（市政工程专业论文）给水管网管壁生物膜微生物多样性研究.pdf

摘要 给水管网系统在整个供水体系中占有重要地位，对水质安全起到了关键作 用。人们越柬越关注给水管道的二次污染问题，并提出了饮用水水质的生物稳定 性概念。控制管道细菌再生长是提高水质生物稳定性的关键所在。给水管网管壁 生物膜中微生物可能因水力条件的变化而脱落到水体，因此，生物膜作为一个微 生物缓慢释放器而存在于管网中。 目前对管道内生物相的研究还较少，本文尝试从生物学角度出发，对给水管 网进行模拟并培养生物膜，对不同时期管肇中形成的生物膜进行研究，分析生物 膜中细菌种类与生长情况，比较不同管材、不同时期生物膜中细菌的多样性。 实验通过扫描电镜直观地观察管道生物膜中细菌的生长情况，对影响细菌总 数的水质指标进行了分析，然后应用a p i 鉴定系统对细菌总数中所选择的菌落进 行鉴定。 从扫描电镜和细菌总数可以看出，模拟管网管壁表面所形成的管垢中有许多 大小不均的孔隙，为细菌的附着生长进而形成生物膜提供了条件，生物膜中附着 了大量的细菌及菌胶团。大量细菌的附着生长为致病菌提供了良好的生长环境， 一旦管道中流速或水压发生急剧变化，管壁生物膜可能脱落，容易引起细菌数量 增多。 实验引入分子生物学技术对给水管壁生物膜细菌多样性进行研究，通过基于 1 6 s r d n a 的p c r d g g e ( 变性梯度凝胶电泳) 图谱分析，对不同钓管壁生物膜样 品中微生物多样性进行了比较。实验证明，通过该方法，可以获得传统培养方法 无法得到的菌株的情况，能够更全面真实地反映饮用水微生态环境的面貌，对自 来水企业保障饮用水的微生物水质安全、保证人民的身体健康是很有帮助的。 关键词：给水管网生物膜扫描电镜a p i 聚合酶链式反应一变性梯度凝胶电泳 a bs t r a c t t h ed i s t r i b u t i o nn e t w o r ki sa ni m p o r t a n tp a r ti nt h ew h o l ew a t e rs u p p l ys y s t e m s ， a n di tp l a y sak e yr o l ei np r o t e c t i n gs e c u r i t yo fw a t e rs u p p l y t h er e c o n t a m i n a t i o n d u r i n gd i s t r i b u t i o n n e t w o r kh a sb e e n r e c e i v i n gc o n s i d e r a b l ea t t e n t i o n ，a n dt h e c o n c e p t i o no fb i o s a b i l i t yo fd r i n k i n gw a t e ra l s oh a sb e e nb r i n gf o r w a r d t oc o n t r o lt h e b a c t e r i a lr e g r o w t hi sak e yi s s u ei n a t t e m p tt oi n c r e a s et h eb i o s a b i l i t yo fd r i n k i n g w a t e r c o n t a m i n a t i o na n dm a t e r i a li nt h eb i o f i l mm a ys u b s e q u e n t l yb er e l e a s e di n t o t h ef l o w i n gw a t e ru n d e rv a r i o u sc i r c u m s t a n c e s a sar e s u l t ，b i o f i l m sc a na c ta sa s l o w - r e l e a s em e c h a n i s mf o r p e r s i s t e n tc o n t a m i n a t i o no f t h ew a t e r t h es t u d yo nt h eb i o t ao fd i s t r i b u t i o ns y s t e mi ss t i l lf e w t h em o d e lp i p e l i n e w h i c hw a su s e dt os i m u l a t et ot h ed i s t r i b u t i o ns y s t e md y n a m i c a l l yt a sd e s i g n e dt o a n a l y z et h eb a c t e r i a lg r o w t h a n dm i c r o b i o l o g i c a lm e t h o d sw e r eu s e dt oi d e n t i f yt h e b a c t e r i aw h i c hg r e wi nt h eb i o f i l m si nd i f f e r e n tp e r i o d s t h e nt h eb a c t e r i a ls p e c i e s a n dt h e i rg r o w t hw e r ea n a l y z e dt om o n i t o rt h eb a c t e r i ad i v e r s i t yo fd i f f e r e n tp i p e l i n e s b i o f i l m si nd i f f e r e n tp e r i o d s t h es c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e ( s e m ) w a su s e dt oo b s e r v et h eb a c t e r i a l g r o w t hi n t u i t i v e l yi nt h em o d e lp i p e l i n eb i o f i l m s ，a n da n a l y z e dt h ew a t e rq u a l i t y t a r g e tw h i c ha f f e c t e di t sg r o w t h t h ea n a l y t i cp r o d u c t si n c ( a p i ) w a su s e dt o i d e n t i f yt h eb a c t e r i aw h i c hg r e wi nt h eh e t e r o t r o p h i cp l a t ec o u n t s ( h p c ) t h es c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e ( s e m ) a n dh e t e r o t r o p h i cp l a t ec o u n t s ( h p c ) o fp i p et u b e r c l es a m p l e sc o l l e c t e di nt h em o d e ld i s t r i b u t i o ns y s t e md e m o n s t r a t e dt h a t t h ei n n e rw a l lo ft h ep i p ew a sn o ts m o o t h ，p e r m i t t i n gc r e v i c et oe x i s ta n db a c t e r i at o g r o w t h eb a c t e r i a lr e g r o w t hw a sc o n f i r m e db yt h es e mr e s u l t ss h o w i n gt h a tm o s to f t h e mw e r eb a c t e r i aa n db a c i l l i h o w e v e r , t h el a r g eq u a n t i t yo fb a c t e r i a lg r o w t hw a s p r o f i tf o rp a t h o g e n i cb a c t e r i at og r o w t h ew a t e rq u a l i t yw o u l dd e t e r i o r a t ew h e n w a t e rf l o wv e l o c i t yo rp r e s s u r ew e r ec h a n g e ds u d d e n l y m o l e c u l a rb i o l o g i c a lt e c h n o l o g i e sw e r ei n n o v a t i o n a lu s e di nt h e s t u d yo fb a c t e r i a d i v e r s i t yi nd i s t r i b u t i o nn e t w o r kb i o f i l m i6 s r d n ab a s e dp c ra m p l i f i c a t i o na n d d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ( p c r d g g e ) w a su s e dt om o ni t o rt h e m i c r o b i a ld i v e r s i t yi nd i f f e r e n tb i o f i l m s i t s p r o v e dt h a tm o l e c u l a rb i o l o g i c a l t e c h n o l o g i e sc o u l db eu s e di nt h er e s e a r c ho fb a c t e r i ad i v e r s i t yi nd r i n k i n gw a t e r , i ti s u s e f u lt op r o t e c tt h es e c u r i t yo fm i c r o b i o l o g yw a t e rq u a l i t y , a n dh e l p f u lf o re n s u r et h e h e a l t ho fp e o p l e k e yw o r d s ：d i s t r i b u t i o ns y s t e m ，b i o f i l m ，s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e ( s e m ) ， a p i ，p c r d g g e 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨鲞盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：列楚j 邓 签字日期： 卅年6 月c7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解叁洼盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权苤盗盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：刘楚，朗尸 签字同期：刎年月f 7 日膨邮 一 乡 旧矿 矿 名 期 签 日 师 字 导 签 第一章绪论 1 1 课题背景 1 1 1 给水管网二次污染 第一章绪论 自从2 0 世纪3 0 年代，美同在未加氯消毒的给水管网中发现细菌再生长现象以 来，管网中细菌的再生长及其所带来的问题日益得到了人们的关注和重视。城市 管网与其输送的水体构成一个庞大复杂的“反应器”，经水厂处理合格的水，在 管网中会发生一系列的物理、化学及生物反应而导致水质下降，所以合格的出厂 水在经过配水管网的转输过程到达用户时，水质就不一定符合国家生活饮用水标 准了。通过原水进入到配水系统中的微生物，由于系统压力的变化，将在浓度和 多样性方面经历一个变化，原水经过处理，其微生物负荷将会降低，但随着离水 厂距离的增加，许多系统都会经过一个细菌数目增加的过程。 自来水公司将水厂处理后的优质水经由管网输送到用户过程中，水质往往发 生变化，使到达水龙头水的水质受到微生物的污染，导致管网水介传染病爆发。 如美国3 0 的水介传染病来自配水系统：1 9 7 1 - 1 9 9 4 年美国爆发的水介传染病2 7 2 例中，由配水系统引起的占3 0 ；1 9 7 1 1 9 8 5 年美国爆发的水介传染病中，有1 6 归因于管网或水库原水出现的微生物；1 9 8 9 1 9 9 2 年美国6 0 次较大的水介传染 病爆发事故中，有1 3 与管网问题有关。又如1 9 3 7 - 1 9 8 6 年英国爆发的2 1 次水介 传染病中，有7 次归因于管网微生物污染，其中4 次由沙门氏菌属和弯曲杆菌属所 造成。为此，p a y m e n t 等人在一项流行病调查研究中指出，1 4 1 9 的肠胃病来 源于水龙头水污染，主要是管网中病原微生物所致1 2 j 。 据统计，我国管网水水质合格率较出厂水下降0 8 8 个百分点，其中浊度平均 比出厂水高0 3n t u ，细菌总数增加4 倍左右，合格率约为9 7 ，而大肠杆菌合格 率只有9 0 左右【3 】。所以，在人们大量研究水处理工艺的同时，管网水质的研究 也开始逐渐受到人们的重视。 引起配水系统水质恶化的许多原因中，生物学现象由于其引起急性的公共健 康危害，成为很多研究的主题。尽管很高的异养细菌数量并不一定会构成健康危 险，但却是某一特定管网遭受生物污染的标志，这一状态能够保护致病菌种1 4 , 5 1 。 管网中生物膜的进化也会影响配水水质的其他方面，如味道和嗅味、大型无脊椎 第一章绪论 动物的发展【6 1 、色度和浊度的出现以及生物腐蚀现象的发生。 城市管网与其输送的水构成一个复杂的化学、生物化学反应系统。某城巾曾 发现管垢厚达1 6 2 0 m m 、赤色、有腥味，含1 6 种金属元素，检出铁细菌、埃希氏 大肠杆菌等6 种微生物。管道结垢，输水水质恶化，管道输水能力下降己成为一 个急需解决的问题。 1 1 2 给水管网中微生物生长状况 1 i 2 1 给水管网的营养环境 由于饮用水原水一般较清洁，即使在微污染状态下，c 、n 、p 等营养元素浓 度也远低于污水处理系统。所以饮用水供水系统中的微生物生态系统一般处于贫 营养状态，微生物生长发育和新陈代谢属于基质限制型，其微生物种群结构也完 全不同于污水生物处理系统1 7 j 。 给水管网为贫营养环境。所谓贫营养环境是指环境中有机营养物质缺乏，特 别是溶解性有机物( d i s s o l v e do r g a n i cc o m p o u n d s ，d o c ) 浓度很低。但贫营养 环境还没有具体的定义，界定范围从d o c 1 0 m g l l 至f j d o c i m g t 不等。如把 d o c 5 m g l 定义为贫营养环境，则这种环境中所生存的微生物需要具有适应这 种低营养的生存对策及特性( 包括生理特性和生态特性) ，能在此条件下生长的 微生物称为低营养型微生物。 生活饮用水水质标准中所规定允许的各类有机物的含量都很低，一般微生物 无法在其中生长，但仍有一些能够在贫营养环境中有效利用低浓度有机物的微生 物种类，当然，在这种贫营养环境中生存的微生物种类和个体数都是很少的。 贫营养微生物一般能够利用多种基质，即对基质的专一性选择不强，特别是 具有二次基质利用特性，当贫营养环境中同时存在一些浓度很低的有机污染物 时，可以在代谢低浓度有机营养物的同时代谢降解浓度更低的有机污染物。有实 验观察，在主营养物浓度为l m g l 时，某些二次基质可以被降解到0 0 0 0 1 m g l 以 下。贫营养微生物生长遵循k 生长对策。k 生长对策是尽其所能利用环境中的 每一个营养物分子，尽可能多地吸收各种不同类型的基质1 8 】。 在贫营养环境中，微生物较少以游离状态存在，9 9 以上的微生物细胞都是 固着在水体中的某种介质表面，当情况较好时，可以形成贫营养生物膜。 1 1 2 2 微生物稳定性 给水水质的生物稳定性是指给水中有机营养基质( 可生物降解有机物) 能支 持异养细菌生长的潜力，即细菌生长的最大。町能性【9 j 。给水生物稳定性高，即水 中所含细菌生长所需的有机营养物低，细菌不易生长。 饮用水生物不稳定会造成配水管嘲中异养细菌等微生物的再生长，对饮水水 2 第一章绪论 质安全带来一定的微生物安全风险，同时还会对输水过程带来一系列的不利影 响，如引起管网的腐蚀，使饮用水产生嗅味，导致色度及浊度的增加等等，最终 造成饮用水水质下刚1 u j 。 与高营养基质相比，贫营养基质下生长的细菌具有较高的抗性。如有荚膜、 无荧膜的肺炎克雷伯式菌株在贫营养基质f 生长对自由余氯的抗性分别增加了3 倍、2 倍；生长于贫营养“自然生境”中的肺炎军团菌( l e g i o - n e l l a p n e u m o n i a e ) 比 营养琼脂中生长的细菌有6 9 倍之多的抗性，其原因可能与细菌在贫营养、有消 毒剂存在条件下细胞的形态结构与内含物的变化有关。 1 1 2 3 给水管网细菌再生长 管网水中细菌再生长的原因有：出厂水中有较多的细菌进入管网；管网 中细菌的生长繁殖；输水过程中外源细菌的进入。而在出厂水正常消毒、管路 完好的情况下，第二种情况是引起自来水中细菌生长的主要途径。 一些研究者对国内3 4 个主要城市的资料进行统计，发现地面水水厂出厂水水 质基本稳定的占2 1 ，腐蚀性的占5 0 ，轻微结垢的占2 9 。地下水水厂出厂水 基本稳定的约占5 0 ，有腐蚀性的占3 0 ，轻微腐蚀性的占2 0 。对占全国总供 水量4 2 4 4 的3 6 个城市调查发现，出厂水平均浊度为1 3 n t u ，而管网水增加到 1 6 n t u ；色度由5 2 度增加到6 7 度；铁由0 0 9 m g l 增加到0 1 l m g l ；细菌总数由 6 6 c f u m l 增加到2 9 2 c f u m l 。尽管如此，研究表明全国自来水公司管网水质4 项 指标的平均合格率还是较高的，但与微生物学相关的水质指标一细菌总数和大肠 杆菌指数最低合格率很低，即管网中有细菌再生长现象的发生。为此，要提高出 厂水的水质稳定性，稳定管网水中的余氯，降低水中有利于细菌再生长的营养物 质( 可生化或可同化的有机碳和氨) 的浓度，设置管网水质自动监测仪器，建立 管网水质模型，进行水质预测，将有助于水质管理【l 。 给水管网中细菌生长是因为细菌内部的再生长或繁殖以及生物膜的形成为 细菌的增长提供了场所。一些研究表明，给水系统沿线生物膜上的微生物繁殖导 致了饮用水中细菌量恶化、臭味及色度的增加以及管道内部的腐蚀现象。细菌在 给水管网中繁殖，使供水水质恶化，加速了管网的腐蚀，存在于水中的某些病原 微生物，即使含量很少，只要有单个病原体进入人体就会使人感染患病，它们对 人的危害比饮用水中的微量有机污染物更大。 近年来的研究表明，出厂水中所含有机物是细菌在管网中滋生的必要条件。 人们认识到引起给水管网中细菌重新生长和繁殖( r e g r o w t h 或a f t e r g r o w t h ) 的主 要诱因是出厂水中残存的异养细菌生长所需要的有机营养基质，即可生物降解有 机物( a o c 或d o c ) 。尽管给水处理厂通常通过加氯消毒杀灭病原菌，同时保 持管网末端一定的余氯量( 我国规定为0 0 5 m g l ) 来控制细菌在管网中的生长， 第一章绪论 但出厂水中仍残存有细菌( 出厂水中细菌控制指标为 1 0 0 c f u m l ) ，总大肠菌群 控制为每1 0 0 m l 水样中不得检出) ：氯消毒后部分受伤细菌会在管网中自我修复， 重新生长，同时，换管和其他原因也会引起外源细菌进入管道。在管网水中存在 可生物降解有机物时，这些残存的细菌获得营养而重新生长繁殖，导致用户水质 变坏。给水管道表面铁瘤和冲洗下来的颗粒沉淀物卜己检测出细菌种属达2 1 种。 多数研究表明当有机物含量高时，即使保持很高的余氯，给水管道中仍可以检出 几十种细菌，除少数铁细菌和硫细菌外，主要是以有机物为基质的异养菌。细菌 在管网中的再生长问题越来越受到重视。 1 1 2 4 给水管网生物膜的形成 “生物膜”通常用来形容水环境中在聚合载体上连接在一起的一层微生物膜， 聚合载体通常附着于像管道、小的块状物或者沉淀淤积等基质上，成功的依附以 及随后微生物在表面上的生长导致了生物膜的形成1 1 2 l 。 给水管网中，许多细菌由于分泌胞外基质( e p s ，可形成荚膜) 而相对亲水， 但管道内的湍流效应对细菌着生显然不利。有研究表明：管壁与水流之间的粘滞 层( 或边界层) ，以及由于粘滞层中营养物质浓度梯度的存在，可以使运动细菌 从水中迁移到管壁表面生存；另外在水流速度很小或相对静止的管道内，直径 u p v c 。因此，应增加新管材的应用，同时研究内壁表面特征( 表面电荷、表 面自由能和表面粗糙度等) 有利于阻止细菌粘附的新型管材。 5 2 2 管道腐蚀的控制 管网使用时间过长，管内壁就会产生沉淀和污垢。管道上的锈垢是细菌繁殖 生长的