（光学工程专业论文）悬浮式生物芯片检测中的图像处理研究.pdf

浙江大学硕士论文 摘要 生物芯片是近年来生命科学领域一项新兴的尖端应用技术，人们在基因组研究、疾 病诊断与防治、药物合成及药理药效分析、司法鉴定等领域对其深为重视。目前采用悬 浮技术的生物芯片与传统的固态基板平面式生物芯片相比有较大优势，正逐渐成为研究 的热点。而悬浮式生物芯片的检测通过图像处理来获得分析结果，目前国内外尚缺少相 应的研究。 本论文对悬浮式生物芯片检测中的图像处理进行了研究，首次提出了较为完整的图 像处理解决方案，并使用虚拟仪器开发环境l a b v i e w 具体实现。另外本文还对检测系 统中承载悬浮试液的微通道中的流场运动情况进行了研究，将粒子图像测速技术p i v 应 用到本系统的通道分析中，能够指导通道的加工并提高悬浮式生物芯片分析的可靠性。 论文首先介绍了生物芯片的原理，对悬浮式生物芯片并行检测方法中各模块进行了 分析。在此基础上，提出了完整的图像处理解决方案，包括预处理、目标定位、提取信 号强度、确定背景等，重点分析了样点的识别定位技术。利用l a b v l e w 的模块化和数 据流编程方法进行了软件实现。接着，分析了检测通道中流场运动情况对最终分析结果 的影响，研究了p i v 无扰动测速技术，着重分析了处理软件的设计。论文给出了 s p h e r o t e c h 公司的荧光微球的检测实验结果并进行了分析，验证了悬浮式生物芯片并行 检测方法的可行性和图像处理方案的效果。另外还给出了对系统液流通道进行p i v 分析 的初步结果，并剥实验结果进行了分析。最后对课题的 i 】f 究进行了总结，并划后续研究 作了展望。 关键词：悬浮式生物芯片，并行检测，图像处理，图像匹配，p i v 分析，微通道，互 相关，l a b v i e w 浙江大学硕士论文 a b s t r a c t b i o c h i pi s a ne m e r g i n gh i g ht e c h n o l o g yi nb i o m e t r i c si nr e c e n ty e a r s ，a n di s w i d e l y a p p l i e dt om a n yf i e l d ss u c ha sl i f es c i e n c er e s e a r c h ，d i a g n o s i s ，d r u gd e v e l o p m e n t ，j u d i c i a l e v a l u a t i o n ，f o o d sa n de n v i r o n m e n ts u p e r v i s i o n ，e t c s u s p e n s i o nb i o c h i ph a sm a n ya d v a n t a g e s o v e rt r a d i t i o n a lf i a t b i o c h i p ，a n db e c o m e st h ef o c u so fr e s e a r c hg r a d u a l l ya t 昂r e s e n t t h e s u s p e n s i o nb i o c h i pi sa n a l y z e dt h r o u g hp r o c e s s i n go ff l u o r e s c e n ti m a g e so ff l u i df i e l d ，b u t ， c o r r e s p o n d i n gr e s e a r c hi ss e l d o m i nt h i sp a p e r , i m a g ep r o c e s s i n gi nt h ed e t e c t i o no fs u s p e n s i o nb i o c h i pw a ss t u d i e da n d i n t e g r a t e ds o l u t i o n o fi m a g e p r o c e s s i n g w a sb r o u g h t u p t h eg r a p h i cd e v e l o p m e n t e n v i r o n m e n tl a b v i e ww a su s e dt oi m p l e m e n tt h ew h o l ep r o c e s s i na d d i t i o n ，m o v e m e n t - i n f l u i df i e l dw a sa l s oa n a l y z e d ，w h i c hi sb e n e f i c i a lt oc h a n n e ld e s i g na n ds u s p e n s i o nb i o c h i p c o n t i n u o u sa n a l y s i s t h en o n - i n t r u s i v et e c h n i q u e - p a r t i c l ei m a g ev e l o c i m e t r y ( p i v ) i su s e dt o a n a l y z et h ef l u i df i e l d f i r s to fa l l ，p r i n c i p l eo fb i o c h i pw a si n t r o d u c e da n dt h eg e n e r a ls t r u c t u r ea n de a c hu n i to f s u s p e n s i o nb i o c h i pd e t e c t i n gs y s t e mw e r ea n a l y z e d t h e nw ep r o p o s e dt h ei n t e g r a t e ds o l u t i o n o fi m a g ep r o c e s s i n g ，i n c l u d i n gp r e p r o c e s s i n g ，r e c o g n i z i n gs a m p l eo b j e c ta n do b t a i n i n gi t s p o s i t i o n ，e x t r a c t i n gi n t e n s i t yo fs a m p l es i g n a l ，c a l c u l a t i n gt h ei n t e n s i t yo fb a c k g r o u n d ，e t c 。 e m p h a s i si st h ea n a l y s i so fs a m p l eo b j e c tr e c o g n i t i o nb a s e do nm a t c h i n gt e c h n o l o g y a l lt h e p r o c e s sw a sc o m p l e t e db ym o d u l e so fl a b v i e w a n df o l l o w i n g ，t h ep a p e ra n a l y z e di m p a c t o fv e l o c i t yd i s t r i b u t i o ni nf l u i df i e l dt ot h ef i n a ld e t e c t i o nr e s u l t s ，s t u d i e dp i v t e c h n o l o g ya n d d e s i g n e di t sp r o c e s s i n gs o f t w a r e t h ee x p e r i m e n t a ld e t e c t i o nr e s u l to fs p h e r o t e c hf l u o r e s c e u t n f i c r o s p h e r e sw a sg i v e na n da n a l y z e d ，w h i c hv e r i f i e dt h ef e a s i b i l i t yo fs u s p e n s i o nb i o c h i p p a r a l l e ld e t e c t i o ns y s t e ma n de f f e c to ft h ei m a g ep r o c e s s i n gs o l u t i o n i na d d i t i o n ，t h e e l e m e n t a r yr e s u l to f m i c r o c h a n n e lt h r o u g hp l vt e c h n o l o g yi sa l s o a n a l y z e d t h e s u n u n a r i z a t i o na n dt h ee x p e c t a t i o na r ep r o v i d e di nt h ee n d k e yw o r d s ：s u s p e n s i o nb i o c h i p ，p a r a l l e la n a l y s i s ，i m a g ep r o c e s s i n g , i m a g em a t c h ，p i v m i c r o c h a n n e l ，c r o s s c o r r e l a t i o n ，l a b v i e w i i 浙江大学硕士论文 第一章绪论 1 1 悬浮式生物芯片技术 1 1 1 生物芯片概述 生物芯片是一种新型的生物检测技术，是继2 0 世纪5 0 年代半导体芯片后微芯片技 术的又一重大发展，也是2 0 世纪9 0 年代中期以来影响最深远的重大科技进展之一。生 物芯片通过微加工工艺在厘米见方的芯片上集成有成千上万个与生命相关的信息分子， 可以对生命科学与医学中的各种生物化学反应过程进行集成，从而实现对基因、配体、 抗原等生物活性物质进行高效快速的测试和分析【l l 。它融合了微电子学、生物学、物理 学、化学、计算机科学等多个学科的先进技术，具有重大的基础研究价值和明显的产业 化前景。当前基因研究的重点课题诸如人类基因计划、发现并阐明未知基因序列、寻找 与疾病有关或直接引发疾病的新基因、用基因诊断和基因疗法战胜遗传疾病、在芯片上 筛选与这些疾病基因有关的新药和发现抗病毒、抗干旱的新的农作物基因等等，生物芯 片技术在其中起着非常重要的作用。 生物芯片使用与微芯片加工工艺类似的方法，将大量与生命相关的探针分子比如核 酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等生物样品同时有序地固定于面积非常小的基板 上，基板可以是玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体。这些信息单元组成密集 的二维排列，一次可以对大量的样品点进行分析，从而实现对基因、配体、抗原等生物 活性物质进行大量、高效、快速的检测【2 】，克服了传统核酸印迹杂交技术操作复杂、自 动化程度低、检测分子数量少、效率低等不足。 生物芯片微阵列的基板载体上连接的分子称为靶标( t a r g e t ) ，能与试液里互补的探 针分子发生反应。而探针( p r o b e ) 是指试液中经过标记的分子，能和基板上的互补靶标 分子发生反应。生物芯片上可寻址的探针与已标记的待测生物样品中靶分子杂交【3 1 ，结 合或反应在相同条件下进行。反应结果用同位素法、化学荧光法或酶标法显示，用特定 的仪器比如激光共聚焦扫描仪或c c d ( 电荷藕合器件) 扫描仪对杂交信号的强度进行 快速地检测分析，通过计算机软件处理，综合成可读的数据信息。由于常用玻片或硅片 作为固相支持物，且在制备过程使用类似微电子芯片的制备技术，所以称之为生物芯片 技术；又由于携带生物信息的样品点在基板上形成微型阵列，也被称为微阵列芯片【4 】。 浙江大学硕士论文 通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可以对多种生物样品进行检测，使之具 有多种不同的应用价值，如基因表达谱测定卧【9 】、突变检测【l o 】【13 1 、多态性分析【1 4 】【17 1 、 医药领域 1 8 l 一 2 2 1 等，为基因功能的研究及现代医学科学及医学诊断学的发展提供了强有 力的工具，将使新基因的发现、基因诊断、药物筛选等方面取得重大突破，为整个人类 社会带来广泛深刻的变革。 生物芯片由于采用了微电子学的并行处理和高度集成的概念，因此具有高效、高信 息量等突出优点。与传统的膜杂交技术相比，样品需求量小，操作简单，自动化程度高， 检测靶分子种类多，检测效率高。微阵列分析方法的通量可达传统的膜杂交的数千万倍， 这是生物芯片分析最明显的一个优势【2 3 1 。 图1 1 为一个典型的生物芯片微阵列图。 剧1 1 彩色生物芯片幽像 荧光是微阵列检测中应用最普遍的方法。目前商用扫描仪大多使用荧光作为微阵列 检测的信号源。荧光染料能吸收光进入不稳定的激发态，激发态存在的时间很短，在它 回到基态时会发出能量较低的荧光。吸收光波长和发射光波长之差称为s t o k e s 位移。在 进行荧光染料的选择时常常希望具有较大的s t o k e s 位移，这样易于降低荧光本底。荧光 检测具有如下优势：检测灵敏度高，速度快；没有放射性，无毒，操作安全；能让不同 强度的信号共存于相邻的微阵列中，而不用考虑信号的干扰问题，空间分辨率高；荧光 2 浙江大学颂j 二论文 标记具有很强的稳定性，保存时间长，因而持续性好；使用方便，能够检测生物试剂， 能使用不同荧光染料。与放射性标记不同的是，荧光能被肉眼所见，因此作标记实验时 更加容易跟踪【2 引。 生物芯片主要使用机械点样法 2 5 1 和半导体技术 2 6 1 【2 8 1 来制备。喷样方法属机械点样 法，通过连续喷样，喷样头可以在1 分钟内制备含有数千个样品点的微阵列。另外，喷 样头可以实现一种或几种样品的快速喷射，适合制各样品种类不多的微阵列芯片。喷样 技术最大的优势是点样速度相对较快，而且不需与基片接触，但也存在系统容易堵塞等 问题。半导体制备技术是将微电子工业中的芯片加工技术应用于微阵列的加工中，如光 引导原位合成和半导体光刻法。光引导原位合成技术融合了固相化学、光不稳定保护基 团和平版照相技术，发展非常迅速，已经成为应用最为广泛的生物芯片制备方法之一。 生物芯片目前主要应用于生物、医学等学科，将给基因组研究、化学、新药开发、 生物武器战争、司法鉴定、食品与环境监督、药理学研究、药物毒性研究、微生物检测、 病原体检测、医学诊断、病理组织学研究、杀虫剂研究等众多领域带来巨大的革新甚至 革命。 1 1 2 片上实验室技术 片上实验室( l a bo nac h i p ，简称l o c ) 类似微电子学中s o c ( s y s t e mo nac h i p ) 高度集成化的概念，就生物检测而言就是将在实验室内进行的样品制备、加热清沈、电 泳分离、荧光检测乃至数据处理等集成在一块芯片上，使用一块芯片就可以实现整个系 统的分析工作2 9 1 。这可以说是芯片技术发展的较为理想的目标，但是山于实现起来极其 复杂，所以j jn u 尚没有个系统能够真证实现将所有的分析步骤集j , 3 z # t10 t 块：出片h l o c 主婴足在微流控：出片1 3 2 j 的牲础上发展起米的。微流控j 岱片魁采川半导休加 工技术构建包含有储液池、微反应室、微通道、微电极、微电路等的微流路系统，将微 量( 数微升甚至纳升) 的生物样品和试剂导入布满毛细管道的芯片中，在机械式或非机 械式的泵浦，如压力泵或电场的作用下让液体在微通道中执行混合、分离、培养、j j u 热 等实验室所需的反应，达到对样品进行高通量快速分析的目的。 微流控芯片本来是利用毛细管及电渗流作毛细管电泳分析的，但是其应用发展非常 迅速，因为微通道具有优异的性能。随着微型机电系统( m e m s ) 技术、x 光深层曝 浙江大学硕士论文 光微电铸复制l i g a 技术和纳米技术的发展和应用，微流控芯片的集成化越来越高。在 芯片上进行样品处理、电泳分离、检测自动化和计算机化的多系统集成是生物微芯片发 展的趋势，微流路芯片的应用也逐渐从生物样品分析扩展到化学样品分析。微流控芯片 具有非常明显的优势：能够实现毛细管电泳进样、分离和检测的集成，几十毫米的有效 分离长度使分析速度大大提高，样品与溶剂的消耗大大减少，检测效率也得以提高，微 流路芯片集成多个通道可以同时对几个甚至几十个样品进行分离，大大降低了检测成 本，使微流路芯片具有诱人的商业化前景。微流控芯片的制备方法随使用芯片的基质不 同而异。最初的微流路芯片是利用光刻、湿腐蚀技术在玻璃、硅或石英上刻蚀出微通道。 这类技术设备昂贵、技术要求高，一般实验室难以实施。而采用现代微电子加工的光刻 技术和化学湿腐蚀技术是应用最为广泛的方法，这种方法使用的基片材料为玻璃或石 英。但是用玻璃或石英基质制作微流路芯片，需要用真空溅射或蒸发沉积的金属镀膜技 术在基片上镀上惰性金属作掩模，技术复杂，步骤繁多，成本较高，因此有机玻璃等有 机材料作片基制作微流路芯片近年来逐渐受到重视。有机材料的显著优点是不需要镀 膜，通常使用压膜、注模、x 光刻蚀或激光刻制等制作方法，太大地降低了成本，促进 了微流路芯片的应用和推广【4 j 。 微流路芯片已广泛地应用于d n a 测序、免疫分析34 1 、蛋白质分析3 ”、分离荧光 染料f 36 1 、小分子化合物p t 等领域。但是微流路芯片技术比较复杂，投资大，而玻璃、石 英材料的芯片制作成本高昂，目前其分析检测方法主要是激光诱导荧光检测，在较大程 度上限制了其应用范围。但随着低成本的塑料芯片、高灵敏度的基于电泳分析的专用仪 器的出现，微流控芯片及此基础上的l o c 芯片将会得到更快的发展和应用。 1 1 3 悬浮式生物芯片 悬浮式生物芯片与使用固相基板的s l z 面式生物：占片刁；同，它的原理是将携带生物信 息的微球悬浮于液相环境中，通过检测微球来实现大规模、高速度的测量和分析口”。悬 浮式生物芯片中的生物物质载体是许多不同的微球，不同微球上固定有不同的探针分 子，探针分子可以与待测液中特定的待测分子发生杂交反应。将这些杂交后的微球探钊 悬浮于一个液楣系统中，可以对一个样品中的多个不同分子同时进行检测。待测分子上 结合了标记有荧光染料的报告分子。在激发光的作用下，微球发射出荧光，通过检测荧 光信号的强度，就可以获得微球探针结合的报告分子的浓度信息，从而得到微球探针已 4 浙江大学硕上论文 经结合的待测分子的数量信息。图1 2 是悬浮式生物芯片的工作原理示意图。 图1 2 悬浮式生物芯片原理图 圈1 3 光学编码示意图 为了对微球上的探针进行区分，使用光学编码技术f 3 9 1 进行编址，即使用不同浓度的 浙江大学硕上论文 两种荧光染料对其进行标记，通过激发后两种荧光的强度等级的组合就可以确定微球上 固定的探针分子的类别。如图1 3 所示，如果两种荧光物质的浓度都划分为1 0 个等级， 则将有1 0 0 种组合，也就是说可以将微球分为1 0 0 种。如果每种微球携带一种探针分子， 就可以同时对待测溶液中的1 0 0 种待测分子进行检测。 悬浮式生物芯片具有传统生物芯片无法比拟的优势【4 0 1 。采用固相基板的平面式生物 芯片制备工艺复杂，成本较高，不宣根据检测对象的不同制作相应的生物芯片；杂交反 应亲和力弱并需小一t l , 冲洗，而且点阵的均匀性难以保证，给芯片的检测带来很大不便， 其应用受到限制。而微流控芯片集成度不高，检测仪器的体积大多过大，分析系统功能 不全，而且目前加工制作成本高，不易广泛推广。而悬浮式生物芯片可以根据每个检测 对象的不同需要来对微球探针溶液( 微球、生物探针) 进行灵活、有目的地配置，而不 是固定的平面微阵列式样，这将大大降低成本并减少检测所需的生物信息物质数量。悬 浮式生物芯片还不存在平面式芯片的冲洗问题，易于信号检测，而且液相环境更有利于 保持蛋白分子的天然构像，也更有利于探针和被检测物的反应，因此悬浮式生物芯片具 有广阔的应用前景。 1 2 悬浮式生物芯片检测技术 一般生物芯片的检测过程通常可以分为生物芯片的制备、杂交或反应、扫描检测、 数据处理等步骤。靶标样品和探针之间发生反应，反应双方中一般有一方固定在芯片上， 另一方通过流路或加样至芯片上，二者在经过实验确定的严格条件下进行杂交。而扫描 检测就是将与f - i 标抗原、抗体、或受体等目标靶分子反应结合厢的生物芯 - 上成ti j j 个生物样点的反应结果显示出来，转变成为计钟现i t j 以处理的数据。 1 2 1 平面式生物芯片检测技术f 4 】 目前大多数生物芯片都是采用荧光染料标记，所以主要介绍荧光标记的生物出片扫 描装置。对于使用荧光染料标记的生物芯片就是通过扫描被激光激发后的生物芯片得到 数字荧光图像，然后对图像进行分析。一般荧光标记生物芯片的扫描仪按照原理和结构 可以分为激光系统扫描仪和c c d 系统扫描仪。下面主要以结构较为简单的c c d 扫描仪 为例来作介绍。如图1 4 所示，激发光源通过激发窄带干涉滤光片获取所需波长的光 束激发生物芯片产生荧光，经发射窄带干涉滤光片再由成像透镜成像在c c d 光敏面上， 6 浙江大学硕上论文 直接获得一幅图像，然后再通过数据采集卡送入计算机存储，进行进步的处理。 图1 4c c d 生物芯片扫描仪光路幽 芯片扫描仪具有很高的灵敏度和分辨率，芯片上微小的尘埃或杂质污染都会引起非 常明亮的背景和噪声，因此在芯片的制作、杂交和清洗过程中都应在洁净的环境中进行， 最好在洁净台或洁净间操作，并注意防静电，防止灰尘附着在芯片上。同时使用的溶剂、 溶液和试剂的纯度应符合规定，并注意溶剂、溶液的过滤和除菌，严格按照芯片制作、 杂交和清沈的规程操作。 芯片完成杂交和清洗后应尽可能立即扫描检测，防止荧光标记靶分子降解。杂交后 的芯片应避免长期暴露在强光下，而导致光漂白，影响测定结果。 l 。2 2 悬浮式生物芯片检测技术 目前悬浮芯片的检测较多地采用流式细胞仪【4 1 】- 1 4 3 1 来进行，其原理是使单个微球探 针逐一通过检测通道并使用双色激光同时对微球探针上的分类荧光和报告分子上的标 记荧光进行检测，以确定微球上探针分子的种类和与待测样品反应结合的情况。 图1 5 显示了流式细胞仪的光路结构，其中s 1 、s 2 为二色镜，b 1 、b 2 、b 3 为相应 的滤色片。作为载体的微球逐个通过流式细胞仪的检测通道。将两种激发光同时聚焦在 检测区域，激发光1 的作用是激发两种分类荧光物质，获取待测分子的光学编码信息； 激发光2 的作用是激发报告分子上标记的荧光物质，获得待测分子的数量信息。这样同 一个微球将发出三种颜色的荧光信号，经过分色装置分离后分别由三个光电倍增管探 7 浙江大学硕士论文 圈1 5 流式细胞仪光路图 i - - - i 成像透镜 i 、，7 车中幸 计算机处理 图1 6 悬浮式生物芯片并行检测示意图 流出 测，分析获得的三个数据就可以确定待测试剂中各种分子的含量。另外还可以通过探测 微球的前向散射光及侧向散射光束获得微球的尺寸，判断微球探针是否存在粘连。流式 浙江大学琐上论文 细胞仪中因为使用激光进行荧光激发，激发光的功率密度相当高，而高灵敏度的光电倍 增管提高了系统的探测灵敏度，因此这种方法得到了广泛的应用。但是该检测技术采用 的是串行检测方法，微球逐个通过检测光照射区域，检测速度受到限制，每秒钟只能检 测数十个微球，极大地制约了悬浮式生物芯片技术的发展。 为了克服流式细胞仪作为悬浮式生物芯片检测平台的速度限制，我们提出了一种 新的并行检测方法，其结构如图1 6 所示。 该检测方法【4 4 】使用脉冲氙灯配合滤色片作为荧光激发照明光源，承载待测试液的微 型通道被设计成扁平状，其特殊的尺寸使液流在检测时近似为二维流场，光源对整个检 测区域同时均匀照明，每次可以同时激发一片区域中多个微球上的荧光物质发出荧光， 经物镜成像。荧光中含有三个波段的光谱，经像面与物镜之间放置的由多块不同二色镜 组成的分色系统分离，被各自相应的高灵敏度面阵c c d 分别采集，共获取到一幅待测 分子信号荧光图像和两幅用于分类编址的荧光图像。荧光图像通过高速图像采集卡传输 至计算机中进行处理，就可以得到待测试液中蕴含的全部生物反应信息，包括每个微球 上携带探针分子的类别以及结合的报告分子的数量。由于次对检测区域内的全部微球 进行检测，如果c c d 以一定的速度拍摄，每秒钟检测的微球数将达数千个。可见这种 方法大大提高了悬浮式生物芯片的检测速度。 无论哪种检测方法，计算机处理都是必不可少的一步。前面光学系统、流场系统的 设计和完善，最终都是要通过计算机的分析处理把采集到的荧光图像中蕴含的信息分离 出来，形成尘物学家能够识别判断的数据。由于悬浮式生物芯片不同于传统生物芯片的 特点，处理起来较为复杂，需要对其进行深入的分析。 1 3 本论文的研究内容 悬浮式生物芯片的检测是一个非常复杂的系统，需要各个模块如光源系统、流场系 统、探测系统、软件处理系统等良好的匹配组合。本论文的主要内容是悬浮式生物芯片 并行检测系统中的图像处理部分，包括图像采集系统、图像处理系统和基于图像处理的 流场运动情况分析，最终得到可以识读的数据信息。主要研究内容包括如下几个方面： 1 完善系统方案和装爱，拍摄出悬浮液中的微球荧光图像，验证该悬浮式生物芯片并行 检测系统的可行性； 浙江大学硕士论文 2 根据悬浮式生物芯片的特点，提出图像处理分析的解决方案并予实现，主要包括：设 计图像采集系统实现图像的获取，并能够以单幅或连续多幅方式将图像保存；通过对荧 光图像的处理提取出微球样点的强度信息，用以判断微球探针的种类以及与待测分子的 反应情况。重点研究单幅图像的处理，提取图像中微球的荧光强度信息。然后方便地扩 充至多幅图像分析，通过对系统采集得到的三幅荧光图像进行分析比较，判断出微球上 探针的种类及反应情况。系统中的处理软件要求能够对图像进行有效的处理，实现简单 且功能易于扩充； 3 对微通道中的流场运动情况进行研究。使用数字流场测速技术对微通道中的流场运动 情况进行初步分析，用以指导微通道制各以实现预期的流场分布；判断出流场不同区域 的流动状况，为连续分析作参考，避免遗漏或重复分析。 1 4 本章小结 悬浮式生物芯片是一种新型的生物检测技术，本章首先介绍了生物芯片的原理、制 备技术以及芯片实验室的概念，论述了悬浮式生物芯片技术的特点和显著优势，然后介 绍了传统平面式和新型悬浮式生物芯片的检测技术，主要对比探讨了针对悬浮式生物芯 片的串行和并行检测方法。在此基础上，提出了本论文的主要研究内容。 浙江大学硕士论文 第二章悬浮式生物芯片并行检测系统分析 2 1 系统概述 目前悬浮式生物芯片的检测平台主要是流式细胞仪，携带生物信息的微球串行通过 检测区域，在激光的激发下发出荧光，由光电倍增管收集送入计算机处理，每秒钟只能 检测几十个微球，限制了悬浮式生物芯片的大规模检测，不能满足悬浮式生物芯片技术 日益发展的需要。 图2 1 所示为使用面阵c c d 实现并行处理的悬浮式生物芯片检测系统流程框图，首 先进行悬浮液的配置，使携带探针分子的微球与标记有荧光的待测分子杂交。反应完成 的测试液在精密电机的驱动下进入微通道，在通道内形成稳定的流场。液流通道是经过 特殊设计的，利用悬浮式生物芯片的特点和微球在流场中分布情况的统计结果，使悬浮 液形成一个二维的平面流场。在光源的均匀照明下，微球上标记的荧光物质受到激发发 射出荧光信号，包含两种用于对探针编码的荧光和一种表征反应程度的荧光。这些荧光 信号用分色装置分离出来，并分别用对应波段的滤色片滤除杂散光，投射在一个高灵敏 度的面阵c c d 上。c c d 同时对流场中的一片区域进行感光，一幅图像中包含有大量的 图2 1 悬浮式生物芯片检测系统的框图 浙江大学硕士论文 微球。以一定速度连续拍摄通道中的流场并通过高速接口传入计算机进行处理分析。系 统的分析通量可由c c d 的帧速、拍摄区域大小、微球间的统计分布距离等得到。如果 光源采用脉冲氙灯，激发一个大小为l m m l m m 检测区域，微球之间的统计平均间距 为1 0 0 肛m ，则每次采集到的荧光图像中约包含1 0 0 个微球；c c d 拍摄速度为每秒1 0 2 0 帧的话，则1 秒内可检测高达i 0 0 0 2 0 0 0 个微球。可见这种方法突破了流式细胞仪 的速度限制，是一种高通量的检测方法。另外，使用c c d 作为荧光探测设备，不像光电 倍增管那样需要配置高压电源和低噪声放大电路等，硬件电路简单。利用计算机的强大 功能，软件处理也较为方便。 2 2 系统结构 如图2 2 所示为悬浮式生物芯片的并行检测装置示意图，悬浮液中的微球探针标记 有两种不同比例的红色编码荧光，发射波长分别为6 6 0 n m 和7 2 0 r i m ，每种荧光具有1 0 个灰度等级，一共组合成1 0 0 个编码，也就是说可以将微球分为1 0 0 类，一次可以同时 图2 2 悬浮式生物芯片并行检测系统示意图 浙江大学颂二 论文 对多达1 0 0 种不同的生物样品分子进行检测。 系统使用脉冲氙灯作为激发光源，氙灯具有功率高、光谱范围宽的特点，可以使检 测区的激发光功率密度满足要求。光源经照明光路中的分色器件，分离出用于激发荧光 物质所需的光谱波段的光束，其中一种光束波长约6 3 5 n m ，用来激发对微球编址的荧光 染料；另一种光束波长约为5 3 2 n m ，用于激发待测试样中报告分子上的荧光标记物。两 个光谱波段的激发光束均匀照射在特制的扁平通道上，所谓特制，是指其尺寸、形状能 够近似将其中的流场当作二维平面处理。检测区域内悬浮液中微球上的荧光物质在光源 的激发下发出荧光。荧光的强度跟激发光功率和荧光物质的数量成正比。混杂在一起的 荧光信号经两片二色镜分离出两种光学编码荧光和种反应荧光。三种荧光信号经相应 的滤色片滤波，去除杂散光，再由c c d 探测采集送入计算机中进行分析。对图像进行 处理，提取出某个微球样点上两种分类荧光的强度，就可以对其携带的探针分子进行分 类；提取出微球结合的报告分子上标记的荧光信号，则可以判断探针是否与待测分子发 生了反应。表征反应的信号荧光按照探针分子的种类进行区分，对比三幅图像，就可以 统计出悬浮液中所有微球的反应情况，就完成了对悬浮式生物芯片的检测。统计数据由 相关专家进行分析最终得出生物学意义上的结论。 2 3 光学系统 对激发光源一般有功率和光谱成分的要求，一方面要能够激发出足够强的荧光信 号，另一方面能够广泛适应不同的荧光标记染料。本系统中使用的是脉冲氙灯，c c d 与之同步可以实现对流场的连续拍摄。氙灯功率较大，可达数十瓦，发射光谱均匀连续， 但是价格昂贵，寿命较短。其他光源如高压汞灯光强度不及氙灯，发射光谱不连续，常 用在荧光显微镜中。由于微球探针被激发后发出的荧光信号与激发光强度成正比，因此 光源应均匀照射在通道的检测区域上，保证处于悬浮液中不同位置的微球发射出来的荧 光信号能够进行对比分析。在对采集得到的通道流场图像进行处理分析的时候，如果需 要应根据检测区域中照明的不均匀性对图像进行校正。 微球上标记的荧光染料一般都存在光漂白现象，即荧光染料分子在激发光的照射 下，产生荧光的能力会逐渐变弱甚至消失。光漂白的程度跟光照强度和照射时间有关， 光强越大，持续照射时间越长，则被漂白的程度也越大。所以还要控制好c c d 扫描的 曝光方式，通常一次扫描产生的光漂白可能并不明显，但是要进行多次重复扫描时应考 浙江大学硕士论文 虑由此产生的光漂白。 在系统中滤色片是非常重要的器件，荧光信号的可靠检测需要多块滤色片配合实 现。滤色片的质量对于系统噪声和本底有较大的影响，应选用高质量的滤光片。首先是 光源分色系统中使用滤色片从光源中提取出符合激发光谱波段要求的光束，称为激发滤 色片。在悬浮式生物芯片的检测中，需要两种波长的激发光，一种用来激发微球中的分 类编码荧光，另一种用来激发表征反应的信号荧光。为了探测荧光信号，一方面要避免 来自光源中包含的荧光光谱波段的干扰，降低背景，即要求激发滤色片能够滤除激发光 中包含的荧光光谱波段；另一方面在荧光探测采集端也要使用滤色片来滤掉任何荧光信 号光谱范围之外的杂散光，而仅容许我们所期望的荧光信号通过，这类滤色片称为发射 滤色片。激发滤色片与发射滤色片的光谱通过波段不能有重叠区。 检测系统中还用到二色镜进行分色，由于悬浮式生物芯片在光源激发下发出三种混 杂在一起的不同波段的荧光，要求分别用不同的c c d 进行探测，所以在进入c c d 之前 需使用二色镜进行分离，荧光信号在分色器件的作用下分成三束，每束光仅包含一种荧 光光谱波段，然后分别由相应的发射滤色片单独滤波进入c c d 进行检测。 2 4 液流系统 流场通道是悬浮式生物芯片检测中的重要部分，是系统的检测区。图2 _ 3 所示为检 测系统中液流通道的纵截面示意图。为用c c d 一次拍摄一片区域，设计了特殊的微型 圈黔圈 驱动区缓冲区通道流场区 图2 3 检测系统流场通道纵截面示意国 _ 网 收集区 通道使流场近似为二维分布处理，通道成扁平状，在光轴方向上的维度小于微球在试液 1 4 浙江大学烦一l 论文 中分布的统计平均距离，从而微球在光轴方向成单层分布，可将其视为二维平面流场进 行检测。通道的加工制备和试剂的驱动是液流系统中两个关键问题。通道加工有机械方 法、激光刻蚀、湿法刻蚀等方法，对制各的透光率、平整度、内部光洁度都有较高要求。 如果通道表面比较粗糙，毛刺较多，不仅影响液流的平稳运动，而且形成的噪声斑点对 微球图像的处理也会有较大干扰。通道放置需注意阻止粉尘的侵入，确保清洁。驱动装 置作用是推射试剂进入通道，要求能够对液流进行精确控制，使之在扁平通道中稳定流 动，并且能够和氙灯曝光的脉冲频率和c c d 的帧频相匹配。检测区域范围与光学成像 系统的放大率和c c d 的光敏面大小有关。检测区要将通道的宽度方向覆盖，以使待测 悬浮液中的微球全部被c c d 采集到。 2 5 图像处理系统 图像处理系统主要包括图像的采集和处理。配置好的悬浮液中微球受脉冲氙灯激 发，发射出三种不同波长的荧光经成像和分色系统分别投射在c c d 的感光面上，一次 需采集三幅图像，这些图像可以直接进行处理或者保存在计算机中。 由于荧光信号比较弱，因此需要高灵敏度、低噪声的c c d 进行采集。c c d 的特性 参数如分辨率、光敏面大小等要与检测区域、光学成像透镜等相匹配，满足系统中对图 像处理的要求。本系统中使用的c c d 是k o d a k 公司的k a f 一0 4 2 1 ，有7 6 8 5 1 2 个像素， 像素尺寸为9 p a n 9 t m a 。 另外图像的数据量比较大，当进行连续采集时数据更为可观，因此需要使用专用的 图像采集卡实现数据的高速传输。n i 公司的p c i 1 4 2 2 图像采集卡使用p c i 接口，可以 将图像保存在板载存储器中或直接存入系统内存。这款采集卡支持高达1 6 位的差分视 频数据，可通过配置4 根通用控制线来产生精准的时钟信号控制采集设备工作。另外可 以使用外部的输入输出线作为触发信号。此图像采集卡支持美国国家仪器公司( n a t i o n a l i n s t r u m e n t s ，简称n i ) 的软件技术，可以快速简便地开发用户应用程序，而不需考虑设 备的底层驱动，能大大缩短开发周期。 单从采集得到的荧光图像并不能直接得出生物学结论，需要在计算机中经过一系列 的处理，从中提取出可供分析的数据信息。对两幅分类荧光图像进行处理可以确定微球 探针信息，包括每个微球上携带探针分子的类别和数量：而通过对报告分子荧光图像的 处理可以得到生物样品的反应信息。通过对三幅图像的对比分析，将得到待测试液中蕴 浙江大学硕士论文 含的所有有用信息。将这些数据综合起来，由生物学家进行专业分析，最终可以得到生 物学意义上的结论。由于悬浮式生物芯片的特殊性，其图像分析也是一个复杂的过程， 需要经过一系列处理步骤，包括图像中噪声的去除、微球的快速识别和定位、荧光信号 强度的提取、对所有微球的反应情况进行统计等，具体将在第三章中进行分析。 n i 公司倡导的虚拟仪器( v i a u a li n s t r u m e n t s ，简称v i ) 技术非常适合于数据采集 和信号处理以及二者间的整合集成，而且其特有的数据流编程方法非常容易实现多进程 的并行计算。在计算机端的应用程序包括图像的获取、存储和处理等，用n i 公司的虚 拟仪器技术丌发，不需考虑细节的实现，而且极易实现友好的人机交互界面。 2 6 本章小结 由于流式细胞仪对检测速度的限制，我们采用了高通量的c c d 并行检测方案。本 章首先整体介绍了悬浮式生物芯片检测的流程和检测系统的结构，然后分别从光学系 统、液流系统、图像处理系统三个方面对检测系统作了详细的分析。 1 6 浙江大学硕士论文 第三章图像处理系统研究 3 1 虚拟仪器技术在芯片检测中的应用 3 1 1 虚拟仪器技术 美国n i 公司倡导的虚拟仪器技术【4 5 】非常适合应用于数据采集领域以及与之相关的 信号分析，而且二者很容易整合在一起。在我们的悬浮式生物芯片检测系统中，使用了 n i 公司的数据采集卡p c i 1 4 2 2 ，结合功能强大的虚拟仪器开发软件，可以方便地实现 悬浮芯片的荧光图像采集和处理。 虚拟仪器技术是随着计算机的普及和软件技术的发展逐渐形成的，它使用软件来替 代传统仪器的大部分功能：提供一套直接面向用户的面板界面，其外观和操作几乎与实 际仪器无异，而程序的源代码则对用户隐藏。 虚拟仪器技术具有性能高、扩展性强、便于集成、成本低等突出的特点。它基于 p c 技术，因此可以充分利用发展迅猛的先进的硬件和软件技术，实现高性能的数据采 集、传输和处理。另外，还可以方便地接入i n t e r n e t ，利用计算机网络实现数据的分享。 对整个应用系统的升级或改进、功能的扩展，只需更新计算机或测量硬件，或仅需升级 软件即可，这在p c 上实现起来非常方便。 虚拟仪器技术从本质上沈嚼于一个软硬件集成的概念。仪器产品常常需要集成多个 测量设备柬进行完整的测试，以实现越来越复杂的功能；但是这些不同设备间的连接和 集成需要耗费大量的时间，很难轻易完成。而虚拟仪器软件平台为这些设备提供了标准 的接口，如数据采集、机器视觉、运动分析等等，帮助用户轻松地将多个测量设备集成 为一个系统，减少了任务的复杂性。这些不同的设备既保持其独立性，同时也紧密地集 成在一起。 虚拟仪器的系统开发成本很低，因为使用成熟廉价的通用p c 来完成处理和实现交 互界面。另外，当测量需要发生变化时，无需购罱新的仪器设备即可轻松对其进行修改 或扩展。也可以开发完整的仪器库备用，成本远低于购买一台传统的商用仪器。 虚拟仪器有多种开发语言和工具，比如最初的b a s i c 语言，现在的c 语言v i s u a lc 十+ ， m a t l a b 等，但设计最易、应用最广的当属n i 公司的虚拟仪器开发环境l a b v i e w ，已被 浙江大学硕二 论文 学术界和工程界广泛接受。 3 1 2l a b v i e w 在图像采集处理中的优势【4 6 】 l a b v i e w 即实验室虚拟仪器集成环境( l a b o r a t o r yv i r t u a li n s t r u m e 眦e n g i n e e r i n g w o r k b e n c h ) 的简称，是n i 公司的一个功能强大的图形化虚拟仪器开发软件产品，发展 非常迅速，在包括航空、航天、通信、汽车、半导体和生物医学等世界范围的众多领域 内得到了广泛应用。 在实验室研究和工业自动化领域会经常遇到数据采集、仪器控制、过程监控和自动 测试等需求。在2 0 世纪8 0 年代初p c 机出现之前，几乎所有的实验室和研究机构都采 用贵重的仪器控制器来控制测试系统，功能单一而且价格昂贵。后来随着p c 机的出现， 工程师们找到了一种通过性能价格比高的通用p c 机控制台式仪器的方法，各种基于p c 机的接口板卡产品得到了广泛使用。 就一个数据采集系统而言，目前数据的获取处理多数采用c 语言编程，跟可读性差、 编程专业性要求高的机器语言和汇编语言相比，已经具有了许多优势，如编程简单、可 读性强、具有交互能力等。但是也存在一个根本问题，即要求开发仪器的科学家、工程 师和技术人员成为较为专业的程序员。这些用户必须根据自己对仪器和应用的要求和认 识来编写从采集到处理、显示等各模块的大量代码，这个过程通常耗费大量的时间和精 力，一般需要专业人员开发。而n i 公司的虚拟仪器丌发环境l a b v i e w 就是为替代常规 的b a s i c 或c 语言仪器开发而设计的，l a b v i e w 不仅是一个软件开发环境，也可以看 成是一门编程语言，只不过它是用图形符号描述的，因此被称为g ( 意为g r a p h i c s ) 语 言。这种图形化的编程语言大大减轻了编程人员的负担。 g 语言和其他高级语言类似，定义了数据模型、结构类型和模块调用与语法规则等 基本要素。同时g 语言丰富的扩展函数库还为用户编程提供了极大的方便。这些扩展函 数库主要面向数据采集、g p i b 和串行仪器控制，以及数据分析、数据显示和数据存储。 g 语言还包括常用的程序调试工具，比如允许设置断点、单步调试、数据探针和动态显 示执行程序流程等功能。g 语言与传统高级编程语言最大的差别在于编程方式，一般高 级语言采用文本编程，而g 语言采用图形化编程方式，在一系列的图标问正确连线就可 以完成程序的编制，具有功能完整和应用灵活的特点。 浙江大学硕士论文 使用g 语言编写的程序称为虚拟仪器，因为它的界面和功能与真实仪器十分相像。 一个v i 由前面板( p a n e l ) 和框图程序( d i a g r a mp r o g r a m ) 等组成。 前面板面向用户，用于设置输入和