（应用化学专业论文）早期癌症诊断的NMR方法的研究.pdf

j 北京化工大学位论文原创性声明 l i i iili ii iil i ii i i i iu l y 1810 5 7 0 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 作者签名： 堑塑鱼 日期：丝1 7 乡：牛 关于论文使用授权的说明 学位论文作者完全了解北京化工大学有关保留和使用学位论文 的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属北 京化工大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印 件和磁盘，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全 部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编 学位论文。 保密论文注释：本学位论文属于保密范围，在土年解密后适用 本授权书。非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授 权书。 作者签名：堑塑堑塑 导师签名：虚鳖姿 学位论文数据集 中图分类号 0 6 5 7 2 学科分类号 1 5 0 5 5 论文编号 10 0 10 2 0 0 7 0 7 8 4 密级 学位授予单位代码 10 0 1 0 学位授予单位名称 北京化工大学 作者姓名赵梅仙学号 2 0 0 4 0 0 0 7 8 4 获学位专业名称应用化学获学位专业代码 0 8 1 7 0 4 课题来源国家自然科学基金研究方向分子光谱与波谱 论文题目早期癌症诊断的n m r 方法的研究 关键词核磁共振波谱技术，早期癌症诊断，分子水平，代谢物 论文答辩日期 2 0 0 7 - 5 - 2 8论文类型 基础研究型 学位论文评阅及答辩委员会情况 姓名 职称 工作单位学科专长 指导教师唐光诗副教授北京化工大学有机合成 评阅人1万有志教授北京化工大学有机合成 评阅人2高秀香高工北京大学仪器分析 评阅人3 评阅人4 评阅人5 石油化工科学研究 椭员会捕王京高工仪器分析 院 答辩委员1万有志教授北京化工大学有机合成 答辩委员2 高秀香 高工 北京大学仪器分析 答辩委员3 答辩委员4 答辩委员5 注：一 四 论文类型：1 基础研究2 应用研究3 开发研究4 其它 中图分类号在中国图书资料分类法查询。 学科分类号在中华人民共和国国家标准( g b t1 3 7 4 5 9 ) 学科分类与代码中 查询。 论文编号由单位代码和年份及学号的后四位组成。 早期癌症诊断的n m r 方法的研究 摘要 核磁共振( n m r ) 波谱法是一种表征分子结构、组成变化的有效手 段，利用核磁共振波谱技术可以从分子水平上研究肿瘤与对照组织之 间的差别，可能发展成为早期癌症诊断的方法。该方法几乎与核磁共 振成像( m r i ) 同时产生，由于技术原因，没能象m 刚一样得到广泛应 用。近年来，随着核磁共振技术的进步，n m r 方法展现出新的生命 力，国内外用核磁共振技术进行肿瘤诊断的报导日益增加。它是在高 分辨的核磁共振波谱仪上对组织细胞进行测试，得到核磁共振波谱， 从而得到组织细胞中很多分子水平的代谢物结构和组成信息，同时结 合核磁共振各种先进的技术手段进行更深入的研究，因此它在癌症的 早期诊断中具有很好的前景。本文利用核磁共振波谱技术对生物组织 样品中代谢物的变化进行了研究，更深入地揭示肿瘤的发生、发展中 产生的各种分子水平变化，初步建立了癌症早期诊断的n m r 方法。 主要工作如下： 1 、采用液体核磁共振波谱技术，对肠肿瘤及对照组织开展核磁共 振1 h 波谱研究，结合临床病理结果，得出肿瘤组织和对照组织在代 谢物的种类和含量差别，初步建立快速肿瘤诊断的新方法。 2 、采用高分辨魔角旋转技术( h rm a s ) 对肠癌组织和正常组织 北京化工大学硕士学位论文 进行测定，并结合肠组织高氯酸( p c a ) 提取物的液体核磁共振波谱， 从而更全面深化对生物组织中代谢物的组成及含量变化的认识。 3 、采用固体和液体核磁共振波谱技术对肠癌组织和正常组织进行 3 1 p 的测定，得到含磷代谢物特征峰化学位移的变化情况，从而得到 肠癌组织和正常组织的酸碱性的差异性。 4 、采用红外光谱技术对肠癌组织和正常组织进行测定，将高分辨 的核磁共振波谱结果与红外光谱测定结果结合起来，更深入地认识肿 瘤的发生发展所引起的光谱和波谱的变化，表征与肿瘤相关的特征峰 的分子结构和组成的变化。使之相互取长补短，最终实现综合两种方 法的优势，达到发展一种新型的肿瘤分子诊断新方法的目的。 关键词：核磁共振波谱技术，早期癌症诊断，分子水平，代谢物 c o m p o n e n t i tc a nb eu s e dt os t u d yt h ed i f f e r e n c e so ft h et u m o ra n dt h e c o r r e s p o n d i n g n o r m a lt i s s u e si nt h em o l e c u l a rl e v e l t h i sm e t h o d a p p e a r e dw i t hm a g n e t i cr e s o n a n c ei m a g i n g ( m r i ) s i m u l t a n e o u s l yi sn o t a p p l i e dw i d e l yb e c a u s eo f t h el a c ko ft h et e c h n i q u e i nr e c e n ty e a r s ，n m r e x h i b i t st h ev i t a l i t yw i t ht h ea d v a n c e m e n to ft e c h n i q u e t h er e p o r t so n t h et u m o rd i a g n o s i su s i n gn m r t e c h n i q u ea r em o r ea n dm o r ei n c r e a s i n g n m r s p e c t r aa r ea c q u i r e db ym e a s u r i n gt h eb i o l o g i ct i s s u e so nt h eh i g h r e s o l u t i o nn m ri n s t r u m e n t s t r u c t u r a la n dc o m p o n e n ti n f o r m a t i o ni nt h e m e t a b o l i t ea sm o l e c u l a ri sa l s oa c q u i r e d c o m b i n e dw i t ht h ea d v a n c e d t e c h n i q u e ，t h em o r er e s e a r c hi sc a r r i e do u t t h e r e f o r e ，i ti sp o t e n t i a li nt h e l e a r l yd i a g n o s i so fc a n c e ei nt h i sp a p e r , t h ec h a n g eo fm e t a b o l i t ei nt h e t i s s u e s a m p l e si s s t u d i e dt h r o u g hn m rt e c h n i q u e t h e c h a n g e i n m o l e c u l a rl e v e la st h ea p p e a r a n c ea n dd e v e l o p m e n to ft h et u m o ri s i n d i c a t e da n dam e t h o do nt h ed i a g n o s i so fc a n c e ru s i n gn m ri s i i i 北京化工大学硕士学位论文 e s t a b l i s h e di n i t i a l l y m ym a i nw o r ka sf o l l o w s ： ( 1 ) t h e 1h n m r s p c t r ao fi n t e s t i n a lt u m o u ra n dt h ec o r r e s p o n d i n gt i s s u e s u s i n gn m rt e c h n i q u ea r ed i s c u s s e d c o m b i n e dw i t ht h ep a t h o l o g i c a l r e s u l t s ，t h ed i f f e r e n c e so ft h ec h a r a c t e r i s t i cm e t a b o l i t ei nt h et u m o rt i s s u e s a n dt h ec o r r e s p o n d i n gt i s s u e sa r eo b s e r v e d ，t h ee x p l o r i n gm e t h o do ft h e t u m o r d i a g n o s i si si n i t i a l l ye s t a b l i s h e d ( 2 ) t h e1 hn m rs p c t r ao fr e c t u mt u m o u ra n dt h en o r m a lt i s s u e su s i n g h rm a s t e c h n i q u ea r em e a s u r e d c o m b i n e dw i t ht h el i q u i d1 hn m r s p c t r ao fp e r c h l o r i ca c i d ( p c a ) e x t r a c t s ，t h ec o m p o n e n ta n dc o n t e n to f m e t a b o l i t ei nt h eb i o l o g i ct i s s u e sa r ea c q u i r e d ( 3 ) t h el i q u i da n ds o l i d3 1 pn m r s p e c t r ao fi n t e s t i n a lc a n c e ra n dn o n i l a l t i s s u e sa r em e a s u r e d t h ec h e m i c a ls h i f to fc h a r a c t e r i s t i c p e a k s i n p h o s p h o r o u sm e t a b o l i t ea r ea c q u i r e d s ot h ed i f f e r e n c e so ft h ea c i d i ca n d a l k a l i n ei nt h et u m o rt i s s u e sa n dt h en o r m a lt i s s u e sa r ei d e n t i f i e d ( 4 ) t h ei rs p e c t r ao ft h er e c t u mc a n c e ra n dn o r m a lt i s s u e sa r em e a s u r e d t h e c h a n g eo fm e t a b o l i t ea st h eo c c u r r e n c ea n dd e v e l o p m e n to ft u m o ri s u n d e r s t o o db yn m ra n di r t h em e t h o do f e a r l yd i a g n o s i n gc a n c e rf r o m t h em o l e c u l a rl e v e lm a yb ed e v e l o p e d k e ww o r d s ：n m r s p e c t r o s c o p yt e c h n i q u e ，e a r l yd i a g n o s i so fc a n c e r ， m o l e c u l a rl e v e r ，m e t a b o l i t e i v i，!iii!一 目录 第一章绪论。 1 1 早期癌症的诊断1 1 2 从分子水平上进行癌症早期诊断方法的研究2 1 3 核磁共振波谱技术的产生及在肿瘤诊断中的应用4 1 3 1 核磁共振波谱技术的产生和发展4 1 3 2 核磁共振波谱在肿瘤诊断中的应用4 1 3 2 1 低分辨核磁共振波谱技术的应用4 1 3 2 2 高分辨核磁共振波谱技术的应用5 第二章液体1 h n m r 研究癌变及正常组织的差异 7 2 1 实验条件7 2 1 - l 样本来源7 2 1 2 实验方法7 2 2 典型的直肠癌组织的1 h - n m r 图谱特征峰的归属7 2 3 结果和讨论9 第三章h r m a sn m r 波谱研究癌变及正常组织的差异1 5 3 1 实验条件1 5 3 1 1 样本来源1 5 3 1 2 核磁共振波谱的测定方法1 5 3 2 肠癌组织和正常肠组织的h r m a s 核磁共振波谱图归属1 5 3 3 结果与讨论1 8 第四章3 1 pn m r 波谱研究癌变及正常组织的差异2 1 4 1 实验条件2 1 4 1 1 样本来源2 1 北京化工大学硕士学位论文 4 1 2 肠组织3 1 p n m r 波谱测试方法2 1 4 2 结果与讨论2 l 4 2 1 无机磷酸盐缓冲溶液的制备2 1 4 2 2 3 1 p - n m r 谱特征峰化学位移与p h 关系2 2 第五章红外光谱研究癌变与正常组织的差异2 5 5 1 样本来源2 5 5 2 实验方法2 5 5 3 结果与讨论2 5 第六章结论与展望 参考文献 致谢 研究成果及发表的学术论文 作者简介 2 8 3 0 3 2 3 3 3 4 、 1 1e a r l yd i a g n o s i so f c a n c e r ”1 1 2s t u d yo nt h ee a r l yd i a g n o s i so f c a n c e ri nt h em o l e c u l a rl e v e l 2 1 3a p p e a r a n c ea n da p p l i c a t i o no f t h en m rt e c h n i q u e 4 1 3 1a p p e a r a n c ea n dd e v e l o p m e n to f t h en m rt e c h n i q u e 4 1 3 2a p p l i c a t i o no f t h en m rs p e c t r o s c o p yi nt h ed i a g n o s i n gc a n c e r 4 1 3 2 1a p p l i c a t i o no f t h el o w e rr e s o l u t i o nn m rs p e c t r o s c o p y 4 1 3 2 2a p p l i c a t i o no f t h eh i g h e rr e s o l u t i o nn m rs p e c t r o s c o p y 5 c h a p t e r 2s t u d yo n t h ed i f f e r e n c eo ft i s s u e su s i n g1 hn m r 7 2 1e x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n 7 2 1 1s o u r c eo f t h es a m p l e s 7 2 1 2e x p e r i m e n t a lm e t h o d ”7 2 2a s s i g n m e n to f t h et y p i c a l1 hn m rs p e c t r ao f t h ei n t e s t i n a lt i s s u e s 一7 2 3r e s u l ta n dd i s c u s s i o n 9 c h a p t e r 3s t u d y o nt h ed i f f e r e n c eo ft h et i s s u e su s i n g1 hh r - m a s 1 5 3 1e x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n 15 3 1 1s o u r c eo ft h es a m p l e s 15 3 1 2m e a s u r eo f t h e1 hh r m a sn m rs p e c r t r a 1 5 3 2a s s i g n m e n to f t h e1 hh r m a sn m rs p e c t r ao f t h ei n t e s t i n a lt i s s u e s 1 5 3 3r e s u l ta n dd i s c u s s i o n 18 c h a p t e r 4s t u d yo nt h ed i f f e r e n c eo f t i s s u e su s i n g ”pn m r 2 1 4 1e x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n 2 1 i i i 北京化工大学硕士学位论文 4 1 1s o u r c eo f t h es a m p l e s 2 1 4 1 2m e a s u r eo ft h e3 l pn m r s p e c t r a 21 4 2r e s u l ta n dd i s c u s s i o n 2 1 4 2 1p r e p a r a t i o no f t h ed i f f e r e n tp h p h o s p h a t eb u f f e r 2 1 4 2 23 1 pc h e m i c a ls h i f tf r o mt h ep e a ki n3 l pn m rs p e c t r aa n dp h 2 2 c h a p t e r 5s t u d y o nt h ed i f f e r e n c eo ft i s s u e su s i n gi r s p e c t r o s c o p y 2 5 5 1s o u r c eo f t h es a m p l e s 2 5 5 2e x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n 2 5 5 3r e s u l ta n dd i s c u s s i o n 2 5 c h a p t e r 6c o n c l u d i n gr e m a r k s 2 8 r e f e r e n c e s 3 0 a c k n o w l e d g m e n t 3 2 p u b l i c a t i o n s 3 3 p e r s o n a lr e s u m e 3 4 i v 缺乏有效的对晚期癌 存机会而言具有极为 重要的意义，为此人们不断致力于用各种先进的物理化学和生物医学技术发展肿 瘤诊断新方法。迄今为止，尽管肿瘤相关的研究已经取得了很大的进展，但总体 上常见恶性肿瘤的发病率及死亡率仍居高不下，实属人类的天敌【l 】。为了提高生 存的机会，目前对于肿瘤患者所采取的行之有效的方法是早期诊断和及时治疗： 早期确诊，即在人体深部作为占位效应的病灶形成之前或初期能够得到可靠的信 息，这时如果能够及时手术治疗则能够达到完全治愈的效果；及时有效地治疗， 包括在肿瘤形成后能够采取合理的治疗方案抑制其生长，使病情得到控制，这时 如果能够尽早确诊则能够赢得最佳的手术时间以提高生活质量。癌症的确诊在临 床上迄今仍以肿瘤切片的细胞学鉴定为主要依据，但这种方法对于癌症的早期诊 断和微小癌乃至癌前病变诊断则显得无能为力。 由于任何生物体都是由一个或一个以上的细胞构成，而细胞如图卜1 所示又 都是由核酸、蛋白质、脂类和糖类等生物大分子组成，为此，人们开始转向从分 子水平寻找诊断癌症新方法的探索性研究。 无机盐 脂质 糖类和核酸 北京化工大学硕士学位论文 基于肿瘤生长是沿着“基因突变一生物分子组成、结构变化一细胞形态变化 一癌变组织形成 的顺序进行的原理，理论上能够检测到生物分子发生变化的物 理化学分析方法都有可能发展成为早期诊断癌症的新方法。 目前人们普遍采用的病理学方法和影像学方法如c t ，m r i 等只能在细胞 形态发生变化，肿瘤组织形成的阶段诊断肿瘤；而分子光谱方法，在理论上讲可 能检测到在肿瘤形成的早期，即生物分子发生变化的阶段所产生的波普和光谱的 变化，因而有望发展为一种实现肿瘤早期诊断的方法。 本文研究的是一种新发展起来的分子水平上早期癌症诊断的新方法，下面介 绍一下分子水平上早期癌症诊断方法的概况。 1 2 从分子水平上进行癌症早期诊断方法的研究 理论上能够检测生物组成变化的方法都有希望用于肿瘤的早期诊断和治疗 监控，荧光光谱技术及其在生物组织中的应用综述认为激光诱导荧光光谱技术可 以无创诊断癌症【2 】，该法诊断癌肿瘤主要有两种做法：一是使用荧光药物诊断， 利用荧光物质与肿瘤细胞有较强的亲合力的原理，在病人服下或注入荧光物质后 一段时间内接受激光照射，根据记录下来的荧光特征曲线来确定肿瘤部位；二是 利用生物组织的自体荧光诊断，根据人体正常和癌组织在激光激发下产生的不同 特征谱进行诊断。然而，天然荧光生物分子的种类极为有限，且荧光强度较弱。因 此在肿瘤诊断的研究方法中为了研究多数不发光的生物分子，人们常需要利用荧 光探针，需要将荧光技术和其他技术紧密结合，如采用显微荧光光度术、流式细 胞术、光镊等。但是该技术仍然处于实验阶段，很多方面还需要进一步提高，国 内外研究报告不多。 拉曼光谱【3 , 4 , 5 】，其和红外光谱有着相互补充的作用，二者结合可使我们对正 常和肿瘤组织的振动光谱行为差异有较全面的认识，对几种肠胃消化道的肿瘤组 织的傅立叶变换拉曼( f t r a m a n ) 谱的研究结果表明，f t r a m a n 法与中红外光 纤法得到的结果具有很好的符合性，亦可能发展为另一种活体、原位、无创诊断 肿瘤的新方法。但是由于拉曼光谱所用激光能量大，对组织具有破坏作用，使其 受到了一定的限制，这也可能是文献中对肿瘤的拉曼光谱方面的研究相对较少的 原因之一。 红外光谱是分子吸收电磁波的能量发生振动能级和转动能级的跃迁而产生 的吸收光群6 1 ，傅立叶变换红外光谱仪( 简称f t i rs p e c t r o m e t r y ) 自2 0 世纪7 0 年 代兴起，由于它具有扫描速度快、光通量大、高分辨率、高信噪比、测定光谱范 围宽的特点，并配备有功能很强的计算机系统，因此，f t i r 及其相关技术迅猛发 2 第一章绪论 展使其广泛应用于蛋白质、核酸等生物大分子的结构研究，而且已经用它来研究 细胞和组织等更加复杂的体系 7 1 。该方法对肿瘤的研究起始于1 9 8 5 年【8 】，近年 来，随着谱学研究的发展，有关文献报导也逐渐增加。最近，无损检测由于对患 者损伤较小，已成为国际上共同关心的热门课题和新的研究方向。 红外光谱法( 瓜) p ，lu j 灵敏度高，操作简单易行，是从分子水平检测样品变化 的有力工具，利用红外光谱法研究肿瘤方面的工作主要是着眼于临床医学实际需 要，不局限于细胞水平对组织的光谱进行直接测定，在方法上作大胆的探索和尝 试开展肿瘤光谱原位、在体检测研究，至今研究经历过三个阶段：1 ) 寻找规律， 测定液氮中冷冻离体正常和肿瘤组织光谱的差异，探讨临床应用的可能性；2 ) 作为病理检测法的补充，在手术室旁对刚刚离体的新鲜样品检测，判别组织是否 正常，帮助医生考虑手术方案，确定手术切除的边缘；3 ) 作为研究目的，进行肿 瘤的在体原位无创检测。研究表明，红外光谱法在临床肿瘤早期诊断中具有广阔 的发展前景，有望成为无创诊断肿瘤的新方法。 北京大学分子光谱组吴瑾光教授在傅立叶变换红外光谱( f t - 瓜) 的肿瘤检 测工作上研究了离体肿瘤组织( 消化道系统和呼吸系统等) 人体不同部位的肿瘤 数千例，在检测消化道( 食道、胃、肠) 肿瘤的方法中经历了三个基础阶段，从 采用冰冻液氮冻样品( 在室温下解冻后，采用水平a t r 进行光谱测量，每次采样 首先扫描背景光谱，用生理盐水充分冲洗，取组织内部进行冰冻切片) 到新鲜样 品( 得到手术室新鲜样品后，立即用生理盐水洗净，k b r 压片法测定红外光谱。可 完全避免因低温而引起的组织破坏及分子结构的改变，而且组织样品是在手术后 4h 内测定的，样品仍保留一定程度的新鲜度) 进而进行原位在体( 将样品贴在 a t r 探头的表面) 临床进行体表无创伤性检测，最后进行方法和应用效果的比较。 研究累积了几万张光谱，结果发现光谱变化与肿瘤发生、发展过程具有相关性与 对应性，红外光谱法有可能用于肿瘤早期诊断，并初步建立了人体组织光谱数据 库，为实现肿瘤的原位检测奠定了基础。但是，由于红外光谱法对于肿瘤的鉴别 诊断研究正处于起步和数据积累阶段，而且在生物组织的i r 谱图上谱峰重叠严 重，使人们对分子组成进行更深入的认识受到了限制。 在研究中，我们认识到，为了使分子光谱法在肿瘤的诊断中发挥更大的作用， 需要进一步加强我们对人体组织在癌变过程中的分子变化的认识，核磁共振波谱 法 1 1 , 1 2 , 1 3 】是另一种人们认识分子结构的有力手段，各种先进的液体、固体核磁共 振多维技术等使核磁共振方法在表征分子结构方面拥有巨大的潜力。在上述基础 上，提出把核磁共振波谱方法引进肿瘤的光谱诊断中，与红外光谱方法相结合， 使之相互取长补短，最终实现综合两种方法的优势，达到发展一种新型的肿瘤分 子诊断新方法的目的。 3 北京化工大学硕士学位论文 1 3 核磁共振波谱技术的产生及在肿瘤诊断中的应用 1 3 1 核磁共振波谱技术的产生和发展 自1 9 4 5 年美国斯坦福大学的f b l o c h h 1 和哈佛大学em p u r c e l l 1 5 1 首次独立地 观察到核磁共振磁( n m r ) 现象以来，众所周知核磁共振波谱技术作为检测分 子结构最有效的工具已广泛用于医药、结构生物学等领域。在生物组织的研究方 面，尽管人们从二十世纪七十年代开始，为了从分子水平上认识肿瘤与对照组织 之间的差别，就尝试研究肿瘤组织和正常组织在核磁共振波谱上的异同，但由于 技术上的原因，大量的组织信号淹没在水峰中，使该领域的研究进展缓慢。近年 来，随着核磁共振技术日新月异的进步，随着科学技术的进步，能够解决实际问 题的新型仪器相继出现，并且不断开发出了适合各种类型样品测定的探头，使得 m r s 在生物组织中的应用研究开始取得令人瞩目的进展。 n m r 方法有如下特点：( 1 ) 无损伤性，不破坏样品的结构和性质，无辐射损 伤；( 2 ) 可在一定的温度和缓冲液范围内选择实验条件，能够在接近生理条件下 进行实验； ( 3 ) 可研究化学交换、扩散及内部运动等动力学过程，给出极其丰富 的有关动态特性的信息；( 4 ) 可设计多种编辑手段，实验方法灵活多样。 1 h n m r 的谱峰与样品中各化合物的氢原子是一一对应的，所测样品中的每一 个氢在图谱中都有其相关的谱峰，图谱中信号的相对强弱反映了样品中各组分的 相对含量。 此外，核磁共振技术包括1 h 、3 1 p 、1 3 c 谱等以及2 d 波谱技术进行肿瘤组织 样品的研究。1 h 是最灵敏的核，而且生物组织内几乎每种化合物都含有1 h ；3 1 p 灵敏度较高，共振谱线简单，容易识别，能较好地实现对各种含磷小分子化合 物的谱峰归属；1 3 c 的自然丰度较低，磁旋比也小，所以往往对样品采用魔角旋 转( m a s ) 、交叉极化( c p ) 及偶极去偶( d d ) 等技术来强化检测灵敏度。二维核磁 共振波谱是解决复杂结构问题的主要手段，它提供了丰富多彩的高效快速的分 析方法，如h hc o s y ，c hc o s y ，t o c s y ，n o e s y 等梯度场和反转检测技术， 极大地拓宽了核磁共振波谱技术的应用范围，尤其是在生物医学中的应用得到 快速发展，帮助解决了组织样品核磁共振波谱中的小分子代谢物的结构。 1 3 2 核磁共振波谱在肿瘤诊断中的应用 1 3 2 1 低分辨核磁共振波谱技术的应用 4 第一章绪论 核磁共振成像( m r i ) 是将人体置于梯度磁场中，以牺牲人体生物分子的化学 位移为代价，利用人体不同部位水分子的含量弛豫行为的差异构建人体内部结 构的影像。m r i 现已经发展成为一种成熟的技术，其创始人m a n s f i e l d 获2 0 0 3 年诺贝尔奖。该方法的优势可以发现藏匿在人体深部的，具有占位效应的病灶。 但是，由于缺乏关于病变组织的进一步的分子水平上的必要信息，该方法往往难 以直接判别病变组织的良性与恶性。 在m r i 的基础上，通过引入特殊的脉冲序列，以原位在体的方式测试人体不 同部分的核磁共振波谱，并通过所得波谱的谱学特征判断所检测组织的良恶性。 这种方法虽然在一定程度上弥补了m r i 方法单纯利用形态学信息诊断占位性病变 组织的良恶性可靠性不高的不足，而且低磁场宽腔的核磁共振成像谱仪对人体没 有不可逆的影响，可以进行生物体的原位、活体检测，得至f j m r i 1 6 , 1 7 1 和磁共振波 谱。但是，由于核磁共振成像仪受所用磁场强度所限，所得到谱图的信噪比和分 辨率不佳。另外，对人体组织核磁共振谱特性研究尚不够全面、彻底，因此， 迄今为止该方法尚未被人们广泛接受，仍然处于基础研究阶段。 1 3 2 2 高分辨核磁共振波谱技术的应用 采用高分辨核磁共振技术，在高磁场下，对离体生物组织细胞进行核磁共振 测试【1 8 。2 1 】，所得到谱图的灵敏度和分辨率高，并充分利用各种先进的核磁共振实 验方法，能够得到很多分子水平的结构和组成信息，并且有可能利用多维谱等先 进的核磁共振技术进行更深入的研究。总结出肿瘤与对照组织在谱学特征及与之 相关的化学组成上的差异。 具体实验措施上，常见的有以下两种： ( 1 ) 生物组织提取物的液体高分辨核磁共振波谱研究( 2 2 之6 1 该方法是把参与生化反应的化合物从生物组织中分离提取出来，然后再利用 液体n m r 技术对其化学组成和结构进行分析。生物组织萃取方法有高氯酸萃取 和氯仿一甲醇双溶剂萃取两种方法，利用这些生物组织提取物的方法能够得到高 分辨的核磁共振波谱图，其包含了组织中不同组分的详细信息，因此可作为一种 组织病理学分析的辅助方法。但是由于提取过程复杂并要求大量的组织样品，提 取过程使组织样品可能受到破坏，因此并不能完全真实地反映活体中肿瘤代谢情 况。 ( 2 ) 离体生物组织细胞的液体魔角旋转高分辨核磁共振波谱研裂2 - 3 6 】 5 北京化工大学硕士学位论文 高分辨魔角旋转技术( h i 曲- r e s o l u t i o nm a g i ca n g l e s p i n n i n gm a g n e t i c r e s o n a n c es p e c t r o s c o p y ，h rm a s ) 是使用1 9 9 0 年新出现的一种与常规高分辨液 相探头设计完全不同的微量探头( n a n o p r o b l e ) ，将体积很小的介于固体和液体之 间的组织样品全部集中在探头内接线圈的有效范围内，置于与磁场夹角为5 4 7 。 的方向上，进行魔角旋转以降低偶极相互作用和化学位移各向异性等引起的谱线 增宽，得到的h r - m a sn m r 谱能够提供极好的谱峰分辨率和更多的有关代谢物 的信息。 总之，核磁共振波谱对分子结构具有强大的解析能力，通过测定生物体液和 离体组织细胞样品，能够得到其中的核酸、蛋白质、脂类和糖类等生物大分子的 含量、分子的空间排列和结构特征等信息，在肿瘤的早期诊断及治疗中发挥独特 的作用。为此我们试图做的工作是，通过借助核磁共振先进的技术观测离体癌变 组织和正常组织的核磁共振波谱的差异，结合前期红外光谱对离体组织的研究成 果，从分子水平更深入地认识肿瘤的发生发展过程中物质成分的变化，有效推进 肿瘤的早期诊断和诊疗控制的进程。 6 第二章液体1 h o n m r 研究癌变及正常组织的差异 第二章液体1 h n m r 研究癌变及正常组织的差异 2 1 实验条件 2 1 1 样本来源 实验所用样品取自北京大学第三附属医院普通外科和西安军医大学的消化 道系统癌患者手术后的新鲜标本共2 1 对4 2 个样品，每对样本取自相同的病人，每 一样品的获得是在征求病人同意的条件下进行的，手术后取得的离体组织对称地 分成两块，一块用1 0 福尔马林溶液固定，石蜡包埋，做常规病理切片染色检查， 确认为癌组织和癌旁正常组织。另一块立即置于液氮中保存，用于核磁共振波谱 的测定。 2 1 2 实验方法 ( 1 ) 肠组织1 h - n m r 谱的测试方法 室温下标本自然解冻，肠组织样品8 0 m g 左右，置于装有0 5 m l 重水、直径为 5 m m 的核磁共振样品管中，在b r u k e r a m 一3 0 0 m h z 波谱仪上利用1 h 1 3 c 双用探 头，采用水峰预饱和程序进行水峰压制，采集1 h n m r 谱，以二氧六环为外标， 二氧六环1 h 化学位移为3 7 p p m ，用b r u k e r 数据处理软件、o m n i c 软件和 s p s s l l 0 软件对谱图和数据进行处理。 2 2 典型的直肠癌组织的1 h n m r 图谱特征峰的归属 直肠癌组织及相应正常组织核磁共振波谱如图2 - 1 的谱峰根据文献进行初步 归属如表2 - 1 所示，谱图中主要特征峰为：在0 9 p p m 附近和1 3 p p m 附近处较宽共 振峰为饱和脂肪酸的c h 3 和一( c h 2 ) n 产生，2 0 p p m 附近处产生的共振峰来自不饱 和脂肪酸h c = c h c h 2 在直肠癌组织及相应正常直肠组织的核磁谱图2 2 中这些 峰存在明显差别。3 0 p p m 附近处为肌酸产生的共振峰，文献中由于其含量较稳定 通常用于作为浓度内标【2 6 1 ，因此我们选定此峰作为标准峰。用其它特征峰与此峰 的相对比来表征特征代谢物在癌组织和正常组织中的差别。而3 2 p p m 附近峰被指 认为是与癌变密切相关的胆碱类化合物产生的共振峰，图2 - 1 中亦可以观察到此 峰的在癌变组织和相应正常组织的显著差别，此处峰区域包括游离的胆碱、磷酸 胆碱及甘油磷酸胆碱等，3 3 5 4 1 5 p p m 为牛磺酸，谷氨酸盐，氨基酸和脂肪酸等 7 北京化工大学硕士学位论文 代谢物产生的共振峰。在癌变组织和正常组织的核磁共振波谱中的这些特征峰的 变化在一定程度上反映了与癌变的发生和发展相关联的代谢物的变化，因此了解 这些特征峰的变化对于我们进行早期癌症诊断具有重要意义。 表2 1 典型肠癌组织的1 h o n m r 图谱的特征峰归属 t a b l e2 - 1p r e l i m i n a r ya s s i g n m e n to f t y p i c a lc h a r a c t e r i s t i cp e a k so n1 h - n m rs p e c t r af r o m h u m a nr e c t u mt i s s u e 图2 - 1典型肠癌组织和相应正常组织的1 h - n m r 图谱 a ：正常组织b ：恶性组织 f i g 2 1t y p i c a l1 h - n m rs p e c t r af r o mh u m a nr e c t u mc a n c e rt i s s u ea n dt h ec o r r e s p o n d i n g n o r m a lt i s s u e a ：n o r m a lt i s s u e b ：m a l i g n a n tt i s s u e 2 3 结果和讨论 o n 1 j 矗i 。5 1 0 。1 c h e m i c a ls h i r ( p p m ) 9 北京化工大学硕士学位论文 “1 i 蠢。3 5 如 c h e m i c a ls h i f i ( 1 m m ) 图2 - 2 典型的肠癌组织和相应正常组织的1 hn m r 图谱 f i g 2 - 2t y p i c a l1 hn m rs p e c t r ao f n o r m a la n dm a l i g n a n tt i s s u ef r o mh u m a nr e c t u m a ：0 5 2 5 p p m b ：2 6 - 4 4 p p m 图2 2 ( a ) 为典型的肠癌组织及相应的正常组织在0 5 - 2 5 p p m 区域的核磁共 振波谱，从谱图中可以看到癌组织和正常组织的相对峰强有明显差别。图2 - 2 ( a ) 中0 8 9 p p m 为脂肪酸的甲基产生的共振峰，1 3 0 p p m 为脂肪酸的亚甲基产生的共 振峰，而2 0 2 p p m 为不饱和脂肪酸产生的共振峰。我们分别对2 l 对肠癌组织及 正常组织核磁共振波谱在0 9 、1 3 和2 o p p m 处峰区域进行积分，得到a 0 9 a 3 0 、 a 1 3 a 3 0 、a 2 0 a 3 0 值如图2 3 ( a 、b 、c ) ，结果显示正常组织的核磁共振波 谱中a 0 9 a 3 0 、a 1 3 a 3 0 和a 2 0 a 3 0 值较相应癌组织偏大，表明癌组织由于 消耗脂肪酸含量较相应正常肠组织偏低。 图2 3 ( d ) 为2 1 对肠癌组织和相应正常组织样品的核磁共振波谱中1 3 p p m 处 峰区域积分面积与0 g p p m 处峰区域积分面积之比，从图2 - 3 ( n ) 中可以看出，正 常组织和癌组织的核磁共振谱中a 1 3 a 0 9 值也存在一