（光学工程专业论文）双激光共聚焦生物芯片荧光分析仪的研究与开发.pdf

双激光共聚焦生物芯片荧光分析仪的研究与开发 摘要 生物芯片技术是生命科学领域中迅速崛起的一项高新技术，它以玻片、硅片或尼龙等为载体， 在其表面高密度地排列大量的生物材料，实现对d n a 、蛋白质、细胞以及其他生物组分的准确、 快速、并行利大信息量的检测利分析，可广泛应用于药物研究、疾病诊断、基因结构与功能研究 等领域。生物芯片采用分子杂交原理进行工作，将待测样品加以荧光染料标记，然后与已知结构 的生物芯片进行充分杂交，用荧光分析仪检测发生杂交反应位置处的荧光信号。因此，荧光分析 仪是获取生物芯片信息的必备仪器，也是决定生物芯片能否得到广泛应用的关键仪器。 本论文主要涉及激光共聚焦生物芯片荧光分析仪的设计与实现，详细论述了仪器的设计方 案、性能指标、实验测试及结果分析，研究如何在降低成本的前提下，开发出具有自主知识产权、 性能良好的生物芯片分析仪器，从产业化的角度出发，做了一些有益的探索工作，初步完成了实 验样机的研制。样机中，荧光的激发光源为5 3 2 n m 的绿激光和6 3 5 n m 的红激光，采j _ l j 一个光电 倍增管分时实现了c y 3 和c y 5 两种荧光信号的检测，生物芯片的一维扫描由振镜与远心f - t h e t a 物镜实现，另维扫描由步进电机驱动精密导轨实现。结合具体的设计参数，分析了荧光分析仪 的分辨率、信噪比、探测灵敏度及动态范用，讨论了它的重复性与稳定性，研究了g t h e t a 物镜的 残留畸变和振镜的响应误差对扫描均匀性的影响，提出了光电倍增管的自动增益控制方法及串扰 误差的校正方法。绿光扫描时，荧光分析仪的光学分辨率可达到5 9 i n ，c y 3 荧光的探测灵敏度为 1 f l u o d p m 2 ，动态范同大于1 0 3 ，完成5 9 m 双光扫描耗时4 0 0 秒，比大部分现有同类产品的扫描 速度快。样机集成有嵌入式操作系统以及显示打印部件，数据处理与分析由d s p 完成，荧光图像 及诊断结果可以在液晶屏上显示，也可通过热敏打印机给出。整台样机面向医院应用，生物芯片 的检测分析自动完成，操作方便。 本论文还研究了生物芯片荧光图像的基本处理技术。设计了一种图像增强算法，可在滤除脉 冲噪声的同时，校正荧光图像中的缓慢背景变化；根据图像的行列投影，实现了分子靶点的自动 定位；针对分子靶点的不规则结构，研究了基于边缘检测的自适应圆分割及基于区域生氏的自适 应形状分割技术，较为准确地实现了分子靶点的分割与识别。 关键词：生物芯片；荧光；激光；共聚焦；分析仪；扫描 r e s e a r c ha n dd e v e l o p m e n to ft w o w a v e l e n g t hc o n f o c a l f l u o r e s c e n tm i c r o a r r a ya n a l y z e r a b s t r a c t t h em i c r o a r r a yt e c h n o l o g yi san e wb r a n c h o fb i o l o g ya n dl i f e s c i e n c e ，w h i c he m e r g e sa ta t r e m e n d o u sp a c e i ti sb a s e do nt h eg l a s ss u r f a c e ，s i l i c o nw a f e r , n y l o ns u b s t r a t ee t c ，o nw h i c hl a 曙e q u a n t i t i e so fb i o m a t e r i a l sa r ei m m o b i l i z e di nh i g hd e n s i t y t h em i c r o a r r a yt e c h n o l o g ya l l o w sa n a c c u r a t e ，r a p i da n dp a r a l l e la n a l y s i so ft h o u s a n d so fg e n e s ，p r o t e i n s ，c e l l sa n do t h e rb i o m o l e c u l e si na s i n g l ee x p e r i m e n t i ti sb e c o m i n gac o m m o nt o o l i nm a n ya r e a so fb i o l o g ya n dl i f er e s e a r c h ，i n c l u d i n g d r u gd i s c o v e r y ，c l i n i c a ld i a g n o s i s ，g e n o m es t r u c t u r ea n df u n c t i o nr e s e a r c he t c m i c r o a r r a ye x p e r i m e n t s d e p e n do nt h eh y b r i d i z a t i o nr e a c t i o n t h et e s ts a m p l e sa r et a g g e dw i t ht h ef l u o r e s c e n td y e sa n d h y b r i d i z e dw i t ht h em i c r o a r r a y s af l u o r e s c e n ta n a l y z e rs c a n st h em i c r o a r r a y sa n di n t e r p r e t st h e f l u o r e s c e n ts i g n a l s ，s oi t i san e c e s s a r yi n s t r u m e n tt oo b t a i nt h em i c r o a r r a ye x p e r i m e n t a lr e s u l t sa n da k e yo n e w h i c hb o o s t st h em i c r o a r r a yt e c h n o l o g yt ob eu s e dw i d e l y h o wt od e s i g na n di m p l e m e n tal a s e rs c a n n i n gc o n f o c a lm i c r o a r r a ya n a l y z e rw a si n t r o d u c e di nt h e d i s s e r t a t i o n ，m a i n l yi n c l u d i n gf o u ra s p e c t s ：t h ed e s i g ns c h e m e ，p e r f o r m a n c ea n a l y s i s ，e x p e r i m e n t a l t e s t i n ga n dr e s u l td i s c u s s i o n t h ea n a l y z e rw o u l db er e a s o n a b l ec o s t ，g o o dp e r f o r m a n c ea n do w n i n t e l l e c t u a lp r o p e r t y f r o mt h ev i e wo fi n d u s t r i a l i z a t i o n ，w ed i ds o m em e a n i n g f u lw o r ka n dm a d ea n e x p e r i m e n t a lp r o t o t y p e i nt h i sp r o t o t y p e ，t h ec y 3a n dc y 5f l u o r o p h o r e sw e r ee x c i t e db ya5 3 2 n mg r e e n l a s e ra n da6 3 5 n mr e dl a s e r r e s p e c t i v e l y t h ee m i t t e df l u o r e s c e n ts i g n a lw a sd e t e c t e du s i n ga p h o t o m u l t i p l i e rt u b e ( p m ns e q u e n t i a l l y o n ed i m e n s i o ns c a n n i n go ft h em i c r o a r r a ys l i d ew a s p e r f o r m e db yat e l e c e n t r i cf - t h e t ao b j e c t i v ew i t ham o v i n gc o i lo p t i c a ls c a n n e r ；t h eo t h e rd i m e n s i o nw a s s c a n n e dt h r o u g hf ls t e p p i n gm o t o rd r i v i n gt h ep r e c i s i o ng u i d a n c e t h ef e a t u r e sa n ds p e c i f i c a t i o n so ft h e a n a l y z e r , s u c ha st h er e s o l u t i o n ，s i g n a l - t o n o i s er a t i o ，d e t e c t i o nl i m i ta n dd y n a m i cr a n g e ，w e r ea n a l y z e d b a s e do nt h ea c t u a lp a r a m e t e r s t h ed i s t o r t i o no ft h ef - t h e t ao b j e c t i v ea n dt h ef r e q u e n c yr e s p o n s ee r r o r o f t h eo p t i c a ls c a n n e rw e r ea n a l y z e dt o o ，t h e yw o u l da f f e c tt h ef i e l du n i f o r m i t yo f t h ei n s t r u m e n t t h e r e p r o d u c i b i l i t ya n dc r o s s t a l kr e d u c t i o nw e r ed i s c u s s e da n da ua u t og a i nc o n t r o ls y s t e mf o rt h ep m t w a sp r o p o s e d w h e ns c o t r u i n gb yg r e e nl a s e r , t h er e s o l u t i o no ft h ea n a l y z e rw o u l db e5 9 ma n dt h e d e t e c t i o nl i m i tw o u l db e1f l u o r p m 2f o rc y 3 i t sd y n a m i cr a n g eo fd e t e c t i o nw o u l db el i n e a ro v e r3 o r d e r so fm a g n i t u d e w h e ns c a n n i n gt h em i c r o a r r a ys l i d eu s i n gt w ol a s e r sa n da t5m i c r o n sr e s o l u t i o n ， i tc o s t4 0 0s e c o n d s ，f a s t e rt h a nm o s to f t h ec o n f o c a lm i c r o a r r a ya n a l y z e ru n d e rt 1 1 es a m ec o n d i t i o n t h e p r o t o t y p ew a si n t e g r a t e dw i t ht h ee m b e d d e do p e r a t i n gs y s t e m ，m o n i t o ra n dp r i n t e r t h ed a t aw e r e p r o c e s s e da n da n a l y z e db yad s rt h ef l u o r e s c e n ti m a g ea n dt h ee x p e r i m , 、n t a lr e s u l t sc o u l db e d i s p l a y e do nt h em o n i t o r o rp r i n t e do u tb yt h ep r i n t e r i tw a sd e s i g n e da c c o r d i n gt h er e q u i r e m e n to ft h e h o s p i t a l ，a l lt h ep r o c e d u r e so fs c a n n i n ga n da n a l y z i n gw e r ea u t o m a t e da n ds t r a i g h t f o r w a r d t h eb a s i ci m a g ep r o c e s s i n gt e c h n i q u ew a sa l s oi n c l u d e di nt h ed i s s e r t a t i o n a na l g o r i t h mf o r i m a g ee n h a n c i n gw a sd e s i g n e d i tn o to n l yr e d u c e dt h ei m p u l s i v en o i s e ，b u ta l s oc o r r e c t e dt h e b a c k g r o u n dv a r i a t i o ni nt h ei m a g e t h em i c r o a r r a yg r i d d i n gw a sp e r f o r m e da c c o r d i n gi m a g ep r o j e c t i o n s t oi d e n t i f yt h es p o v 3f r o mt h eb a c k g r o u n da c c u r a t e l y , b o t ht h ea d a p t i v ec i r c l ea n da d a p t i v es h a p e s e g m e n t a t i o na l g o r i t h mw e r ed i s c u s s 甜i nd e t a i l k e yw o r d s ：m i c r o a r r a y ；f l u o r e s c e n c e ；l a s e r ；c o n f o c a l ；a n a l y z e r ；s c a n n i n g 致谢 y 6 0 0 0 6 , ； 首先，我要衷心感谢我的导师陆祖康教授，他将我带入了生物光学这个充满魅力的科学领域， 并在后面的学习和工作中，给予我精心的指导利全面的支持。导师1 ；仅予我传道、授业，还帮我 解惑，我所取得的每一个进步，都倾注着导师的心血。导师那渊博的知识、敏锐的科学洞察力、 严谨的治学态度，以及旺盛的t 作热情，值得我去认真学习和借鉴；导师那及时、中肯、直言不 讳的批评与教诲，更使我受益终生。 我还要感谢吴碧珍老师，她在课题工作中给予了我真诚的帮助和悉心的关怀。课题中全部的 机械、光学设计与澜试，得益于她的辛勤i ：作和亲身指导。 在我身处浏境之时，曹向群教授伸出了双手。无论是学习上、1 _ 作中，还是生活里，曹老师 对我关怀备至、体贴入微。他既是一个学识渊博、思路敏捷的良师，又是一个真诚坦率、和蔼可 亲的益友，论文工作的完成得益丁他的言传身教，在此表示深深谢意。 同时我还要感谢林斌教授，他使我融入了i ：程中心这个大家庭，时时刻刻给予我鼓励与支持， 他的谆谆教导使我受益匪浅。 另外我要感谢陈珏清教授，他在薄膜设计中给予的指导，在实验1 作中给予的火心和鼓励， 对我帮助很大。感谢倪旭翔副教授、严惠民教授、周建民老师的热情帮助和有髓讨论。实验作 还得到了金成科技公司华师傅等人的帮助，在此一井表示感谢。 李映笙硕士和郑旭峰硕士承担了课题工作的具体实验部分，包括机械、光路、电路、软什等 各个方面，没有他们两人的努力工作年刻苦钻研，本课题不可能顺利完成，1 f 常感谢他们的全力 帮助与协作。 感谢徐国雄博士、石岩博士、徐进硕士、刘国光硕士、吴翔博士、杨洪钦n i - 等实验帑人员 他们不仅给予我课题工作上的帮助，而且给予我生活上的帮助。 本课题得到国家自然科学基金项目“双激光共焦生物芯片荧光分析仪”( 编号为3 0 2 2 0 0 2 ) 的资助，感谢课题组成员汪乐宇教授、陈耀武教授、段会龙教授、田翔溥十、邓。j t 硕十、张桦博 十等的帮助与支持，感谢深圳盏生堂生物企业有限公司提供的丙型肝炎蛋自芯片。 我还要感谢评审和评阅本论文的各位号家、教授，诣 谢他们提出的宝贵意见和建议。 最后，我要感谢我的父母币家人，感谢他们对我始终如一的关心、支持和理解，尽管我知道， 他们从来不在乎 浙江大学博上学位论立 第一章绪论 二十世纪的科学技术取得了令人眩目而又激动不已的成就。在五十年代，集成电路芯片的研 制成功，使占地数间房屋的分离元件计算机缩小至现在只有书本火小的笔记本计算机，但功能雨l 速度有过之而无不及。无独有偶，同样是在五十年代，年仅2 5 岁的詹姆斯- 沃森和3 7 岁的弗朗两 斯克里克共同完成了一项伟业：他们从d n a ( 脱氧核糖核酸) 的x 光衍射图上解读了它的烈螺 旋结构，从此揭开了人类探索生命奥秘的新纪元。这个时代的两大高新技术信息技术年生物 技术，也就从此诞生并一直不断地发展平创新，创造出一个又一个的科学奇迹。刚刚进入二十一 世纪，人类基因组计划就已初步完成，蛋白质组计划已经启动，基因序列数据及蛋白序列数据l l 在以前所未有的速度增长。然而，怎样去研究如此众多基冈和蛋白质在生命过程中所担负的功能 呢? 生物芯片技术正是在这样的背景下应运而生，它是信息技术与生物技术相结合的产物，是生 命科学研究中的一次革命性技术突破。财富杂志在1 9 9 7 年的3 月3 1 日讲到：“微处理器芯片 使我们的经济发生了根本改变、给人类带来了巨人的财富、改变了我们的生活方式。然而，生物 芯片给人类带来的影响可能会更大”。科学杂志将生物芯片技术评选为1 9 9 8 年世界十大 科技突破之一。 本章首先筒述生物芯片技术的概念、制作、检测及应 ! j 等内容，进而引山全文的立论依据及 主要研究内容，最后介2 7 1 论文的整体结构安排。 第一章绪论 1 1 论文的选题背景 生物芯片技术出现了仅仅十年左右，但它已经吸引了无数人的关注。它有可能破译深藏在生 物体内巨人的遗传信息，揭示生命的本质，阐明疾病的治病机理，从而治愈困扰和折磨人类多年 的疑难杂症。生物芯片将大最的生物信息以及许多不连续的分析过程集成在一个芯片上，从而实 现对d n a 、蛋白质、细胞以及其他生物组分的准确、快速、并行干大信息量的检测和分析，能 在很短的时间内完成上万次的生物化学反应，具有高通量、高集成度、并行分析、微型化的优点。 正是生物芯片的这些突出优点，世界各国的众多科研工作者都致力于生物芯片相关工艺、设备、 检测技术及处理软件的研究与开发。 1 1 1 生物芯片的基本概念 狭义的生物芯片是指微阵列生物芯片( m i c r o a r r a y ) ，它采用光导原位合成法l 。“或芯片外台成 后机械点样法 6 - 9 等方法，将大量的生物大分子，比如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等 生物样品有序地固化于支持物( 如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体) 的表面，组成 密集的二维生物分子阵列。根据吲定的探针种类不同，生物芯片可主要分为基因芯片和蛋白芯片。 如果芯片上同定的分子是寡核苷酸( o l i g o n u c l e o t i d e ) 或d n a ，就是d n a 芯片，如果芯片上同定 的是蛋白质，则称为蛋白芯片。f i g 1 1 为一个b dc l o n t e c ha bm i c r o a r r a y3 8 0 图，它是一个蛋白 芯片，有3 7 8 个单克隆抗体，排列为3 2 2 4 个点阵，每个单克隆抗体排列两点，四个角的标记 点为c y 3 c y 5 标记过的牛血清蛋白( b s a ) ，用来作为定位标志，四个环状标记点为未荧光标记 的b s a ，用来作为阴性控制点。 f i g1 it h eb dc l o n t e c h x ”a bm i c r o a r r a y3 8 0c o n t a i n s3 7 8m o a o c l o a a a n t i b o d i e sa r r a y e di na3 2x2 4 g r i de a c ha n t i b o d yi sp r i n t e di nd u p l i c a t e d a r kg r a yd o t sa tt h ec o m e r sr e p r e s e n tc y 3 c y 5 l a b e l e db o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) s p o t s ，w h i c hs e r v ea so r i e n t a t i o nm a r k e r s t h eo p e nc i r c l e s c o r r e s p o n dt ou n l a b e l e db s as p o t s ，w h i c hs e d ea sn e g a t i v ec o n t r o l s 生物芯片是由美国旧金山以南的一个新兴生物公司a f l y m e t r i x 首先发展起来的。s p a f o r d e r 及其同事于9 0 年代初发明了一种利用光刻技术在固相支持物上光导合成多肽的方法【”，并在此基 础上于1 9 9 3 年设计了一种寡核苷酸生物芯片”。与此同时，美国s t a n f o r d 大学的m s c h e n a 在研 2 浙江大学博士学位论文 究植物转录因子时提山了将大量d n a 探针集成在同体表面上米研究基因表达的方法【】，并在 1 9 9 5 年用机械手在玻璃片上进行d n a 点样，利用双荧光标 己一次检测了4 5 个基因【，j 。1 9 9 6 年， m s c h e n a 与s p a f o r d o r 等合作，制造出世界上第一个商业化的生物芯片。在此之后，国际上 掀起了一股生物芯片设计的热潮，出现了多种类型的生物芯片。生物芯片在产生的短短1 0 年叫 间| ：j ! i 技术不断完善，它结合了寡核苷酸合成、l 刮相合成、p c r 、探针标记、分子杂交、大规模集 成l b 路制造、荧光显微探测、生物传感器及计算机控制平图像处理等多种技术，充分体现1 r 生物 技术与其他学科相结合的巨大潜力“。 生物芯片的大小一般只有几个平方厘米，在这样大小的空间内需要排列几百甚至几白| 万个信 息单元，所以，生物芯片的制作是一个复杂而精密的过程，目前主要有以r 两种方法： 第一种方法是光导原位合成法l | “，f 9 1 2 为其原理图。具体方法是在经过处理的载玻片表 面铺上一层连接分子( 1 i n k e r ) ，其羟基上加有光敏保护基团，可用光照除去，削特制的光刻掩模 ( p h o t o l i o g r a p h i cm a s k ) 保护不需要合成的部位。而暴露合成部位，在光照作用f 除去羟基上的 保护基团，游离羟基，利用化学反应加上第一个寡核苷酸，所加寡核苷酸的种类及在芯片上的位 置预先设定，所加入的寡核苷酸带有光敏保护基团，以便下一步合成。然后按照上述方法在其他 位点加上另外三种寡核营酸，这样，具有4 “个寡核营酸的芯片需要4 n 个步骤，它包含了全部妖 度为n 的寡核苷酸序列。这种原位直接合成的方法无须制备处理克隆和p c r 产物，但是每轮反 应所需设计的光刻掩模是其主要的成本消耗。采用这种方法制作的生物芯片密度很高，可达每平 方厘米1 0 。个探针。 m 1 x x xx u s h i n e i i g h t c 。u p l e xx i i 一工l i 工 il i i i l l i l l f i i i i i i i i i ti i o o i o 凸i o ti i o b i i 口d i l d k e p e a t i i i i i i i l i l i iiiliiiiiiiii 一- i o o i l d o l i 口 i 口o o o i i o i i i i l l l l i i i i l i i i i i i i ii l d 8 l l b o i i df m i c r o a r r a y f i gi2l i g h td i r e c t e do l i g o n u c l e o t i d es y n t h e s i s ag l a s sw a f e rm o d i f i e dw i t hp h o t o l a b i l ep r o t e c t i n gg r o u p s ( x ) i s s e l e c t i v e l ya c t i v a t e df o rd n as y n t h e s i sb ys h i n i n gl i g h tt h r o u g hap h o t o m a s k ( m 1 ) t h ew a f e ri st h e n f l o o d e dw i t hap h o t o p r o t e c t e dd n ab a s e ( a _ x ) ，r e s u l t i n gi n s p a t i a l l yd e f i n e dc o u p l i n go nt h ec h i p s u r f a c e as e c o n dp h o t o m a s k ( m 2 ) i su s e dt od e p r o t e c td e f i n e dr e g i o n so ft h ew a f e rr e p e a t c d d e p r o t e c t i o na n dc o u p l i n gc y c l e se n a b l et h ep r e p a r a t i o no f h i g h - d e n s i l yo l i g o n u c l e o t i d em i c r o a r r a y s 与光导原位合成法的思路相反，m s c h e n a 等人发明了芯片外合成后机械点样法1 6 - 9 。首先在 芯片外液相合成探针分子，然后用高速阵列仪机械点样，形成微阵列，该方法很实用，虽然产生 的分子阵列密度没有光导原位合成法高，但它不仅可以同定小片段核酸，还可以固定基因片段、 c d n a 甚至蛋白质等，而且是一种开放的方法。机械点样的方式有接触式打印法【6 。7 t ”和1 f 接触式 喷印法【6 ”，i ”，前者用针头在样品液中蘸一下，再移到固相支持物上并与之接触后直接被吸附利 同定，用实心针头，每蘸一次样品液点一点，而采用空心针头或翎管式针头可人大提高效率。非 接触式喷印法则是在吸入一定量的样品后，在同相支持物上方，通过热喷印、压电晶体喷印及注 射泵推进喷印等方法“喷”到固相支持物表面并被固定，它的优点是可自行设计分配体积，不与 固相支持物表面接触，对精细表面无损伤，分配机制与固相支持物表面性质无关等。机械点样法 的原理图如f i g 1 3 所示： 等 第一章绪论 b t o u c h m e v e 删。 霹 三节三 ， ， ，0 0 q o 0j 一 ，0 0 0o o ， r e p e a t， ， 十一 ，口o oo o ， ，o o d o 口t ， ， ，oo od d ， m i c r o a r r a y ， ， ，d o o o 0 ，0 0 0 0 0 ， r e p e a t j ， 一 - - - - ! - t o o o 口o ， ，o o o o o ， ， ， ，o0 o0 o m i c r o a r r a s f i g13 ( a ) m e c h a n i c a lm i c r o s p o t t i n g ：ab i o c h e m i c a ls a m p l ei sl o a d e di n t oas p o t t i n gp i nb yc a p i l l a r ya c t i o n ，a n d as i n a i lv o l u m ei st r a n s f e r r e dt oas o l i ds u r f a c eb yp h y s i c a lc o n t a c tb e t w e e nt h ep i na n dt h es o l i ds u b s t r a t e a f t e rt h ef ij s ts p o t t i n gc y c l e t h ep i ni sw a s h e da n das e c o n ds a m p l ei sl e n d e da n dd e p o s i t e dt oa na d i a c e n t a d d r e s sr o b o t i ec e n t r e 】s y s t e m sa n dm u l t i p l e x e dp r i n t h e a d sa l l o wa u t o m a t e dm i c r o a r r a yf a b r i c a f i o n ( b ) i n kj e t t i n g ：ab i o c h e m i c a ls a m p l ei sl o a d e di n t oam i n i a t u r en o z z l ee q u i p p ! dw i t hap i e z o e l e c t r i c f i t t i n g ( r e c t a n gc s ) a n da ne l e c t f i c a lc u r r e n ti su s e dt oe x p e lap r e c i s ea m o u n to fl i q u i df r o mt h ei e to n t o t h es u b s t r a t e a t i e rt h ef i r s t e t t i n gs t e p t h ei e ti 8w a s h e da n das e c o n ds a m p l ei sl o a d e da n dd e p o s i t e d 协 a na d j a c e n ta d d r e s s ar e p e a t e ds e r i e so f c y c l e sw i t hm u l t i p l ei e t se n a b l e sr a p i dm i c r o a r r a yp r o d u c t i o n 0 r e 岛r e n c e c o l l h - 0 d n a w i t h c y 3 t a g s 避峰卧套 r n a 一 ，避目+ 强 1 1 1 d n a w l t h c y 5 t a g s 目 ，_ 肆蠢 。， 争。 熬羔罗 c d n a f l u o r e s c e 眦 a n a g e s f i g 1 4t h ee x p e r i m e n t a ls t e p so fm i c r o a r r a y a tf i r s t , t h er n ai se x t r a c t e df r o mt h ec e l l s ，a f t e ras e r i e so f e h e m i c a 】r e a c t i o n s ，d n ac o p i e so ft h er n aa r ec o n s t r u c t e da n dt a g g e dw i t hd i f i e r e n tf l u o r e s c e n td y e s t h e n ，t h et a g g e dd n ai sw a s h e do v e ram i c r o a r r a yt h a th a ss i n g l e - s t r a n d e de d n af i x e dt oi t ss u r f a c ei n k n o w nl o c a t i o n st h i sd n ar e p r e s e n t si m p o r t a n tg e n e so rp a r t s & g e n e s i f ag o n eh a sb e e ne x p r e s s e di n ac e l l j t w i l lb i n dt oac o p yo fi t s e l fo nt h em i c r o a r r a y ；t h u s ew i t hn oc o m p l e m e n t a r ys i t eo nt h e m i c r o a r r a yw i l lw a s ho l ea tl a s t ，al i g h ts o u r c es c a n st h em i c r o a r r a y , c a u s i n gt h ed y c st of l u o r e s c e ，t h e g l o wi sp i c k e du pb yas g n s o r , a n dac o m p u t e ri n t e r p r e t st h ep a t t e r no fs p o t s ，i n d i c a t i n gf o re a c hc e l l w h i c hg e n e sa r ca c t i v ea n dt h er e l a t i v ea b u n d a n c eo f t h er n a 生物芯片是采州分子杂交原理进行j 二作的。其基本过程如下：首先从待测细胞和参考细胞 中提取出相应的r n a 信息，经过一系列生物化学过程后，r n a 被转录为d n a 并标记上不同的 4 n v n 业 9 圈日譬一 量 当-l咿， 1：!：；量一 雀案鼓叫造数篙耋劫一 鼍，一 燕曩畦 圳愀 浙江大学博士学位论文 荧光染料( 目前大多数为c y 3 和c y 5 ) ，标记过的d n a 与已知结构的生物芯片进行杂交反应，若 生物芯片上有此基因的互补基因，该基因就会与之结合，固定在生物芯片上，否则该基因在洗脱 过程中被清洗掉。最后，经过杂交反应的生物芯片在烘干后，用生物芯片荧光分析仪扫描得到相 应的荧光图像，荧光的强度间接地描述了杂交反应的程度。f i g 1 4 完整的表示了此过程。 广义的生物芯片除了上述的微阵列生物芯片外，还包括另外一类芯片一一微流控芯片 ( m i c r o f l u i d i c s ) ，也称为微全分析系统( m i c r o - t o t a la n a l y s i ss y s t e m ，“一t a s ) ，或者芯片实验室( l a b o na c h i p ) 。它是利用光刻微加工技术在玻璃或者石英基质的表面加工出一条条微型的液体通路， 从而将传统实验室中的样品处理、热反应器、屯泳分离、p c r 等过程集成在一个芯片上完成i l 7 - 2 1 o 微流路芯片的初衷是利用其毛细管及电渗流米做毛细管电泳分析，但微通道的优异性能使其鹿刖 得到了j 。l 泛扩展。1 9 9 8 年，m a b u m s 等将样品处理、热反应器、电泳分离、荧光检测、r 导体 芯片、加热清洗等姨置集成到一块芯片上【2 ，引起了j “大科学家的重视。2 0 0 2 年，丁t h o r s e n 等 研制成功了一种微流控大规模集成芯片口，将上千个阀和几百个反应器集成到一个芯片上，实现 了真正意义上的微流控芯片。 f i g15 ( t o p ) s c h e m a t i co fi n t e g r a t e dd e v i c ew i t ht w ol i q u i ds a m p l e sa n de l e c t r o p h o r e s i sg e lp r e s e n t t h e o n l y e l e c t r o n i cc o m p o n e n tn o tf a b r i c a t e do nt h es i l i c o ns u b s t r a t e e x c e p tf o rc o n t r o ia n dd a t a - p r o c e s s i n g e l e c t r o n i c s ，j sa ne x c i t m i o n1 i 巾ts o u r c ep l a c e da b o v et h ee l e c t r o p h o r e s i sc h a n n e l ( b o s o m ) o p t i c a l m i c r o g r a p ho f t h ed e v i c e , f r o ma b o v ew i r eb o n d st ot h ep r i n t e dc i r c u i tb o a r dc anb es e e na l o n gt h et o pe d g e o f t h ed e v i c et h eb l u et i n ti sd u et ot h ei n t e f f e r e n c ef i l t e rr e f l e c t i n gt h es h o r 卜w a v e i e n g l hl i g h t t h ep r e s s u r e m a n i f o i da n db u f f e rw e l l st h a tf i to v e rt h ee n t r yh o l e sa te a c he n do f t h ed e v i c ea r en o ts h o w n 微流控芯片的主要部件包括：与进样及样品处理有关的透析、膜、固相萃取、净化：用于流 第一章绪论 体控制的微阀( 包括主动阀和被动阀) 、微泵( 包括机械泵和非机械泵) ：微混合器、微反应器、 微通道和微检测器等。f i g 1 5 为一个较为完整的微流控芯片口“，为三层结构，底层为p c 板，中 间层为硅片，上层为玻璃片。该芯片集成了微流控通道、加样部件、热反应器、温度探测器、屯 极、电泳通道、荧光探测器等，可进行纳升级的d n a 分析。整个系统除了激发光源、压力源和 控制部分外其他部分都通过光刻技术加工在硅片和玻璃片上。整个芯片长为4 7 m m ，宽为5 r a m ， 高为l m m 。随着微机电系统( m e m s ) 技术、x 光深层刻蚀( l i g a ) 技术和纳米技术的引入承l 应用，微流控芯片的集成化程度也越米越高，它将与微阵列生物芯片共同形成生物芯片的发展趋 势。 生物芯片技术虽然尚在幼年阶段，但已展示山它潜在的广阔应用前景。在基础研究领域，生 物芯片主要应用于新基因发现f 2 4 - 2 7 、基因表达谱分析 2 8 - 3 2 】、基冈突变 3 3 - 3 6 i 及多态性分析 3 7 - 4 0 l 等， 在揭开生命之谜的历程中发挥了重要作用。在医药研究领域1 4 1 4 “，生物j 出片用丁药物筛选平弱物 毒副作川的发现币i 验证，大大降低了药物设计的成本，缩短了新药开发的周期，