p e i 上的伯胺基和仲胺基发生m i c h a e l 加成反应，从而将小分 子量的p e i 交联成高分子量的聚合物。双键和胺的反应条件很温和，也比较容易控制。 一般将p e i 或小胺、交联剂溶解在溶剂( 通常是二氯甲烷) 中，控制温度在4 5 0 c 左右， 按分子量的要求反应数小时就可以了。这类交联剂大致可以分为双丙烯酸酯类交联剂和 双丙烯酰胺类交联剂。 1 3 1 1 双丙烯酸酯类交联剂 关于双丙烯酸酯和小胺交联合成聚合物基因载体的文献很多，部分已经建立起了组 合化学库。m i t ( m a s s a c h u s e t t si n s t i t u t eo ft e c h n o l o g y ) l a n g e r 小组在2 0 01 年j a c s 上首 次以组合化学库的形式发表了多种类型的双丙烯酸酯交联剂和各种小胺的组合交联化 学库 4 9 1 ，共计七种双丙烯酸交联剂和2 0 余种小胺组合交联出1 4 0 余种聚阳离子基因载 体。其中7 0 多余种水溶性比较好( 2 m g m l ，2 5 m m 乙酸缓冲溶液) ，这其中有5 6 种能 在1 ：2 0 的d n a 聚合物的比例下充分与d n a 亲和形成复合物纳米颗粒。以c o s 7 细 胞( 非洲绿猴s v 4 0 转化的肾细胞) 为转染对象，就转染效率、细胞毒性等方面对聚合 物基因载体做了筛选，初步认为带羟基的小胺交联的聚合物细胞毒性小，转染效率高。 这个工作为建立双丙烯酸酯与小胺的交联组合化学库奠定了坚实的基础。2 0 0 4 年，他们 进一步丰富了双丙烯酸酯和小胺的交联库，新合成了4 8 6 种第二代聚氨酯基因载体【5 0 】。 合成了7 0 余种一级结构的聚合物。并且通过测定分子量、形成复合物的纳米颗粒粒径、 表面正电性和转染效率作了评价。在这个组合库中，2 0 余种一级结构的聚合物比商业中 最好的脂质体l i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 的转染效率还要高，较好转染效率的聚阳离子与d n a 形成的纳米颗粒的粒径在1 5 0 n m 以下，转染效率高和细胞毒性小的聚合物都是来源于带 羟基的小胺交联聚合物，而这三种小胺仅仅在于氨基和羟基之间碳原子数目的不同，并 确定了5 胺基1 戊醇( a p o ) 与1 ，4 丁二醇丙烯酸酯( b d d a ) 的聚合产物( c 3 2 ) 为 最优。并在以上的5 0 0 多种聚合物基因载体的库中筛选出这种聚合物用于小鼠细胞体内， 获得了良好的结果1 5 。这个小组又成功地将e 1 2 r g d 肽蛋白序列作为特许配体引入到 了c 3 2 包裹质粒d n a 复合物的纳米颗粒上，具备了临床应用的可制5 2 1 。在最近的工作 中，他们又创新地设计出了一种末端修饰聚氨酯合成聚合物基因载体的方法1 5 3 , 5 4 1 。采用 二次聚合使丙烯酸酯封端的聚合物再经过氨基封端产生末端官能化的聚合物，即采用高 转染效率的聚氨酯c 3 2 ，通过多种小胺末端再修饰c 3 2 的方法合成了多种末端官能化的 5 l 绪论 硕士学位论文 聚合物基因载体组合库。这些聚合物载体比未被修饰的转染效率普遍高出3 0 以上，而 因末端官能化修饰原因在很低的n p 比下就能很好地与d n a 形成复合物，复合物纳米 颗粒粒径大约在1 0 0 n m 左右。这种末端修饰的策略为聚合物基因载体的研究开发提供了 一条新的思路。 m i tk l i b a n v 小组选用了第三代交联剂( 部分带羟基) 分别以一定比例交联了两类 小分子量的l p e l 4 2 3 d a 和b p e l l 8 k d a 以及两者的混合物( w w = 1 ：1 ) ，合成了1 4 4 种 生物可降解的聚合物基因载体组合库【5 引。并分别以c o s 7 细胞和a 5 4 9 细胞( 人肺癌细 胞) 对细胞转染效率和细胞毒性做了评价。筛选出来的线型交联聚合物比母体的转染效 率高出3 6 0 0 多倍，混合p e i 交联的聚合物比母体高出了8 5 0 多倍，大部分的交联聚合 物比l p e l 2 2 l 【d a 也要高出2 倍多，而细胞毒性要比线型l p e l 2 2 k d a 小的多。而且发现某 些聚合物在肺细胞内的转染效率很高。d a r r e nm b r e y 也对双丙烯酸交联剂的链长对聚 合物基因载体的性能影响作了研究1 5 6 j 。 最近，双丙烯酸类交联剂已经广泛应用于p e i 的交联。继f o r r e s t 以二丙烯酸1 ，3 丁二醇酯为交联剂交联了b p e i s 0 0 d a 成聚合物用于转染【5 7 】后，董伟等人分别以二甲基丙 烯酸乙二醇酯( e g d m a ) 和二丙烯酸1 ，4 丁二醇酯( b d d a ) 为交联剂交联了b p e i s 0 0 d a 成聚合物基因载体，筛选出以e g d m a 为交联剂、聚合时间为4 小时的聚合物基因载体 的转染效率要高于b p e 2 5 k d a ，且发现其在b 1 6 f 1 0 细胞( 小鼠黑色素瘤高转移细胞) 和2 9 3 t 细胞( 人胚肾细胞) 中的转染效率分别是b p e 2 5 a 的9 倍和1 6 倍，在最优实 验条件下没有发现细胞毒性【5 8 j 。 c h o 等人分别用丙烯酸封端的泊洛沙姆【5 9 1 和聚乙二醇( p e c g a = 3 ) 1 6 0 l 做交联剂交联 了p e l l 8 k d a 和4 2 3 d a 合成出聚合物基因载体。发现前一种聚合物显示了较好的d n a 亲和能力，在a 5 4 9 、2 9 3 t 和h e p g 2 细胞( 人肝癌细胞) 中，转染效率要比p e l 2 5 k d a 高出很多，且细胞毒性要小，而后一种聚合物在肺和肝细胞中的转染效率比p e l 2 5 k d a 高，且在小鼠体内的转染效率能维持7 天。 w a g n e r 等人分别以过量2 0 倍的二丙烯酸乙二醇酯( e d ) 、二丙烯酸丁二醇酯( b d ) 和二丙烯酸己二醇酯( 皿) 为交联剂交联b p e l 8 0 0 d a 成以p e i 为内核，表面为丙烯酸 酯链臂的聚合物，再用各种胺对表面的丙烯酸酯封端，合成了一系列以p e i 为内核，酯 键为连接臂，低聚胺表面修饰的聚合物基因载体1 6 1 1 。并发现二丙烯酸己二醇( h d ) 修 饰的基因载体比p e l 2 5 k d a 更能亲和d n a ，且细胞毒性要低，3 7 0 c 时的降解半周期为3 天，转染效率和p e l 2 5 k d a 相当。进一步研究发现在体内肿瘤组织中运输d n a 的能力 要优于i p e i 。 1 3 1 2 双丙烯酰胺类交联剂 e n g e r s n e n 等人研究了几种双丙烯酰胺类交联剂和小胺的合成，这几种新型交联剂 包括n ，n7 二丙烯酰基胱胺( c b a ) 、n ，n ，二丙烯酰胺甲烷( m b a ) 、n , n - - - 丙烯酰基 6 硕士学位论文可体内降解的新型交联聚乙烯亚胺的设计、合成及性能研究 哌嗪( b a p ) 和n ，n 二丙烯酰胺己烷( h a ) 。利用这些交联剂与几种小胺( 包括 h i s ) 交联成聚合物，这类聚合物与d n a 形成复合物的纳米颗粒小于2 0 0 r i m ，z e t a 电位 大于+ 2 0 m v ，复合物在中性条件下相当稳定。这些聚酰胺酯的缓冲能力的p h 在7 4 5 1 ， 要高于p e i 。以c o s 7 细胞为转染对象，转染效率比b p e l 2 5 l a 高出很多，且细胞毒性 很小【6 2 】。 p a n 等人利用n n 二丙烯酰胺十二烷( d d a ) 通过迈克尔加成反应交联了小胺n 氨乙基哌嗪( a e p z ) 和4 氨甲基哌啶( 舢帅d ) ，并用聚氧乙稀( p e o ) 封端仲胺，通过 改变比例得到不同支化度的仲胺封端的聚合物。这种球状聚合物的纳米颗粒直径大约在 9 5 r i m 左右【6 3 】。有望应用于细胞转染实验中。 1 3 2 醇类衍生物交联剂 醇羟基和胺不直接发生反应，必须通过活化羟基或引入其他官能团才能与p e i 的胺 基反应。以醇羟基为官能团，可通过在醇分子中引入环氧键【6 叼、异氰酸酯【6 5 】或羧酸类、 烯烃【6 6 ，6 刀以及磷酸化等活性高的官能团和p e i 的胺反应而交联。也可通过羟基活化剂来 实现，这类活化剂通常包括溴化腈、有机磺酰氯【6 8 】( 对甲苯磺酰氯( p t s c ) 、对硝基苯 甲酰氯( p n s c ) 、三氟乙酰磺酰氯等) 、n ，n 羰基二咪唑( c d 4 ) 6 9 l 、n 羟基琥珀酰亚 胺酯( n h s ) 、二乙烯基砜( d v s ) 等等。有关糖( 碳水化合物) 的伯羟基活化详见糖 小节。本小节不再累赘。 g u p t a 等人以p e g 为底物，分别用对硝基苯甲酰氯法和磷酸化法合成了两类交联剂 p e g - - - ( 对硝基苯甲酸酯) 和p e g - - - ( 磷酸酯) ，并分别与p e l 7 5 0 k d a 交联和成了两类聚 合物基因载体 7 0 l ，这种p e g 化的聚合物的细胞毒性非常小并且随着p e g 化的程度越大， 生物相容性越好。以c o s 1 细胞( 非洲绿猴s v 4 0 转化的肾细胞) 为转染对象，研究发 现p e g 化的p e i 聚合物的转染效率比p e i 本身高出了5 1 6 倍。 1 3 3 醛类及其衍生物交联剂 醛和胺的反应条件比较苛刻，必须在无水条件下反应。反应原料和溶剂都必须经过 无水处理。 y o u n g 等人利用戊二醛作交联剂交联p e l l 8 k d a 的聚合物作为生物可降解的基因载 体。这种聚合物中间的连接臂是对酸很不稳定的亚胺键，这种对酸不稳定的聚合物在p h 为4 5 时降解的半周期为1 1 小时，在p h 为7 4 时降解的半周期为1 1 8 小时。降解后的 小分子无细胞毒性。在凝胶阻滞实验中，质粒d n a 在n p 比为3 ：1 时完全包裹。聚合 物的z e t a 电位在4 6 1 - 5 0 9 之间，粒径大小在1 3 1 8 一- 1 6 4 6 之间，细胞转染实验显示这 种聚合物的转染效率与b p e l 2 5 k d a 不分上下，而细胞毒性却比它小得岁7 。双醛类交联 剂也可作为潜在的非病毒基因载体。 7 l 绪论 硕士学位论文 1 3 4 酯类交联剂 主要介绍羧酸酯衍生物和异氰酸酯类两种交联剂。这种通过酯键在生理条件下降解 的交联剂是研究的热点。 1 3 4 1 羧酸酯类及其衍生物交联剂 因羧酸类交联剂与p e i 的胺反应后生成的酰胺键能在生物体内降解而广泛关注，近一 来研究较多。羧酸和胺很难直接发生反应，考虑到p e i 上的氨基数目太多，采用提高羧 基的活性达到和胺反应的目的。一种是使酸生成羧酸酯类，羧酸酯和胺的反应比酸要高。 一种是活化羧基，常用的活化羧基的试剂有d c c ( 二环己基碳二亚胺) 法，e d c ( 1 己基3 ( 3 二甲基氨丙基) 碳二亚胺) 法，n h s ( n 羟基琥珀酰亚胺酯) 法和c d i ( n ，n 羰基二咪唑法) 以及酰氯化等。h s i u e 等人将聚l 哥l 酸和叶酸修饰到p e i 上就是利用了 d c c 活化羧基的方法1 7 2 1 。 n g u y e n 等人将5 k d a 和8 k d a 甲氧基封端的聚乙二醇的端羟基用n ，n 羰基二咪唑 活化后，分别修饰到2 k d a p e i 和2 5 k d a p e i 上，发现这类聚合物与质粒d n a 形成的复 合物能均匀分散到水溶液中，其粒径大小从7 0 n m - - - 2 0 0 n m 不等，然而在c o s 7 细胞中 的转染效率却远不如p e l 2 5 k d a 和其它商业转染试剂。相反，利用n ，n 羰基二咪唑活化 后的聚醚系列( p l u r o n i e l 2 3 ) 修饰到p e l 2 k d a 上的聚合物却显示了比2 5 k d a p e i 更高的 转染效率，聚醚修饰的p e i 聚合物与质粒d n a 形成的复合物粒径大小在1 1 0 n m 左右， 而且，将这种复合物注入小鼠体内2 4 小时后，发现其在小鼠的脾、心脏、肺和肝脏等 部位仍有转染效率【7 引。 k i m 等人用n h s 活化羧基化的p e g 的两个羧基得到了聚乙二醇二( 琥珀酰亚胺丁 二酸酯) ，该交联剂和小分子量的p e i 交联得到阳离子聚合物基因载体i | 7 4 1 。研究发现亲 水性p e g 链的引入提高了聚合物的水溶性，降低了细胞毒性。以2 9 3 t 细胞为转染对象， 通过严格控制聚合物的分子量，转染效率在p e l 2 5 k d a 的基础上有很大提高。 k l i b a n o v 等人用n h s 活化的辛二酸和乙二醇二丁酸合成了琥珀酰亚胺辛二酸酯 ( d s s ) 和乙二醇二( 琥珀酰亚胺丁二酸酯) ( e g s ) ，分别交联了小分子量的1 p e l 4 0 0 d a 和b p e l 5 5 0 d a 以及两者的混合物( w w = l ：1 ) ，以c o s 7 细胞为转染对象，这些聚阳离 子基因载体的转染效率都超过了b p e l 2 5 k d a ，且大部分都超过了b p e l 2 5 k d a 的两倍，与 d n a 形成的纳米颗粒复合物的粒径大约在3 0 0 n m 左右，并基本无细胞毒性网。 1 3 4 2 异氰酸酯类交联剂 异氰酸酯类交联剂用的较多的是作为连结臂将p e g 修饰到p e i 上，m i c h a e l 等人将 2 0 k d a 和3 0 k d a 的c h 3 0 - p e g - n h 2 用六亚甲基二异氰酸酯( h d i ) 活化，将活化后的p e g 接到p e i 的胺基上，实验证实，与b p e l 2 5 k d a 作为基因载体相比，该聚合物大大降低了 细胞毒性，粒径也小于2 0 0 n m ( b p e l 2 5 k d a ) ，显示出了良好的与d n a 凝聚和配位作用， 最高转染效率比p e l 2 5 k d a 提高了l o 倍左右，溶血活性明显降低【7 6 1 。 g 硕士学位论文可体内降解的新型交联聚乙烯亚胺的设计、合成及性能研究 异氰酸酯的反应活性很高，能够和醇、胺等反应。异氰酸酯和p e i 胺基的反应必须 在无水条件下进行，原料必须经过无水处理，溶剂也要现蒸现用，生成的脲基可以在生理 条件下水解。 六亚甲基二异氰酸酯( h d i ) 本身就是一种交联剂，可与p e i 交联用于基因载体。 同样其它二异氰酸酯( 异佛尔酮二异氰酸酯，i p d i ) 也可作为潜在的交联剂，有关异氰 酸酯改造羟基糖作为交联剂将在糖小节做说明。 1 3 5 环氧类交联剂 环氧类交联剂是利用环氧键与伯胺基反应，环氧键打开生成羟基而实现交联的，共 聚产物中的羟基也可增加聚合物的水溶性。但环氧与胺反应的活性比双键要高的多，如 果控制不好，会在单时间内固化而水溶性极差。一般将p e i 和环氧交联剂配成极稀的溶 液，将交联剂溶液慢速滴加进p e i 溶液。 有些交联剂可以从商业中得到。比如甲基丙烯酸缩水甘油酯( g m a ) 、1 , 4 丁二醇 缩水甘油醚( b d d g e ) 、异氰酸三缩水甘油脂( t g i c ) 等等。环氧类交联剂也可以从其 他原料合成。二醇和环氧氯丙烷在碱的作用下生成缩水甘油醚，最典型就是不同链长度 聚l - - 醇缩水甘油醚【_ 7 丌。二酸和环氧氯丙烷在碱和相转移催化剂的作用下生成缩水甘油 酯，见文献报道的有己二酸缩水甘油酯【7 8 1 和癸二酸缩水甘油酯1 7 9 1 。二酯在重金属盐的催 化下和缩水甘油反应生成缩水甘油酯，见文献报道的有己二酸缩水甘油醚 s 0 1 和对苯二甲 酸缩水甘油酯【s 。上面的方法都难以到达选择性环氧化，产物难以控制在单环氧化的阶 段。 双丙烯酸酯类或双丙烯酰胺类交联剂的双键可以通过过氧酸将双键氧化成环氧化 合物，这些过氧酸常见的有过氧乙酸、双氧水、过硫酸氢钾和间氯过氧苯甲酸。前三种 环氧化的产物基本上没有选择性，即有单环氧化产物也有双环氧化产物，柱层析可以将 它们分离开。间氯过氧苯甲酸是一种很好的环氧化试剂，通过控制底物和间氯过氧苯甲 酸的投量比可以达到很好的选择性。 董伟等人利用甲基丙烯酸缩水甘油酯( g m a ) 作为交联剂，二氯甲烷作溶剂，交 联b p e l 2 k d a 和b p e l 8 0 0 d a ，在4 5 0 c 的摇床里反应4 到6 个小时，产物经透析、冻干后 用于胍k 2 9 3 细胞转染效率达到了8 1 ( g f p ) ，并且通过g m a 酯键的降解大幅度降 低了细胞毒性【s 2 j 。甲基丙烯酸缩水甘油酯的一端是双键，另一端是环氧键，通过董伟的 工作可以看出双键和胺的反应条件与环氧键和胺的反应条件不相冲突。 s w a m i 等人将交联剂l ，4 丁二醇缩水甘油醚和p e i 配成极稀的水溶液，在4 5 0 c 下 将交联剂水溶液慢速滴加进p e i 水溶液并维持4 5 0 c 反应1 6 小时，冻干后的产物在h e k 细胞转染效率达到了7 0 ( g f p ) ，同时测得粒径大小为6 9 - - 7 7 n m ，z e t a 电位大约在3 5 - - 4 0 m v 之间m 】。但是这类聚合物的降解性差，从而导致了较高的细胞毒性。 9 l 绪论硕士学位论文 1 3 6 含s s 交联剂 二硫键是一种共价键，多数蛋白质都具有二硫键。二硫键的形成使蛋白肽链的空间 结构更为紧密。体内含有巯基的功能蛋白主要是通过巯基与二硫键的相互转化而实现 的。在体内自然状态下，二硫键与巯基的相互转化主要是通过巯基- - 硫键氧化还原酶 而实现的。二硫键在体内生理条件下可发生降解作用。 纵观文献，含s s 键的聚合物的合成大致分为两类，一是将巯基修饰到p e i 上，再 通过氧化巯基成二硫键而交联成高分子的聚合物载体。另一种则是交联剂本身含有二硫 键，而通过别的官能团和p e i 或小胺实现交联，这种交联剂大致有三种：3 , 3 - - 硫代丙 酸双( n 羟基琥珀酰亚胺) 酯( d s p ) 、二甲基3 ，3 - - - 硫代双( 丙亚氨酸酯) 二氯化氢 ( d t b p ) 、n n 叔丁氧羰基l 胱氨酸( b c ) 和n ，n 7 二丙烯酰基胱胺( c b a ) 。后一种 方法占主导地位。 y a nl e e 等人以巯基修饰两端的线型p e i 为原料，经过多步反应合成出两端巯基修 饰的线型p e i ，经氧化剂氧化合成出通过s s 桥接的聚合物载体i s 4 。其细胞转染效率和 p e l 2 5 k