（微生物学专业论文）黔产药用植物艳山姜内生真菌的研究.pdf

摘要 责州省中药赞源十分丰富，资源名列全国第4 德，是驰名中井鼹地邋药材之 多。有研究表明，植物的内生真菌可能产生与宿主相同或相似的代谢产物，因丽 扶植物内生真菌串提取叛药，是霹蓠一令新兴的方向。本研究从蠹圭真菌的焦度 出发，希塑在既不破坏现有的黔产药用植物资源的基础上，还能开发出有益于医 药事监韵天然活性物质。论文工作涉及三部分：( 1 对袍出姜等6 种黔产药用植 物内生真菌进行分离；( 2 ) 开展内生真菌的小量培养，对其提取物进行抗菌活性 筛选；8 ) 剃蔫活谯鼹踪法，对艳出蓑翡重株肉生真菌主要活性成分展开研究。 取得的结果如下： i 、从艳由姜等6 种黔产药用植物中分离得到1 0 2 株内生真菌。 2 、以多种菌为测试蘑株，对分离得到的内生真菌代谢产物活性进行襁筛， 发现从艳山姜中分离出来的一株内生真菌s r t 2 ，其发酵菌丝体提取物对金黄色 葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ) 具有较好的抗菌活性。 3 、从黔产药稍植物艳山姜中分离得到一株内生真菌s r t 2 ，根据菌株的形态 学特征，经初步鉴定为聚端拖霉属( t r i c h o t h e c i u ms p p ) 。s r t 2 经发酵培养，利用 多种层析手段对其菌丝体提取物的乙酸乙酯部分进行分离和纯化，得到了9 个化 合物，通过理化方法及光谱分橇对讫合物遴行结构鉴定，鉴定结果舞： 7 - d e o x y r o s e n o n o l a c t o n e ( s r - i ) 、麦角甾醇( s r - 2 ) 、过氧化麦角甾醇( s r 3 ) 、 6 - h y d r o x y m s e n o n o l a c t o n e ( s 则 、r o s e n o n o l a e t o n e ( s r - 5 ) 、正三十二烷酸( s r 一国、 藏十六烷酸( s r - 7 ) 、胡萝卜瞢( s r - 8 ) 和蔗糖( s r 9 ) 。经活性复筛，发现化合物 6 - h y d r o x y r o s e n o n o t a c t o n e 和7 - d e o x y r o s e n o n o l a e t o n e 对桔革芽孢籽菌株( b a c i l l u s s u b t i l i s ) ，藤黄微球菌( m i c r o c o c c u sl u t e u s ) 和金黄色葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ) 麓榇有较好的的抗菌活性。， 关键词：内生真菌；代谢产物；抗藏活性；筛选；艳出姜 a b s t r a c t t h e r ew e r ea b u n d a n tr e s o u r c e so fc h i n e s em e d i c i o ei ng u i z h o up r o v i n c e ，w h i c h l i s t e dt h ef o r t hi no u rc o u n t r y s oi tw a sc a l l e dt h ef a m o u st r a d i t i o n a lc h i n e s e m e d i c i n e st o w n a c c o r d i n gt ot h er e s e a r c h t h ee n d o p h y t i cf u n g im a yh a dt h es a m eo r s i m i l a rm e t a b o l i s mp r o d u c t 、柝mt h eh o s t t h u se x t r a c t e dn e wd r u g sf r o me n d o p h y t i c f u n g iw a san e wd i r e c t i o n t h i sr e s e a r c h , f r o mt h ep e r s p e c t i v eo fe n d o p h y t i cf u n g i ， h o p e dt h a tn o to n l yu n d e r m i n e dt h ee x i s t i n gr e s o u r c e so fm e d i c i n a lp l a n t si ng u i z h o u , b u ta l s ob e n e f i t i e dt h e p h a r m a c e u t i c a li n d u s t r y t o d e v e l o pt h e n a t u r a la c t i v e s u b s t a n c e s t h i sp a p e ri n v o l v e dt h r e ep a r t s ( 1 ) t h ee n d o p h y t i cf u n g if r o mt h em e d i c a lp l a n t s i ng u i z h o up r o v i n c ew e r ei s o l a t e d ( 2 ) a f t e ras m a l la m o u n t1 0 fe n d o p h y t i cf u n g if e r m e n t a t i o n , t h ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t yo fi t se x t r a c t sw a st e s t e dt h r o u g ha n t i m i c r o b i a l e x p e r i m e n t s ；o ) t h r o u g ha c t i v i t yt r a c k i n gm e t h o d ，t h em a i nc h e m i c a lc o m p o s i t i o no f o n ee n d o p h y t i cf u n g iw h i c hi s o l a t e df r o ma 勿i n k 7z e r u m b e tw a sb e e nr e s e a r c h e d t h e r e s u l t sa c h i e v e dw e r ef o l l o w i n g ： 1 at o t a lo f10 2e n d o p h y t i c 觚西w e r ei s o l a t e df r o m6m e d i c i n a lp l a n t si n g u i z h o u p r o v i n c e 2 a n t i b a c t e r i a la c t i v i t yo fe n d o p h y t i cf u n g io ft h e i rm e t a b o l i t e sw e r es c r e e n e d w i n la n t i b i o t i cr e s i s t a n c eb a c t e r i a f o u n dt h ee n d o p h y t i cf u n g ie x t r a c t sw h i c hf r o m a l p i n i a z e r u m b e th a dg o o 鑫a n t i b a c t e r i a la c t i v i t ya g a i n s ts t a p h y l o c o c c u sa u r e u s 3 a c c o r d i n gt ot h em i c o r p h o l o g yo ff u n g i ，t h ee n d o p h y t i cf u n g iw h i c hs e p a r a t e d f r o ma l p i n i az e r u m b e tw a si d e n t i f i e dt r i c h o t h e c i u ms p p a f t e rf e r m e n t e d , n i n e c o m p o u n d sw e r ei d e n t i f i e db ys p e c t r o s c o p i ca n a l y s i st o g e t h e r 谢mp h y s i c o c h e m i c a l d a t aa m o n gt h ee x t r a c t so fm y c e l i u me t h y lp a r t s t h ec o m p o u n d sw e r ei s o l a t e da n d i n d e n t i f i e d 。t h e yw e r e7 - d e o x y r o s e n o n o l a c t o n e ( s r - 1 ) ，e r o g o s t e r o l ( s r - 2 ) , e r g o s t e r o l 5 a ，8 a - p e r o s i d e ( s r - 3 ) ，6 - h y d r o x y r o s e n o n o l a c t o n e ( s r - 4 ) ，r o s e n o n o l a e t o n e ( s r 一5 ) ，d o t r - i c o n t a n o i ca c i d ( s r - 6 ) ，h e x a d e c a n o i ca c i d ( s r - 7 ) ，d a u c o s t e n o l ( s r - 8 ) ，s u c r o s e ( s r - b yt h es c r e e n i n go fb a c t e r i o s t a s i sa c t i v i t y , w h i c hf o u n dt h a t6 - h y d r o x y r o s e n o n o l a c - t o n ea d d7 - d e o x y r o s e n o n o l a c t o n eh a d - s p e c i a lb a c t e r i o s t a s i sa c t i v i t yt ob a c i l l u s 4 s u b t i l i s ，m i c r o c o c c u sl u t e u sa n ds t a p h y l o c o c c u sa u r e u s k e yw o r d s ：e n d o p h y t i cf u n g i ；m e t a b o l i t e s ；a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y ；s c r e e n i n g ； t r i c h o t h e c i u ms p p 5 学位论文原创琏声明和关于学位论文使用授权的声明 原刨性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注瞬弓 用的内容外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。 对本文的研究在做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确 方式标羁。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名_ 熊丞蕉 霹 期：至垒垒缝箧 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解贵州大学有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阂簪借阅；本人授权贵州大学可以将本学位论 文的金部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 深密论文在耨密后应遵守此规定 论丈椿者签名：似导师签名：雏日 一、综述 天然产物化学研究的重要组成部分为微生物及其代谢产物。早在i o o 多年 前，人们既经发现微生物存在于健康植物组织内部，但出于其生长特点的特殊性， 其存在和作用长期以来一直为人们所忽视。自2 0 世纪3 0 年代人们发现引起畜牧 业重大损失的牲畜中毒事件是由于食用感染内生真菌的牧草造成后，其研究才得 以广泛关注( l e u c h t m a n na e ta 1 ，1 9 9 2 ) 。9 0 年代s t r o b e lg 等( 1 9 9 3 ) 首次报道了 从短时紫杉( t a x u sb r e v i f o l i a ) 的树皮中分离出一株产紫杉酵的蠹生真菌 ( t a x o m y c e sa n d r e a n a e ) ，引发了从植物内生真菌中寻找新物质的热潮。 目嚣从内生真菌中分离到多种具有生物活性的代谢产物，主要有黄酮、生劣 碱、萜类、脂肪酸等化合物，并发现其化学成分具有抗肿瘤、抗菌、降糖等多种 生物活性。目前仅仅研究了极少数植物的内生真菌，因此从植物内生真蔻中寻找 到新物质的机率是很大的，并且植物内生真菌本身作为新的微生物资源也具有广 泛的研究价僮和意义。 1 内生真菌的概念 关于内生真菌的定义，目前在学术界仍有很多争论。在过去多年内生真菌的 研究中，可以发现两个概念：注重于内生真菌生物本身特定的生理作用的研究者， 如植物病理学家通常强调宿主专一性及生态适应性方面的特征；而侧重内生真菌 生物多样性以及群落分析的研究者则通常把栖息予宿主组织内的全部微生物都 称做内生真菌，其中包括潜伏的、静息的或条件致病的一些病原菌。目前较普遍 接受的内生真菌的概念是：植物内生真菌是指那些在其生活史的一定阶段或全部 阶段生活予健康植物内部，被感染的宿主植物不表现出任何外在病症的微生物。 2 内生真菌与宿主的关系 植物与内生真菌的关系是互利共生的，主要表现在两个方谣：一方面内生真 菌分布于楗物组织癌，蠹生真菌可从宿主植物中获取营养，供自己生长所需；丽 且内生真菌长期生活在植物体内，受到植物组织的良好保护，因而比暴露于恶劣 的外部环境酶辫生蔼及腐生菌具有更稳定的生存环境；另一方面内生真菌可能通 过自身的代谢产物或借助于信号转导作用对植物体产生影响，在宿主的生长发育 6 及系统演化过程中起重要的作用： ( 1 ) 促进宿主植物的生长发育 内生真菌对宿主植物的促进作用表现在种子发芽、幼苗存活和生物量等多个 方恧。内生真菌也可促进密主的生长，在低水平氮源的土壤中，可增强宿主对氮 元素的吸收。此外，内生真菌还可以通过增强植物吸收s ，p 等营养元素，或直 接产生拮抗物质而抑制病原菌，或与病原菌竞争营养和空间，从两能够更好的促 进植物的生长。 ( 2 ) 增强宿主植物的抗逆性 内生真菌对植物抗逆性的作用可以分为两个方面：即对非生物胁迫的抗性和 对生物胁迫的抗性，前者主要包括抗干旱和耐高温，后者主要包括阻抑昆虫和食 草动物的采食、抵抗病虫害等。感染植物的内生真菌能产生多种生物碱和真菌毒 素如黑麦草碱和麦角碱等，这些次生代谢物对食草动物和昆虫等具有毒性或能降 低宿主植物的适口性，能提高植物对多种食革昆虫的抗性。 内生真菌研究现状 3 1 内生真菌概况及其多样性 植物内生真菌的研究相对其它学科来说尚缺乏一定的系统牲，僵近年来由予 其代谢产物在病虫害的生物防治上和医药工业的用途和范围的逐渐增大，因此有 关该方面的研究逐渐受到入们豹重视( j a e o bm e ta l ，2 0 0 0 ) 。虑生真菌由予其物种 丰富，数量繁多，而且与其它生物之间具有紧密的关系，故其成为目前国内外研 究的热点之一。 植物内生真菌大多数属于子囊菌亚门中的核菌纲( p y r e n o m y e t e s ) 、盘菌纲 ( d i s c o m y c e t e s ) 和腔藩纲( l o c u l o a s c o m y c e t e s ) 及其无性型的多种真菌，主要分布予 植物的花、茎、叶片、叶鞘、种子和根等细胞f 司( c a r r o lg e ta l ，1 9 9 8 ) 。近年来， 从许多植物如针叶类的各种杉类、松、柏等植物的树皮、枝叶内分离和鉴定出多 种内生真菌，在多种草本植物、栽培植物、苔藓等植物中也发现了多种内生真菌 类群。根据内生真菌与宿主专一性分析，平均每种寄主有4 5 种寄生菌，按地球 目前已知的2 5 万种植物计算，内生真菌的种类至少有5 - 6 万种，其生物多样性 和存在酶普遍性力内生真菌的研究提供了最基本的保证。 7 3 2 植物内生真菌产生与宿主相同或相似药用活性成分机制 - - 内共生理论认为，次生代谢过程中生化途径的连续演化会导致有益物质进入 到共生体中，其基本的生化过程信息有时还会传递到其它生物中去。在共生体内， 一旦次生代谢中有用生化途径出现，它就能被其它生物所利用，表现出相互作用 和“协同进化”。正是由于这种机制，研究者才能从药用植物中筛选出产生与宿主 相同或相似的生理活性成分的内生真菌。 由予这类内生真菌菌株需要加工，故在提高其相应成分的产量，并探索相应 工艺，保证较高得率的前提下，才能进入天然药物生产。目前对内生真菌何以能 产生与宿主相同或相似活性成分的原因，尚需深入研究。有研究者认为内生真菌 长期与宿主共生，相互遗传物质可能有了传递，很多实例已证实它们具有相同代 谢产物合成的途径，是获得了相关基因的直接传递，种特殊的内生真菌基因型 要找至蛔：确的宿主基因型才能成功感染( a h l h o mj e ta l ，2 0 0 2 ) ，相互代谢产物长 期诱导影响等等，但尚缺乏协同进化的实验证据。 4 。内生真菌的生物活性 内生真菌的生物活性主要体现在以下几个方面： ( 1 ) 抗肿瘤活性 。 从红豆杉属植物中分离得到的化合物紫杉醇( t a x 0 1 ) 能促进微管聚合，抑制解 聚，现己被许多国家用于治疗纯疗无效的卵巢癌和乳腺癌，已成为近年来抗癌药 物研究中新的热点( 姜威等，1 9 9 8 ) 。另外，s t i e r l ea 等( 1 9 9 3 ) 分别从寄生予太平洋 红豆杉树皮蠹的真菌的发酵液中和西藏红豆杉( t a x u s w a l l a c h i a n az u e c ) 的内生真 菌中分离得到了紫杉醇。姜威等( 1 9 9 8 ) 对生长在长自山地区的东北红豆杉 ( t a x u s c u s p i d a t a s i e b e tz u c c 。) 内生真菌进行了研究，发现其中一株丝状真菌t c h 6 8 的发酵液，体外细胞实验发现能够使细胞有丝分裂停止在中期，可能从中获得新 的作用于微管的抗肿瘤抗生素。 从我国特有的植物喜树当中分离得到喜树碱和羟基喜树碱，而喜树碱在临床 上被广泛应用于肝癌、胃癌、膀胱瘸及鑫盘瘸等的治疗( r i y o r yl c ta l ，1 9 9 5 ) 。 由于喜树中喜树碱、羟基喜树碱的含量极低( o 0 1 - - 0 1 0 ) ，且结构复杂难以合 成，不能满足临床治疗的需要。遥过研究发现，喜树的叶、枝条和采实申内生真 菌丰富。因此，对喜树内生真菌进行体外抗肿瘤活性筛选，在筛选出的l o 个内 8 生真菌菌株孛，有7 株发酵液能显著抑制费血病细胞h l 6 0 的生长( c h a v a ns e t - a l ，2 0 0 4 ) ，这为寻找新药物提供了新的思路。 k u p c h a ns 等( 1 9 7 2 ) 首先跌齿时美登本( m a y t a n u ss e r r a t a ) d ? 获得的离效、低 毒、结构新颖的抗癌有效成分美登索( m a y t a s i n e ) 。周韵丽等( 1 9 8 0 ) 也从美登木 ( m h o o k e r i l o e s ) 中分到了美登素，餐是在其肉生真蘩串并未得到该物覆，张玲琪 簿( 2 0 0 2 ) 酋次报道了从美登木茎、叶中分离筛选到一株产球毛壳甲素的内生真菌 球毛壳蘸。 鬼臼毒素( p o d o p h y l l o t o x i n ) 含有独特的反式内酯环结构，属于细胞周期特异 性药物( 辆仓良等，1 9 9 3 ) ，是合成多种治疗癌症药物韵前体，抗肿瘤活性显著， 因而具有较大的经济价值( 杨新波等，1 9 9 6 ) 。鬼臼毒素一直是从小檗科鬼臼亚科 植物中提取，嚣含鬟低不麓满足要求，对禧物原料需求的增多西使这类植物资源 遭到严重破坏。李海燕等( 19 9 9 ) 从桃儿七( s i n o p o d o p h yl l u mh e x a n d r u m ) 植株中分 离得到2 8 株真菌，其中有两株产鬼翻毒素类儆物，分属于青霉属( p e n i c i l l i u m ) 和 链格孢属( a l t e r n a r i a ) 。杨显志等( 2 0 0 3 ) 从四) l l y k 角莲( d y s os m av e i t c h i i ) 、南方山 旖叶( d i p h y l l e i a s i n e n s i s ) 等产鬼臼毒素的植物中都分离别产鬼臼毒素的内生真菌。 白灰制菌素a ( l e u c i n o s t a t i n a ) 是s t r o b e l 等( 2 0 0 1 ) 在欧洲紫杉( t a x u s b a c c a t a ) 的 内生真菌枝顶霉满翟翻嗍d 撑f 堋嘲肇) 中提取到的，这种物质除了具有杀真菌活性外， 对人体的某些癌细胞具有很强的抑制作用，爨此具有很好的推广价值。 t o r r e y a n i ca c i d 是一种选择性的具有细胞毒的苯醌二聚物( w a n g e n a a rm e t a l ，2 0 0 0 ) ，由一株分离自佛罗里达摄树( 殆础烨纽扣蚴酶内生寞菌的研究发现 其具有较强的抗肿瘸作用，并且可以通过诱导细胞凋亡而促进肿瘤细胞死亡。 异香翌素是一类广泛存在予自然界的天然产物，其中某些纯合物具有通便、 退热等药理作用和明显的抗癌活性。海洋微生物的研究是一个新兴的巨大领域， 红撼林海洋真菌是海洋微生物的重要组成部分。芏军等( 2 0 0 1 ) 扶南海红树 ( r h i z o p h o r a c h i n e n s i s u 的嫩叶中获得一种肉生真菌n o 2 5 3 3 ，其代谢产物很丰 富，其中分离获褥的异香豆素a v i c e r u i n - a 是一种新化会物。w a g e n a a r 等人( 2 0 0 0 ) 从传统药阁植物雷公藤( t r i p t e r y g i u m w i l f o r d i i ) 中分离了一种内生真菌，发现其产 生三种结构新颖的臌松素。进一步研究发现，这三种纯合物都具有抗肿瘤活性。 另外，h u a n g 等( 2 0 0 1 ) 从南方红辍杉( t a x u s 珑口讹0 和香榧( 孙r 强弦矿群船矗器) 等 药用植物孛分离了拟青霉菌属( p a e c i l o m y c e s 蹬) 内生真菌，通过m 订法检测到这 o 种内生真菌具有很高豹抗蘧活性，对人体癌缡胞存抑制作用。 通过对抗肿瘤药用植物内生真菌的研究，从中可以锝到与宿主植物相同的活 性物质，不仅可以扩大药瘸资源，同时也缓解了某些药惩植物资源缺乏闻题，搜 濒危物种得以保存，解决了药用植物资源生长周期长而不能满足人们预防治疗疾 瘸的需求闻遂。 ( 2 ) 抗菌活性 经研究发现，一些来源予植物内生真菌的天然产物具有撺制和杀灭许多病原 微生物的作用，这些微生物包括感染人和动物的细蘑、真菌、瘸毒等瘸原体以及 植物病原葫等。 环肽抗生素( c r y t o c a n d i n ) 是一种多肽化合物，具有抗霉菌活性( s t r o b e lg a e t a l ，2 0 0 1 ) ，是壶分离毒药蘧植耪雷公藤酶蠹生真菌产生韵。不仪对许多植物病原 菌如核盘菌( s c l e r o t i n i as c l e r o t i o r u m ) 和灰葡萄孢( b o t r y d t i sc i n e m a ) 等有抗蘸活性， 还对叁镁丝酵母( c a n d i d aa l b i c a n s ) 、毛癣菌( t r i c h o p h y t o ns p p ) 等有抗菌活性，因 而有望开发成抑制皮肤和指甲真菌感染的药物。从番茄( l y c o p e r s i c u me s c u l e n t u m ) 的根部分离得到的内生真菌尖镰孢霉( f u s a r i u mo x y s p o r u m ) 7 ；尊病原菌有很好的抑 制作用( h a l l m a n nj 默a l ，1 9 9 6 ) 。 麸锡兰肉挂( c i n n a n o m u m z e y l a n i c u m ) 中分离的肉生真菌，遵过产生多种挥发 性物质来抑制或杀灭一些植物和人体病原菌( s t r o b e lg a e ta t ，2 0 0 1 ) 。另外，h a r p e r 等( 2 0 0 3 ) 从t e r m i n a l i a m o r o b e n s i s 的肉生真菌中分离到了两种纯合物p c s t a c i n ，和 i s o p e s t a c i n 。实验证明两者既具有抗菌活性，同时又有抗氧化活性。 邸) 杀虫活性 n o d u l i s p o r i ca c i d s 是一种晖| 哚二萜类化合物，是从檀物b o n t i a d a p h n o i d e s 的 内生真菌中发现的( s t r o b e lg e ta l ，2 0 0 4 ) ，它具有杀灭大苍蝇幼虫的活性。 香豆酮衍生物对云杉蚜虫具有毒性，d s i s y 等( 2 0 0 2 ) 从伏卧盘株树( g a u t t h e r i a p r o c u m b e n s ) 中分离的内生真蔺中发现了两种香豆酮衍生物。 萘是由藤蔓植物的内生真菌产生i 搀( h a r p r ej k 。e ta l ，2 0 0 3 ) 。该优合物是一种 广泛使用的驱虫剂。樟脑球的有效成分。 另外，o s t e r h o g ec ( 2 o ) 缺绿藻类磊莼( ( 蕊躲泌级徽d 植物蠹生真菌中分离出 一种新的结构异常的四聚体酸对瘫原虫k 1 和心5 4 有抗性。从内生真菌 g e o t r i c h u ms p 的发酵液中分离出三种赫的二氢异香要素衍生物和扶内生真菌 l o p h o m o p s i ss p b c c l 3 2 3 中分离出的雠种新的二聚体，都具抗疟疾作用( i s a k am e t a l ，2 0 0 1 ) ；同时这两种物质还有抗结核的作用。 禾本科植物内生真菌能够产生多种生物碱，如有机胺类，麦角碱类等。这些 生物碱有抗病原菌、抗线虫等多种生物学作用，其中大多数对食草昆虫及哺乳动 物有较强的毒性。f i n d l a y 等扶云杉等针叶树的内生真菌豹代谢产物中发现了一 系列具有抗虫活性的物质。如从胶冷杉似6 洒b a l s a m e a ) r 扣分离到一株内生真菌 ( 不产孢，来鉴定) ，在它的液体发酵产物中分离出2 个二菇类化合物9 a - h y d r o x y - 1 ， 8 ，5 - i s o p i m a r a t r i e n 一3 ，7 ，11 - t r i o n e 和对9 a - h y d r o x y l ，8 ，1 5 一i s o p i m a r a t r i e n 3 ， 11 d i o n e ，对擞色卷蛾( c h r i s t o n e u r a f u m i f e r a n a ) 的胃毒致死率分别为2 8 和3 2 。 从黑云杉( p i c e am a r i a n a ) 的一株内生真菌c a n o p l e ae l e g a n a 的液体发酵物中分离 到的2 个舜香豆素类仡合物，均对云杉蚜虫具有唆显毒性。 ( 4 ) 植物生长调节物质 内生真菌长期和宿主植物生活在一起，对植物的生长发育具有很重要的作 用。研究表明植物内生真菌可以产生或促进宿主植物产生某些植物激素。张集慧 等的研究则证明金线莲( a n o e c t o c h i l u sr o x b u r g h i i ) 、铁皮石斛( d e n d r o b i u m c a n d d i d u m ) 、天麻( g a s t r o d i a et a r a ) 等兰科植物内生真菌能够产生赤霉素( g a 3 c i 、 吲哚乙酸( t a a ) 、脱落酸( a b a ) 等植物生长调节剂。 ( 5 ) 免疫抑制剂 分离臼药用植物雷公藤的镰孢菌属( f u s a r i u ms u b g l u t i n a n s ) 内生真菌能产生 一种非细胞毒的二菇毗酮类化合物s u b g l u t i o n o la 和8 ，实验证明，两者都具有 免疫抑制活性。两者在m l r ( m i x e d l y p h o c y t e r e a c t i o n ) 和t p ( t h y m o c y t ep r o l i f e r a t i o n ) 评价系统的i c 5 0 都为o 1t m a o l l ，与环孢菌素a 相比较，m l r 系统分析发现嚣 者的活性与其相当，而t p 因为s u b g l u t i o n o la 和b 实验结果则显示环孢菌素a 的活性比两者高1 0 4 倍，但缺乏细胞毒性，所以二者仍将具有诱入的应用前景。 ( 抗氧化剂 h a r p e rj k 等( 2 0 0 3 ) 从t e r m i n a l i am o r o b e n s i s 的内生真菌中分离到了两种纯合 物p e s t a c i n 和i s o p e s t a c i n ，实验证实，两者既具有抗菌活性，又有抗氧化活性。 p e s t a c i n 是一种消旋体，实验发现其抗氧化活性至少比t r o l o x ( v e 的衍生物) 大 一个数量级。i s o p e s t a c i n 的结构与f l a v a n o i d s 相似，在缓冲液中，它可以消除超 氧自由基和羟基自由基。 7 ) 其他活性作用的疼生真蔻 包括产胞外多糖的内生真菌和产香料物质的内生真菌。微生物胞外多糖通常 是指某些微生耪发酵产生麴一类水溶性胶，函箕独特豹理纯性囊，可作为乳化裁、 胶凝剂、悬浮剂等广泛应用于石油、化工、食最和制药等领域。张玲琪等( 1 9 9 9 ) 从德蓄鸢尾( i r i s f e r m a n i c a ) 豹根状茎干片率分离翻1 4 株丝状真菌，其中l 株能产 鸢尾酮。鸢尾酮具肖紫罗兰鸯，是一种高级香料，耳前主要从植物中提取，此虎 生真菌的获取又为利用微生物发酵生产鸢尾酮奠定了基础。 s 。内生真菌成为抗菌活性物质重要来源的可熊性 最近有入对微生物及其植物宿主之间的关系进行研究发现，所有的高等植物 都有一种线凡种内生真菌寄生，这些微生耪包括真菌、缨菌和放线菌。尽管有无 数的微生物与植物相联系，但是内生真菌较之体外及土壤微生物，与寄主植物之 间的生物联系更密诱，医此麟产生的代谢物质笼其是生物活性物质不论在数量 还是种类上都比植物体外微生物产生的更多、更新。内生真菌在自身进化过程中 也更好地适应寤主或者产生菜些鲡抗菌等对寤主有益酶功巍，例如某些内生真菌 为宿主提供抗菌化台物，而宿主为内生真菌提供营养，最终在内生真菌与宿主之 闻形成7 备饕专一梭的或非专一性的共生关系，这种共生关系也揭示了内生真菌 与宿主之间存在着的复杂而按同的生化联系。芷是有了这种关联，才使部分内生 真菌能够产生与宿主相同或相似豹抗菌活性成分，使植物蠹生真菌中具有抗菌活 性的菌株比率大大增加，为我们利用植物内生真菌筛选活性高、结构新颖的抗菌 活性纯合锈提供了有利蘸条律。 6 存在的问题与展望 内生寞菌及其代谢产耪的研究在近年来虽然取得了较丰硕韵成果，但也发现 了许多问题，主要袭现在以下几个方面： ( 1 ) 酃使用多种不同豹培养基来培养植物组织，也不能保证所有生活在植物 组织内的内生真菌全部被分离出来( 文才艺等，2 0 0 4 ) ，专性寄生内生真菌不能在 入王培养鏊上生长，也有哥熊是植物正处在菲内生性瘸原菌感染初期，这样分离 到的就不定是目的走生真菌。一 0 ) 内生真菌毂鉴定较势隧难。虽然分离到癍生真菌，但是有酶菌株在人工 培养基上不产生孢再从已有的研究结果来看，不产孢蘧株占总壤株数的比例离 1 2 达4 1 3 这些不产孢菌株是无法用传统的形态学方法来进行鉴定。 ( 3 ) 植物内生真菌作用机理的研究有待深入。内生真菌对宿主植物的有益影 晌是基翁研究的熟点之一。如果说是由内生真菌本身或其刺激宿主植物产生的次 生代谢物所致，而产生这些物质的代谢调控机理是什么? 是如何在植物体内运转 和发挥作用的? 有关这方蘧的研究王作还不够深入。 ( 4 ) 由于内生真菌代谢产物数量极少，为新化合物分离增加了难度，很容易 也现漏失( 文才艺等，2 0 0 4 ) 。即使分离到新化合物，又往往会因为量太少两不足 以完成结构鉴定和活性测定的所有程序。 植物内生真菌妁研究仍处于起步阶段。尽管人钔在植物痣生真菌的种类、生 态分布、代谢产物等方面做了很多正作( 郭良栋等，2 0 0 1 ) ，但仍缺乏全面系统深 入的研究，丽且迄今为止研究过的植物也不过数百种，还有大量的研究工作需要 进一步开展。结合学科发展的趋势，内生真菌的分子检测和鉴定、植物内生真菌 的多样性、植物内生真菌与寄主植物闻专一性机理和分布等生态学阀题、植物内 生真菌在寄主中的种群组成和相互关系、植物内生真菌产生与寄主相同或相似的 生物活性物质的遗传机制，以及植物内生真菌的具有工农业生产与医药价值的代 谢产物的开发和利用等领域可能将是今后植物内生真菌的主要研究内容( 王永中 等，2 0 0 4 ) 。 研究目的和意义 我国植物资源十分丰富，但目前能进行人工栽培的药用植物仅几百种，绝大 多数豹药爝资源仍然来源于野生种类( r y a n c a 。e ta 1 ，2 0 0 2 ) 。尤其是近年来，入 类对药物特别是天然药源药物的需求量急剧增大( f a e t hs h e ta l ，19 9 7 ) ，在经济 利益酶驱健下，入稍对一些药用植物瓷源实行掠夺式采挖，加上过度放牧、乱垦 滥伐等其它原因，造成些野生药用植物丧失了合适的生长环境以及正常的繁育 能力，不少野生种类的蕴藏曩急剧下降，甚至濒临灭绝( 陈抗事等，1 9 9 4 ) ：与诧 同时也造成了某些药物价格昂贵、供不应求的状况。因此，新药的开发显得意义 尤为重大。以往化学合成的药物对入类有一定毒副作用，从安全性和环境角度考 虑，人们开始关注并使用高效低毒性和对环境影响小的抗生素化学治疗剂和农雳 化学品，人们的焦点也开始转向了天然药物。目前主要获得天然药物的方法是直 接从药用植物中提取，大批疗效独特的抗癌、抗舯癯、抗菌活性成分被筛选出来， 而药 用植物在拯救人类生命的同时，资源却日益稀少，为了使入与自然和谐发展， 顺应当今时代发展的主题以及可持续发展的战略，微生物药物的研究越来越受魏 国内外的重视。自然界中微生物及其代谢产物的多样性，也为发现新药提供了不 竭动力，地球上的植物资源将是内生真菌及其代谢产物的巨大资源库，综合各方 面，进行内生真菌的研发具有重要的意义和广阔的前景。 为了解决某些药震植物生长缓慢、资源紧张等因素带来的药源紧张秘生态破 坏问题，从药用植物内生真菌中发现与宿主相同或相似的药物，以及新的活性化 合物，我国加强了对药餍植物态生真菌代谢产物的相关研究。 贵州各族人民在长期与疾病作斗争的实践中，积累了丰富多彩的独特医药经 验，鬼本民族鲶健康和繁衍昌盛作出了重要的贡献；弱时贵州邕然环境独特，药 材资源丰富，民族医药极具特色，是我国四大产药区之一。在自然环境中有抗菌 佟震的天然植物很多，其中不少经现代药理研究证赞不但有广谱酶抗菌作尾，蔼 且有抗病毒作用，随着医药技术的进步，人们从这些植物中开发了许多抗菌药， 将它们用予l 隆床抗感染治疗。根据文献调研，发现楚山姜、吴架萸、黄柏、岩鞋 豆、追风散和木兰6 种黔产药用植物的提取物具有较好的抗菌活性，本实验室的 翦麓研究工作结果亦证鳃了这一点，毽对其内生真菌代谢产物鲶纯学成分及活性 1 4 研究报道却很少。 为了从植物内生真菌代谢产物中寻找到活性高、结构新颖的抗菌活性化合 物，本论文通过开展6 种黔产药用植物内生真菌的分离纯化，筛选具有活性代谢 产物的内生真菌，利用多种层析手段对抗菌活性好的内生真菌代谢产物成分进行 分离和纯化，并通过理化方法及光谱分析鉴定化合物结构，从而为黔产药用植物 内生真菌更深入的研究与资源的开发利用奠定基础。本研究是6 种黔产药用植物 内生真菌资源开发利用的前期基础研究，其成果对后续研究具有重要的参考价值 与指导意义。 三、艳山姜等黔产药用植物内生真菌的分离 我国植物资源极其丰富，选择药用植物作为内生真菌的分离材料，是因为药 用植物本身就能产生多种活性成分，面宿主与内生真菌在相互作瘸过程孛，有的 内生真菌能产生与宿主相同或相似的活性物质，因此从药用植物中分离到产生活 性物质的内生真菌的机率可能就更大。根据这一观点，药用植物内生真菌一直是 近年来筛选一些重要医用药物的理想途径，特别是生产成本高、价格昂贵或其它 途径不易得到的药物。 贵州的中药资源十分丰富，资源名列全囡第4 位，是驰名中外的地道药材之 多，素享“黔遗无闲草，夜郎多灵药嚣之美誉。据1 9 8 3 - 1 9 9 2 年贵娴省中药资 源普查结果，贵州有中药资源4 2 9 4 种，其中药用植物3 9 2 7 种、药用动物2 8 9 种、 药用矿物7 8 种。目前，贵州中药资源通过普查统计得到，贵州省4 2 9 4 种资源中 实际利用的仅有2 5 0 种左右( 其中8 0 来自野生采集) 。为了合理利用贵州的药物 资源，从植物内生真菌代谢产物中寻找到活性商、结构新颖的抗菌活性仡合物， 因此，重点选择对黔产药用植物的内生真菌进行研究。 根据文献调研，发现黔产药用植物艳出姜，吴茱荑，黄柏，岩甄豆，追风散， 木兰的提取物具有较好的抗菌活性，前期的研究工作结果亦证明了这一点，但对 其内生真菌代谢产物的化学成分及活性研究报道却很少。本实验采用组织分离法 对6 种黔产药用植物的内生真菌进行分离，建立植物内生真菌的样本资源库，为 植物内生真菌代谢产物的研究打下基础。 1 材料和实验方法 1 1 材料 1 1 。l 实验材料 吴茱萸、黄柏、木兰 采集囱贵阳药用植物园内 岩豇豆、艳山姜、追风数购于贵阳万东大桥下药材市场 1 1 2 培养基 w a 一抗生素培养基：马铃薯2 0 魄( 只取滤汁) ，葡萄糖1 5 9 ，琼脂1 5 9 ，补永 至1 0 0 0 m l ，0 0 5 m p a ，1 1 5 ，灭菌2 0 m i n ，自然冷却到4 0 。c 后，再加入氨苄青 霉素2 0 0 m g ，链霉素2 0 0 m g 。 1 6 p d a 培养基：马铃薯2 0 0 9 ( 只取滤汁) ，葡萄糖1 5 9 ，琼脂1 5 9 ，补水至1 0 0 0 m l ，0 0 5 m p a ，11 5 ，灭菌2 0 m i n 。 马铃薯去皮，切成块加水煮沸2 0 3 0 m i n ，然后用纱布过滤，取滤汁，再加 入葡萄糖及琼脂，溶化后补水至1 0 0 0 m l 。 1 1 3 主要药品及仪器 1 1 3 1 药品 琼脂福建省莆田县平海琼脂加工厂分析纯 升汞上海试四赫维化工有限公司分析纯 葡萄糖沈阳化学试剂厂 分析纯 “ 链霉素国药集团圆瑞药业有限公司1 0 0 万单位 氨苄青霉素 华北制药华胜有限公司8 0 万单位 1 1 3 2 仪器 恒温振荡器d h z c 高压蒸汽灭菌锅g m s x - 2 8 0 受 超净工作台 s w - c j 1 f 电热恒温培养箱h h 、b h 4 2 0 显微镜b x 5 l 电子天平 j a 2 0 0 3 1 2 实验方法 江苏太仓实验设备厂 北京市永光甓医疗仪器厂 苏州安泰空气技术有限公司 天津市实验仪器厂 o l y m p u s 显微镜 上海天平仪器厂 1 2 。l 菌种的分离 植物组织样本先清洗干净，经7 5 的医用酒精浸泡5 m i n ，用无菌水清洗后， 爵用o 1 的氯化汞溶液浸泡l m i n ，对表面彻底消毒，用无菌水清洗，然后用灭 菌小刀、镊子、剪刀等去掉表面组织，并把组织切成0 5 c m 的长段，最后用无菌 水清洗后置于w a 抗生素培养基上，2 7 培养5 两，每天观察记录培养情况。 对照实验：将上述经过表面消毒的，未作剪切的植物组织直接置于w a 抗 生素培养基上，于相同条件下培养，以植物组织周围没有任何慧长出、重复三次 结果致时，确定所分离的为内生真菌。同时将最后次清洗植物组织后的无菌 水涂布予w a - 抗生素培养萋上，检查组织表面消毒是否彻底，如无菌生长说明 消毒彻底。 1 7 1 2 2 菌种的纯纯及僳存 取切豳处新长蹬的菌熊，及时转接至p d a 培养基上培养，待菠落嫩现蜃， 根据菌落形态、颜色的差异以及长出时间驹不同，分剐挑取各平板上的菌落边缘 的菌丝接辩于p d a 培养基上进行分离培养。用菌丝尖端纯化法逐步纯纯，反复 5 次得到纯化昀菌丝。对菌株编号蓿，转至p d a 斜面培养基上，予2 7 培养5 7 d ， 然后放入4 4 c 冰箱傺存， 2 结果与分析 、罴震缍织块分离方法，姨不蓊越褥翦不嚣簿位努嵩凄蠹生囊落1 0 2 椿，吴蒋 见表l ： 表i 内嶷真菌势襄藜暴 t a b l e