（化学工艺专业论文）硫酸软骨素提取条件优化研究.pdf

郑州人学硕士学位论文 摘要 硫酸软骨素( c h o n d r i t i ns u l f a t e ) 多分布于软骨、鼻骨、喉骨、韧带、肌膜中， 鱼类软骨中含量很丰富。c s 临床上主要用于治疗神经痛、关节炎、耳鸣以及促进 溃疡愈合和防止高血脂症等。随着其生理功能及生化性质的深入研究，发现它具 有凝血和防止血管硬化等功效，对冠心病、心肌梗塞等心血管病的防治有较好的 疗效，还对神经细胞、粘膜细胞、肾细胞等具有保护作用；c s 还可与某些物质调 制成化妆品用于保护皮肤的健美。 本研究试验的内容是：以鸡胸软骨为原料，选取硫酸软骨素的最佳生产工艺 条件。硫酸软骨素的生产方法主要有以下几种：( 一) 中性盐法；( 二) 碱提取法； ( 三) 酶提取法；( 四) 超声波法；( 五) 乙酸抽提法。单纯的碱提取废液污染环 境严重，而单一的酶解提取成本较高。本文选用碱解一酶解相结合的方法进行实 验研究。如何节省原料，减少环境污染，提高硫酸软骨素的产品产量和质量是本 研究的关键。 硫酸软骨素与蛋白质等成分结合在一起，用碱提取有利于破坏硫酸软骨素与 蛋白质之间的共价键使硫酸软骨素释放出来，所以碱提取过程是提高硫酸软骨素 收率的关键。酶水解过程是提高硫酸软骨素产品纯度的关键，蛋白质是硫酸软骨 素中最主要的杂质之，通过酶解处理使溶液中及硫酸软骨素长链上的蛋白进一一 步得到水解破坏，形成为可溶性小分子肽、氨基酸等物质。由于一次酶解，氮含 量很难达到要求，所以采用双酶进行酶解。所做的试验结果如下： ( i ) 、在碱解部分，本研究选取料液比( 软骨质量与碱液体积之比) 、碱液浓度、 反应温度、滤液的p h 值、反应时间等因素进行正交实验，以硫酸软骨素产率为考 察对象，对影响产率的因素进行考察，确定出了主要的考察因素为料液比、反应 温度和碱液浓度。并在此基础上对这些主要的影响因素进行了单因素优化实验， 得出了产率最高的工艺条件。实验结果表明：料液比为1 ：6 7 5 ，反应温度为4 0 ， 碱液浓度为6 时，硫酸软骨素的产率最高，可达2 0 6 7 。 ( i i ) 、在酶解部分，本文选取胰蛋白酶和胃蛋白酶两种酶进行水解反应。本研究 选取料液比，水解温度，p h 值和水解时间等因素进行正交实验，以硫酸软骨素纯 郑州大学硕士学位论文 度为考察对象，确定了主要的考察因素，对影响纯度的因素进行了探讨，并在此 基础上对这些主要影响因素进行了单因素优化实验，得出了硫酸软骨素纯度最高 的工艺条件：胰蛋白酶在p h 值为8 3 ，料液比为1 0 0 0 ：o 9 ，水解温度为4 6 ；胃 蛋白酶在p h 值为5 9 ，水解时间为1 小时4 0 分钟，料液比为1 0 0 0 ：1 1 ，水解温度 为4 0 ，所得硫酸软骨素的纯度最高，可以达到8 5 6 5 。 ( i i i ) 、各个影响因素对含氨量均有影响，通过试验可以得到：硫酸软骨素的纯度 越高，氮含量越高。本试验所得硫酸软骨素的最高纯度为8 5 6 5 ，含氮量为3 2 6 ， 符合国家标准。 关键词：硫酸软骨素；正交试验：单因素优化试验 i i 郑州大学硕士学位论文 a b s t r a c t c h o n d m i t i ns u l f 缸ei st h eb a s i so fc o n n e c t i v et i s s u eo ft h em a i 啪a l i a l l ，i tm o s t l y d i s t r i b u t e sc a n i l a g e ，n o s e ，m r o a t ，l i g 锄e n ta 1 1 dm y o l e m m a ，e s p e c i a l yf i s hc a r t i l a g e c s i sm o s t l yu s e dt ot r e a tn e u r a l g i a ，枷t i s ，t i 皿i t u s ，a l o n gw i t ha c c e l e r a t i n gc a l l k e r c i c a m s a t i o na n dp r c v e n t i n gh y p e r l i p e m i a w i m1 u c u b r a t i n gp h y s i 0 1 0 9 i c a la c t i o na n d b i o c h e m i c a lc h a r a c t e ro fc s ，t h ee f f e c to fc u r o ra n dp r e v e r n i n gv e i nh a r d e ni sa l s o f o u n d t h e r ei sp r e f c r a b l ec u r a t i v ee 疵c tf o rt h ep r e v e n t i n go fc o r o n a r yh e a nd i s e a s e 柚dm y o c a r d i a li n f h r c t i o n c sc a np m t e c tn e n ，ec e l l ，舢c o s a lc e l l ，k i n d e yc e l l c si s a l s oe x e c u t e dt o i l e t r ym i x e dw i t hs o m e t l l i n gt op r o t c c tc u t a n e o u sb e a u t y c h i c k e nb r c a s ti su s e da st e s 廿n gm a t e r i a lt oc h o o s et h eb e s tp i c k - u pt e c 王l i m i c so f c si nt h es t u d y c sa r ee x 订a c t e db yu s i n gn e u 臼嘲s a l te x t r a c t i o n ，a l k a l ie x t r a c t i o n ， e i l z y r n ee x 廿a 以o n ，u i t r a s o i l i ce x t r a c t i o na i l d a c e t i ca c i de x t r a c t i o n s i n g l e a l k a l i e x t r a c t i o nm a k e ss e r i o u sp o l l u t i o n t h ec o s to fs i n g l ec n 巧m ee x t r a c t i o ni sh i 曲t h e m e t h o do fd i l u t ea l k a l i - e n 巧m eh y d r 0 1 y s i si su s e di nm et e s t t h ek e yo ft h es t u d yi s h o wt os a v em a t c r i a l s ，r e d u c ee n v i r o m e mp o i l u t i o na n di m p r o v et h ey i e l da i l dq u a l i t y o f c s a sc sb a t l dw i t hp r o t e i n ，a l k a l ie x t r a c t i o ni sp r o p i t i o u st od e s t o t yc o v a l e mb o n d 眦o n gc sa n dp r o t e 血t or e k a s ec s t h ep r o c e s so fa l k a l ih y d r o l y s i si st h ek e yo f e x 廿a c t i n gc s t h ep r o c e s so fe m z y m eh y d r o l y z ei sm em a i nt e c h n o l o g yo fi m p r o v i n g p m d u c t i o np u r i t yp r o t e i ni so n eo ft h em o s ti m p o t a l l te x 呦e o u sc o m p o n t e n t so fc s t h r o u 曲e m z y m eh y 出o l y z e ，p r o t e 抽o ft h e1 0 n gc h a i n 锄o n gl i q u o ra n dc si sm o r e d e s t 嘶e da n db e c o m e ss o l u b l es m a l lm o l e c u l e ，s u c ha sp e p t i d e ，锄i n oa c i d a si ti s d i m c u l tt or e a c ht h es t a n d a r db yu s i n go n ek i n do fe m z y m e ，t 1 1 es t u d yu s e st w ok i n d s o fe m z y r n eh y d r o l y s i s t h er e s u l ti sa sf o l l o w s ： ( i ) ：i nt h ep r o c e s so fa l k a l ih y d r o l y s i ss o m ef 犯t o r si n n u e n c et h ee 丘b c to ft h e p r o d u c t i o ny i e l di n c l u d i n gr a t i oo fc a n i l a g eq u a l n ya i l dl y el i q u o r ，l y ec o n s i s t e n c y ， r e a c t i o nt e m p e r a t u r c ，p h ，r e a c t i o nt i m e ，h a v eb e e ni n v e s t i g a t e da n ds c r e e n e do u t t h e f a c t o r si n n u e n c i n g 廿1 ee f r e c to ft h ep m d u c t i o ny i e l db 8 v eb e e ni n v e s t i g a t e dm m u 曲 i i i 郑卅i 大学硕士学位论文 o n l l o g o n a lt e s t s r a t i oo f c a r t i l a g eq u a l i 哆，r e a c t i o nt e m p e r a t u r e 锄dl y ec o n s i s t e n c y a r e d e c i d e dt ob et h em 匈o ri n n u e n c i n gf a c t o r s b a s e do nt h es t l 】d i e s ，m eb e s tp r o c e s s c o n d i t i o n sh a v eb e e ng a i n e da f l e rs i n g i ef 如t o ro p t i m i z i n gt e s t so f t h ei m p o r t a n tf 如t o r s t h eo p t i m i z a t i o nt e c m d l o g yc o n d i t i o na r ea sf o l l o w s ：r a t i oo fc a r t i l a g eq u a l i t ya n dl y e l i q u o r1 ：6 7 5 ，r e a c t i o nt e m p e r a t u r e4 0 ，l y ec o n s i s t e n c y6 ，p r o d u c t i o ny i e l da c l l i e v e s m o r et h a n2 0 6 7 ( i i ) i nt 1 1 ep m c e s so fe m z y m eh y 山d 1 y s i s ，t l l es t i l d yu s e sp a l l c r e a sp m t e i n a s ea n d s t o m a c hp r o t e i n a s et oh y d | o l y z e s o m ef 沁t o r si 1 u e n c i n go nt h ep r o d u c t i o np l l r j t y i n c l u d i n gr a t i oo ff i l t e rl i q u o ra n de 1 1 1 z y m e ，h y d m l y s i st e 珈【p c r a t l l r e ，p h ，h y d r o l y s i s t i m e ，h a v eb e e n 抽v e s t i g a t e da 1 1 ds c r e e n e do u t t h eb e s tp r o c e s sc o n d i t i o n sh a v eb e e n g a i n e da r e rs 抽g l ef a c t o ro p t i m i z i n gt e s t so fm ei m p o r t a n tf k t o r s ，t 1 1 eo p 佃n i z a t i o n t e c l l n o l o g yc o n d i t i o n sa r ea sf o u o w s ： p a n c r e a sp r o t e i n a s e ：p h8 3 ，r a t i oo fm c e r1 i q u o ra 1 1 de m z y m e1 0 0 0 ：0 9 ，h y d r o l y s i s t e m p e r a t u r e4 6 s t o m a c hp r o t e i n a s e ：p h5 9 ，h y d r o l y s i st i m e1 0 0 m i n u t i e s ，r a t i oo f f i n e rl i q u o ra n de n l z y m e1 0 0 0 ：1 1 ，h y d r o l y s i st e m p e r a t u r e4 0 ，p r o d u c t i o np u r i t y a c h i e v e s8 5 6 5 ( i ) t h ec o n t e mo fn i 廿o g e ni sm f l u e n c e db ye v e r yf 如t o lt h er e s u l ts h o wt h eh i 曲e r p r o d u c t i o np u r i 坝廿1 e l o w e rl l i 虮唱e nc o n t e m p r o d u c t i o na c c o r d sw i mn a t i o n a l 删a r d s ，i t sp u r i t yi s8 5 6 5 ，n i d g c nc o n t e n t3 2 6 k e yw o r d s ：c h o n d r o i t i ns u l f a t e ；o m l o g o n a lt e s t ；s i n g l ef 撕c o ro p t i m i z i gt e s t 郑重声明 本人的学位论文是在导师指导下独立撰写并完成的，学位论文没有剽窃、抄 袭等违反学术道德学术规范的侵权行为，否则，本人愿意承担由此产生的一切法 律责任和法律后果，特此郑重声明。 学位论文作者( 签名) ： 际勿衍 2 0 0 6 年，月a 相 郑州大学硕士学位论文 前言 我国是一个农业大国，畜牧业发达。猪、牛、羊及其它动物的饲养量和屠 宰量都居世界f j 列，动物的软骨和气管很多都被遗弃，造成了极大的浪费。动物 的软骨和气管中都富含硫酸软骨素，所以生产硫酸软骨素的原料广泛。据调查， 我国有为数不少的厂家在生产硫酸软骨素，其中多数是粗制品，少数精制品出口 到国外。从经济效益上看，生产精制品比粗制品的效益高，特别是出口产品效益 更高。与此同时，由于疯牛病，欧美的硫酸软骨素市场很大一部分转移到了中国， 出口需求进一步增加。但硫酸软骨素的出口要求非常严格，像美国等需求量较大 的国家自己拥有认定的检测方法，而国内许多厂家的产品达不到要求，主要是产 品质量问题，造成有市场但无效益的局面。 从技术上讲，硫酸软骨素的提取方法有很多种，如高温高压法、中性盐法、 碱提取法、酶提取法等。但是合乎出口要求的产品不多，主要是生产硫酸软骨素 的原料多种多样，现行的工艺还比较粗糙，缺乏针对性。本文采用一种全新的提 取方法：碱解一酶解相结合的方法提取硫酸软骨素，以鸡胸软骨为原料，通过实 验研究得到较为适用的技术路线，为生产高质量产品提供了理论依据。 郑州大学硕士学位论文 1 文献综述 1 1 硫酸软骨素的性质和作用 1 1 _ 1 硫酸软骨素的性质 硫酸软骨素( c h o n d 嘶ns u l f a t c ) 别名牛磺软骨素、康得宁等，是哺乳动物 结缔组织的主要成分之一，多分布于软骨、鼻骨、喉骨、韧带、肌膜中，鱼类软 骨中含量很丰富，如鲨鱼骨含5 0 6 0 ，结缔组织含量很少。空腔动物、海绵 动物、原生动物也含有，植物中几乎没有。软骨中的硫酸软骨素与蛋白质结合， 以蛋白多糖的形式存在，属糖氨聚糖类物质，系一种酸性粘多糖，其钠盐为白色 无定形吸湿粉未，无臭无味，易溶于水，其水溶液呈粘稠性；可与阳离子形成多 种金属盐而发生沉淀【1 ；难溶于甲醇、乙醇、乙醚、丙醇、丙酮和冰醋酸等有机 溶剂。硫酸软骨素遇热不稳定，乙酰基易发生水解脱落，在酸性条件下更易水解 成不同聚合度的低聚糖【2 】。硫酸软骨素系一种生化产品，迄今为止尚无法人工合 成。 硫酸软骨素约含有5 0 7 0 个双糖基本结构，分子量约为1 0 0 0 0 5 0 0 0 0 。按 其化学组成和结构，可分为c s a 、c 、d 、e 、f 、h 等多种同分异构体，药用硫 酸软骨素是从动物软骨中提取的，主要是a 、c 及各种硫酸软骨素的混合物。c h a 和c h c 均由d - 氨基葡萄糖醛酸和n 乙酰一d 氨基半乳糖组成，只是硫酸基团位 置不刚3 1 。硫酸软骨素a 在哺乳动物的软骨中含量很高，它也是机体其他组织的 自然组成部分，硫酸软骨素a 是一种没有分支的一系列不同长度的聚阴离子多 糖链，由己糖醛酸和己糖胺通过p 1 - 3 和b 1 4 交替相连而成h 。而硫酸软骨素c 则 主要存在于鱼类的软骨中。天然状态的硫酸软骨素分子量为2 6 0 0 0 ，由于制各方 法不同，所得产品的平均分子量也不同。一般碱水解提取法所得产品的平均分子 量偏低，而酶解或盐解法所得产品的分子量较高，分子结构较完整。其分子式如 下图所示1 5 j ： 郑州大学硕士学位论文 悸刮_ 恽。国j 硫酸软骨素还具有以下化学性质吲： ( 1 ) 水解反应硫酸软骨素可被浓硫酸降解成小分子组分，并被硫酸化，降解 的程度和硫酸化的程度随着温度的升高而增加，在3 0 5 0 温度下，2 h 可使平 均分子量h 血降至3 0 0 0 4 0 0 0 。硫酸软骨素也可以在稀盐酸溶液中水解而成为 小分子产物，温度越高水解速率越快。 ( 2 ) 酯化反应硫酸软骨素分子中的游离羟基可以被酯化，而生成多硫酸衍生 物。 ( 3 ) 中和反应硫酸软骨素呈酸性，其聚阴离子能与多种阳离子生成盐。这些 阳离子包括金属离子和有机阳离子如碱性染料甲苯胺蓝等，可以利用此性质对它 进行纯化，如用阴离子交换树脂纯化等。 1 1 2 硫酸软骨素的用途 c s 临床上主要用于治疗神经痛、关节炎、耳鸣以及促进溃疡愈合和防止高 血脂症等。随着其生理功能及生化性质的深入研究，发现它具有凝血和防止血管 硬化等活性，对冠心病、心肌梗塞等心血管病的防治有较好的疗效，对神经细胞、 肾细胞等具有保护作用，因此在国外是很流行的保健品添加剂。还对神经细胞、 粘膜细胞、肾细胞等具有保护作用；c s 还可活化脂解酶，使脂肪降解，因此是防 止肥胖的有效物质；c s 还具有保水性、保胶性和高粘性，可与某些物质调制成 化妆品用于保护皮肤的健美。我国出口到日本、韩国的c s 都被用作食品添加剂【7 】。 硫酸软骨素与铜等金属离子结合可用于治疗皮肤病，与硝酸铋或氢氧化钠反应得 到的络合物可用于治疗消化性溃疡，与苯甲酸酯、利多卡因或布比卡因作用生成 的衍生物可广泛用于外科手术的麻醉剂，对正常的血液循环无影响，比单一用局 部麻醉剂更稳定，麻醉作用时间更持久 ”。硫酸软骨素是结缔组织中天然存在的 成分，能够结合水分子用于润滑和支撑关节，使关节活动自如，减轻关节疼痛， 郑州大学硕士学位论文 在短期内服用没有明显的副作用【9 j 。 樊洪等口0 】的试验结果表明低浓度的硫酸软骨素a 在一定程度上能促进成骨 细胞的增殖，高浓度的硫酸软骨素a 对成骨细胞有轻度抑制作用。已有大量的 试验依据表明硫酸软骨素具有软骨保护作用 1 1 1 2 1 。林熹等的研究结果表明具有 软骨保护作用的硫酸软骨素不会促进软骨细胞的过度增殖。 硫酸软骨素a 不但在热力学过程中有利于提高溶液中c a 2 _ 存在的浓度，而 且能诱导一水草酸钙( c o m ) 晶体的( 1 0 1 ) 晶面优先生长，并抑制c 0 m 的二 维生长和聚焦【1 4 】。h u r 此r 掣1 5 1 也测量了c s 结合c a 2 十的能力，发现c s 与c a 2 + 的结合力很微弱，但有很大的结合量( 一个二糖单位约粘附o 7 个c a 2 + ) 。 t e n e n b a 啪等【l6 j 还研究了c s 对细胞介导的体外钙化的影响。国内制备肝损伤模 型化合物d 安及半乳糖也多以c s 为原料【1 7 】。 ( 1 ) 硫酸软骨素与药品 2 0 0 2 年国家卫生部颁布了硫酸软骨素原料以及其注射液、滴眼液、硫酸软骨 素a 钠原料及其胶囊的国家药品标准。硫酸软骨素注射液用于神经性头疼、神 经痛、关节痛、动脉硬化等疾病的辅助治疗；硫酸软骨素滴眼液用于治疗角膜炎、 角膜溃疡、角膜损伤；硫酸软骨素a 钠胶囊作为调节血脂药物用于治疗动脉粥 样硬化疾病，主要用于调节血脂。 硫酸软骨素具有促进创面愈合和防粘结的作用。将硫酸软骨素制成膜剂，还 可有效洽疗口腔黏膜溃疡。一项随机双盲临床试验提示局部应用氨基葡糖和硫酸 软骨素可有效解除骨关节患者的疼痛。相关制剂有待于进一步开发。 ( 2 ) 硫酸软骨素与保健食品 美国药典2 6 版n f 2 1 1 8 】收载了硫酸软骨素原料及氨基葡糖与硫酸软骨的复合 片剂。在国外上市的以硫酸软骨素或氨基葡糖和硫酸软骨素为主要成分的制剂很 多，如c b 彻d r o i t i j ls u l p h a i e ，o s t e oj o i n tc a r e ，m o r ef r c e r n u 订a i o i n 芦，a r t 敝t m 等，作为膳食补充剂用于保护关节。具体见表1 一l 。 4 郑卅大学硕上学位论文 表1 一l 国外上市的几种硫酸软骨素产品的情况 近年来，c s 大量出口美国或欧洲，已成为出口量最大的生化医药产品之一， 年出口量约2 0 0 0 吨。今后应不断开拓国际市场，扩大其应用范围，发挥其在心 脑血管方面缓和、无副作用的特点，以及在骨关节疾病方面的潜力，扩大国内用 量。同时，不断改进生产工艺和分析检验方法，适应国内外对原料和制剂的要求， 提高出口产品的质量和价格。 综上所述，硫酸软骨素在药品和保健食品方面有广阔的应用和研究价值。 1 2 硫酸软骨素的提取方法 硫酸软骨素属于酸性粘多糖，目前酸性粘多糖的提取方法主要有降解法和 非降解法。非降解法仅用于非蛋白多糖的粘多糖透明质酸。而降解法适用于包 括透明质酸在内的所有酸性粘多糖。硫酸软骨素的提取采用降解法。降解法又包 括碱提取法和蛋白酶提取法两种。硫酸软骨素的提取方法有很多，归纳起来，主 要有以下几种： 塑坐! 查堂堡主兰焦笙塞 l _ 2 1 中性盐法 先用1 0 氯化钙提取，氯仿一戊醇( 1 ：4 ) 除去蛋白质，2 倍量乙醇沉淀，最 后以l 1 0 y d 试剂精制。而以透析法除杂质、氯化六氨合钴纯化，或一磷钨酸纯化， 均可使工艺简化。以3 0 氯化钾或3 0 氯化钾加1 碳酸钾提取，高岭土吸附除 去杂蛋白，可提高产品收率。 该方法提取的产品较白，各项指标符合国家标准，也不会造成环境污染， 但是产率较低，造成原材料的大量浪费，对经济效益有一定的影响。 1 2 2 碱提取法 ( i ) 浓碱提取工艺 软骨碎片堡塑掣翳衰鬯暴堕盟浸提液笪噜篇警滤液堕器慧要蒸罄蚤半 酶解液适丝急芒铲滤液旦学沉淀蔫产品 ( ) 稀碱提取工艺 软骨碎片号葛荠警纛掣浸提液堇坠铲滤液堕篙慧焉嚣罂筹 酶解液笪擎滤液旦坠型墅立堕遑滤液堕豸辎瓣沉淀 巡滤液幽沉淀靠产品 ( ) 稀碱稀盐提取工艺 软骨碎片堕墅塑哗塾箬署篆黔等慕幽浸提液堕醒盟遁量幽兰垒2 旦堡塑：! 酶解液竖雩强著紫滤液旦巡沉淀物竺挚滤液旦燮沉淀 物杀警产品 ( ) 稀碱浓盐据取t 萝 软 骨碎 片型型鼗拦氅簧嚣骝翕手鹭墨掣浸 提液 迎型赴秀妻蠢篙三意竽盐解液堂皆滤液奠誉紊碧瓣 8 5 9 0 。c ，2 0 一4 0 m i n盐蔺竿敝可忑f i l _ 一滤液百薛丙面磊万一 郑州大学硕士学位论文 沉淀物且皆滤液旦铲沉淀物蓑摹产品 以上四种工艺路线 2 1 制得的硫酸软骨素含量和氨含量都符合原料药的要求。 但是，这四种路线都存在有缺陷。采用稀碱温和条件下制备的样品溶液混浊，且 时间长，污染严重，其原因在于该条件下软骨中的胶原蛋白、粘蛋白等不能完全水 解而且它在中性盐和弱酸溶液中是可溶的，在溶液中不易被除去。经乙醇沉淀所 制得的产品含变性蛋白，+ 旦溶于水后就出现混浊，产品中小分子杂质如多肽等也 随同聚合物沉淀，影响产品纯度。最主要的是，这些工艺的生产周期都太长，极 大的限制了工厂的生产效益和经济效益。 1 2 3 酶提取法 ( 1 ) 稀碱一酶解提取法： 邹开朗【19 】等提出稀碱与酶解相结合法生产硫酸软骨素。先将软骨在8 0 煮 4 6 h ，然后按原料( 干重) 与2 n a 0 h 的比例为1 ：6 。2 5 的量加入n a o h ，室温 提取1 5 h ，然后用h c l 调p h 到6 6 5 ，双层纱布过滤：留下滤液，滤渣再以 l ：o 1 2 的比例加入2 的n a o h ，于4 0 下提取l h ，再用双层滤布过滤；弃滤 渣，取滤液。合并2 次滤液，并测量体积待用。滤液调节p h 到8 0 9 o ，按滤 液与胰酶1 0 0 0 ：o 5 的比例加入胰酶，于4 0 5 0 水解l h 后，再按1 0 0 0 ：0 5 的比 例加入胃蛋白酶，4 0 5 0 水解1 5 h 。过滤后加入高岭土和活性炭吸附。用氯仿 反萃取法萃取滤液，留水层。调水层p h 至6 8 7 2 ，再加入2 5 倍体积的9 5 以上乙醇沉淀，即得硫酸软骨索。该工艺每2 蚝原料可获1 1 8 1 2 5 9 ( 最高可达1 3 0 g ) 硫酸软骨素。葡萄糖醛酸含量达3 5 以上( 2 4 以上即达部颁标准，可用于制药， 3 0 以上可出口) 。因此按本工艺制得的产品可达优级纯。该工艺用氯仿反革取 的方法纯化硫酸软骨素，与其他提取方法相比较，缩短了一半工艺流程，同时提 高了纯度和提取率，又减轻了碱法提取所带来的环境污染。 l 蟾n o t b 等在干软骨与水的料液比为9 ：1 0 0 ( 耐v ) 的体系中加入2 魄酶制剂 ( l y p a i n e 酶) ，酶解条件为p h 3 5 、温度6 5 、酶解3 h ，可得到纯度为3 l 的硫酸软 骨素。马淑涛 2 0 j 等将冷冻的新鲜猪喉骨用稀碱溶液提取后，使用原料量的o 1 5 的胰酶在p h 为8 5 9 o 、温度为5 0 的条件下进行酶解，得到含氮量仅为3 1 6 的提取物。奚俊1 2 1 】等采用稀碱法提取家畜的鼻骨和气管中的硫酸软骨素，按原料 7 郑州大学硕士学位论文 量的0 0 5 加入胰酶和木瓜蛋白酶，当酶解温度为4 0 5 0 、p h 分别为8 o 8 5 和 5 7 6 1 时。可得到含氮量仅为3 5 的提取物。 ( 2 ) 浓碱一复合酶酶解提取法 该方法的实验流程与稀碱酶解法基本一样，只是在碱解这一步增大了碱的浓 度。高华f 2 2 1 等应用该法生产了硫酸软骨索，研究得出优化的试验条件。碱提取的 最佳条件是按软骨与1 m o i l n a 0 h 溶液质量比1 ：2 混合，温度控制在4 5 ，搅拌 提取2 h 。复合酶酶解工艺的适宜条件为按复合蛋白酶与料液1 ：1 0 0 0 的质量比加 入蛋白酶，控温4 0 5 0 ，保持溶液p h 8 5 9 o ，水解4 h 。在最佳实验条件下， 得到硫酸软骨素为白色粉末，产品纯度达9 5 2 ，收率为3 2 6 。该工艺提高了 产品纯度和收率，降低了生产成本。 ( 3 ) 稀碱一盐提取法 朱瑞芬纠等用以n a o h 碱化的氯化钠溶液从动物气管中提取硫酸软骨素。 该工艺是取处理后的动物气管用3 4 m o l l 的n a c l 溶液浸没，加5 0 的n a o h 调p h 为1 3 左右，室温间歇搅拌，提取1 0 1 7 h ，过滤；滤渣再用等量3 4 m o l l 的n a c l 溶液浸泡提取1 次，合并2 次提取液。加入稀盐酸调p h 为7 左右，在 8 0 1 0 0 水解2 0 6 0 m i n ，冷却。水解液过滤，滤液用稀盐酸调p h 为2 3 ，静 置，过滤。滤液在搅拌下，用碱调p h 为6 7 ，在上述溶液中，边搅拌边加入无 水乙醇，使溶液中乙醇浓度控制在5 0 7 0 ，可以得到硫酸软骨素沉淀。该 工艺的合适的操作条件为2 次浸泡时间总和2 5 3 0 h ，水解时间2 0 4 0 i n i n ，乙醇 最终浓度为6 0 7 0 。 ( 4 ) 复合酶酶解提取法 王凤琴 3 】等用复合酶解法提取硫酸软骨素。把猪肋、喉、气管等软骨预处理 后，以骨粉1 ：3 的比例加入去离子水，加入原料量l 的复合酶，于5 5 搅拌酶 解1 2 1 5 h 。复合酶水解液用h c l 调p h 7 5 ，加入2 的醋酸钠溶液，搅拌溶解后， 升温到8 5 ，保温2 0 m i n ，过滤去残渣。滤液加入胰酶酶解。经酶解后的酶解液 在8 5 下维持1 5 i n i n ，过滤，乙醇沉淀，干燥磨粉后得成品。影响该工艺水解反 应的因素为酶解温度、p h 值与加酶量，利用正交试验得出优化条件为温度5 0 、 p h 8 6 8 9 、加酶量0 3 9 l ，收率达1 7 8 4 。采用全新的双酶酶解工艺和中空纤 维超滤等现代技术生产硫酸软骨素，由于酶作用专一性强的特点，质量稳定、收 郑卅l 大学硕士学位论文 率高，产品颜色洁白，生产周期较短。 华子义 2 4 1 也提出了双酶生产硫酸软骨素的新工艺，使质量稳定，与传统生 产法相比，得率可提高1 r 2 ，产品洁白，生产周期缩短l 3 ，生产成本降低 5 。 罗曼口5 1 等用稀碱和双酶解法生产硫酸软骨素，其方法操作与邹开朗等的基 本一致。根据该工艺生产，每千克原料可获硫酸软骨素1 1 8 1 2 5 9 ( 最高为1 3 0 9 ) ， 葡萄糖醛酸含量为2 7 7 。还指出在酶解后，按5 体积比加入5 预冷的氯醋酸， 静置后离心去沉淀，并立即对清液调节p h 为6 8 7 2 ，然后再用乙醇沉淀实验品， 可提高硫酸软骨素的产量。 ( 5 ) 酶解一树脂提取法【2 6 】 将鲸鱼软骨绞碎，加l m o l 几的n a 0 h 溶液浸泡，4 0 保温水解2 h 或加p h 为7 5 的水浸泡，用蛋白酶5 5 保温水解2 0 h ，再加h c l 中和至近中性，过滤， 调整滤液中n a c l 浓度达到0 5 m o l 几后，将溶液通过a m b e r l i t ei r a 9 3 3 离子交 换树脂柱，吸附完毕，用o 5 m o l l 的n a c l 液洗涤，再用1 8 m o l l 的n a c l 液洗 脱，流速2 l m ，洗脱液脱盐，乙醇沉淀，离心分离，收集沉淀，真空干燥，即 得成品。应用此工艺制得的硫酸软骨素样品，经纸电泳检查为单一区带，抗原物 质试验结果为阴性，含硫量为7 2 。其优点是酶水织或稀碱水解与树脂交换技 术相结合，保证了硫酸软骨素分子不降解，解决了成品纯度的问题。方法简便， 收率高，是一种较有实用价值的制备方法。 1 2 4 超声波法 蒲志军【2 7 】等利用超声波法制备硫酸软骨素，其原理是在碱性条件下蛋白质 易离解和超声波的热学机制促使蛋白质快速解离而达到去杂蛋白的目的，升温 ( 8 5 g o ) 均能使解离的蛋白质变性吸附到白陶土上，从而使硫酸软骨素与蛋白 质分离，提高产品质量。以猪喉骨为原料，在对其进行预处理后，使用超声波手 段进行稀碱抽提，浸出液再用超声波二次处理使杂蛋白解离，经白陶土和活性炭 去杂脱色，酒精沉淀后，干燥即得合格的硫酸软骨索。 该工艺方法提取、除杂时间只用了3 个多小时，大大缩短了生产周期，节约 了生产成本( 不使用酶) ，而且提取和除杂过程无需加热，操作起来比较简便。 但是该工艺在抽提过程中，超声波处理时间不能太长，否则很多杂质会跟着离解 塑型盔兰堡圭兰垡堡塞 出来，从而增加去除杂质的难度，并使产品的色泽和质量达不到要求，且该工艺 收率偏低，限制其在生产上的广泛应用。 1 2 5 乙酸抽提法 n a k a n d 等利用乙酸水溶液提取硫酸软骨素。先把鲜软骨上的脂肪、肉及 其他软组织去掉，在一2 0 冷冻，使用前在4 解冻。把软骨放在水中，用乙酸调 节p h 为4 - 5 ，在3 7 下抽提7 h 。抽提液沸腾浓缩后，在9 0 下干燥即得硫酸软骨 素粗品。 影响硫酸软骨素浸出率的主要影响因素是p h 值。该工艺流程简单，成本较 低，可以考虑商业化大规模生产。但是目前在国内还没有厂家用这种工艺生产硫 酸软骨素。 1 3 硫酸软骨素的分析方法 1 3 1 硫酸软骨素产率计算方法 产室 硫酸软骨素产品质量 1 藏磊吾：藤r 一+ 1 0 0 1 3 2 硫酸软骨素纯度分析方法 酶提取主要是提高硫酸软骨素的纯度，硫酸软骨素的含量测定方法有很多。 各种含量测定方法均有其特点，但测定原理均是基于其组成的糖单位( d 葡糖醛 酸和n - 乙酰- d 一氨基半乳糖) 、硫酸基以及酸性粘多糖的大分子性质。含量测定 方法包括色谱法、电泳法、比色法、原子吸收法、比浊法、配位滴定法及免疫法。 1 3 2 1 色谱法 ( 1 ) 离子色谱法 茅力2 9 】根据c s 中硫酸软骨素与软骨素之问的关系，将c s 水解生成等摩尔 的硫酸根，用a n i o n h c 色谱柱将硫酸根与其他干扰物质分离后，以硼酸钠一葡萄 郑卅f 大学硕士学位论文 糖酸钠淋洗液为流动相，流速1 5 m m i n ，电导检测器检测。对照物：无水硫酸钠， 采用外标法检测其含量。 p l a a s 【3 0 】将c s 用c s 酶a b c 或a ci i 消化水解，产物用2 一氨基吡啶和硼酸 二甲胺制得糖的衍生物，然后在o 5 0 0 啪o l l 三氟乙酸梯度洗脱下经过a s 4 a 离子交换柱分离，荧光法测定。该法衍生物制备重复性和稳定性好，色谱系统灵 敏度高，可广泛用于常规分析定量。该法还可以估算c s 链的个数。 ( 2 ) 化学发光高效液相色谱法 a k i y 啪a 【3 i 】等用化学发光高效液相色谱法，先将c s 用c s 酶a b c 或a ci i 降解，然后用酰胺一8 0 二氧化硅色谱柱( 2 5 0 x 4 0 m m ) 反相色谱进行分离，用 1 m m o l l 草酸盐和3 m m o l l 过氧化氢洗脱，电导检测器检测。该方法特别适用 于临床生理检测。 ( 3 ) 指纹色谱法 m i d u m 等【3 2 1 、l a u d e r 等刚同样将c s 等黏多糖酶解，释放出寡糖，然后通 过c a r b o p a cp a l 色谱柱分离，分离组分用紫外分光光度法定量，在波长2 3 2 m 除检测吸收度，寡糖的检测范围5 0 5 0 0 n g 。该方法适用于细胞和体液中黏多糖 的分析分离。 ( 4 ) 其它色谱法 有反相离子对高效液相色谱法【34 1 、吸附高效液相色谱法口5 1 等。另外，国内 一些生化厂总结多年工作经验，利用凝胶柱或c 1 8 柱测定，以1 4 2 、p h 6 8 的 磷酸二氢钠为流动相，波长2 0 6 姗紫外检测，并以对照品对照制作标准曲线， 利用组分蜂面积或峰高与对照品进行比较。但分辩率较差，杂质容易产生干扰。 1 3 2 2 电泳法 ( 1 ) 醋酸纤维素薄膜电泳法 一。 一 苎型查兰堡尘堂垡丝塞 g a 腩n 等f 3 6 1 把供试品先用c s 酶a b c 消化，产物与钌 1 0 3 r u 结合，然后经 醋酸纤维素薄膜电泳分离，红斑印迹检测。该方法检测灵敏度可达2 n g ，还可以 消除核酸和玻璃酸的影响。 ( 2 ) 聚丙烯酰胺凝胶电泳法 l y 。n 等 3 7 】利用c s 的黏多糖性质进行梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳，供试品可 降解也可不降解，用天青一a 银氨试剂染色进行定量，属半微量分析，检测灵敏 度在1 2 n g ，几乎可用于所有黏多糖的分离分析。m 。1 l e r 等【3 8 】将该方法进行改 进，首先采用高碘酸氧化，然后天青a 染色，最后用硝酸银滴定进行定量。该 方法多用于实验室小量供试品的分析、定量。 ( 3 ) 琼脂糖凝胶电泳法 v o l p i 利用黏多糖中的“快移动”片断和“慢移动”片断性质的不同，以及 不同黏多糖中二者比例不同，首先用细菌酶降解，然后用琼脂糖凝胶电泳分离分 析，标准曲线分光光度法定量。该方法多用于实验室小量供试品种不同黏多糖的 分析、定性及定量。 ( 4 ) 毛细管区带电泳法 p a y a i l 口9 】等建立了毛细管区带电泳测定c s 含量的方法。测定时把供试品放 在阴极，应用离子对试剂四丁基铵磷酸盐和硼酸盐缓冲液，离子对试剂浓度的增 加可导致z 电位的降低。此方法尤其适用于临床上测定病人关节组织中的c s 含 量。 1 3 2 3 比色法 ( 1 ) 氨基己糖的测定 该法又称为e l s 。n m 。唱a 1 1 法，是c s 部颁药品标准采用的方法。测定原理 是基于c s 由d _ 葡糖醛酸和n 一乙酰一d 氨基半乳糖组成，经盐酸水解可释放出氨 基葡糖，在碱性条件下与乙酰丙酮缩合，产物与对二甲氨基苯甲醛的酸醇溶液呈 郑州大学硕士学位论文 红色，于波长5 2 5 j l i l l 处测定吸收度，以氨基葡糖作对照品，计算氨基葡糖含量， 再换算成c s 含量。该方法操作繁琐，最棘手的是重现性差。谢继青等4 叫对此法 进行析因实验设计，对比实验，发现影响最终测定结果的关键步骤有乙酰化和显 色两步，色定时按乙酰化同时计时、显色剂随加随计时操作，所得结果精密度高、 重现性好。 ( 2 ) 己糖醛酸的测定 该法又称咔唑法，测定原理是c s 分子中的d 葡糖醛酸在硫酸作用下生成 糠醛，后者在咔唑的醇溶液中显红色，于波长5 3 0 n m 测定吸收度，制作标准曲 线计算出d 一葡糖醛酸含量，再换算出c s 含量。该法较测定氨基葡糖法简单一些， 但由于在操作过程中有浓硫酸，所以给实际操作带来诸多不便。 ( 3 ) 染色法 原理是具有大分子聚阴离子的黏多糖与荷正电碱性燃料天青a 在一定p h 条件下结合产生与原来燃料不同的颜色，并以黏多糖本身作对照，通过测定在波 长5 0 5 n m 的吸收度定量。由于天青a 对不同的黏多糖选择性不强，测定结果容 易受其它黏多糖的影响。 施文建等h 1 1 以乳化剂o p 作稳定剂，在p h 值为3 o 的磷酸一磷酸二氢钾缓冲 液中碱性艳蓝b 0 与硫酸软骨素反应形成离子对缔合物，水溶液颜色由绿色变为 蓝色，在波长为5 7 0 n m 处测定吸收度。此方法简便、快速、准确，可用于工业 供试品的测定。 ( 4 ) 间苯三酚分光光度法 高华等h 。1 利用c s 与含有间苯三酚的无机酸在1 0 0 反应3 0 m i n ，生成的有 色物质在波长5 5 8 锄处有最大吸收，通过比色测定c s 含量，线性范围o 1 1 o m g m l ，具有较好重现性，操作简单。 1 3 2 4 原子吸收法 郑州大学硕士学位论文 茅力等利用间接原子吸收法测定鲨鱼软骨粉中c s 的含量。利用c s 完全 水解释放出等摩尔的硫酸根，钡离子过量定量，用原子吸收法直接测定过量的钡 含量，求算总硫酸根与游离硫酸根，得出有机硫酸根，间接换算出c s 的含量。 1 3 2 5 比浊法 姬胜利等【4 卅根据c s 可与氯代十六烷基吡啶结合生成稳定乳浊液的聚阴离 子性质，建立了比浊测定法。该法不需要特殊设备，但受杂质的影响较大，所以 特别适用于精品硫酸软骨素的含量测定。国内一些生化厂根据以上原理，结合实 际设备条件，建