（应用化学专业论文）毛细管电泳核酸定量分析及基因突变检测方法研究.pdf

上海交通人学博 论文 摘要 摘要 高效毛细管电泳是八十年代初发展起来的一种新型分离技术，该技术具有分 离效率高、分析速度快、样品用量少、高灵敏度、易于自动化等特点，因此在化 学、生命科学、临床医学、药学等领域具有广泛的应用。特别是在核酸分析方面， 例如p c r 产物分析、酶切片段、突变检测、基因类型以及序列分析等方面，高 效毛细管电泳是一种非常有效的分析工具。 激光诱导荧光检测是所有检测方法中灵敏度最高的一种检测方法。它与毛细 管电泳技术结合，成为了一种高灵敏、高选择性的分析方法，被广泛地应用于微 量生物样品的分析。本论文旨在以毛细管电泳一激光诱导荧光系统为分析手段， 发展核酸的定量分析和基因突变检测新方法，主要内容如下： ( 1 ) 毛细管电泳核酸定量分离分析。毛细管电泳核酸定量分离分析在临床 诊断、基因突变检测以及基因序列测定等方面具有广泛的应用，因此建立一种简 单、快速、稳定、高灵敏的定量分离分析方法具有重要的应用价值。我们系统研 究了电泳条件对d n a 定量分离分析的影响，建立了核酸定量分析方法。着重研 究了三种荧光染料( e v a g r e e n ，s y b rg r e e ni 和s y b rg o l d ) 对d n a 定量分 析的影响。实验发现e v a g r e e n 比s y b rg r e e ni 和s y b rg o l d 具有较宽的线性 范围，他们的检测限并没有非常明显的差别。同时我们发现采用以上三种染料时 巾x 1 7 4d n a 片均得到了很好的分离，其中e v a g r e e n 对d p x l 7 4d n a 片段进行分 离分析时的重现性要稍优于s y b rg r e e ni 和s y b rg o l d 两种染料，在同一天 内测得迁移时间和峰面积的相对标准偏差分别为0 2 4 o 2 7 和3 4 5 7 5 9 ； 在连续三天内测得迁移时间和峰面积的相对标准偏差为1 3 5 1 6 3 和6 7 2 1 2 0 5 。我们建立了毛细管电泳核酸定量分析方法，并成功地用于人的循环血 d n a 的定量研究。与其他定量方法相比，该方法具有自动化高、简单、快速等 优点。 ( 2 ) 毛细管区带电泳循环血d n a 定量法与实时定量p c r 定量法的对照。毛 细管区带电泳循环血d n a 定量法与其他定量方法的相关性一直是我们所非常关 注的问题，因此我们对其进行了一系列的评价，并与循环血d n a 定量的”金”标 准实时定量p c r 的方法作以对照。实验测得毛细管区带电泳日内和日间相对标 准偏差分别为4 1 9 和6 9 1 。同一根涂层毛细管以及不同涂层毛细管之间的 相对标准偏差分别为5 1 4 和9 0 2 。测得实时定量p c r 的线性方程为：y = 3 3 2 x + 3 6 9 2 ，其中x 值代表起始拷贝数的对数，y 值代表q 值，其相关系数为： 上海交通人学博i 论文 摘要 r 2 ：0 9 9 6 ，批内和批间相对标准偏差分别为7 3 和1 4 9 2 。我们还同时用 三种方法( r e a l t i m e p c r ，c z e t , c 7 _ , e 2 ) 对5 0 个正常人的血清样品进行测定，结果 表明毛细管区带电泳和实时定量p c r 两种方法的相关性非常好，而且进一步证 明血样的采集等处理步骤对循环血d n a 水平有重要的影响。 ( 3 ) 基于逆流衍生基因突变检测方法研究。我们将逆流衍生标记法成功地用 于恒变性剂毛细管电泳咀及单链构象多态性分析两种基因突变检测方法中。我们 分别用s y b rg o l d 和e v a g r e e n 两种染料为d n a 荧光内插试剂，对m t h f r 基 因的c 6 7 7 t 进行了突变检测。系统地研究了实验条件对突变检测的影响，选择 4 m 的尿素和2 0 的甲酰胺作为变性剂，6 的线性丙烯酰胺作为筛分介质。在恒 变性剂毛细管电泳突变检测中，应用两种染料均得到很好的结果，对于杂合子样 品得n - f 两条同源双链d n a 以及两条异源双链d n a 的峰。同时采用柱上衍生 法进行实验，发现对于杂合子样品得到分离度非常差、荧光信号比较弱的四个峰， 更有趣地是在温度达到5 4o c 以上时，荧光信号非常弱，不能被检测器检测到。 荧光标记引物是基因突变检测中应用最广泛的一种标记方式，因此我们同时用荧 光标记引物的方法作了对照实验：在单链构象多态性分析中，对于杂合予样品我 们得到了四条单链d n a 的四个峰。纯合子样品得到两条单链的两个峰，实验还 进一步证明e v a g r e e n 这种新型荧光染料还可以应用于单链d n a 的分析。我们 的结果初步表明逆流衍生的柱后标记方式可以成功地用于恒变性剂毛细管电泳 以及单链构象多态性分析方法的基因突变检测。 ( 4 ) 基于m u t s 蛋白分子识别基因突变检测方法研究。m u t s 蛋白是d n a 错 配修复系统的重要组成部分，m u t s 蛋白能够识别并结合八种错配d n a 双链， 以及由碱基修饰引起的错配，还能识别结合1 - 4 个核苷酸插入或缺失形成的l o o p 环结构。多种基于m u t s 蛋白分子识别基因突变多态性的检测技术，相对比较复 杂，而且成本比较高。为此我们偿试用毛细管电泳激光诱导荧光的系统对基于 m u t s 分子识别基因突变及多态性进行初步探索。实验中我们选择o 5 的p v p 作为筛分介质，成功地发现m u t s 蛋白对错配d n a 双链有较强的结合能力，同 时还发现对完全匹配d n a 双链仍有轻微的非特异性吸附。我们的结果表明毛细 管电泳与m u t s 蛋白分子识别技术结合可能成为基因突变检测新方法。 关键词：毛细管电泳；内插染料；循环血d n a ；逆流衍生；基因突 变；m u t s 上海交通大学博上论文 a b s t r a d a b s t r a c t h i g hp e r f o r m a n c ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s i san e wa n a l y t i c a l t e c h n i q u e d e v e l o p e di nt h ef i r s t1 9 8 0 s t h i st e c h n i q u ei sc h a r a c t e r i z e db yt h eh i g hr e s o l u t i o n ， s h o r ta n a l y s i st i m e ，s m a l ls a m p l er e q u i r e m e n t ，h i g hs e n s i t i v i t ya n da u t o m a t i o n t h e r e f o r ei ti sw i d e l yu s e di nm a n yf i e l d s ，s u c ha sc h e m i s t r y , b i o t e c h n i q u e ，c l i n i c a l m e d i c i n ea n dp h a r m a c e u t i c se t c h i i g hp e r f o r m a n c ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sh a s b e c o m eam o r ep o w e r f u lm e t h o de s p e c i a l l yi nn u c l e i ca c i d ，f o ri n s t a n c et h ea n a l y s i s o fp c rp r o d u c t sa n dr e s t r i c t i o nd i g e s tf r a g m e n t s ，m u t a t i o nd e t e c t i o n ，g e n o t y p i n ga n d d n a s e q u e n c i n g l a s e r - i n d u c e df l u o r e s c e n c ed e t e c t i o ni so n eo ft h em o s ts e n s i t i v em e t h o d c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( c e ) c o u p l e d w i t hl a s e r - i n d u c e d f l u o r e s c e n c e ( l i f ) d e t e c t i o nb e c o m e sa na n a l y t i c a lt e c h n i q u ew i hh i g hs e n s i t i v i t ya n dh i g hs e l e c t i v i t y c e - l i fh a sb e e nw i d e l yu s e di nt h ea n a l y s i so fs m a l lb i o l o g i c a ls a m p l e s i nt h i s d i s s e r t a t i o n ，w ew a n tt od e v e l o pt h en e wm e t h o do fq u a n t i t a t i v ea n a y s i so fn u c l e i c a c i da n dg e n e t i cm u t a t i o nd e t e c t i o nu s i n gc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sw i t hl a s e r - i n d u c e d f l u o r e s c e n c ea sa n a l y t i c a lt e c h n i q u e t h em a i nc o n s t i t u t e sa sf o l l o w ： 1 ) q a n t i f i c a t i o na n ds e p a r a t i o no f n u c l e i ca c i du s i n gc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s q u a n t i f i c a t i o na n ds e p a r a t i o no fn u c l e i ca c i du s i n gc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sh a sb e e n w i d e l yu s e di n c l i n i c a ld i a g n o s e s ，g e n e t i cm u t a t i o na n dg e n o t y p i n ga n dd n a s e q u e n c i n g i ti sv e r yi m p o r t a n tt o e s t a b l i s has i m p l e ，f a s t ，r e l i a b l ea n dh i g h l y s e n s i t i v em e t h o d t h ee f f e c t so ft h ee x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n so nt h eq u a n t i t a t i v e a n a l y s i so fd n a w e r ei n v e s t i g a t e ds y s t e m a t i c a l l y , a n dt h eq u a n t i t a t i v em e t h o d so f n u c l e i ca c i dw e r ge s t a b l i s h e d q u a n t i f i c a t i o na n ds e p a r a t i o no fo fd s d n aw e r ed o n e u s i n gt h r e ed y e s ，i n c l u d i n ge v a g r e e n ，s y b rg r e e nia n ds y b rg o l da si n t e r c a l a t i n g d y e s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h el i n e a rr a n g eo fd s d n au s i n ge v a g r e e nw a ss l i g h t w i d e rt h a nt h a tu s i n gs y b rg o l da n ds y b rg r e e ni ，a n dt h ed e t e c t i o nl i m i t so f d s d n aw e r en os i g n i f i c a n td i f f e r e n c ef o rt h r e ed y e s t h eg o o ds e p a r a t i o n so fq b x l 7 4 d n a f r a g m e n t sw e r eo b t a i n e du s i n gt h r e ed y e s r e p r o d u c i b i l i t i e so fm i g r a t i o nt i m e a n dt h ep e a ka r e ao fd s d n af r a g m e n t sw i t he v a g r e e nw e r eb e t t e rt h a nt h o s ew i t h s y b rg r e e nla n ds y b rg o l d t h er s dv a l u e sw e r eo 2 4 一o 2 7 f o rm i g r a t i o n t i m ea n d3 4 5 7 5 9 f o rp e a ka r e aw i t h i nt h es a m ed a y , 1 3 5 1 6 3 f o r j ：海交通大学博t 论文 a b s l r a c t m i g r a t i o nt i m ea n d6 7 2 1 2 0 5 f o rp e a k a r e af o rt h r e ed a y s w eb u i l tt h e q u a n t i t a t i v ea n a l y s i so fn u c l e i ca c i du s i n gc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，a n ds u c c e s s f u l l y u s e dt h i sm e t h o di nt h eq u a n t i f i c a t i o no fc i r c u l a t i n gd n a o u rm e t h o dw a s c h a r a c t e r i z e db ya u t o m a t i o n ，s h o r ta n a l y s i st i m e ，s i m p l e ，f a s ta n de x t r e m e l yh i i g h s e n s i t i v i t y w ef u r t h e ri m p r o v e dc z e l i fm e t h o df o rt h eq u a n t i f i c a t i o no fc i r c u l a t i n g d n ai no r d e rt ot h ee x t e n s i v ea p p l i c a t i o ni nt h ec l i n i c a ld i a g n o s e si nt h ef u t u r e 2 ) c o m p a r i s o n sb e t w e e nc a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i sa n d r e a l - t i m ep c r 如rq u a n t i f i c a t i o no fc i r c u l a t i n gd n al e v e l si nh u m a ns e r a i ti sak e yp r o b l e mf o r u st h a tc o r r e l a t i o no fc i r c u l a t i n gd n al e v e l so b t a i n e db yc z e - l i fm e t h o dw i t ho t h e r m e t h o d s ( s u c ha sr e a l - t i m ep c r ) t h e r f o r e ，w ee v a l u a t e dc z e - l i fm e t h o df o rt h e q u a n t i f i c a t i o no fc i r c u l a t i n gd n a , a n d m a k ec o m p a r i s o nb e t w e e nc z e - l i fm e t h o d a n dr e a l - t i m ep c ra s s a yf o rt h eq u a n t i f i c a t i o no fc i r c u l a t i n gd n al e v e l s i nc z e a s s a yt h ei n t r aa n di n t e rv a r i a b i l i t yw e r e4 1 9 a n d6 9 1 r e s p e c t i v e l y t h er s d v a l u e so ft h es a m ec o a t e dc a p i l l a r ya n dd i f f e r e n tc o a t e dc a p i l l a r i e sw e r e5 1 4 a n d 9 0 2 ，r e s p e c t i v e l y ag o o dl i n e a rr e l a t i o n s h i po f r e a l t i m ep c r ( y 2 - 3 3 2 x + 3 6 9 2 ) b e t w e e nc t ( t h r e s h o l d c y c l e ) v a l u e sa n d t h e l o gc o p y n u m b e rw a so b t a i n e d ( r 。= o 9 9 6 ) t h e i n t r aa n di n t e rv a r i a b i l i t yo fc i r c u l a t i n gd n a q u a n t i f i c a t i o nb y r e a l t i m ep c rw e r e7 3 a n d1 4 9 2 r e s p e c t i v e l y t h ec i r c u l a t i n gd n al e v e l so f 5 0n o r m a lc o n t r o l sw e r em e a s u r e db yt h r e eq u a n t i f i c a i t o nm e t h o d s o u rd a t as h o w e d t h a tt h ec i r c u l a t i n gd n al e v e l so b t a i n e db yt h r e em e t h o d s ( r e a l t i m ep c r ，c z e l ， c z e 2 ) h a dag o o dc o r r e l a t i o n m o r e o v e r , w ef u r t h e rc o n f i r m e dt h a tb l o o ds a m p l e s c o l l e c t i o n ，s e r u mp r e p a r a t i o na n do t h e rt r e a t m e n tp r o c e d u r e sh a das i g n i f i c a n ti m p a c t o nt h ed n al e v e l si ns e r a 1 3 ) g e n e t i cm u t a t i o na n a l y s i sb a s e d o nt h ei n v e r s e - f l o wd e r i v a t i z a t i o no f d n a f r a g m e n t s i n v e r s e - f l o wd e r i v a t i z a t i o nw a ss u c c e s s f u l l yu s e di nt h ed e t e c t i o no f g e n e t i cm u t a t i o nb yc d c e o rs s c pa n a l y s i sb a s e do nc e l i et h eg e n e t i cm u t a t i o n s o fc 6 7 7 ti nm t h f rw e r ed o n eu s i n gt w od y e s ( s y b rg o l da n de v a g r e e n ) a sd n a i n t e r c a l a t i n gd y es e p a r a t e l y t h ee x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n sw e r ei n v e s t i g a t e d s y s t e m a t i c a l l y ；ad e n a t u r a n tb u f f e r ( 4m u r e ap l u s2 0 ( v v ) f o r m a m i d e ) w a su s e d t or e d u c et h em e l t i n gt e m p e r a t u r eo fd s d n a f r a g m e n t s 6 l p aw a sa st h es i e v i n g m e d i u m g o o dr e s u l t sw c r co b t a i n e du s i n gt w od y e s ( s y b rg o l da n de v a g r e e n ) i n c d c e a n a l y s i so ft h em t h f rc 6 7 7 t w i t hi n v e r s e - f l o wd e r i v a t i z a t i o n f o u rp e a k s w e r eo b t a i n e df o rh e t e r o z y g o u ss a m p l e ，w h i c hw e r ef r o mt h et w oh o m o d u p l e x e s ( g c 上海交通大学博i 一论文 a b s t r a c t a n d a t ) a n dt h et w oh e t e r o d u p l e x e s ( g ta n da c ) a tt h es a m et i m e ，c d c ea n a l y s i s o ft h em t h f rc 6 7 7 tw i t ho n c o l u m nd e r i v a t i z a t i o nw a sd o n e f o u rp e a k sw e r e o b s e r v e da t5 3o r5 4o cf o rh e t e r o z y g o u ss a m p l e ，b u tt h er e s o l u t i o na n df l u o r e s c e n c e i n t e n s i t yw e r ev e r yp o o f i n t e r e s t i n g l y , w h e nt h et e m p e r a t u r ef u r t h e ri n c r e a s e d ，n o s i g n a l so fd n a d y ec o m p l e x e sw e r eo b s e r v e d f l u o r e s c e n tl a b e l e dp r i m e r st e c h n i q u e h a sb e e nw i d e l yu s e di nc d c e a n a l y s i sc o m b i n e dw i t hc e u f i n o r d e rt oe v a l u a t e t h ee f f e c t i v e n e s so fi n v e r s e f l o wd e r i v a t i z a t i o n ，w eh a v ep e r f o r m e dp a r a l l e l e x p e r i m e n t sw i t hf l u o r e s c e n tl a b e l e dp r i m e r st e c h n i q u e f o rh e t e r o z y g o u ss a m p l e s ， f o u rp e a k sw e r ed e t e c t e di ns s c pa n a l y s i sw i t hi n v e r s e f l o wd e r i v a t i z a t i o n a n df o r h o m o z y g o u ss a m p l e ，t w op e a k sw e r ed e t e c t e d t h ed a t af u r t h e rd e m o n s t r a t e dt h a t e v e o r e e nc o u l di n t e r c a l a t ew i t hs s d n a f r a g m e n t s o u rp r e l i m i n a r yr e s u l t s d e m o n s t r a t et h a tc d c ea n ds s c p a n a l y s i sb a s e do nc e l i f w i t l li n v e r s e - f l o w d e r i v a t i z a t i o nw i l lb e c o m ep o w e r f u lt o o l sf o rt h es c r e e n i n go fg e n e t i cm u t a t i o n 删g e n e t i cm u t a f f o nd e t e c t i o nb a s e do nm u t sm o l e c u l a rr e c o g n i t i o n m u t s p r o t e i n ，ac r u c i a lc o m p o n e n to ft h ed n a m i s m a t c hr e p a i r ( m m r ) s y s t e m ，c a n s p e c i f i c a l l yr e c o g n i z ea n db i n de i g h tk i n d so fm i s m a t c hd n a a sw e l la s1 - 4b a s e i n s e r t i o no rd e l e t i o nl o o p s m a n i f o l dt e c h n i q u e sf o rt h ed e t e c t i o no fd n am u t a t i o n b a s e do nm u t s p r o t e i na l ev e r yc o m p l i c a t e da n dm u c he x p e n s i v e t h e r e f o r e ，w ew a n t t od e t e c tt h em u t a t i o na n dp o l y m o r p h i s mb a s e do nm u t su s i n g c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s 0 5 p v ps o l u t i o nw a su s e da sas i e v i n gm e d i u m a tt h es a m et i m e ， w eo b s e r v e dt h es t r o n ga f f i n i t yo fm u t st ot h eh e t e r o z y g o u sd n aa n dt h en o n s p e c i f i c l o wa f f i n i t yb i n d i n go fm u t st ot h eh o m o d u p l e xd n a t h er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a t c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sc o u p l e dw i t hm u t sp r o t e i nm o l e c u l a rr e c o g n i t i o nw o u l d b e c o m ean e wd e t e c t i o nm e t h o df o rg e n e t i cm u t a t i o n k e y w o r d s ：c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ；i n t e r c a l a t i n gd y e ；c i r c u l a t i n gd n a ； i n v e r s e f l o wd e r i v a t i z a t i o n ；m u t s 上海交通大学博士论文 上海交通大学 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在一年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 r 不保密型。 ( 请在以上方框内打“”) 学位论文作者签名：雍付词 e t 期：纠年叶月e t 杉 细 洲 鹏 ，：幽7 名 年 签 7 j ， 刻 修 氍 期 指 日 上海交通大学博士论文 上海交通大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究 工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人 或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：象付明 日期：加1 7 年昕月膳日 f 上海交通大学博论文第一章绪论 第一章绪论 1 1 高效毛细管电泳的研究概况 高效毛细管电泳是八十年代初发展起来的一项新型分离技术，该技术将电 泳和色谱技术结合起来，是继高效液相色谱后分析科学领域的又一次革命。高 效毛细管电泳技术具有分离效率高( 理论塔板数达1 0 6 1 0 7 ，m ) 、分析速度快 ( 1 0 。3 0 分钟内完成一次电泳操作1 、样品用量少( 仅为纳升级，可对单细胞进行 分离分析) 、高灵敏度( 用激光诱导荧光检测器，可达l x l 0 2 4m o l 的超低检测 限) 、应用范围广等特点，因此在化学、生命科学、临床医学、药学等领域得 到了广泛的应用。 1 1 1 高效毛细管电泳的发展史 高效毛细管电泳历史久远，多数学者以毛细管区带电泳( c z e ) 的出现为 起点，其历史可上溯到1 9 6 7 年，h i e r t e n 采用内径3m m 的石英管，内涂甲基 纤维素，在旋转下分离，紫外检测，实现自由区带电泳。1 9 8 1 年，j o r g e n s o n 和l u k a e s 使用内径7 5 微米的熔融石英毛细管进行毛细管区带电泳【1 】，利用 电迁移进样和荧光检测，其理论塔板数达4 x1 0 s m ，成为毛细管电泳发展史上 的一个里程碑。1 9 8 3 年后，h i e r t e n 先后建立了毛细管凝胶电泳【2 】和毛细管 等电聚焦【3 】。1 9 8 4 年，t e r a b e 运用含s d s 胶束的缓冲液电泳分离了中性组分， 从而建立了胶束电动毛细管色谱。1 9 8 8 年r o s et 和j o r g e n s o n 应用毛细管电泳 制各了5 0p m o l 的蛋白质和肽。1 9 8 8 、1 9 8 9 年出现了第一批商品毛细管电泳仪 器。 9 0 年代初，开始了芯片毛细管电泳操作模式的研究【4 7 】。目前已在芯片 上进行了荧光标记的氨基酸【8 】，d n a 限制性片段【6 ，9 - 1 0 1 ，p c r 产物 【1 1 ，1 2 】，短链寡核苷酸【1 3 ，1 4 】及测序片段【1 5 ，1 6 】等的分离分析研究。 上海交通人学博上论文 第一章绪论 1 2 电泳分离原理 毛细管电泳( c e ) 分离的基本原理是根据溶质所带电荷和体积大小的差异，导致 在电场作用下迁移速率的不同而进行电泳分离。 电泳所用的毛细管通常为内径2 5 1 0 0 微米，管外径一般为弹性聚酰亚胺外 涂层的熔融石英管，毛细管电阻高，能应用高电场( 1 0 0 1 0 0 0 v o n ) ，缩短了分 离和分析的时问，而大的表面积体积比又能有效扩散所产生的热量，提高了分 离效率。毛细管电泳所用的石英毛细管柱，一般情况下( p h ) 3 ) ，其内表面带有 负电荷，负电荷表面在溶液中积聚相反电荷的离子形成双电层；当外加电场时， 双电层中的溶剂化的阳离子带动毛细管中整体溶液朝阴极迁移，形成电渗流 ( e o f ) 。组分的流出时间取决于电渗速度和电泳速度的矢量合。一般电渗方向从 阳极到阴极且电渗速度比电泳速度快5 7 倍，而正离子的迁移方向与电渗流一致， 故最先流出；中性粒子的电泳速度为零，其迁移速度与电渗速度一致：负离子的 运动方向与电渗流方向相反，其将在中性粒子后面流出，这样可因各种粒子迁移 速度的不同而实现分离。 1 3 毛细管电泳的分离模式 毛细管电泳按分离介质和分离原理不同，存在多种操作模式，各种模式的 分离机理是不相同的。常见的毛细管电泳的分离模式主要包括毛细管区带电泳 ( c z e ) 、毛细管凝胶电泳( c g e ) 、毛细管等电聚焦电泳法( c i e f ) 、毛细管胶束电 动色谱法( m e c c ) 、毛细管等速电泳色谱法( c 1 t p ) 、毛细管电色谱法( c e c ) 等。 1 3 1 毛细管区带电泳 毛细管区带电泳又称毛细管自由电泳，其操作简单、多样化，是高效毛细 管电泳中应用最早、最广泛的一种模式。其分离原理是由于各种粒子的电泳淌度 不同，因此各种粒子在彼此分开的区域中迁移，具有相同电泳淌度的分离对象将 在同一区域中共迁移。毛细管电泳中的电泳除具有一般的电迁移外，还有电渗流 的影晌，被分离组分在毛细管内电解质的迁移速度等于电泳和电渗流速度的矢量 合。正离子的运动方向和电渗流方向一致，故最先流出；中性粒子的电泳速度为 上海交通大学博l 论文第一章绪论 零，其速度为电渗流速度：负离子的运动方向与电渗流方向相反，但电渗流速度 一般都大于电泳速度，故将在中性粒子之后流出。 l 3 2 毛细管凝胶电泳 毛细管凝胶电泳是毛细管电泳的重要模式之一，它综合了电泳和平板凝胶 电泳的优点。我们知道凝胶是毛细管电泳的理想介质，它粘度大、抗对流，能减 小溶质的扩散，因此可以限制谱带的展宽，所得样品峰的峰形尖锐，柱效高，而 且凝胶能够防止溶质在毛细管管壁的吸附并减少电渗流，所以毛细管凝胶电泳是 毛细管电泳分离模式中分离效率最高的一种，成为蛋白质、多肽、寡核苷酸和 d n a 等生物大分子分离分析的有力工具。1 9 8 3 年由h j e l t e n 首先将传统的聚丙 烯酰胺引进毛细管电泳，并对蛋白质进行了分离且取得良好的分离效果【2 】。 1 9 8 7 年c o h e n 和k a r g e r 等用毛细管凝胶电泳成功地分离了蛋白质碎片【1 7 】，并 证实毛细管凝胶电泳是能单碱基分辨d n a 聚核苷酸的高速分离技术f 1 8 1 9 1 ， 随后又在d n a 序列和限制性片段分析中取得很好结果【2 0 2 4 1 。但是毛细管凝 胶电泳存在着一个致命的缺点就是凝胶柱的制备比较困难，使用寿命很短，而且 常常有气泡形成。 1 3 3 毛细管等电聚焦电泳 毛细管等电聚焦电泳是根据样品组分( 主要是两性化合物) 的等电点不同 而实现分离。一般两性分子中既有酸性基团又有碱性基团，在某一p h 值时，其 表现电荷数为零，通常把这一p h 值称为该物质的等电点( p 0 。当p h 高于等电 点时，它们失去质子带负电荷，在电场作用下向正极移动：低于等电点时，移 向负极。在毛细管柱中置一p h 梯度缓冲溶液，两性物质由于具有不同的等电点 分别聚集在不同的位置上，不作迁移而彼此分离。等电聚焦具有较高的分辨率， 通常可以分离等电点差值小于o 0 1p h 值单位的两种蛋白质。 1 3 4 毛细管胶束电动色谱法 毛细管胶束电动色谱法是1 9 8 4 年有t e r a b c 首先提出的一种毛细管电泳技术 【2 5 1 ，该技术是以胶束为假固定相的一种电动色谱，是电泳技术和色谱技术的巧 妙结合。其原理为在缓冲溶液中加入浓度大于临界胶束浓度的表面活性剂，表面 上海交通大学博：t 论文第一章绪论 活性剂形成一疏水内核、外部带负电荷的胶束，把胶束作为准固定相，中性物质 按其亲水性不同在固定相和水相之间分配，从而使亲水性不同的中性物质在电 泳中得以分离。 1 3 5 毛细管等速电泳色谱法 毛细管等速电泳是一种移动边界的电泳技术，分离机理也是依据样品组分电 泳淌度的不同来进行分离的。实验中使用两种电解质，一种为前导电解质，含有 比所有样品组分淌度都大的离子；另一种为尾随电解质，含有比所有样品组分电 泳淌度都小的尾随离子，样品组分加在两种电解质的中间，以同一速度移动，实 现分离。其特点就是实现了样品富集、浓缩。 1 3 6 毛细管电色谱法 毛细管电色谱是近年来发展起来的一种新型分离分析技术，它整合了毛细 管电泳和液相色谱的优点。是以电渗流( 或电渗流结合高压输液泵) 为流动楣驱 动力的微柱色谱法，它的分离机理包含有电泳迁移和色谱固定相的保留机理，而 溶质与固定相间的相互作用对分离起主导作用。 1 4 毛细管电泳的检测方法 毛细管电泳的检测器按检测原理可分为通用型和专用型，前者如电导法、折 射指数法，其余都属专用型，专用型只针对有所需特性的分析物，故更灵敏。表 1 - 1 列出各检测器的检测限和相应的优缺点： 上海交通人学博卜硷文 第一章绪论 表1 - 1c e 常用捡测器及其特点 t a h i e1 - 1g e n e r a ld e t e c t o ra n di t sc h a r a c t e r i s t i ci nc e 紫外一可见吸收检测器通用性好、结构简单，而且商品紫外一吸收检测器已 达到较高性能，因此紫外一可见吸收检测器是目前毛细管电泳应用最广泛的一种 检测器。我们知道具有相同吸收光谱的化合物其结构不一定相同，因此紫外吸收 光谱分析主要用于已知物质的定量分析和纯度分析，另外紫外一可见吸收检测器 存在一个缺点就是其灵敏度不高，常常需要样品浓度达到l o _ 6 mf 2 6 ，远远满足 不了对低浓度和极微量样品分析的要求。激光诱导荧光检测是所有检测方法中 灵敏度最高的一种检测方法，很适合于痕量级样品的检测。例如利用激光诱导荧 光检测技术可对单细胞中的核酸进行定量测定【2 7 】，对某些荧光效率较高的物 质可以达到单分子的检测【2 8 】，而且目前通常的单分子检测技术也都是建立在 激光诱导荧光的原理之上的。激光诱导荧光检测方法在检测物质方面还具有一 定的特异性，即只有荧光的物质才能被检出，这就可以避免检测系统中其他物质 的干扰。然而，这也同时限制了激光诱导荧光检测方法的应用，因为大多数物质