（应用化学专业论文）微生物MF04产絮凝剂的研制、絮凝机理及其应用研究.pdf

微生物m f - 0 4 产絮凝剂的研制、絮凝机理及其应用研究 摘要 本论文在系统地论述近年来国内外微生物絮凝剂的研制开发现状与发 展的基础上，对微生物絮凝剂产生菌m f 0 4 的筛选、替代培养基的研究、培 养条件优化、絮凝特性、絮凝机理以及应用，进行了研究与探讨，主要内 容与所得结论如下： ( i ) 本实验以广西大学化学化工学院环境工程实验室和蒲庙造纸厂活性 污泥为菌源，在特定培养基中经过富集培养、分离和筛选得到1 4 株有较高 絮凝活性的菌株，其中一株对高岭土有较高的絮凝活性，达n 8 7 1 ，命名 为m f 0 4 。为了节约成本，找到了一种廉价物质甘蔗汁作为替代培养基。考 察了外加氮、磷源对絮凝活性的影响。还对合成培养基进行了研究。 ( 2 ) 为了提高絮凝活性，在通用发酵培养基的基础上，对碳源、氮源、 k 2 h p 0 4 浓度、培养基p h 、摇床转速进行了条件优化。并通过正交实验得出 了各因素影响絮凝活性大小的顺序和最优条件。 ( 3 ) 将m f 一0 4 所产絮凝剂对高岭土悬浊液p h 值、静沉时间、絮凝剂投加 量、c a c l 2 投加量、搅拌速度、高温处理、絮凝剂存储时间条件进行了条件 验证，得出了各种条件下的最佳值。并对得到的产絮凝剂微生物m f 0 4 的生 长曲线进行了研究，得出了m f 0 4 的最佳生长周期为6 0 h 。 ( 4 ) 对茵m f 0 4 所产絮凝剂进行了提取和纯化，通过紫外和红外光谱发 现该絮凝剂的主要成分为多糖，并对多糖含量进行了测定。通过z e t a 电位和 红外光谱对絮凝机理进行了深入研究后发现，絮凝机理为吸附架桥机理， c o o 与c a 2 + 为单齿架桥的键和机理模式。 ( 5 ) 通过正交和单因素实验发现，由菌m f 0 4 所产絮凝剂，对选矿废水 浊度幂i c o d 的去除率都有良好的效果。和聚硅酸锌复配后，浊度不仅比单 独使用时降低了，絮凝剂的总投加量也减少了。通过和无机高分子絮凝剂 进行比较发现，处理效果要优于无机高分子絮凝剂；对赤砂糖脱色也有比 较好的处理效果，菌m f 0 4 所产絮凝剂和聚二甲基二烯丙基氯化铵复配后， 赤砂糖的脱色率可达3 8 9 。 关键词：微生物絮凝剂絮凝活性机理废水脱色 s t u d yo fm i c l u b i a lm f 0 4p r o d u c i n g f l o c c u l a n to nm a n u f a c t u r e 、 f l o c c u l a t i o nm e c h a n i s ma n da p p l i c a t i o n a b s t r a c t t h ep a p e rs u m m a r i z e das e r i e so fb a s i cr e s e a r c ha n dd e v e l o p m e n to np r e p a r a t i o no f m i c r o b i a lf l o c c u l a n t t h i si s o l a t i o no ff l o e e u l a n t - p r o d u c i n gb a c t e r i u mm f - 0 4 、r e s e a r c ho f s u b s t i t u t i n gc u l t u r em e d i u m ，o p t i m i z a t i o no f c u l t u r ec o n d i t i o n ，c h a r a c t e r i s t i co ff l o c c u l a t i o n ， a p p l i c a t i o na n dm e c h a n i s mo f t h em i c r o b i a lf l o e c u l a n tw e r es t u d i e da n dd i s c u s s e d 啦m a i n c e n t e n to fr e s e a r c ha n dt h er e s u l ta r ea sf o l l o w s ： ( o w eg o tm i c r o b i a lf l o e c u l a n t - p r o d u c i n gm i c r o o r g a n i s m sf r o ma c t i v es l u d g ew h i c h w a s c u l t i v a t e di ns p e c i f i c a l l yc u l t u r em e d i u m t h e r ew e r e1 4b a c t e r i u m s ，1b a c t e r i u mo fw h i c h h a sb e t t e rf l o e c u l a t i o na c t i v i t y , a t t a i n8 7 1 ，d e n o m i n a t e dm f 一0 4 i no r d e rt os a v ec o s t , w e s t u d i e dt h ee f f e c to f n 、po nf l o c c u l a t i o na c t i v i t yu s i n gs u g a r c a n e - j u i c e 嬲s u b s t i t u t i n gc u l t u r e m e d i u m a tt h es a m et i m e ，w ed i dr e s e a r c ho ft h ec o m p o u n dc u l t u r em e d i u m ( 2 ) 1 1 1o r d e rt oh e i g h t e nf l o c c u l a t i o na c t i v i t y , c a r b o n 、n i t r o g e ne t cw e r eo p t i m i z e do nt h e b a s i so fg cc u l t u r em e d i u m e l i c i t e ds e q u e n c eo fa l lt h ee f f e c tf a c t o ra n do p t i m i z a t i o n c o n d i t i o nb yo r t h o g o n a le x p e r i m e n t s ( 3 ) e l i c i t e do p t i m i z a t i o nn u m e r i c a lv a l u eb yd o i n gc o n d i t i o nv a l i d a t ee s p e r i m e n t si n w h i c hw es t u d i e dt h ei m p a c to f m f 一0 4o np ho f k a o l i np o i s e 、s u b s i d i n gt i m e 、m b fd o s a g e 、 c a c l 2d o s a g e 、w h i s ks p e e de t c b yt h er e s e a r c ho fg r o w t h c u t - v eo fm f 一0 4 ，w ef o u n dt h a ti t s o p t i m i z a t i o ng r o w t hp e r i o d sw a s6 0 h ( 4 ) b yd i s t i l l i n ga n dp u n r i f i n gt h em f 一0 4p r o d u c i n gf l o c c u l a n t , i t sm a i nc o m p o n e n tw a s a m y l a s eb yi n f r a r e ds p e c t r aa n du v , a n di t s c o n t e n tw a sd e t e r m i n e d w ef o u n dt h a t m e c h a n i s mw a sb r i d g ea n da b s o r p t i o n , c o o 。a n dc a 2 + i ss i n g l e t o o t hb r i d g e - l i n k i n gb yz e t a i i i p o t e n t i a la n di n f r a r e ds p e c t r a ( 5 ) b yo r t h o g o n a ie x p e r i m e n t s a n ds i n g l e f a c t o r , w ef o u n dt h a te f f e c to fm f 0 4 p r o d u c i n g - f l o c c u l a n t st oe l i m i n a t em i n e r a lw a s t e w a t e rt u r b i d i t ya n dc o d w a sp r o m i n e n t b y m i x i n gm f - 0 4p r o d u c i n gf l o c c u l a n t 、访t 1 1p a a z , w ef o u n dt h a tt u r b i d i t yw a s n o to n l yf a i l e r , b u ta l s ot h ef l o c c u l a n td o s a g ed e c r e a s e d w ef o u n dt h a te f f e c to fm f - 0 4p r o d u c i n g - f l o e c u l a n t w a sb e t t e rt h a ni n o r g a n i cp o l y m e rf l o c c u l a n t st om i n e r a lw a s t e w a t e rb yc o m p a r i n gw i t h i n o r g a n i cp o l y m e rf l o c c u l a n t t h ee f f e c ti nd e c o l o u ro fm u s c o v a d ow a sp r o m i n e n tb y m i x i n g m f 一0 4p r o d u c i n g - f l o c c u l a n tw i t hp d m a d d c ，a n dt h ed e c o l o u ro f m u s c o v a d ow a s3 8 9 0 , 4 k e yw o r d s ：m b f ；f l o c c u l a t i o na c t i v i t y ；m e c h a n i s m ；m a s t ew a t e r ；, d e c o l o u r i v 符号说明 意义 小时 化学需氧量 絮凝率 表示任一列上水平号为i 时多对应的实验结果 表示任一列上因素取水平i 时所取得实验结果 极差 双电层中的斯特恩层 空白消耗硫酸亚铁铵量 水样消耗硫酸亚铁铵量 水样体积 硫酸亚铁铵溶液的浓度 对称伸缩振动和非对称伸缩振动频率之差 纳盐时对称伸缩振动和非对称伸缩振动频率之差 样品检出量 样品重量 浊度 x 单位或量纲 r a g l 1 m l m l m l m 0 i l 1 u g m l l u g m l l 号 附 符 d 瞰 慷 u 牢 伽 e 墨 厨 r 蜘 乃 巧 c 小 血 y w 肌 广西大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得 的成果和相关知识产权属广西大学所有，本人保证不以其它单位为第一署名 单位发表或使用本论文的研究内容。除已注明部分外，论文中不包含其他人 已经发表过的研究成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对 本文的研究工作提供过重要帮助的个人和集体，均已在论文中明确说明并致 谢。 做作者签名对讳 矽g 年j 其| c 日 学位论文使用授权说明 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本： 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 讲h 时发布口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 一：晰名纠缔护罗日 广西大掌硕士掌位论文微生物m f 一0 4 产絮凝剂的研制、絮凝机理及其应用研究 第一章绪论 目前我国废水处理的基本方法有物理处理法、化学处理法、物理化学处理法和生物 处理法。絮凝沉淀法处理污水属于化学处理方法。作为一种新兴的有效的水处理手段， 絮凝法越来越多的使用于给排水处理工程中。而絮凝沉降效果的好坏很大程度上取决于 絮凝剂的性能。 现在所使用的絮凝剂有2 0 世纪6 0 年代开发的无机盐类的絮凝剂( 如硫酸铝、氯化 铝、氯化铁等) ，但其处理效果不理想，进而又研制了高分子聚合无机盐型絮凝剂( 如 聚合氯化铝、聚合硫酸铁等) 在水处理中收到了很好的效果，但在其使用过程中会对环 境产生一定的二次污染，铝系絮凝剂絮凝效果好，用量少，但存在明显的二次污染，经 铝系絮凝剂处理的污水，不可避免的出现铝离子浓度过高的问题。现有的研究表明，水 中高浓度的铝离子对环境有诸多危害。现用絮凝剂存在的问题，使研究开发具有高絮凝 活性、安全、无毒、不造成二次污染的絮凝剂成为迫切而有意义的课题。人们已把研究 目光转向微生物絮凝剂的开发和应用上来。近些年来微生物絮凝剂因其天然、可降解、 安全、无毒、无二次污染而受到了环境科学研究者的极大关注。 1 1 微生物絮凝剂的概况 1 1 1 微生物絮凝剂的研究进展 微生物絮凝剂是利用现代生物技术，通过微生物发酵、抽提、精制从微生物或其分 泌物中得到的一种具有生物分解性和安全性的新型、高效、无毒的水处理剂。微生物的 絮凝作用最先由法国的l o u i s p a s t e u r ( 1 8 7 6 年) 在酵母菌中发现的。美国学者b u t e r f i e l d 在 1 9 3 5 年首次在活性污泥中发现能够产生絮凝物质的菌胶团【l 】。而人们真正对微生物絮凝 剂进行系统、科学地研究只是近二、三十年的事情。制备微生物絮凝剂的关键是菌种的 筛选，高效的产絮菌能产生好的絮凝剂。 国外在2 0 世纪7 0 年代初就对微生物絮凝剂进行了研究，并在市场上有多种牌号的的 广西大掌硕士掌位论文微生物m f 一0 4 产絮凝剂的研制、絮凝机理及其应用研究 微生物絮凝剂粉末和生物活性液销售，用于废水处理、快速清除下水道淤塞和解决污泥 膨胀问题等。最为著名的就是由日本的仓根隆一郎等人从日本的旱田土壤中分离筛选到 的红平红球菌，并将该菌株产生的絮凝剂命名为n o c 1 t 2 1 。并成功应用于泥浆水、河水、 粉煤灰水、活性炭粉水、膨胀污泥和纸张废水等。这也是己发现的最好的微生物絮凝剂， 它具有强而广泛的絮凝活性，有关研究的报道较多。1 9 8 5 年，h i r o n k it a k a g i a _ 亭t 3 分离出 p e a e i l o m y c e s s p i 1 产生的絮凝剂对各种微生物细胞均有絮凝沉淀作用。 我国从2 0 世纪8 0 年代以来展开对微生物絮凝刑的研究，9 0 年代后期研究开始进入高 潮，各种研究成果缤纷而出，并取得了相当的成就，如邓述波【4 】等从土壤中分离筛选得到一 株能产生高效微生物絮凝剂( m a v ) 的硅酸盐芽孢杆菌a - 9 ；中科院成都研究所张本兰掣 从活性污泥中分离得到的p a l c a l i g e n e s 8 7 2 4 菌株产生的絮凝剂和武汉市建设学院康建雄 等用黑酵母以淀粉水解或葡萄糖为原料发酵产生的普鲁兰絮凝剂；宫小燕1 6 】等在污水处 理厂活性污泥中分离筛选获得l 株具有稳定絮凝性状的菌株，经初步鉴定为假单胞菌属。 但迄今为止，我国尚无微生物絮凝剂成品出售，基本上仍停留在实验室阶段，并且多数 集中在絮凝剂产生菌的筛选研究方面。所以我国对微生物絮凝剂的研究还有很长的路要 走。 1 1 2 絮凝剂产生菌的来源及种类 目前国内外研究所采用的絮凝微生物种群主要来自于三个方面：( 1 ) 来自天然土 壤，土壤中絮凝微生物极其丰富，分离方法简单，而且成本低；( 2 ) 水厂的活性污泥， 从污水厂活性污泥中采集絮凝微生物成本低，且所制出的微生物絮凝剂投入污水处理系 统，不会增加活性污泥系统成分，能够保持投加前后微生物系统状态的稳定性；( 3 ) 直接 购买产絮菌株，因其成本高所以只适用于实验室小规模的研究实验。 到目前为止有将近几十种限1 3 1 见诸报道的具有絮凝性能的微生物产生菌，它们分别 属于细菌、放线菌、霉菌、酵母茵、藻类等。其中细菌和真菌居多，而藻类很少。其中 研究比较多的有红平红球菌属、拟青霉菌属、酱油曲霉等。微生物絮凝剂虽都由微生物 产生，但不同的菌产生方式不同，一般可归于三类【1 4 1 ：( 1 ) 直接利用微生物细胞的絮 凝剂；( 2 ) 利用微生物细胞壁提取物的絮凝剂；( 3 ) 利用微生物细胞代谢产物的絮凝 剂。 2 广西大掌硕士掌位论文微生物m f - 0 4 产絮凝剂的研制、絮凝机理及其应用研究 1 1 3 微生物絮凝剂产生菌的筛选 具有分泌絮凝剂能力的微生物称为絮凝剂产生菌。菌种的筛选主要是采用初筛和复 筛方法经多次固体、液体培养通过发酵培养液对高龄土悬浊液的絮凝效果来检验。这种 方法工作量大，效率很低，不具代表性。然而人们在长期的研究过程中，也总结了一些 简单快捷的方法。通过肉眼观察菌落或显微镜观察菌体进行初筛；在培养基中添加一些 特殊物质也可以对絮凝剂产生菌进行快速而有效的筛选。最近李文膊1 5 】等人研究了一种 新的筛选方法，该方法是在培养基中同时添加刚果红( 英文名称：c o n g or e d ，分子式： c 3 2 如n 科a 2 0 6 s 2 ) 和考马斯亮蓝，选择性地从不同样品材料中筛选絮凝剂产生菌。利用 此方法可以选择性地从不同样品材料中筛选絮凝剂产生菌，能高效、直观地将絮凝剂产 生菌和其他微生物区分开来，工艺简单，工作量小，周期短，筛选效率较高。 1 1 4 微生物絮凝剂的提取与纯化研究 为了深入研究微生物絮凝剂的物化性质，剖析其分子结构，得到较纯的产品，有必 要首先对其分离纯化。纵观几十年的微生物絮凝剂的研究工作，人们对微生物絮凝剂的 制备基本可分为两大步：先是微生物絮凝剂产生菌的筛选；其次是微生物絮凝剂的提纯。 微生物絮凝剂的化学成分主要是多聚糖、蛋白质、核酸以及一些金属离子，因而其提取 方法与一般的多聚糖和蛋白质的提取方法并无多大的差距。根据絮凝剂物质的种类性质 不同而采用无水乙醇、硫酸铵盐、丙酮等沉淀获得。 对于结构较复杂的絮凝剂的提取，则需要用酸、碱或有机溶剂反复溶解、沉淀以得 到粗品。将粗品溶于水或缓冲溶液，可通过离子交换，凝胶色谱等方法，使其纯化得到 絮凝剂精品。常采用的方法有：凝胶电泳、溶剂提取、碱提取等。最近国内研究者们在 这方面研究中也取得了一些进展，比如北京化工研究院的叶晶等人【1 6 j 采用了一种新的工 艺路线：即采用水抽提一丙酮沉淀一真空干燥的工艺路线，最终从1 0 0 m l 发醇液中得到 o 1 9 8 5 9 干品。栾兴社等人【1 7 】发明了一种新的方法就是将上游微生物絮凝剂产生菌节杆 菌l f t o u 2 为生产菌种经发酵工序生产的发酵液，在下游经除菌、浓缩、纯化、浓缩脱 水等工序制得水处理用微生物絮凝剂。该微生物絮凝剂可代替化学絮凝剂被广泛地应用 于含有颗粒悬浮物或重金属等液相体系的污水处理，还可用于生物分离、单细胞蛋白生 产、污泥浓缩、生态湖水净化及生物工艺澄清、抗菌素发酵液处理等等。此方法与现有 技术相比具有无毒无害、效率高、成本低、应用无二次污染、可生物降解、可适合大规 3 锨生物m f - 0 4 产絮凝剂的研制、絮凝机理及其应用研究 模工业化生产和推广，因此具有广阔的应用前景。 1 1 5 影响微生物絮凝剂活性的因素 1 1 5 1p h 值 絮凝剂的絮凝能力受p h 值影响的原因，是酸碱度的变化改变了生物聚合物的带电状 态和中和电荷的能力以及被絮凝物质的颗粒表面性质。所以说任何一种絮凝剂都有一个 适合自己本身的一个p h 值，例如大肠杆菌属b y - 2 9 絮凝剂在p h = 3 时的絮凝活性最大，且 随p h 值增大其絮凝活性逐渐减少【1 8 】。 1 1 5 2 金属离子 金属离子可以加强微生物絮凝剂的桥联作用和中和作用，对微生物絮凝剂的絮凝活 性有重要意义，甚至是必需的条件。添加一些金属离子能提高絮凝活性，通常都是用二 价金属离子如c a 2 + 、m 矿等作助凝剂【1 9 1 。在高离子强度下，大量离子占据了絮凝剂活性 位点，就把絮凝剂与固体悬浮颗粒隔开而抑制絮凝【2 0 】。 1 1 5 3 微生物的浓度 和其它无机或有机絮凝剂一样，微生物絮凝剂的絮凝率也受其浓度的影响在较低浓 度范围内，随絮凝剂浓度的提高，絮凝率升高，但达到最高点后，在增加絮凝剂的浓度， 絮凝率反而下降。通常，每升废液中微生物絮凝剂的投加量约为几毫升到几十毫升之间， 通常控制在3 0 m l l 。1 左右【1 9 1 。 1 1 5 4 微生物絮凝剂的分子量 絮凝剂的分子量大小对絮凝活性有很大影响。通常分子量越大吸位点就越多，所带 电荷也就越多，架桥作用和卷扫作用也就越明显。目前已经分离纯化的微生物絮凝剂多 是多糖和蛋白质之类的大分子，分子量大都在几十万到几百万之间。 1 1 5 5 絮凝剂中活性基团的数量与类型 一些特殊基团在絮凝剂中充当颗粒物质的吸附部位或维持一定的空间结构，对絮凝 活性有很大影响。大多数微生物絮凝剂的红外光谱表明，在其结构中存在着羧基、羟基、 氨基和磷酸根【2 1 1 。z 勾i c 等认为，这些官能团对高岭土的絮凝是有贡献的。大多数人认为， 羧基在絮凝中起重要作用，而其他学者则强调氨基和磷酸根的重要性【瑚。 1 1 5 6 胶体表面电荷和表面结构 胶粒表面电荷亦影响絮凝活性，同一絮凝剂对不同胶粒会表现出不同的絮凝活性。 4 微生物m f - 0 4 产絮凝剂的研制、絮凝杌理及其应用研究 微生物絮凝剂所带电荷多数为负电荷，在处理阳离子型废水时，加入的生物高聚物吸附 在带电胶粒上，将中和胶粒的表面电荷，这就降低了胶粒的z e t a 电位而使其聚沉，提高 了絮凝活性圈。胶粒的表面结构对絮凝活性也有一定的影响。实践表明，尽管微生物絮 凝剂具有广谱的絮凝作用，但对不同胶体颗粒表现出不同的絮凝活性，地衣芽孢杆菌 c c r c l 2 8 2 6 对高岭土、氧化铝和活性碳的絮凝活性( 1 o d ) 分别为8 5 、6 1 及3 o 2 a 。 1 1 6 微生物絮凝剂的机理研究 1 1 6 1 化学机理 相对经典的胶体体系的絮凝机理而言，微生物絮凝剂的絮凝机理还不是十分清楚。 目前对微生物絮凝剂的絮凝机理得到普遍认同的有四种：桥联作用、中和作用渊、化学 反应【1 4 ，2 5 1 、卷扫作用。微生物絮凝剂是带有电荷的生物大分子，这四种机理都可能存在， 但主要是前两种，其中较为流行的是架桥机理【4 孤2 6 2 7 】，吸附在某个微粒表面的线性 生物分子长链可能同时吸附在另一个微粒表面上，絮凝剂大分子通过借助离子键、氢键 和范德化力，同时吸附多个胶体颗粒，在颗粒间产生架桥现象，从而形成一种网状三维 结构沉淀下来。图1 1 是根据吸附架桥理论绘制的絮凝机理示意图。该理论可以解释大 多数微生物絮凝剂引起的絮凝现象。 ? + 。一孑+ 孑翌 絮蒯瓣 苎竺量登型竺主 絮凝沉淀 与颗粒的结合物 一“一 图1 - 1 絮凝机理示意图 f i g 1 1 s k e t c hm a po f f l o c c u l a t i n gm e c h a n i s m 国外在絮凝机理方面，目前只是提出了一些假说，如电中和作用、架桥学说粘质假 说、菌体外纤维素行为学说、离散细胞和伸展桥键之间的三维基质模型假说病毒假说等 f 2 8 - 2 9 | 。而目前，人们普遍接受的学说是离子键、氢键结合学说。该学说可以解释大多数 微生物絮凝剂引起的絮凝现象以及一些因素对絮凝的影响，并为实验所证实。 1 1 6 2 生物学机理 广西大局啦炙士学啦论文微生物m f - 0 4 产絮凝剩的研制、旁濒机理及其应用研究 在生物学机理方面，因大多数微生物只在特定的生长时期才产生絮凝剂，所以有的 科学家推测它的产絮凝剂能力是受到遗传基因调控的。目前对絮凝基因的研究主要还是 从研究啤酒酵母开始的【刀，也正是通过这方面来研究絮凝剂的生物学机理。近期国外的 研究学者从啤酒酵母中至少发现了1 4 个絮凝基因。其中f l 0 1 、f l 0 2 和后来发现的f l 0 4 、 f l 0 8 是等位基因，后来统称f l 0 1 基因，它的位置在i 染色体上3 7 端距离染色体右端2 4 k b 处。f l 0 6 和f l 0 7 是隐性基因，并可能是f l 0 1 的等位基因。f l 0 1 絮凝基因位于1 号染色体 上a d e d n a 片段的3 7 r i m 处，有现性表达絮凝性的功能。f l 0 1 和f l 0 5 是不等位的显性基因， 所以这两个基因构建出的新菌株所分泌的絮凝剂成分是不同的，研究表明，它们两个正 好相反。f l 0 5 表达对糜蛋白酶稳定，然 i i i f l 0 1 表达产物却容易被糜蛋白酶降解【7 】。到目 前为止这些絮凝基因的分子克隆以获成功的只有f l 0 1 、f l 0 5 、f l 0 8 。在国内，中科院 的何秀萍等人踟是最早进行絮凝基因的研究工作的，但由于研究起步较晚和国外相比还 有一定的差距。 1 1 7 替代培养基的研究 微生物絮凝剂只所以没有进行工业化生产，最主要的一个问题就是培养基的成本比 较昂贵，从而导致了微生物絮凝剂的成本太高。所以说寻找廉价的培养基是当前研究的 一个重点课题。在国夕 k u r a n e 【l l ，3 1 】对红平红球菌的优化培养研究中就发现- 他用乙醇、 米糠、鱼肉和葵花籽粉作为培养基的替代成分，絮凝剂的活性大大提高，还可免去灭菌 的操作，从而降低了生产成本。 在国内替代培养基的研究也取得了实质性的进展。林松等人 3 2 1 利用食品加工废水对 复合型微生物絮凝剂产生菌进行驯化培养，考察其产絮凝剂周期和优化培养条件。实验 结果表明，絮凝剂产生菌x l 、x 1 6 、x 2 0 以及x 3 8 在果蔬脆片浸糖废水中培养3 0 h 后，其 絮凝活性分别为8 7 6 、8 6 5 、7 9 7 和8 2 1 。刘晖等人1 3 3 】用桔水废水作为替代培养 基并对其产絮凝剂进行了絮凝特性研究，实验表明：桔水由于c 源丰富，是一种良好的 培养基，最佳培养条件为c o d = 2 0 0 0 0m g l 一，投加k 2 h p 0 4 1 0 9 ，培养3 天，则絮凝率为 9 0 5 0 。经过成本核算，桔水培养基的成本要少于生产废水培养基、味精废水培养基、 蔡氏培养基。湖南大学陶然等人1 3 4 1 发明了一种利用豆渣生产微生物絮凝剂的产生菌及其 生产工艺。该工艺主要是先对豆渣经过一个p h 为1 1 o 的高温高压蒸煮预处理后，调至p h 为6 肛8 0 ，接种0 5 - 2 种子液，采用两段发酵培养工艺，即在培养的初期2 4 h 1 内，培养 6 徽生物m f - 0 4 产絮凝剂的研制、絮凝机理及其应用研究 温度3 0 c ，摇床速度1 5 0 r m i m 1 ；培养后期3 2 h 的温度为2 5 ，摇床速度为1 0 0 r m h l ；采 用两段发酵培养法能使菌体最大限度的利用营养物质合成絮凝剂，絮凝剂的产量达 7 8 6 9 l - ，又能将培养周期缩短到5 6 h 。该方法能合理利用豆渣这一廉价资源，降低微生 物絮凝剂的生产成本，提高产量，为以后实现微生物絮凝剂大规模工业化的生产奠定基 础。 1 2 微生物絮凝剂的应用研究 随着工业和科学技术的发展，种类不同、用途各异的各种絮凝剂越来越广泛地应用 于废水处理和给水工程领域，获得了极好的效果。其中微生物絮凝剂作为一类新型絮凝 剂，其广谱絮凝活性、可生物降解性和应用安全性显示了其在给水工程、废水处理、食品 加工和发酵工业等方面的应用前景。下面着重介绍微生物絮凝剂在废水处理中的应用。 1 2 1 处理红薯淀粉废水 红薯淀粉废水是以鲜红薯或红薯干为原料，采用酸沉淀法生产淀粉时产生的废水， 其中含有水溶性淀粉、可溶性蛋白质、多糖、氨基酸、维生素以及无机盐等多种有机和 无机物质，是一种不含有毒物质的高浓度有机废水。它的c o d 值比较高，y 9 5 0 0 0 m g l - 1 以上，所以处理比较困难。最近南开大学李琳等【3 5 】将胶质芽孢杆菌和酿酒酵母直接用 红薯淀粉废水培养，并用它们产生的絮凝作用处理红薯淀粉废水。结果表明，在适量氯 化钙助絮凝作用下，仅以2 5 的絮凝菌液，在p h 值9 5 的条件下，絮凝率高达9 7 ，红薯 淀粉废水的c o d 去除率达至u 6 5 ，p h 值8 0 左右。经复合微生物絮凝剂处理得到的沉淀 物是富含蛋白质的营养物质，干燥后可以制备成高级饲料。 1 2 2 酱油废水的处理 曹建平等【3 6 】用微生物絮凝剂m 2 5 应用于酱油废水的处理中，取得了较好的处理效 果。m 2 5 处理酱油废水所形成的絮体具有沉降快的特性，在投量为6 0 m l l 。1 时，沉淀时 间仅为1 0 m i n 时，絮凝率和c o d 去除率分别达6 8 5 和7 4 7 ，且在p h 值5 9 的范围内处 理效果较稳定。m 2 5 与眦( s 0 4 ) 3 复配后，可提高处理效率。当投加量各为3 o m l l 1 和 6 0 m g l 1 ，沉降时间为3 0 m i n 时，絮凝率和c o d 去除率分别达到7 7 2 j 9 1 7 9 8 。 7 广西大学啁正士掌位论文 徽生物m 噼0 4 产絮凝剂的研制，鬟凝栅理及其应用研究 1 2 3 染料废水的脱色 目前的废水处理技术虽能降低b o d ，但是对可溶性色素溶液的脱色效果不佳，使用 微生物絮凝剂处理可以达到理想的效果。同济大学的张志强等f 3 刀以啤酒废水为培养基， 利用其中的碳源和能源，对复合菌群进行发酵培养，制得微生物絮凝剂。将此絮凝剂处理 靛蓝印染废水。复合菌利用啤酒废水所产微生物絮凝剂对靛蓝印染废水有良好的去除 c o d 汀和脱色效果，最大c o d 盯去除率和脱色率分别达7 9 2 和8 7 6 。 1 2 4 乳化废水的处理 废乳化液是一种较难处理的工业废水，且排放量较大，严重污染环境。这类废水的 特点是乳化程度高，化学性质稳定，化学成分复杂，同时油类等有机污染物浓度高， c o d c r 可达几千甚至几万m g l 1 ，可生化性很差，处理难度也较大。南昌大学杨圣云等哪l 用从活性污泥中分离筛选出一株絮凝活性较高的絮凝剂产生菌h x c s 1 ，采用其产生的 絮凝剂处理南昌市客车厂乳化液废水。絮凝实验的结果表明：絮凝菌h x c s 1 所产絮凝 剂对废乳化液c o d c ，有很好的。去除效果，去除率为8 7 8 4 。 1 2 5 食品工业废水的处理 微生物絮凝剂用于食品废水的处理，可达到满意的效果。如用微生物絮凝剂普鲁兰 来处理味精生产废水，其c o d 和s s 的去除率可达到4 0 左右，其浊度去除率可达9 9 f 3 9 】。 用絮凝剂a - 9 处理淀粉厂的黄浆废水，其处理效果也明显优于目前使用的化学絮凝剂， 且可回收其蛋白质成分作饲料。 1 2 6 其它方面的应用 最近李楠等m 人将微生物絮凝剂用于甘蔗蔗汁澄清工艺。实验结果显示，微生物发 酵液在蔗汁沉降试验中的絮凝率为6 9 2 ，清汁色值为8 7 4 i u 。这些研究在制糖工业中对 蔗汁的絮凝澄清具有很好的应用价值，可降低企业的生产成本，为微生物絮凝剂的利用 开辟了条新途径，也为微生物絮凝剂将来在糖厂中的应用奠定了基础。微生物絮凝剂 在活性污泥脱水方面的应用是一个新的领域，目前应用较少。之所以考虑到在这方面应 用主要还是看到微生物絮凝剂具有的良好絮凝效果。污水处理厂浓缩池中的的污泥，由 8 广西大学硕士掌位论文徽生物h 伍一0 4 产絮凝荆的研制、絮凝机理及其应用研究 于含水率较高，对污泥的处理带来很大困难，在浓缩池中的污泥加入少量微生物絮凝剂， 同时加人一些有效的助凝剂，不但能够大大改善污泥的脱水效果，还能去除无机和有机 高分子絮凝剂对污泥后续处理带来的不良影响【4 1 1 。 1 3 微生物絮凝剂的发展前景与趋势 微生物絮凝剂以其无二次污染、可降解等特点展示了广阔的应用前景。鉴于目前国 内外的研究状况，微生物絮凝剂的主要发展趋势体现在以下几个方面： ( 1 ) 目前菌种筛选的方法主要是考察发酵培养液对高岭土悬浊液的絮凝效果，但这 种方法并不具有代表性。所以找到一种快速准确的方法筛选絮凝剂产生菌势在必行。 ( 2 ) 继续深入微生物絮凝剂成品的提取工艺研究，为以后大规模工业化生产和推广 奠定基础： ( 3 ) 选用廉价的培养基来降低培养基的生产成本，建立高效生化反应器，不断发展 适合微生物絮凝剂研制与应用的新技术、新工艺。 ( 4 ) 研究微生物絮凝剂与其它絮凝剂的配合使用。这样不仅可以互补，还可提高絮 凝效率，而且还可降低絮凝剂投加量，达到降低成本的目的。采用廉价底物经过多株菌混 合发酵后制得复合型微生物絮凝剂也是微生物絮凝剂的一个发展方向。 ( 5 ) 加强微生物絮凝剂在生物学领域的研究，比如遗传学、代谢机理、系统发育学 等方面。 ( 6 ) 利用核磁共振、气质色谱、紫外、红外光谱等高科技手段对微生物絮凝剂的结 构进行表征，加强微生物絮凝剂絮凝机理和结构的研究。 1 4 课题研究的目的、意义及研究内容 1 4 1 研究目的 微生物絮凝剂是利用现代生物技术，通过微生物发酵、抽提、精制从微生物或其分 泌物中得到的一种具有生物分解性和安全性的新型、高效、无毒的水处理剂。本课题研 究的目的是基于目前微生物絮凝剂研究发展趋势及其存在的问题，优化微生物絮凝剂产 9 徽生物m f 一0 4 产絮凝荆的研制、絮凝机理及其应用研究 生菌m f 0 4 的制备条件，寻找替代培养基来降低生产成本，探讨絮凝机理，开展广泛的 应用研究，为微生物絮凝剂的工业化生产和实际应用提供理论依据。 1 4 2 研究意义 污水处理技术的不断发展和工程应用己经成为维系社会经济可持续发展的必要组 成部分。随着水资源和水污染形势的日趋严峻，水处理技术开始走向了以资源综合利用 为背景的历程。在当今各种污水处理工艺中，生物处理工艺应用最为广泛。但是随着污 水水质的复杂化和更多难降解有机物的出现，传统的污水处理工艺及方法己很难满足现 代污水处理要求。絮凝剂是一类可使液体中不易沉降的悬浮颗粒凝聚沉淀的物质，它是 絮凝沉淀法处理水和废水的必不可少的药剂。现在广泛使用的无机絮凝剂和有机高分子 絮凝剂都对人类和生态环境有不同程度的影响。所以微生物絮凝剂方面的研究，在絮凝 剂领域己越来越受到国内外的关注。 本课题的创新性为：( 1 ) 为菌株m f 0 4 寻找到了一种新的替代培养基，降低了生产 成本；( 2 ) 对絮凝机理进行了深入研究；( 3 ) 将微生物絮凝剂应用到选矿废水和赤砂 糖脱色的研究中，取得了良好的处理效果。 1 4 3 研究内容 本课题主要开展如下研究工作： ( 1 ) 微生物絮凝剂产生菌的富集培养、分离和纯化研究。 ( 2 ) 替代培养基的研究。 ( 3 ) 首先对不同碳源、不同氮源、无机盐浓度、培养基p h 值、摇床转速进行单因 素实验，最后选取四个因素进行正交实验得出最佳的培养条件。 ( 4 ) 对菌株所产絮凝剂进行絮凝活性研究并测定菌株m f 0 4 的生长曲线。 ( 5 ) 通过紫外和红外光谱对菌株m f 0 4 所产絮凝剂进行表征，并通过z e t a 电位和红 外光谱对絮凝机理进行研究。 ( 6 ) 对选矿废水和赤砂糖的脱色进行应用研究。 l o 做生物m f - 0 4 产絮凝锕的研制、絮凝机理及其应用研究 第二章微生物絮凝剂产生菌的富集培养及替代培养基的研究 2 1 实验仪器与药品 2 1 1 实验仪器 立式压力蒸汽灭菌器 z h w h - 2 1 0 2 型恒温摇床 s p s 15 0 b 型生化培养箱 f a 2 1 0 4 型电子天平 p h s 3 型酸度计 7 2 3 p c 可见分光光度计 i - i h $ 2 1 - 6 电热恒温水浴锅 m y 3 0 0 0 6 智能型混凝试验搅拌仪 x p 2 0 1 显微镜 2 1 2 实验药品 上海华线医用核子仪器有限公司 上海智城分析仪器制造有限公司 上海跃进医疗器械厂 上海森信实验仪器公司 中国杭州雷磁分析仪器厂 上海欣茂仪器有限公司 北京长安科学仪器厂 潜江梅宇仪器有限公司 上海精密仪器仪表有限公司 牛肉浸膏、酵母浸膏( 广东环凯微生物科技有限责任公司) 、蛋白胨( b r ：生化试 剂，j 匕京奥博星生物技术有限责任公司) 、硫酸铵( a r ，洛阳市化学试剂厂) 、脲( a r 、 广东省化学试剂工程技术研究开发中心) 、氯化钠( a r ，天津市大茂化学试剂厂) 、硫 酸镁( a r ，上海化学试剂有限公司) 、细菌琼脂粉( 北京陆桥技术有限责任公司) 、无 水氯化钙( a r ，广东台山化工厂) 、磷酸二氢钾( a r ，广东汕头新宁化工厂) 、硝酸钾、 可溶性淀粉、磷酸氢二钾、硝酸钠、氯化钾、葡萄糖( a r ，广东汕头市西陇化工厂) 、 高岭土( c p ，广东汕头市西陇化工厂) 、糖汁( 武鸣某糖厂) 、马铃薯( 广西大学菜市厂) 。 微生物m f 一0 4 产絮凝剂的研制、絮凝机理及其应用研究 2 1 3 样品来源 广西大学玉米地土壤、化学化工学院环境工程实验室改性活性污泥、西校园藕池底 污泥、蒲庙造纸厂正常运行的处理本厂废水处理系统的好氧段活性污泥。 2 1 4 培养基选择 2 1 4 1 富集及分离培养基 细菌： ( 1 ) 牛肉蛋白胨：牛肉膏5 9 ，蛋白胨1 0 9 ，n a c i5 9 ，琼脂l g g ，h 2 01 0 0 0 m l ，p h 7 0 - 7 2 ； ( 2 ) 高氏一号：可溶性淀粉2 0 9 ，k n 0 33 9 ，k 2 h p 0 40 5 9 ，m g s 0 4 7 h 2 0o 5 9 ，f e s 0 4 0 0 1 9 ，n a c l0 5 9 ，琼脂18 9 ，h 2 01 0 0 0 m l ，p n7 0 - 7 2 ； 真菌： ( 3 ) 马铃薯培养基：2 0 马铃薯浸汁1 0 0 m e ，葡萄糖2 9 ，琼脂1 8 9 ，p h 自然 2 1 4 2 通用发酵培养基 葡萄糖2 0 9 ，k h 2 p 0 42 9 ，k 2 h p 0 45 9 ，n a c l0 1g ，脲o 3 9 ，酵母膏0 6 9 ， ( n h 4 ) 2 s 0 4o 3 9 ，m g s 0 4 7 h 2 00 2 9 ，h 2 01 0 0 0 m l ，p n7 5 - 8 5 ； 培养基的灭菌条件为1 2 1 ，0 1 m p a 下灭菌2 0 m i n ，其中葡萄糖在117 ( 3 ，0 0 7 m p a 下灭菌2 0 m i n 。 2 2 实验原理与方法 2 2 1 富集培养 将采集来的样品用无菌水溶解于三角瓶中，并加入几颗玻璃珠并充分震荡，静止2 0 分钟后，用移液管吸取l m l 上清液注入装有5 0 m l 富集培养液的三角瓶( 2 5 0 m l ) 中， 1 4 0 r m i n 1 、3 0 ( 3 培养3 天，用刻度吸管吸取培养液l m l ，转移至新鲜培养基内，如此 重复操作3 次。 絮凝活性的测定参照文献h 刁的方法稍做改动。具体方法为：向1 0 0 m l 的量筒中加 1 2 广西大学硕士学位论文 做生物m f 0 4 产絮凝射的研制、絮凝机理及其应用研究 入4 9 l 的高岭土悬浮液9 6 m l ，在加入2 m l 培养液和2 r o l l 的c a c l 2 溶液，摇匀后静 置1 0 m i n ，取上清液于7 2 3 分光光度计在5 5 0 r i m 波长下测其吸光值。以不加培养液的样 品作对比，以絮凝率e 表示絮凝活性。 e ( ) = ( a - b ) a 1 0 0 式中：a 为未絮凝处理的原悬液5 5 0 r i m 波长处的吸光度；b 絮凝处理后的上清液 5 5 0 r i m 波长处的吸光度。 经过三次富集培养后，得到了不同来源样品的富集浑浊培养液。因此可以根据富集 后的混合培养液的絮凝活性来大致推断能不能从该混合培养液中筛选出微生物絮凝剂 产生菌。本实验选择培养液絮凝率高于6 0 的，对其应用平板稀释法或涂布法进行菌株 的分离与纯化。 2 2 2 微生物产生菌的分离与纯化 用5 支试管分别装9 m l 无菌水，将第三次富集后的培养液用无菌移液管取l m l 注 入装有9 m l 无菌水的试管中，制成l o - 1 的稀释液，依次类推分别制成1 0 、1 0 、1 0