（应用化学专业论文）抗氧化大豆多肽制备和纯化的研究.pdf

上海海洋人学硕士学位论文 抗氧化大豆多肽制备、纯化的研究 摘要 大豆多肽是大豆蛋白经过控制性水解、精制以后得到的一类外源性生物活性 肽，通常由3 5 0 个氨基酸组成。本试验旨在基于国内外研究，即对抗氧化多肽分 子结构、分子大小与抗氧化生理功能的联系，短时、高产率、低成本制备具有较 强抗氧化能力的大豆多肽，并经过分离纯化手段去除低效组分，有效地提高抗氧 化大豆多肽制品的质量，为抗氧化大豆多肽产品的进一步开发、生产奠定基础。 抗氧化多肽分子结构是由选用的酶决定的，而分子大小是由水解程度决定的。 以大豆蛋白为底物，分别用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶和 碱性蛋白酶在各自的最适条件下进行水解，比较酶解物的抗氧化活性。结果表明 菠萝蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶酶解物具有较高的还原能力、清除超氧阴 离子自由基和过氧化氢的能力。筛选制备抗氧化大豆多肽的水解酶及水解条件， 得到高效的抗氧化大豆多肽制品，结果表明：选择1 0 0 0 u g 菠萝蛋白酶、2 0 0 0 u g 中性蛋白酶、2 0 0 0 u g 碱性蛋白酶，三酶复合在p h6 0 ，酶解温度5 0 ，底物浓 度8 0 的酶解条件下，对大豆蛋白酶解4 小时，多肽的抗氧化能力表现最强，还 原能力达到0 8 9 8 ，超氧阴离子自由基的清除率达到4 0 9 3 ，过氧化氢的清除率达 到3 3 3 7 。在此步骤先确定利用复合酶酶解大豆蛋白的最佳酶解温度、底物浓度 和p h ，然后以抗氧化为指标筛选酶解时间，从而达到酶作用于大豆蛋白的高效性。 利用超滤技术分离大豆蛋白酶解物，多肽( 5 1 0 k d a ) 表现出较强的还原能力， 且由t r i c i n e s d s p a g e 电泳验证得分子量比较集中，多肽种类相对较少；而表现 出较强的清除超氧阴离子自由基和过氧化氢的能力，分子量不集中，多肽种类相 对较多。利用高速逆流色谱技术( h s c c c ) 对多肽( 5 k d a ) 进行分离，并利用 反相高效液相色谱技术( i 冲h l p c ) 进一步纯化，得到的多肽的清除超氧阴离子 自由基和过氧化氢的能力分别为5 0 2 o 8 9 和4 9 1 4 0 11 ，相对大豆蛋白酶解 物分别提高了4 3 7 2 和7 1 6 4 ；但是还原能力还是不及经超滤得到的分子量范围 在5 1 0 k d a 的多肽。 利用胃蛋白酶胰酶复合酶水解模式模拟人体自然生理消化过程，经过胃蛋白 上海海洋大学硕士学位论文 酶和胃蛋白酶胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶酶解后的精制抗氧化大豆多肽，清除超氧阴 离子自由基和过氧化氢的能力都有降低，但是降低程度甚微，几乎不影响抗氧化 多肽在人体内的效果。 关键字：抗氧化，大豆多肽，制备，纯化 i i p r e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no fs o y b e a np e p t i d e s w i t ha n t i - o x i d a n ta c t i v i t y a b s t r a c t s o y b e a np e p t i d e s ，t h ec o m b i n a t i o no ft h r e e t of i f t ya m i n oa c i d s ，a r et h ee x t r a n e o u s 枷v es u b s t a n c ea f t e rc o n t r o l l e dh y d r o l y s i sa n dr e f i n i n go fs o y b e a np r o t e i n t h e r e s e a i hi st of i n dae f f i c i e n ta n dc h e a pw a yo fp r e p a r i n gt h ea n t i o x i d a n tp e p t i d e si n s h o r tt i m eb a s i co nt h ec o n n e c t i o no ft h em o l e c u l a rs t r u c t u r ea n dt h em o l e c u l a rw e i g h t o fp e p t i d e sw i t ha n t i o x i d a t i o n s e l e c tt h ew a yo fp u r i f i c a t i o nt og e tt h e e f f e c to f a n t i o x i d a n tp e p t i d e si m p r o v e d b a s i co nt h er e s e a r c h ，p r o d u c t i o na n dd e v e l o p m e n t o f p r o d u c to fa n t i - o x i d a n tp e p t i d e sm a yg oe a s i e r t h em 0 1 e c u l a rs t r u c t u r eo ft h ea n t i o x i d a n tp e p t i d e si se f f e c t e db ye n z y m eb u tt h e m o i e c u l a rw e i g h te f f e c t e db yt h ed e g r e eo fh y d r o l y s i s i n d i c a t et h ea n t i - o x i d a t i o no f f i v ek i n d so fh y d r o l y s a t eh y d r o l y z e dw i t hp e p s i n ，p a p a i n , b r o m e l a i n , n e u t r a lp r o t e a s e a n da l k a l i n ep r o t e a s er e s p e c t i v e l yi ne a c ho p t i m u me n v i r o n m e n to fh y d r o l y s i sw i t h s o y b e a l lp r o t e i na ss u b s t r a t e r e s u l ts h o w s t h a th y d r o l y s a t e sh y d r o l y z e dw i t hb r o m e l a i n , n e u t r a lp r o t e a s ea n da l k a l i n ep r o t e a s eh a v et h es t r o n g e s tr e d u c i n gc a p a c i t ya n dt h e a b i l i t yo fs c a v e n g i n gs u p e r o x i d ea n i o nr a d i c a la n dh y d r o g e np e r o x i d e s e l e c th y d r o l y s i s c o n d i t i o n sf o rp r e p a r i n gs o y b e a r lp e p t i d e sw i t ha n t i o x i d a n ta c t i v i t y r e s u l t ss h o wt h a t t h ep e p t i d e s ，w h i c hs h o wh i g h e s ta n t i o x i d a n ta c t i v i t y , h a v eb e e np r e p a r e db y l0 0 0 u g b r o m e l a i n , 2 0 0 0 u gn e u t r a lp r o t e a s ea n d2 0 0 0 u ga l k a l i n ep r o t e a s et o g e t h e rf o r 4 h o u r s u n d e rt h eh y d r o l y s i sc o n d i t i o n so fp h 6 0 ，t e m p e r a t u r e a t5 0 9 ca n ds u b s t r a t e c o n c e l l t r a t i o na t8 0 r e d u c i n ga b i l i t yr e a c h e so 8 9 8 ，a b i l i t yo fs c a v e n g i n gs u p e r o x i d e 五旧er a d i c a l4 0 9 3 a n da b i l i t yo fs c a v e n g i n gh y d r o g e np e r o x i d e3 3 3 7 s e p a r a t e l y d e c i d et h eh y d r o l y s i st i m ea c c o r d i n gt ot h ea n t i o x i d a t i o na f t e rs e l e c t i n gt e m p e r a t u r e ， p h 锄ds l l b s 仃a t ec o n c e n t r a t i o ni no r d e rt om a k e t h ee n z y m et ot a k eab i g g e s ta f f e c t i o n a f t e ru l t r a f i l t r a t i o nt h ep e p t i d e s ( 5 k d a - 10 k o a ) s h o ws t r o n g e rr e d u c i n ga b i l i t y a n dm ef a c tt h a tt h em o l e c u l a rw e i g h ti sc o n c e n t r a t e di s a l s oi n d e n t i f i e db yt r i c i n e 1 1 1 上海海洋大学硕十学位论文 - s d s p a g ee l e c t r o p h o r e s i s p e p t i d e s ( 酶解温度，且底物浓度对酶解程度的影响非常大，p h 、酶解温度对酶解程 度的影响很小。 表2 - 2 三酶复合酶解正交试验结果直观分析表 t a b l e2 - 2t h eo r t h o g o n a le x p e r i m e n t a lr e s u l t so ft r i p l e e n z y m ec o m p o s i t eh y d r o l y s i s 2 2 3 3 酶解时间的筛选 在最适温度、p h 、底物浓度的酶解条件下，大豆蛋白得到最高效地酶解，以 还原能力、清除超氧阴离子、过氧化氢能力为指标，筛选酶解时间，以期短时、 高效得到抗氧化能力较强的大豆多肽。 ，( 1 ) 还原能力的测定 图2 7 ，未酶解的大豆蛋白还原能力为0 4 7 1 0 0 2 4 。大豆蛋白酶解液的还原能 力大于未酶解的大豆蛋白还原能力，且在4 h 时酶解液的还原能力达到最大，为0 8 9 8 0 0 5 7 ，是未酶解的大豆蛋白还原能力的1 9 1 倍。酶解4 h 后酶解液还原能力逐渐 上海海洋大学硕士学位论文 变小，原因可能是在4 小时后酶解液中具还原能力的基团和位点更多地暴露出来， 但随着水解程度的加深，部分活性结构被破坏，酶解出韵活性基团和位点其具有 的还原能力不足以弥亭卜被破坏的活性结构所具有的还原能力。因此在上述酶解条 件下，4 4 , 时为制备抗氧化大豆多肚的最适值。 口束酶解大自 酶解大豆自 图28 样品清除超氧阴离子自由基能力的测定结果 f i g2 - 8 a b i l i t y o f t h es a m p l e t os c a v e n g es u p e r o x i d ea n i o n l a d i c a l 2 4 操w i_j_j。 删 l_-l- f躺帅 一 _j-j 0张川定 。-_-_f；|蛳舰产l_j旧赢=蚴一月 。_-。 目盹。_l-_ l f l u 。 酹 广|旧旧，蝴 ， 。 桨 i!o 蒯 m o o o 0 o 0 o o o s*aoiw目 o 。0 0 0 上海海洋大学硕l 学位论文 罔2 8 ，未经酶解的大豆蛋白超氧阴离子自由基清除率为1 317 17 2 。大豆 蛋白酶解液清除超氧阴离了自由基的能力远大于未经酶解的大豆蛋白的消除能 力，且在4 h 时酶解液清除超氧阴离子自由基的能力达到最大，为4 09 3 26 3 ，足 米酶解大豆蚩白的31 2 倍，之后逐渐变小。因此经4 h 酶解，可得到对超氧阴离子自 山基有较强清除能力的大豆多肚。 ( 3 ) 清除过氧化氢能力的测定 i i 口i 1 自 i 图2 - 9 样品清除过氧化氢能力的测定结果 f i g2 9 a b i l i t y o f t h es a m p l e t os c a v e n g eh y d r o g e np e r o x i d e 罔2 - 9 ，未经酶解的大豆蛋白过氧化氢清除率为51 7 04 3 。大豆蚩门酶解 液消除过氧化氢的能力远大于未经酶解的大豆蛋白的清除能力，且在4 h 时酶解液 清除超氧阴离子自由基的能力达到撮大， 64 5 倍，之后逐渐变小。因此经4 h 酶解 h 多肽。 为3 33 7 o1 8 ，是未酶解大豆蛋白的 可得到对过氧化氧有较强清除能力的大 以还原能力、清除超氧阴离子自山基和过氧化氢能力为指标，在最适酶解条 件f ，大豆蛋白经4 h 酶舾! ，制得的大豆多肽表现m 的抗氧化性最强。 23 本章小结 ( i ) 选择1 0 0 0 u g 菠萝蛋白酶、2 0 0 0 u g 中性蛋白酶、2 0 0 0 u g 碱性蛋白酶， 三酶复合在p h60 ，酶解温度5 0 c ，底物浓度8o 的酶解条件f ，对大 一$一*s#s# 上海海洋大学硕士学位论文 豆蛋白酶解4 h ，还原能力、超氧阴离子自由基和过氧化氢的清除率达到最高， 分别为o 8 9 8 + 0 0 5 7 、4 0 9 3 4 - 2 6 3 、3 3 3 7 4 - 0 1 8 ，表现出较高的抗氧化能 力。 ( 2 ) 大豆蛋白酶解液的抗氧化能力远大于未经酶解的大豆蛋白的抗氧化能力，还 原能力前者为后者的1 9 1 倍，超氧阴离子清除率为3 1 2 倍，过氧化氢的清 除率为6 4 5 倍。 上海海洋大学硕士学位论文 3 1 材料和方法 第三章抗氧化大豆多肽的纯化 3 1 1 材料 大豆蛋白酶解物( 自制) ； 抗超氧阴离子自由基与产生超氧阴离子自由基测试盒、双氧水测试盒( 南京建成 生物科技研究所) ； s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳超低分子量标准蛋白质( 上海升正生物技术有限公司) ； 铁氰化钾、三氯乙酸( t c a ) 、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、三氯化铁、正庚烷、 正丁醇、甲醇、正丙醇、乙醇、甲基叔丁基醚、乙腈、甲酸等( 国药集团) ： 3 1 2 仪器 r o n f u f 4 1 0 0 型膜分离装置、中空纤维式超滤组件：外压式p p 1 0 0 、p s 5 ，内 压式p s 1 0 ( 上海摩速科学器材有限公司) ； 圆盘电泳槽、d y y i i i 稳压稳流电泳仪( 北京市六一仪器厂) ； t b e 2 0 a 高速逆流色谱仪( 深圳同田生化技术有限公司) ； t b e 3 0 0 b 高速逆流色谱仪( 深圳同田生化技术有限公司) ； 半制备型高效液相色谱仪( a m e r s h a mp h a r r n a c i ab i o t e c h ，s o u r c e5 r p cs t 4 6 1 5 0 柱) ； 分析型高效液相色谱仪( 上海天美分析仪器有限公司) ； 紫外可见分光光度计( u n i c ou v 2 0 0 0 ) ； 真空冷冻干燥器( c h s ta l p h a l 2 ) ； 超低温冰箱( 海尔公司) 3 1 3 方法 3 1 3 1 超滤分离 将大豆蛋白酶解物离心，取上清液，经1 0 0k d a 超滤膜( p p 1 0 0 中空纤维组 件) 截流分离，保留浓缩液；将滤液再经1 0k d a 超滤膜( p s 1 0 中空纤维组件) 截流分离，保留浓缩液；将滤液再经5k d a 超滤膜( p s 5 中空纤维组件) 截流分 离，保留浓缩液。超滤过程保持组件最大工作压力不超过0 1 5 m p a ，依次制备分子 上海海洋人学硕士学位论文 量为1 0 0k d a 以上、1 0 0 1 0k d a 、1 0 5k d a 、5k d a 以下的大豆多肽溶液。然后 将各部分溶液进行真空冷冻干燥，分别测定各部分的抗氧化活性。 3 1 3 2t ri c i n e - s d s - p a g e 电泳 采用三层胶，从上到下分别为浓缩胶、间隙胶和分离胶，浓度分别为5 、1 2 和2 0 ，上样量为1 0 m g m l 的样品6 1 a l ，稳流1 5 m a 。 3 1 3 3 高速逆流色谱法( h s c c c ) 分离 ( 1 ) 试剂系统的选择 a 试剂系统的吸光度 本研究检测物为肽段，在2 1 4 r i m 处有强吸收，因此在选择溶剂系统时要避开 在2 1 4 n m 处有强吸收的系统，例如醛类、酮类、不饱和烃类和酯类等。饱和的醇、 烃、醚在近紫外，即2 0 0 4 0 0 h m 处不产生吸收，作为系统的组成成分。 b 样品的极性 本研究目标大豆多肽为极性物质，因此在选系统时应选适宜极性物质分离的 系统。本研究从以下系统中筛选。 a ：正庚烷：正丁醇：甲醇：水宅：2 ：3 ：3 b ：正丁醇：甲醇：水= 2 - 1 ：3 c ：正丁醇：乙醇：水= 2 ：l ：3 d ：甲基叔丁基醚：乙腈：水= 2 ：1 ：3 e ：甲基叔丁基醚：乙腈：正丁醇：水_ 2 ：1 ：2 ：5 f 甲基叔丁基醚：乙腈：甲醇：水= 2 - 1 ：3 ：5 c 样品分离 a 系统配制 将组成系统的各试剂按比例混合，充分摇匀，静置，待上下相完全分离，分 别取上下相，脱气o 5 h ，待用。选用上相为固定相，下相为流动相。 b 样品溶液制备 称取分子量 5 k d a 的样品8 0 m g ，溶于l m l 体系试剂中( 流动相和固定相分 别o 5m l ) ，充分溶解，制成样品溶液。进样量2 0ul 。 c 分析型逆流色谱仪分离 以8 0 m l m i n 的流速将固定相泵满主机中的螺旋柱，停泵，启动水浴温度为 2 5 。开启主机，逐步调节转速至1 7 5 0 r m i n ( 正转) ，然后以0 5 m l m i n 的流速向 螺旋柱泵入流动相，待流动相泵出。检测波长为2 1 4 n m ，待基线平稳，也就是固 定相与流动相达到了动力学平衡状态，由进样阀将样品溶液注入主机。 ( 2 ) 固定相保留率测定【5 6 】 上海海洋大学硕十学位论文 在制备型逆流色谱仪上，将固定相泵满主机中的螺旋柱，开启主机，逐步调节 转速至需要值，然后以一定流速向螺旋柱泵入流动相，收集主机出口流出的固定 相。当主机出口流出流动相时，螺旋柱内固定相和流动相达到动力学平衡状态， 此时测量被流动相推出的固定相体积v 出，按下式计算固定相保留率p 。 p = ( v 总一v 出) v 总宰1 0 0 ( 3 - 1 ) 式中：v 总- 管路总体积( m l ) ； v 出一流动相推出的固定相体积( m l ) 以保留率为指标，筛选制备型逆流色谱仪分离样品的最佳转速、温度和流速。 ( 3 ) 样品制备 以2 0 m l m i n 流速将固定相泵满主机中的螺旋柱，停泵，启动水浴。开启主机， 逐步调节转速至需要值，然后以一定流速向螺旋柱泵入流动相，待流动相泵出。 检测波长为2 1 4 n m ，待基线平稳，也就是固定相与流动相达到了动力学平衡状态， 由进样阀将样品溶液注入主机。分别收集各峰的组分，进行真空冷冻干燥，分别 测定各部分的抗氧化活性。样品溶液为分子量 5 k d a 的样品1 5 0 m g m l ，进样量 为2 0 m l 。 3 1 3 4 半制备型反相高效液相法( r p - h l p c ) 分离 ( 1 ) 系统配制 流动相a ：乙腈：甲酸：水= 2 ：0 1 ：9 7 9 流动相b ：乙腈：甲酸：水= 7 0 ：0 1 ：2 9 9 ( 2 ) 操作参数 流动相流速1m l m i n ：上样量为5 0 m g m l 的样品溶液l m l ，检测波长 2 1 4 n m 。如表3 1 进行梯度洗脱： 表3 - 1 半制备型h p l c 梯度洗脱流动相配比 t a b l e3 1t h em o b i l ep h a s e 谢t hs e m i - p r e p a r a t i v eh p l c 分别收集各峰的组分，进行真空冷冻干燥，分别测定各部分的抗氧化活性。 2 9 上海海洋大学硕士学位论文 3 1 3 5 分析型反相高效液相法( r p - h l p o ) 分离 ( 1 ) 系统配制 流动相a ：乙腈：甲酸：水= 2 ：0 1 ：9 7 9 流动相b ：乙腈：甲酸：水= 7 0 ：o 1 ：2 9 9 ( 2 ) 操作参数 流动相流速o 5m l m i n ；上样量为s o m g m l 的样品溶液2 0ul ，检测波长 2 1 4 n m 。 如表3 2 进行梯度洗脱。 表3 - 2 分析型型h p l c 梯度洗脱流动相配比 t a b l e3 - 2t h em o b i l ep h a s e 谢ma n a l y t i c a lh p l c ( 3 ) 蛋白质含量测定 福林法【2 l 】。 3 1 。3 6 抗氧化能力的测定 样品浓度为1 0 m g m l ，其它操作详见制备部分1 3 5 。 3 2 结果与讨论 3 2 1 超滤分离 对分子量为1 0 0k d a 以上、1 0 0 1 0k d a 、1 0 5k d a 、5k d a 以下4 部分的大 豆多肽取相同的量，进行抗氧化能力测定。 由图3 1 、3 2 和3 3 可得，分子量分布在1 0 k d a 以下的大豆多肽抗氧化能力 表现较高，原因可能是小分子的多肽活性位点或基团更多地暴露在外，能充分和 自由基等结合，所以多肽分子量的大小与抗氧化性有着密切的联系。具体为多肽 ( 5 1 0 k d a ) 表现出更强的还原能力，为0 4 8 7 0 0 1 6 。而5 k d a 以下的大豆多肽 表现出最强的清除超氧阴离子自由基和过氧化氢的能力，分别为4 6 8 1 9 3 、 3 0 海海洋大学硕+ 学位论文 4 55 3 24 。 1 0 k d a 以f 的人且多肽得率为3 75 2 ，产率较高，满足实际生产的要求。如 需提高蟓料的利用率，可对1 0 k d a 以上的大豆多肤进步进行控制性水解。 6 0 5 0 ： 差柏 耋 主” k l 2 0 日 】0 紧a n 垂錾：。4 图3 - 2 不同分子量大豆多肤的清除超氧阴离干自由基的能力 f i g3 - 2 a b i l i t y o f t h es o y b e a np e p t i d c s w i t h d i f f e r e n t m o l e c u l a r w e i 曲b t os c a v e n g es u p e r o x i d ea n i o nm d i c a l e c 0 0 0 o o 上海海洋大学硕士学位论文 6 。 s 。 ： 。v 4 0 ；3 0 姜 2 0 $ 1 0 丁 _ _ 一 囤3 - 3 不同分子量大豆多肤清除过氧化氢的能力 f i g3 - 3 a b i l i t y o f t h es o y b e a np e p t i d e s w i t hd i f f c r e m m o l e c u l a r w e i g l l b t os c a v e n g e h y d r o g e np e r o x i d e 3 2 2t r i c i n r s d sp a g e 电泳 2 0 1 k d a 一 1 44 k d a 4 7 6 k d a 十一a b o u t 7 6k d a 62 k d a 一 3 4 k d a _ + 一3 4 - 6 2 k d a m a r e e r 图3 - 4 小于10 k i ) a 走豆多肽t r ic i n es d sp a g e 电泳结果 f i g3 - 4 r e s u l t o f t h e t r i c i n e - s d s - p a g ee l e e t r o p h o r e s i s o f t h ep e p t i d e s l e s s t h a n l 0 k d a 图3 - 4 ，小于1 0 k d a 大豆多肽经t r i c i n e s d s p a g e 屯泳，在接近7 6 k d a 及 34 62 k d a 出现了谱带，且在接近76 k d a 的位置谱带较窄，颜色较淡；在 3 4 - 62 k d a 的位黄谱带分布较宽，颜色较深，因此可以得出小于1 0 k d a 的大豆多 肽，主要山大约为76 k d a 和3 4 62 k d a 问的多肽组成，且3 4 62 k d a 间的组分 上海海洋人学硕士学位论文 含量比例较大。 在接近7 6 k d a 标准蛋白谱带处出现的谱带较窄，可能是分子量差异较小，分 布的大豆多肽种类相对比较少；在6 2 k d a 和3 4 k d a 标准蛋白谱带间出现的谱带 较宽，可能是分子量差异较大，相对含有的大豆多肽种类比较多，因此接下来对 分子量小于5 k d a 的大豆多肽进行进一步分离。 3 2 3h s c c c 分离 3 2 3 1 试剂系统选择结果 利用上述溶剂系统对分子量小于5 k d a 的大豆多肽进行进一步分离，以下为利 用各溶剂系统的分析型高速逆流色谱图。 图3 - 5 溶剂系统ah s c c c 谱图 f i g 3 5h s c c cc h r o m a t o g r a mo ft h ep c p t i d e ss e p a r a t e d 、i ms o l v e n ts y s t e ma 上海海洋大学硕士学位论文 图3 - 6 系统bh s c c c 谱图 f i g 3 - 6h s c c cc h r o m a t o g r a mo f t h ep e p t i d e ss e p a r a t e d 谢ls o l v e n ts y s t e mb 图3 - 7 系统ch s c c c 谱图 f i g 3 7h s c c cc h r o m a t o g r a mo ft h ep e p t i d e ss e p a r a t e dw i t l ls o l v e n ts y s t e mc 图3 - 8 系统dh s c c c 谱图 f i g 3 - 8h s c c cc h r o m a t o g r a mo ft h ep e p t i d e ss e p a r a t e dw i t hs o l v e n ts y s t e md 上海海洋人学硕十学位论文 图3 - 9 系统eh s c c c 谱图 f i g 3 - 9h s c c cc h r o m a t o g r a mo ft h ep e p t i d e ss e p a r a t e dw i t hs o l v e n ts y s t e me 图3 1 0 系统fh s c c c 谱图 f i g 3 - 10h s c c cc h r o m a t o g r a mo ft h ep e p t i d e ss e p a r a t e dw i t hs o l v e n ts y s t e mf 对以上图谱进行分析，图3 1 0 ，即利用甲基叔丁基醚：乙腈：甲醇：水试剂 系统，样品可以得到部分分离，因此选择甲基叔丁基醚：乙腈：甲醇：水系统为 本试验所用试剂系统。 3 2 3 2 制备型h s c c c 条件优化 样品性质、流动相流速、进样量、主机转速、主机温度等因素，均会影响逆 流色谱仪运转过程中固定相的保留值，也必然影响逆流色谱仪中样品成分的动态 分配特性，因而影响样品成分的分离效果。一般固定相保留率越高，分离效果越 上海海洋人学硕士学位论文 好，固定相保留率必须大于等于4 0 t 5 6 1 ，否则该溶剂系统不适用。针对具体样品 来说，样品性质已经固定，通过改变逆流色谱条件对固定相保留率的影响，从而 筛选出高速逆流色谱仪分离样品的最佳参数。 ( 1 ) 转速对保留率的影响 7 0 5 7 0 6 9 5 6 9 琶6 8 5 篓6 8 举6 7 5 6 7 6 6 5 6 6 7 0 07 5 08 0 08 5 09 0 09 5 0 转速( r m i n ) 图3 - 1 1 转速对固定相保留值的影响结果 f i g 3 11r e l a t i o nb e t w e e ns t a t i o n a r yp h a s er e t e n t i o na n dr o t a t i o n a ls p e e d 图3 1 1 ，随着转速的提高，固定相保留率增加，所以在实际操作中，尽可能 地提高转速，提高样品的分离效果。本实验所用制备型逆流色谱转速范围是 0 10 0 0 r p m m i n ，考虑到设备的损耗，主机转速不宜过高，采用9 0 0r p m m i n 为试 验操作参数。 ( 2 ) 温度对保留率的影响 7 0 5 7 0 6 9 5 笔6 9 糌 缸6 8 5 毯 6 8 6 7 5 6 7 温度( 1 2 ) 图3 - 1 2 ( a ) 温度对固定相保留值的影响结果 3 6 上海海洋大学硕士学位论文 f i g 3 - 1 2 ( a ) r e l a t i o nb e t w e e ns t a t i o n a r yp h a s er e t e n t i o na n dt e m p e r a t u r e 图3 1 2 ( a ) ，随着试验温度的升高，固定相保留率增加，当温度升到2 5 c 后， 保留率出现最大值，后续逐渐下降。进一步确定温度。 6 9 9 4 6 9 9 2 6 9 9 6 9 8 4 6 9 8 2 6 9 8 2 42 52 6 2 72 82 9 图3 1 2 ( b ) 温度对固定相保留值的影响结果 f i g 3 1 2 0 , ) r e l a t i o nb e t w e e ns t a t i o n a r yp h a s er e t e n t i o na n dt e m p e r a t u r e 图3 1 2 ( b ) ，当温度升高到2 6 c 时，固定相保留率达到最大，为样品分离的 最佳温度。 ( 3 ) 流速对保留率的影响 7 1 5 7 1 ；7 0 5 姗 鬈7 0 6 9 5 6 9 00 511 522 5 流速( m l m i n ) 图3 - 13 流速对固定相保留值的影响结果 f i g 3 - 1 3r e l a t i o nb e a v e e ns t a t i o n a r yp h a s er e t e n t i o na n df l o wv e l o c i t y 图3 一1 3 ，随着流速的增加，固定相保留率下降，样品的分离效果降低，因此在 3 7 8 6 8 8 9 9 6 6 弓船诬肇 上海海洋大学硕士学位论文 操作中，尽可能降低流动相流速来提高样品的分离效果。但是降低流速也会出现 一些负面的现象，例如拖尾等。因此，针对此操作系统，选择1 5 m l m i n 为最佳 试验操作参数。 综上所述，选定制备型高效逆流色谱仪的最佳操作参数为：转速正转9 0 0 r p m m i n ，主机温度2 6 。c ，流动相流速1 5 m l m i n 。 3 2 3 3 制备型h s c c c 谱图 粗 靴 翰 栩 嵫 八 几 锨 k 1 。钿。f 山1 1 1 缸i t 。i 缸自。1 矗1 矗1 1 面。蕊狮 k 图3 1 4 制备型高速逆流色谱图 f i g 3 - 1 4c h r o m a t o g r a mo f t h ep e p t i d e ss e p a r a t e db yp r e p a r a t i v eh s c c c 图3 1 4 ，由制备型高速逆流色谱仪对样品进行分离，得到五个大峰。测得峰 1 ：峰2 ：峰3 ：峰4 ：峰5 大豆多肽含量质量比值约为8 3 ：2 4 2 ：3 6 8 ：2 2 1 ： 3 3 。 3 2 3 4 抗氧化能力的测定 利用逆流色谱仪分离样品，对分得的五个峰的组分，分别取相同的量，进行 抗氧化能力测定。 图3 1 5 、3 1 6 和3 1 7 ，峰1 组分虽然含量只占8 3 ，但其还原能力为0 4 2 3 4 - 0 0 2 3 、超氧阴离子自由基和过氧化氢的清除率分别达到4 8 8 1 1 2 3 和4 7 9 8 4 - 0 5 ，均明显较强，可以作为强抗氧化剂利用。峰3 的组分抗氧化能力位居第二， 还原能力0 4 1 5 4 - 0 0 1 7 、超氧阴离子自由基和过氧化氢的清除率分别达到4 7 3 4 o 8 9 和4 5 5 5 4 - 0 6 2 ，但是峰3 组分含量占3 6 8 ，为含量最高的峰，因此从得 率和抗氧化强度两个角度考虑，峰1 和峰3 的组分作为目标产物。峰4 和峰5 抗 氧化能力整体偏弱。 上海海洋大学硕+ 学位论文 0 4 6 0 4 4 o 4 2 星0 4 o o 苫0 3 8 o o 3 6 0 3 4 0 3 2 2345 略 图3 - 1 5h s c c c 各峰大豆多肽的还原能力 f i g 3 - 15r e d u c i n ga b i l i t yo f t h es o y b e a np e p t i d e ss e p a r a t e db yh s c c c 5 1 5 0 主4 9 糌4 8 鬓4 7 謦4 6 皿 m4 5 龌 区4 4 錾4 3 4 2 4 l 12 345 蝰 图3 - 1 6h s c c c 各峰大豆多肽的清除超氧阴离子自由基的能力 f i g 3 1 6a b i l i t yo f t h es o y b e a np e p t i d e ss e p a r a t e db yh s c c c t os c a v e n g es u p e r o x i d ea n i o nr a d i c a l 3 9 上海海洋大学硕士学位论文 3 睦 图3 - 1 7h s c c c 各峰大豆多肽清除过氧化氢的能力 f i g 3 1 7a b i l i 够o f t h es o y b e a r lp e p t i d e ss e p a r a t e db yh s c c c t os c a v e n g eh y d r o g e np e r o x i d e 3 2 4r p h l p c 分离 3 2 4 1 半制备型r p - h l p c 分离 姗 l 嘲 埘 o40 6 0 吐 图3 - 1 8 分析型r p - h p l c 图谱 f i g 3 18c h r o m a t o g r a mo ft h ep e p t i d e ss e p a r a t e db ys e m i - p r e p a r a t i v er p - h p l c 由半制备型r p h l p c 分离由高速逆流色谱仪分离得到的峰1 的组分，可得到 六个峰，分别收集组分。测得峰1 ：峰2 ： 比值约为4 2 ：1 5 3 ：1 8 8 ：3 1 1 ： 峰3 ：峰4 ：峰5 ：峰6 大豆多肽含量质量 1 2 3 ：4 4 。 的 船 舱 化 们 鹪 母v r箍g埔翠骄竣鬣115 上海海洋人学硕士学位论文 3 2 4 2 抗氧化能力测定 0 4 4 5 0 4 4 0 4 3 5 0 4 3 皇 舌0 4 2 5 o 苫0 4 2 o 0 4 1 5 0 4 1 0 4 0 5 0 4 5 2 5 l 芭5 0 糌 鬟4 9 鹕 佃4 8 血 寝4 7 医 球4 6 骝 4 5 4 4 12 3 4 56 峰 图3 - 1 9r p - h p l c 各峰大豆多肽的还原能力 f i g 3 - 1 9r e d u c i n ga b i l i t yo f t h es o y b c a np e p t i d e ss e p a r a t e db yr p - h p l c 23456 蝰 图3 - 2 0r p - h p l c 各峰大豆多肽的清除超氧阴离子自由基的能力 f i g 3 - 2 0a b i l i t yo ft h es o y b e a np e p t i d e ss e p a r a t e db yr p h p l c t os c a v e n g es u p e r o x i d ea n i o nr a d i c a l 上海海洋人学硕士学位论文 水 v r 捉 g 骊 篁 骄 捌 畿 澳 2 3 456 峰 图3 - 2 1r p - h p l c 各峰大豆多肽清除过氧化氢的能力 f i g 3 21a b i l i 够o ft h es o y b e a np e p t i d e ss e p a r a t e db yr p - h p l c t os c a v e n g eh y d r o g e np e r o x i d e 图3 1 9 、3 - 2 0 和3 - 2 1 ，峰4 还原能力为0 4 3 9 0 8 9 、超氧阴离子自由基和过 氧化氢的清除率分别达n 5 0 2 0 8 9 和4 9 1 4 9 6 0 1 1 ，均明显较强。 3 2 5 分析型r p - h l p c 纯度检测 对峰4 的组分上分析型r p h l p c 分离，进行纯度鉴定。 ，j 法毵：系统默认( f f i f 移：p 1 法) 一 第 譬 一 o 。寸盘 ，o ：- ，： 6 ： 叠 悸 051 01 52 02 53 03 54 04 55 05 5 f m 叫 图3 - 2 2 大豆多肽r p - h p l c 谱图 f i g 3 - 2 2c h r o m a t o g r a mo ft h ep e p t i d e ss e p a r a t e db ya n a l y t i c a lr p - h p l c 4 2 巧 的 巧 镐 巧钉 巧 伯 巧 钻 巧 伯 鸫 钉 怕 蟠 上海海洋人学硕士学位论文 表3 3 数据显示，图3 2 2 ，在3 0 4 2 3 m i n 出现一个大峰，面积比为7 3 6 8 ，也 就是说由半制备型r p h l p c 制备所得的峰4 组分，纯度为7 3 6 8 。收集图3 2 2 最大 峰的组分，测定其蛋白质含量为5 4 8 m g m l 。进行抗氧化测定，还原能力、超氧阴 离子自由基和过氧化氢的清除率分别为0 4 4 2 0 0 0 6 、5 0 1 6 1 0 2 、4 9 0 4