（光学工程专业论文）多通道dna分析仪嵌入式系统研究.pdf

浙江大学硕士学位论文 摘要 摘要 在过去的二十几年内，分子遗传学取得了辉煌的成就。而这些成就的取得，与分析技 术的发展、分析仪器的完备是分不开的。d n a 分析仪作为分子遗传学的基础分析仪器更 是取得了长足的进步。我国在d n a 分析技术及其应用领域虽有不俗表现，但至今未能在 市场上看到一台具有完全自主知识产权的d n a 分析仪器。 本课题来源于2 0 0 8 年科技部创新方法专项，旨在研发具有高通量、高稳定性和适用 于车载性能的d n a 分析设备。设计的d n a 分析设备采用毛细管电泳方式实现d n a 片段 的快速分离，采用毛细管阵列达到提高系统分析通量的目的；荧光检测系统则采用具有高 灵敏度和高信噪比的共聚焦激光诱导荧光检测系统，其中多通道d n a 样本的并行检测， 使用f - t h e t a 物镜- 9 振镜构成的光学扫描结构来实现，另外利用滤色片轮分时切换技术实现 仅使用单个p m t 完成多色荧光信号的检测。设计的新型多通道d n a 分析仪采用基于嵌入 式平台的控制系统，实现稳定、可靠的系统控制，满足系统小型化的要求。 本论文主要工作是对应用于多通道d n a 分析仪的嵌入式控制系统进行研究。通过分 析多通道d n a 分析仪在使用过程中的控制需求，对比分析各种不同设计之间的优劣，选 择满足系统控制需求、同时经济可行的设计方案。设计的嵌入式控制系统采用基于 a r m 7 t d m i - s 内核的l p c 2 3 7 8 高性能3 2 位r i s c 微控制器作为主控芯片，扩展相应的控 制电路，完成自动灌胶、自动进样、电泳高压控制、光学扫描、微弱荧光信号采集等功能， 实现d n a 分析的全自动化。系统的光学扫描频率设定为8 h z ，数据采集系统的最高采样 速率为6 3 k b p s ，同时其探测下限为5 l s b ，动态范围达到1 3 位。 本论文同时还对激光诱导荧光检测系统中振镜的离焦对系统荧光收集效率的影响进 行了理论分析与光学仿真，并定义了荧光收集效率不均匀度，用于度量系统在整个视场中 荧光收集效率的不一致性。仿真结果表明，设计的l i f d 系统用于并行检测4 8 通道d n a 样本时，荧光收集效率不均匀度为6 9 2 。最后利用设计的嵌入式控制系统与激光诱导荧 光检测系统联合搭建了实验平台用于对理论分析进行了实验验证。实验结果显示实际 l i f d 系统的荧光收集效率不均匀度为7 6 1 ，较仿真结果偏大。 关键字：d n a 分析、多通道、光学扫描、嵌入式系统 浙江大学颁_ j 学位论文 摘要 a b s t r a c t o v e rt h el a s tt w e n t yy e a r s ，m o l e c u l a rg e n e t i c sh a sm a d er e m a r k a b l ea c h i e v e m e n t s t h e s e a r ec o n t r i b u t e db yt h ed e v e l o p m e n to fa n a l y t i c a lt e c h n o l o g i e sa n da n a l y t i c a li n s t r u m e n t s d n a a n a l y z e r , a st h eb a s i ci n s t r u m e n to fm o l e c u l a rg e n e t i c si sa l s om a d ea c o n s i d e r a b l ep r o g r e s s w e d oh o l du pq u i t ew e l li nt h ef i e l do fd n a a n a l y s i st e c h n o l o g ya n di t sa p p l i c a t i o n s ，b u t u n f o r t u n a t e l yt h e r ei s n od n aa n a l y z e rw h i c hi s 、而t hc o m p l e t e l yi n d e p e n d e n ti n t e l l e c t u a l p r o p e r t yr i g h t sc a n b ef o u n di nt h em a r k e t t h i st o p i ci ss u p p o r t e dt h em i n i s t r yo fs c i e n c ea n dt e c h n o l o g yi n n o v a t i v em e t h o do f2 0 0 8 ， w h i c ha i m st od e v e l o ph i g h t h r o u g h p u t ，h i g he f f i c i e n c ya n do n s i t ep e r f o r m a n c ed n aa n a l y z e r h i g h s p e e dd n as e q u e n c i n ga n df r a g m e n ts i z i n ga r ea c h i e v e dt h r o u g he l e c t r o p h o r e s i sa n d c a p i l l a r ya r r a ye l e c t r o p h o r e s i sh a sb e e ne m p l o y e dt oe n h a n c e t h et h r o u g h p u to ft h en o v e ld n a a n a l y z e r c o n f o c a ll a s e ri n d u c e df l u o r e s c e n c ed e t e c t i o n ( l i f d ) s y s t e mi sa d o p t e db e c a u s eo fi t s h i g hs e n s i t i v ea n dh i g hs i g n a l - t o - n o i s er a t i o n o p t i c a ls c a n n e rc o n s i s t e do ff - t h e ml e n sa n d g a l v a n o m e t e ri su s e dt od e t e c tm u l t i c h a n n e ld n as a m p l e s o n l yo n ep m t i ss u f f i c i e n tt o d e t e c td i f f e r e n tf l u o r e s c e n c es i g n a l sb yu s i n go n et i m e s h a r i n gc o l o rf i l t e rw h e e l e m b e d d e d s y s t e mi sd e s i g n e dt om i n i m i z eo u rs y s t e ma n dp r o v i d es t a b l ea n d r e l i a b l ec o n t r 0 1 t h i st h e s i ss t u d i e st h ee m b e d d e dc o n t r o ls y s t e ma p p l i e dt on o v e lm u l t i c h a n n e ld n a a n a l y z e r b ya n a l y z i n gt h ec o n t r o lr e q u i r e m e n t so f t h en o v e ld n a a n a l y z e r , e v a l u a t i n gd i f f e r e n t d e s i g n st oc h o o s et h ef i n a ld e s i g ns c h e m e st h o s em e e tt h ec o n t r o ln e e d sa n da r ea l s oc o s t ： e f f e c t i v e t h ee m b e d d e ds y s t e ma d o p t sl p c 2 37 8a st h em a i nc o n t r o l l e rw h i c hi sa l l a r m 7 t d m i - sb a s e dh i g h p e r f o r m a n c e3 2 b i t sr i s cm i c r o c o n t r o l l e r , a n do t h e rc o n t r o lc i r c u i t s a r ee x t e n d e df o ra u t og e lf i l l i n g ，a u t os a m p l i n g ，h i g hv o l t a g ec o n t r o l ，o p t i c a ls c a n n e r , w e a k f l u o r e s c e n c ed a t aa c q u i s i t i o ne ta l ，t oi m p l e m e n tf u l l ya u t o m a t e dd n aa n a l y s i s t h ef r e q u e n c y o fo p t i c a ls c a n n e rh a sb e e ns e tt o8 h z t h em a x i m u ms a m p l i n gr a t eo fd a t aa c q u i s i t i o ns y s t e mi s u pt o6 3 k p b s ，w h i l ei t sl i m i to f d e t e c t i o n i s5 l s ba n dd y n a m i cr a n g ei su pt o1 3b i t m e a n t i m et h ee f f e c to fd e f o c u so ft h eg a l v a n o m e t e ro nf l u o r e s c e n c ec o l l e c t i n ge f f i c i e n c y w a sa n a l y z e dt h r o u g ht h e o r e t i c a la n a l y s i sa n do p t i c a ls i m u l a t i o n t h ef l u o r e s c e n c ec o l l e c t i n g e f f i c i e n c yn o n - u n i f o r m i t y ( f c e n u ) w a sd e f i n e dt oe v a l u a t et h ei n c o n s i s t e n c yo ff l u o r e s c e n c e c o l l e c t i n ge f f i c i e n c yi n w h o l ev i e wf i e l d s i m u l a t i o nr e s u l t ss h o wt h a tf c e n uo ft h e 浙江大学硕士学位论文 摘要 4 8 一c h a n n e ll i f ds y s t e mi s6 9 2 a tt h ee n d ，w eb u i l ta ne x p e r i m e n tp l a t f o r mw i t hl i f d s y s t e ma n dt h eh o m e m a d ee m b e d d e dc o n t r o ls y s t e mt ov e r i f yt h e o r e t i c a la n a l y s i s e x p e r i m e n t a l r e s u l t sd e m o n s t r a t et h a tf c e n uo fa c t u a ll i f ds y s t e mi s7 61 ，l a r g e rt h a ns i m u l a t i o nr e s u l t s k e y w o r d s ：d n aa n a l y s i s ，m u l t i c h a n n e l ，o p t i c a ls c a n n i n g ，e m b e d d e ds y s t e m i v 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包含为获得逝姿盘鲎或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：锄 签字日期： 却f 口 年 易月 矿日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解迸婆盘鲎有权保留并向国家有关部门或机构送交本 论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝姿盘堂u r 一1 7 沧 文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段 保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：乓瞬 签字日期：沙7p 年易月 ，口目 导师签名： 签字日期：c ，u 加年乡月of t 浙江大学硕士学位论文 致谢 致谢 首先我要衷心感谢我的导师严惠民教授。严老师将我带入充满神奇的d n a 分析领域， 让我感受到这一高度交叉的学科的魅力与活力。在两年多的学习时光中，严老师一直无私 地为我提供悉心的指导与全面的帮助，使我的科研能力得到了很好的锻炼与提升。严老师 渊博的学识、严谨的治学态度以及实事求是的工作态度，给我树立了良好的学习榜样。严 老师在学习及生活中给我提出的中肯的意见与建议，将使我受益终生。 我还要感谢本文的另一位指导老师王立强老师。王老师以其扎实的专业知识，在本课 题的实施过程中给我提出许多宝贵的改进意见，同时在我遇到困难时，他总能及时地帮我 分析问题所在，并与我一起解决问题，使我能够顺利地完成课题任务。王老师性格爽朗、 态度平和，是不可多得的良师益友。 同时我要感谢石岩老师在光学设计、光学仿真等方面给予的帮助，使我能够在激光诱 导荧光检测系统的荧光收集效率方面进行分析与验证。同时也要特别感谢上官王聘同学在 实验过程中给予的帮助。 衷心感谢中心的曹向群老师。曹老师以其旺盛的工作热情、和蔼可亲的态度，在学习 工作与生活上给予中心的每一位同学无微不至关怀与关注。我还要感谢袁波老师，在我刚 进入中心时给予我的指导，使我能够明确自己的目标，不再迷惘。同时要感谢中心的林斌 老师、倪旭翔老师。 我要衷心感谢张秀达师兄在学习工作中对我提出的宝贵意见，同时也感谢在本课题完 成过程中他为我答疑解惑，而且还提供了许多实验器材。感谢姜燕冰师兄、陈浙泊师兄、 孙鸣捷师兄在我的学习过程中给予的支持与鼓励。另外还要感谢与我一同在中心学习的姚 金良、王英男、黄恩立、杨超、叶斌、马俊以及刚进中心的苏恒、周琴等同学，在中心的 学习生活，因为有你们的陪伴显得更加的丰富多彩。 我想借此机会向我的父亲、母亲以及哥哥说一声“感谢”。他们始终以一种不求回报 的方式默默地支持着我，使我能够顺利地完成我的学业。没有他们做我强大的后盾，我不 可能有机会成就今天。 时光飞逝，犹如白驹过隙，在求是园求学的两年多时间已悄然接近尾声。回想这两年 多时光，思绪万千，感触良多。仅以此文，聊表谢意。 李晖 2 0 1 0 年1 月于求是园 浙江大学硕十学位论文绪论 1 绪论 1 9 5 3 年沃森和克里克提出了d n a 分子的双螺旋结构，分子生物学时代随之开启。分 子生物学从分子水平研究生命本质，以核酸和蛋白质等生物大分子的结构以及其在遗传信 息与细胞信息传递过程中的作用为研究对象【1 1 。核酸( 包括d n a 和r y a ) 、蛋白质、多糖 和脂质是组成生物体的4 类大分子。其中d n a 是生物体中遗传信息的原始载体，通过半 保留复制方式将遗传信息传递给子代，然后经转录将特定基因的遗传信息转换成相应的 m r n a ，后者将氨基酸按一定的顺序连接成特定的多肽，多肽在伴侣分子的帮助下折叠成 具有生物活性的蛋白质。蛋白质是遗传信息表达的最终产物，几乎参与到所有生物功能当 中，如：催化化学反应；作为细胞内及细胞间的运输分子；控制膜的渗透性；支持细胞、 器官和机体结构等【2 1 。核酸和蛋白质的合成是生物体在其生命活动中遗传信息流动的主 线，统帅着生命的全过程。 分子生物学的开启，使人们对生物大分子的研究进入一个全新的阶段，对遗传的研究 深入到分子水平，人们从此开始从分子角度来研究生命科学。为了清楚地了解遗传信息的 构成与传递的途径、揭开“生命之谜”，对作为生物体遗传信息原始载体d n a 的分析便成 为了人们的首要任务。 1 1d n a 分析的生物学依据 d n a ( d e o x y f i b o n u c l e i ca c i d l 卜脱氧核糖核酸，是脱氧核苷酸的聚合物。脱氧核苷酸 由含氮有机碱( 碱基) 、戊糖( 脱氧核糖) 和磷酸组成。组成d n a 的碱基主要是嘌呤和嘧啶的 衍生物，包括腺嘌呤( a ) 、乌嘌呤( g ) 、胞嘧啶( c ) 和胸腺嘧啶( t ) ，其结构如图1 1 所示。碱 基和脱氧核糖组成脱氧核糖核苷，而脱氧核糖核苷的戊糖羟基与磷酸以酯键连接形成脱氧 核苷酸，多个脱氧核苷酸通过3 ，5 磷酸二酯键连接形成脱氧多核苷酸链即单链形式 的d n a 链。天然的d n a 由两条长的单链d n a 互相缠绕成双链螺旋状。螺旋的d n a 多 聚核苷酸链通过相应链上碱基间的o h - 相互连接。碱基以特定的互3 1 、配对出现，即只有a 与t 配对，g 和c 配对，其中a t 碱基对通过两个氢键相连，而g c 碱基对则由三个氢 键相连，结构如图1 2 。a t 和g c 碱基对位于分子内部，5 - - - * 37 连接的磷酸基团和脱氧核 糖成分构成单链的骨干。d n a 分子两条链彼此按相反的方向排列，一条链的方向是由 37 _ 5 ，另一条则是5 _ 37 。当已知一条链上的碱基顺序，按照碱基互补原则即可决定另一 条链上的碱基序列。碱基互补原则具有十分重要的生物学意义，它不仅与d n a 的结构有 关，而且d n a 的复制、转录和遗传信息的传递都与它有着密切的关系。 浙江 学碳 学m z a d e n i n e ( a 】 一c h g u a n i n ec y t o s i n et b y m i n e f g l( c )( 1 3 搿ii 纽r i ) n a 的日绅醢基结柳 p h o s i 2 m t es u g “ m0 i e c u l em 0e c u l e 田12 d n a 双螺旋结构模型i d n a 分子的结构可以分为一级、二级和三级结构。d n a 分子中脱氧棱苷酸的连接方 式与排列顺序一一即a 、g ，c 、t 四种碱基的排列组合，称为d n a 分子的一级结构。二 缎结构是指d n a 分子中稳定的空间立体结构，印沃森和克里克建立的d n a 双螺旋结构 而三级结构则是指具有二级结构的核酸所形成的更复杂的折叠状态。其中一级结构中高度 有序的碱基序列蕴含t 丰富的遗传信息。任何一种不同的d n a 序列都能反映出它的高度 个体性或种族特异性，而这种不同物种或同一物种不同个体闸萋闺组序列的特异性，称为 d n a 的多态性卜1 1 d n a 的多惫性分为两种：序列多意性和长度多态性 i 。序列多志性印 d n a 片段的碱基排序存在个体差异，如h l a 基因中由于存在几个或几十个碱基的差异， 便形成多样的l i l a 类型。长度多态性是指特定位点中重复单元的重复次数有所不同，使 得d n a 片段长度不一，固此长度多态性叉称可变数日串联重复序列( v nr r ) 。d n a 多惠 性遵守孟德年退传规律，由亲代遗传给子代，且十分穗定、无组织特异性这种符合孟德 水规律曲其育个体差异- 陛的d n a 多态性，是将d n a 分析作为个体识别与亲子鍪定的理 论基础。 。i，l。 f 文 卜忙叫：匕 严恕丫 。_蓦 0 仓v 爿 叫 卜鑫z-一 浙江火学硕t 学位论文绪论 一级结构决定d n a 的高级结构，因此研究d n a 的一级结构对阐明遗传物质的结构、 功能以及它的表达、控制都非常重要，也只有阐明某种生物基因组的核苷酸序列，才可能 破译其全部遗传信息【1 1 。 1 2d n a 分析技术现状及发展 d n a 分析只是认识基因遗传、揭开生命机制的第一步，但也是最重要的一步【7 1 。遗传 信息存在于d n a 分子一级结构的碱基序列中，要弄清楚特定序列所表达的信息，首先要 进行序列测定。 2 0 世纪6 0 年代以前，由于分离分析技术和研究方法上的限制，d n a 序列分析进展缓 慢，直到7 0 年代中后期，两种d n a 测序技术被发明并广泛应用于d n a 分析中，才使 d n a 序列分析成为可甜1 1 。1 9 7 7 年2 月m a x a m 和g i l b e r t 在美国科学院院报上发表 了( ( an e wm e t h o df o rs e q u e n c i n gd n a ) ) 一文，标志着化学降解法的建立【8 】。该方法独具的 鲜明特点是可以探测d n a 构象中的蛋白质一d n a 之间的相互作用。在这一方法中，一个 末端标记的d n a 片段在5 组互相独立的化学反应中分别得到部分降解，每一组反应特异 地针对某一种或某一类碱基，因而产生了5 组由放射性标记的分子，从共同起点( 放射性 标记末端) 延续到发生化学降解的位点。每组混合物中均含有长短不一的d n a 片段，该 组反应所针对的碱基在原d n a 全片段上的位置决定了d n a 分子的长度。然后，通过对 各组混合物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测末端标记分子，从而读出d n a 序列。几十年过去，m a x a m g i l b e r t 化学降解法白提出以来没有太大变化。虽然陆续设计 了另外一些化学降解反应，但它们一般只作为m a x a m g i l b e r t 化学降解法的补充。 双脱氧核苷酸末端终止法简称为s a n g e r 法或末端终止法，是由s a n g e r 等人于同年1 2 月提出的【9 1 。该技术的高明之处在于引入了双脱氧核苷三磷酸( 2 ，3 d d n t p ) 作为链终 止剂。与普通d n t p ( 脱氧核苷三磷酸) 不同的是2 ，3 d d n t p 在脱氧核糖的3 位置缺少 一个羟基，所以，它虽然可以在d n a 聚合酶作用下通过其5 三磷酸基团掺入到正在增长 的d n a 链中，但由于缺乏3 羟基，2 ，3 d d n t p 无法同后续的d n t p 形成磷酸二酯链，于 是，d n a 链的合成便嘎然而止。如果在d n a 合成体系的4 种普通d n t p 中加入少量的一 种d d n t p ，链延伸将与偶然发生但却高度特异的链终止展开竞争，结果就形成了一系列长 短不一的核苷酸链。在4 组独立的d n a 合成体系中分别采用4 种不同的d d n t p ，就可以 产生4 组寡核苷酸，每组将产生以一种特异性的d d n t p 为末端的不同长度的核苷酸链。 之后经过一定的分离技术及检测方法，即可读出需要测定的d n a 分子的全部顺序。 浙江人学硕士学位论文绪论 在m a x a m g i l b e r t 化学降解法和s a n g e r 法刚刚问世时，前者由于所需操作简单、试剂 完备而占据上风。随着m 1 3 噬菌体、噬菌粒载体的发展和简单易得的合成引物，以及测 序反应的日臻完善，加之化学降解法中使用的化学试剂存在毒性，目前s a n g e r 法远比 m a x a m g i l b e r t 化学降解法的应用更为广泛。s a n g e r 法之所以被现代d n a 分析中广泛采用 的另一个重要原因是s a n g e r 法更易实现d n a 分析的全自动化，这对于满足目前人们对大 规模、高通量d n a 分析的需求而言，至关重要。 作为人类基因组计划基础的s a n g e r 法在人类基因组测序过程中发挥了巨大的作用。 目前，人类基因组计划虽然已经完成，但基因组测序的需求却未减反增，更多的基因组需 要测定，这也促使人们发展新一代的更廉价、更快速且更灵敏的测序技术【1 0 1 。也正是这种 需求的出现，推动了新技术的发展，出现了焦磷酸测序技术( 以罗氏公司g s 2 0 系统和f l x 系统为代表) ，单分子阵列原位扩增测序技术( 以i l l u m i n a 公司的s o l e x ag e n o m ea n a l y s i s s y s t e m 为代表) ，以及支持寡核苷酸和检测的s o l i d 方法( 以a b i 公司的s o l i d 测序仪 为代表) 等新型高速测序技术。 d n a 测序技术的革新及其相应技术的创新与应用，推动了d n a 分析仪器的进步。 d n a 分析仪发展至今，可以分为四个阶段【1 1 , 1 2 。第一阶段为非自动化同位素垂直板凝胶 电泳测序技术。这一阶段的测定策略主要是在所有不同长度的聚合物片段中掺入放射性同 位素，在四个聚合反应中加入四种碱基的双脱氧核苷三磷酸，待反应结束后，将得到四组 分别在a 、g 、c 、t 位置终止的不同长度的d n a 片段。将四组通过聚合反应得到的产物 分别在四条凝胶电泳通道中进行分离，经同位素曝光后，便可通过读取四条泳道上的不同 片段，获取所测片段的碱基序列。 由于读长片段只有2 0 0 3 0 0 个碱基，需要人工制备凝胶板和等待同位素曝光，另外同 位素还存在放射性，对人身存在一定的伤害，而且垂直板凝胶电泳分析仪与自动化分析仪 相比，并不适用于大量d n a 片段的测定，不能满足大规模d n a 测序的需求。于是出现 自动荧光垂直板凝胶电泳分析仪。2 0 世纪9 0 年代初，荧光标记及其相应的检测技术被应 用于d n a 序列分析当中，同时出现了自动化测序仪。其突出表现是采用四种颜色的荧光 双脱氧核苷酸对d n a 片段进行标记【1 3 】，使用单泳道电泳就可以将不同长度的d n a 片段 进行分离并且检定，因此提高了检测的并行度即检测通量，辅之以后来发展的并行化 与自动化检测技术1 1 4 1 ，大大提高了测序速度的同时还降低了测序成本，开始了d n a 铡序 的大规模应用。在始于1 9 9 1 年、持续时间长达1 3 年之久的人类基因组计划1 5 1 中，第二代 d n a 分析仪起到了不可磨灭的作用。 4 浙江大学硕士学位论文 绪论 为了满足更大规模、更高通量、更快速度的d n a 分析的需要，便出现了第三代自动 化荧光毛细管凝胶电泳分析仪【l6 1 。这一代的新型仪器使用毛细管代替原来的垂直电泳板， 克服了平板凝胶电泳需要手工制胶与人工识别泳道的缺点，使d n a 分析技术走向自动化、 低成本、高通量、规模化的道路。由于毛细管内径小，表面积和体积的比值很大，易于散 热，因此毛细管电泳可以减少焦耳热的产生，这样可以在毛细管的两极使用很高的电压， 从而提高电泳的速度，大大提高仪器的测序速度。 目前，国内外都在研究发展基于微流控芯片的d n a 分析系统，该系统还处于起步阶 段 1 7 , 1 8 , 1 9 , 2 0 , 2 1 】。第三代d n a 分析系统中采用的毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，c e ) 被广泛应用于d n a 片段分型与测序；毛细管电泳阵列( c a p i l l a r ya r r a ye l e c t r o p h o r e s i s ， c a e ) 则用于提高d n a 分析的通量，在人类基因组计划中发挥了重要的作用。但是传统 c e 的进样效率不高，对试样中盐的浓度敏感，且对较长的d n a 片段存在着歧视效应。 d n a 分析通量需要进一步提高时，传统c e 只能通过增加毛细管的数量，但随着阵列毛细 管数量的增多，制作合格阵列的难度也随之增加【2 2 1 ，不利于大批量生产；而且随着毛细管 数量的增加，必然使d n a 分析仪的体积变大，不符合小型化的要求。而微流控阵列毛细 管芯片能很好地解决传统c e 中所遇到的这些问题，同时由于其进样体积相对与传统毛细 管更小，毛细管长度更短，分离速度明显提高。另外通过微制造工艺，可以方便地将d n a 分析中样本的预处理步骤，如p c r 、样本纯化等过程集成在同一块微流控芯片上，甚至还 能将温控装置等其他辅助设备也集成在同一块芯片上，实现真正意义上的片上实验室( l a b o nc h i p ) 2 3 1 ，因此基于微流控芯片的d n a 分析系统具有广阔的应用前景。 目前d n a 分析技术已广泛应用于临床遗传疾病、传染病和肿瘤的基因诊断，以及农 业、畜牧业中的动植物育种，法医鉴定等领域，并在其中发挥着越来越重要的作用。而作 为d n a 分析的必备工具d n a 分析仪具有广阔的市场前景。在医疗卫生领域，虽然人 类基因组计划已经完成，美国又启动了基因变异鉴别工程【2 4 1 ，目的在于寻找出2 0 万个与 人类疾病有关的变异基因，开发相应的药物；在农业领域，我国在成功完成“杂交水稻基 因组计划，【2 5 1 之后，于2 0 0 9 年7 月又启动了“兰花基因组计划”【2 6 1 ，旨在对被喻为植物界 大熊猫”的兰科植物进行全基因组测序和生物信息分析，其结果将为进化生物学乃至整个 生命科学的发展做出巨大贡献；在法医鉴定领域，我国政府目前正在积极筹建d n a 数据 库，将d n a 证据鉴定技术应用于刑事侦察，提高刑事案件的破案率。另外，当突发性灾 难事件发生时，如地震、海啸、飞机失事等，人体的残骸通常残缺不全或高度腐烂，d n a 分析技术就成了对死者进行身份确认的唯一手段。 气 浙江大学硕士学位论文绪论 我国对大规模、高能量d n a 分析设备的需求很大，但遗憾的是目前尚未有国产的d n a 分析仪器市场化，导致所有的应用都必须依赖于外国公司生产的d n a 分析设备。由于没 有国产设备、缺少竞争，进口的d n a 分析设备价格居高不下，因此急需研究具有自主知 识产权的d n a 分析设备。 本课题来源于2 0 0 8 年科技部创新方法专项( 2 0 0 8 i m 0 4 0 9 0 0 ) ，旨在研发出具有高通量、 高稳定性并适用于车载性能的d n a 分析设备。 1 3 论文的整体结构 文章第l 章首先介绍论文的选题背景。从分子生物学的角度出发，对d n a 分析的生 物基础进行阐述，指出d n a 分子的一级结构在d n a 分析中的重要重用。对d n a 测序技 术及d n a 分析仪器的发展与现状进行论述，并对d n a 分析仪器的市场前景进行分析。 同时指出由于缺乏国产d n a 分析设备，导致进口设备的价格居高不下的现状。 第2 章主要介绍实验室自主设计的多通道d n a 分析仪的整体方案设计。首先介绍 d n a 分析仪的典型结构，并对比分析现有不同结构间的优缺点。在此基础上提出本文中 设计的多通道d n a 分析仪的整体结构，并详细描述各部分的参数选型及其工作过程，再 对激光光源、光学扫描机构、光电倍增管等主要部件的选择依据进行讨论，为最终的部件 选型提供理论依据。 第3 章重点介绍应用于新型多通道d n a 分析仪的嵌入式控制系统。首先介绍新型多 通道d n a 分析仪工作过程，分析其控制需求，在此基础上给出嵌入式系统的整体设计方 案。随后详细介绍嵌入式控制系统中各个模块的设计方案。 第4 章通过实验验证设计的嵌入式控制系统的各项性能，主要分析设计的数据采集系 统的性能及振镜驱动的性能，并对实验结果进行理论分析。 第5 章主要讨论新型多通道d n a 分析仪中激光诱导荧光检测系统的荧光收集效率， 通过理论分析、仿真计算总结出系统特性，并利用设计的嵌入式控制系统对理论分析进行 实验验证。 文章最后部分第6 章，对全文进行总结，点明创新要点，并提出设计需要改进的 方向。 6 浙江大学硕十学位论文多通道d n a 分析仪系统设计 2 多通道d n a 分析仪系统设计 2 1d n a 分析仪的典型结构 目前，国内外使用的大多数商用d n a 分析仪多以第三代自动化荧光毛细管凝胶电泳 分析仪为主。图2 1 为其典型结构框图，其中d n a 片段分离装置用于分离不同长度的d n a 片段；荧光诱导及检测装置用于激发掺入到d n a 分子中的荧光染料，使其发出荧光信号， 并通过相应的荧光检测机构对荧光信号进行检测；控制装置主要用于d n a 片段分离、荧 光诱导及检测过程中各种参数的产生与控制；数据处理一般在p c 机中进行，包括数据的 预处理、d n a 片段长度的判读、序列信息的重建等。 图2 1d n a 分析仪的典型结构框图 2 1 1d n a 片段分离技术 d n a 分析技术的两个重要应用是d n a 测序与d n a 分型。而无论是测序还是分型， ! 其基本的过程都需要先将不同长度的d n a 片段进行分离。目前，应用于d n a 片段分离 的技术主要有电泳技术和高效液相色谱( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，h p l c ) 分析技术。电泳是电介质中带电粒子在电场作用下以不同的速度向电荷相反方向迁移的现 象，利用这种现象对化学或生物组分进行分离的技术就称为电泳技术【2 7 1 。将电泳与毛细管 相结合所形成的毛细管电泳技术较传统电泳技术，具有快速、高效、所需样本量小且可实 现自动化等优点；相比于h p l c ，虽然二者同为液相分离技术，都有许多的分离模式，但 无论是速度、效率、样品用量还是分析成本，毛细管电泳的速度更快，柱效更高，同时它 几乎不消耗溶剂，样品用量仅为h p l c 的几百分之一。由于不需要泵输运系统，因此毛细 管电泳的成本也更低。另外通过改变操作模式和缓冲液的成分，毛细管电泳具有很大的选 择性，可根据不同的分子性质对众多对象进行有效的分离【2 7 1 。因此，目前在d n a 分析领 7 浙江大学硕士学位论文 多通道d n a 分析仪系统设计 域，毛细管电泳的应用范围远大于h p l c 。 在毛细管电泳过程中，电泳在充满缓冲溶液的毛细管中进行。毛细管的内径很细，通 常在2 5 1 0 0 9 m 之间，细内径毛细管由于电阻高，能应用更高的电场而产生较小的焦耳热， 而且大的表面积与体积比能有效地扩散焦耳热，因此可以在电泳过程中采用很高的电压。 高电压的应用能有效地提高电泳的分离效率，缩短d n a 分析的时间。由于毛细管电泳过 程中样品的进样体积小，能够进行在柱检测，进行定量分析，加之自动化程度较高，使得 毛细管电泳代替了传统的平板电泳，成为目前重要的分离分析技术。 毛细管电泳的原理并不复杂，商品化仪器的结构也很简单。常用的毛细管电泳设备由 石英毛细管( 电泳通道) 、样品池、高压电源和检测系统四部分组成。图2 2 为毛细管电 泳系统的典型结构图【2 8 1 。 7 61 厂 i ，l - 高 。 5 ) 4 压 电 源 ii 上 、 、 3 l2 图2 2 毛细管电泳系统的典型结构 l 高压电极槽；2 - 一氐压电极槽；3 负极；b 数据记录处理； 5 检测器；由一毛细管；7 恒温机构 毛细管电泳的工作流程可分为预电泳、进样、电泳分离三个步骤。预电泳时。将毛细 管的两端和高压电源的阴极与阳极分别插入到装有缓冲液的电极槽中，通电一段时间使毛 细管内的物质分布均匀，同时将毛细管加热到指定温度并维持稳定；进样阶段，根据待分 析样品所携带电荷极性的不同，选取高压电源的阴极( 样品带负电荷) 或阳极( 样品带正 电荷) 和毛细管的一端一同插入样品池，将毛细管的另一端插入缓冲液池，通过控制进样 电压的大小与进样时间，达到分析要求所需的进样量；电泳阶段则与预电泳过程类似，将 电极与毛细管两端分别插入缓冲液池，并开启高压电源和检测器，由于不同长度样品的迁 移速率不同，因此它们到达检测窗的时间就不同，这样就可以得到随时间变化的电泳信号。 在d n a 分析仪中，这些信号经过后续软件的处理与分析，就可以重建d n a 序列的信息。 实际电泳过程中d n a 片段的迁移速率还与毛细管中填充的筛分介质、缓冲液成分以及温 浙江大学硕士学位论文多通道d n a 分析仪系统设计 度等因素有关。 随着各国国家d n a 数据库的建立、法医d n a 鉴定应用的越来越广泛以及突发性自 然灾害时有发生，这都对d n a 分析仪器的通量及分析时间提出了更高的要求 2 9 , 3 0 , 3 1 】。目 前的d n a 分析仪多采用毛细管r 4 歹, j 方 3 2 , 3 3 1 来提高系统的通量，以满足实际应用的需要。 2 。1 2 荧光诱导及检测技术 前一小节对毛细管电泳的原理及其工作流程进行了相应的论述，接下来对相应的荧光 诱导及检测技术进行讨论。毛细管电泳的迅速普及，和与之相对应的检测技术的发展是分 不开的。紫外检测技术和荧光检测技术是目前使用最广泛的两种检测手段【2 7 1 。但是由于紫 外检测技术的灵敏度相对较低，尤其在小内径毛细管的应用场合，加之多色荧光标记法口4 】 的出现，使得荧光检测技术在d n a 分析应用中的优势明显，从而成为主流检测方法。 荧光的概念早已为人所知，当紫外或可见光照射到某些物质上时，这些物质就会发射 出波长和强度各不相同的光线，当照射停止时，这种激发出来的光线也随之消失，这就是 荧光 3 卵。就其本质而言，荧光的产生是因为当多原子分子吸收光量子时，电子根据量子力 学的选择原则从基态的低能级跃迁至高能级态，然后电子以辐射跃迁和非辐射跃迁失去能 量返回基态，这一过程中放射出来的光子，就是我们所说的荧光。这种荧光方式称为诱发 荧光，各种分析仪器中使用的荧光检测技术通常指的就是这种荧光方式。我们知道，并不 是所有波长的光照射到荧光物质上都能激发出荧光，荧光物质存在着特定的吸收光谱，也 称为激发光谱，吸收峰的中心波长被定义为最大吸收波长，用k 表示。同样，激发出来 的荧光也存在发射光谱，将发射光谱中荧光强度最强的波长定义为最大荧光发射波长，用 儿所表示。通常荧光发射光谱中的最大荧光发射波长大于吸收光谱中的最大吸收波长，即 有以。 以。，两者之差称为斯托克斯( s t o k e s ) 位移【3 6 】，这个值越大，越有利于通过波长 滤色片将二者分离开来。 由原理分析可知，荧光检测系统应该包括以下四个基本要素【3 7 l ：激发光源；荧光试剂； 将发射光子与激发光子分离的波长滤色片；记录荧光的检测器。其中激发光源可以采用紫 外光，也可以采用激光光源。由于毛细管电泳的光程短，需要采用高灵敏度的检测技术， 以获得尽可能低的检测限。相比之下，激光更适合用作毛细管电泳中荧光检测的光源，因 为它的聚焦性能好，可以将激光光束聚焦到毛细管内径的中心，这样可以大大提高系统的 检测灵敏度。高灵敏度对基于毛细管电泳的d n a 分析技术有着重要的意义，因为这样可 以使用内径更小的毛细管，并在毛细管的两端加上更高的电场强度，以获得更高的分离效 率，同时，可以处理更小量的d n a 样品，这对于当只能获得极微量d n a 样品的情况时， 0 浙江人学硕士学位论文多通道d n a 分析仪系统设计 如犯罪现场获得的已经部分降解的d n a 样本，毛细管电泳分离技术同样能够进行检测分 析。由于具有灵敏度高、选择性好、响应速度快等优点，激光诱导荧光检测( l a s e ri n d u c e d f l u o r e s c e n c ed e t e c t i o n ，l i f d ) 系统成为目前商用d n a 分析设备中最常见的配置【3 8 3 9 , 4 0 , 4 。 应用于多通道d n a 分析仪系统中的荧光检测系统大致可以分成两类：基于面阵图像 传感器的成像式非扫描检测系统和基于点探测器的共焦扫描检测系统f 4 2 】。前者主要采用致 冷c c d 作为荧光探测器，后者的荧光探测器多为光电倍增管( p h o t o m u l t i p l i e rt u b e ，p m t ) 。 由于c c d 的读出噪声及暗电流的影响，基于c c d 成像式荧光检测系统的灵敏度较基于点 探测器的检测系统要低。虽然可能通过对c c d 进行致冷，增长曝光时间【4 3 】，采用多像素 合并等方法来提高系统的信噪比和检测灵敏度，但同时也会使得检测系统变成更加复杂， 成本更加高昂，从而限制了成像式非扫描检测系统在d n a 分析系统中的应用。 面 图2 3 共焦检测原理图 基于点探测器的检测系统则多采用共焦扫描式检测技术，该技术从共聚焦扫描显微镜 发展而来，通过焦平面上光点的扫描完成整个待测区域的成像4 4 1 。! 图2 3 为共焦检测系统 的原理图。光源经扩束镜和物镜组成的照明系统聚焦成衍射极限大小的光斑，在待测样品 上形成点照明；照明点激发出的荧光信号经收集物镜、二色镜及会聚镜到达光探测器前的 共焦小孔，光源、样本点、共焦小孔两两处于光学共轭位置，这也就是称之为共焦的原因。