（应用化学专业论文）水溶性四氮唑盐类生物细胞活力检测剂的合成和性质研究.pdf

摘要 摘要 四氮唑盐类化合物是目前在生物化学及细胞生物学方面应用很广泛的生物染色剂。但目前应用的四氮 唑盐类化合物大都是非水溶性的，这在很大程度上限制其应用范围和检测灵敏度，因此近年对水溶性四氮 唑盐的研究越来越多，水溶性四氮唑盐不仅本身水溶性很好，其还原态有色中间体甲膜，在水中也有很好 的溶解度，而且四氮唑盐本身及其还原态甲膜均无毒，可以直接进行生物体的活体分析。因此设计合成高 水溶性四氮唑盐是当前对该类化合物研究的主要方向，而且在提高检测效率和灵敏度等方面具有非常重要 的意义。 本论文设计合成六个含有水溶性基团的水溶性四氮唑盐类化合物，这六个化合物是：2 ( 2 甲氧基4 硝基苯基) 3 ( 对硝基苯基) 5 ( 2 ，4 二磺酸苯基) - 2 h 四氮唑单钠盐( i ) 、2 ( 对碘苯基) 3 ( 对硝基 苯基) 5 ( 2 ，4 二磺酸苯基) - 2 h 四氮唑单钠盐( i i ) 、2 ( 对甲苯基) - 3 ( 对硝基苯基) 5 ( 2 ，4 二磺酸 苯基) 2 h 四氮唑单钠内盐( 1 i d 、2 ，3 双( 2 磺酸基- 4 甲基苯基) 5 腈基- 2 h 四氮唑单钠内盐( ) 、2 ，3 一双( 对 甲基苯基) - 5 - 羧基一2 h 一四氮唑内盐( v ) 、2 ，3 一双( 对碘苯基) - 5 - 羧基一2 h - 四氮唑内盐( v i ) ，其中化合物i i i 、 i v 、v 、为新化合物，化合物i 、i i 为文献报道的物质，我们对其工艺进行改进，并且首次采用氯气作 为氧化剂，简化操作，提高了总收率，均在2 0 以上。化合物i 、i i 、i i i 是采用了由醛和肼制备腙，腙再 和重氮盐反应生成中间体甲膜，然后氧化成四氮唑盐等四步合成路线制得，化合物i v 、v 、采用了由重 氮盐和含活性亚甲基的化合物反应生成中间体甲膜，然后氧化成四氮唑盐，再腈基水解等四步合成路线制 得，并对它们的合成进行了工艺研究，为该类化合物的工业生产打下基础。 此外，还通过紫外和电化学分析对其与生物医学领域应用相关的紫外吸收和氧化还原电势进一步讨论 研究，结果表明这些化合物在细胞活力检测等方面有潜在的应用价值。 关键词：四氮唑盐，合成，水溶性，细胞活力，电化学分析 a b s t r a c t a b s t r a c t t h et e t r a z o l i u ms a l t sa r e w i d e l yu s e d a s c h r o m o g e n i c i n d i c a t o r si n b i o c h e m i s t r y a n dc e l l b i o l o g y h o w e v e r , m o s tf o r m a z a nd y e sa r ei n s o l u b l ei nw a t e rw h i c hl i m i t sf u r t h e ra p p l i c a t i o n sa n ds e n s i t i v i t y r e c e n t l y , m o r ea n dm o r ep e o p l er e s e a r c hi nan o v e lt e t r a z o l i u ms a l tw h i c hp r o d u c e sah i g h l yw a t e rs o l u b l e f o r m a z a nd y ea n dw i t hn ot o x i ct h a tp r o v e dt ob ee x t r e m e l yu s e f u la sac e l l - v i a b i l i t yi n d i c a t o ri nc o l o r i m e t r i c q u a n t i t a t i v ea n a l y s i sf o rt e s t i n gc e l lp r o l i f e r a t i o n c y t o t o x i n n o wd e s i g na n ds y n t h e s i so fn e ww a t e r - s o l u b l e t e t r a z o l i u ms a l t si so n eo fm o s ti m p o r t a n td i r e c t i o ni ns t u d y i n gt h i sc o m p o u n dw h i c hi sg r e a tm e a n i n gi n e n h a n c i n gs e n s i t i v i t ya n de f f i c i e n c yo f t e s t i n g d e s i g n i n ga n ds y n t h e s i so fs i xw a t e r - s o l u b l et e t r a z o l i u ms a l t sw h i c hh a v ew a t e r - s o l u b l ef u n c t i o n a lg r o u p i n c l u d e s2 - ( 2 一m e t h o x y - 4 - n i t r o p h e n y i ) 一3 - ( 4 一n i t r o p h e n y l ) - 2 h - 5 - t e t r a z o l i u m - 2 ，4 - b e n z e n ed i s u l f o n a t em o n o s o d i u m i n n e rs a l t ( i ) 、2 彤- i o d o p h e n y l ) 3 - ( 4 - n i t r o p h e n y l ) 2 h5t e t r a z o l i u m 一2 ，4 - b e n z e n ed i s u l f o n a t em o n o s o d i u mi n n e r s a l t ( i i ) 、2 冰- m e t h p h e n y l ) - 3 - ( 4 - n i t r o p h e n y l ) - 2 h 一5 - t e t r a z o l i u m - 2 ，4 一b e n z e n ed i s u l f o n a t em o n o s o d i u mi n n e rs a l t ( h i ) 、2 , 3 b i s ( 2 s u l f o n a t e - 4 - m e t h p h e n y l ) - 5 一c y a n 一2 h - t e t r a z o l i u mm o n o s o d i u mi n n e rs a l t ( i v ) 、2 , 3 - b i s ( 4 m e t h - p h e n y l ) 5 一c a r b o x y l 一2 h - t e t r a z o l i u mi n n e rs a l t ( v ) 、2 , 3 一b i s ( 4 一i o d o p h e n y l ) 一5 - c a r b o x y l - 2 h t e t r a z o l i u mi n n e r s a l t ( v i ) c o m p o u n d si i i 、i v 、v 、v ia r en e w w h i l ec o m p o u n di 、i ia r er e p o r t e db yl i t e r a t u r e w eh a v es t u d i e d i nu p s w i n gt h e i rt e c h n i c sa n do x i d i z e dt h e mw i t hc h l o r i n ef o rt h ef i r s tt i m ew h i c hr e s u l t e di n s i m p l i f y i n g m a n i p u l a t ea n di m p r o v i n gy i e l d ，a m o u n tt o2 0 o ra b o v e t h es y n t h e s i sr o u t ec o m p o u n d si 、i i 、i i ii sr e a c t i o no f a l d e h y d ea n dh y d r a z i n ep r e p a r a t e dh y d r a z o n e ，f o l l o w e db yr e a c t i n gw i t hd i a z o l i u ms a l ty i e l df o r m a z a n , a tl a s t f o r m a z a nw a so x i d i z e dt og a i nt e t r a z o l i u ms a l ta n dt h es y n t h e s i sr o u t eo f c o m p o u n d si v 、v 、v ii st h a td i a z o l i u m s a l tr e a c t e dw i t ha c t i v em e t h y l e n et og a i nf o r m a z a nf o l l o w e db y o x i d i z i n gt ot e t r a z o l i u ms a l t s w ea l s or e s e a r c hi n t h e i rt e c h n i c so fs y n t h e s i s i nt h i sp a p e rw eh a v es t u d i e df u r t h e ri np r o p e r t i e so ft h e s ec o m p o u n d sw h i c hr e l a t e dt oa p p l i c a t i o ni n b i o m e d i c i n ew i t hu va n de l e c t r o c h e m i s t r ya n a l y s i s ，t e s t i n gt h e i ra b s o r b a n c ea n dr e d o x - v o l t a g e t h er e s u l t ss h o w t h a tt h e s en e wc o m p o u n d sh a v ep o t e n t i a lv a l u ei ni n s p e c t i n gc e l lv i a b i l i t y k e yw o r d s ：t e t r a z o l i u ms a l t , s y n t h e s i s ，w a t e r - s o l u b i l i t y , c e l l - v i a b i l i t y , e l e c t r o c h e m i s t r ya n a l y s i s i i 东南大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过 的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：碰剐 日 东南大学学位论文使用授权声明 东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文的复印 件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质 论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括 刊登) 论文的全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权东南大学研究生院办理。 研究生签名：盔2 型导师签名：之2l j ：差日期：h 时墨，和乙 东南大学硕士学位论文 第一章绪论 四氮唑盐类化合物( t e t r a z o l i u ms a l t s ) 在1 8 9 4 年就已被发现，但其广泛的研究开始于1 9 4 1 年，此时， k u h n 和h e r c h e l 发现它们具有抗菌活性并能使细菌的特定部位染色【1 ，2 1 。从此大量的四氮唑盐被合成出来 并被用于各方面的研究，尤其是生物化学方面的应用研究。 1 1 选题背景 四氮唑盐类可用下图的结构通式来表示： 一中 四氮唑盐的氧化还原过程如下图所示，其能广泛应用于生物化学、组织化学及临床诊断等方面研究的 主要原因有三：四氮唑盐化合物本身是无色或是浅色物质，且其在紫外区有吸收，而其还原态甲膜 ( f o r m a z a n ) 类化合物却是深色物质，其在可见光区有吸收，这是它可以作为着色剂，通过比色法进行检 测的主要原因；四氮唑盐的氧化还原电势与生物系统中的氧化还原势值重叠，因此在细胞脱氢酶等生物 系统催化还原下可以生成深色中间体甲腹( f o r m a z a n ) 类化合物；大多数四氮唑盐及其f o r m a z a n 都无毒， 所以四氮唑盐类化合物可以作为生物细胞活力检测剂【l t3 1 。 r 2 r n n k + 一导 氧化态还原态 作为在生物化学、组织化学及临床诊断上的应用，其发展可划分为两个阶段。第一阶段为八十年代前， 早在五、六十年代就已开始应用，这个阶段的四氮唑盐上均不含水溶性基团，但由于四氮唑盐是一种季铵 盐，其在水中仍有一定的溶解度，而其还原态甲膜( f o r m a z a n ) 均为水不溶性化合物，可作为有色物沉积 在还原它的组织上，从而便于显微镜观察，因而作为细胞着色剂在临床上广泛用于脱氢酶的定位及定性， 而如果要定量分析则必须用有机溶剂将其溶解提取后再比色测定，这样不仅工作量增加而且会破坏细胞， 第一苹绪论 对定量分析的准确度和重现性产生影响【2 】。 第二个阶段是水溶性四氮唑盐的合成研究，鉴于上述非水溶性四氮唑盐在应用上的不便，近年来合成 的四氮唑盐，分子中含有水溶性基团，如磺酸基团，羧基等。这样不但四氮唑盐本身水溶性很好，而且其 还原态有色甲膜( f o r m a z a n ) 在水中也有很好的溶解度，因此特别适用于活细胞定量分析，用于直接检测 细胞毒性，细胞增殖和抗肿瘤药敏实验等领域1 3 4 ，5 1 。 目前开发成功的四氮唑盐类生化试剂可用于各种脱氢酶、氧化还原酶的活性、细胞增殖突变及毒性、 蛋白质及核酸等的检测，特别在肿瘤发病率越来越高的情况下，寻找用于抗肿瘤药物筛选等临床领域的优 秀试剂得到高度关注，但目前国内仅限于其应用方面的研究，未见关于合成方面的报道，院校、研究单位 的科研及大医院用的该类诊断试剂全靠进口，因此，该系列产品价格相当昂贵，故研究这类化合物的合成 对于填补国内空白及增强我国自产这类医疗关键试剂在国际市场上的竞争力具有重大的意义。 1 2 非水溶性四氮唑盐的应用 1 2 1 过氧化物岐化酶( s o d ) s o d 能催化过氧化物阴离子发生岐化作用，生成过氧化氢和分子氧，是一种很重要的抗氧化酶。其活 性测定法有很多，其中3 ，3 - - - 甲氧基4 ，4 二苯撑3 ”，3 双( 2 对硝基苯基5 苯基氯化四氮唑) 由于 使用方便而被广泛用于定性测试【7 8 9 1 。 1 2 2 植物选种 种子生活力的生化测定：在短期内急需了解种子发芽率或当某些样品在发芽末期尚有较多的休眠种子 时，可应用生活力的生化法快速估测种子生活力n 0 u 1 。生活力测定是应用2 ，3 ，5 一三苯基氯化四氮唑盐无 色溶液作为一种指示剂，这种指示剂被种子活组织吸收后，接受活细胞脱氢酶中的氢，被还原成一种红色 的、稳定的、不会扩散的和不溶于水的三苯基f o r m a z a n 。据此，可依据胚和胚乳组织的染色反应来区别有 生活力和无生活力的种子。除完全染色的有生活力种子和完全不染色的无生活力种子外，部分染色种子有 无生活力，主要是根据胚和胚乳坏死组织的部位和面积大小来决定，染色颜色深浅可判别是健全的，还是 衰弱的或死亡的种子。 1 2 3 在脱氢酶中的应用 脱氢酶能从底物中将电子转移到氧化试剂或电子体上。四氮唑盐做为受氢体在反应中由脱氢酶将底物 氢原子转移到四氮唑盐而形成有色的f o r m a z a n 局部沉淀，显微镜下可判明该酶在细胞的定位。至于显示何 2 东南大学硕士学位论文 种脱氢酶则由所用底物而定【6 】，如用琥珀酸钠，f o n n a z a n 是琥珀酸脱氢酶作用下的产物，用乳酸钠或苹果 酸钠则是乳酸脱氢酶或苹果酸脱氢酶作用的结果。但有些脱氢酶需有辅酶i ( n a d + ) 或辅酶i i ( n a d p + ) 才能 发生作用，显示这种脱氢酶时须另加所需的辅酶，辅酶i 、辅酶i i 或黄素蛋白( f a d 或f m n ) 可作为氢接受 体，当n a d + 和n a d p + 接受脱氢酶释放的氢时，它们即成为还原n a d ( 且g n a d h ) 和还原n a d p ( 即n a d p h ) ， 其电子转移示意图为图1 - l ： 可用于检测乳酸脱氢酶的四氮唑盐如m t t ，3 ，3 一二甲氧基- 4 ，4 二苯撑3 ”，3 2 双( 2 对硝基苯基5 苯基氯化四氮唑) 【2 】，2 对碘苯基3 对硝基苯基5 苯基氯化四氮唑1 3 l ，检测琥珀酸脱氢酶活性的四氮唑盐 如n i t r ob t 4 1 ，t n b t | 5 1 ，检测葡萄糖- 6 磷酸酯脱氢酶活性的四氮唑盐如n i t r ob t 6 1 。 底物 厂圈 脱氢酶 产物 1 2 4 生物相容性研究 还原态甲膜 f o r m a z a n 四氮唑盐 ( 无色水溶性) 图1 1电子转移到四氮唑盐的图解 f a d ：黄素腺嘌呤核苷酸， f m n ： 黄素单核苷酸 f i g 1 1c h a r to fe l e c t o nt r a n s f e rt ot e t r a z o l i u ms a l t 目前对生物标记物的研究越来越深入，任何一种生物标记物都要具有较好的生物相容性，四氮唑盐可 以检测这些标记物的生物相容性，j e s u sm d el af u e n t e 掣亿1 3 1 在研究纳米粒子进入细胞作为细胞标记物时 采用m t t 来检测它们的生物相容性，m t t 还原以后的中间体甲膜的浓度与标记后活细胞的数量相关。 1 2 5 对青铜等贵重金属的缓蚀 巯基苯并四氮唑等一些杂环化合物对青铜具有优异的缓蚀作用，正日益引起人们的重视，在文物和青 铜制品的保护方面显示了四氮唑盐类化合物的另一个广阔的应用前景【1 4 1 。 3 第一章绪论 1 3 水溶性四氮唑盐的应用 1 3 1 糖化血清蛋白的测定 w s t - 3 可用比色法测定糖化血清蛋白1 5 】：在表面活性剂存在的条件下，以w s t - 3 为显色剂测定糖化 血清蛋白的含量。该法具有快速、简便、灵敏可靠等优点。适合临床应用；糖化血清蛋白的检测是临床常 规检验项目，国内大多采用文献介绍的硝基四氮唑蓝n b t 比色法进行测定( 简称n b t 法) 临床应用表明： 此法存在干扰因素多、测定体系水溶性差的缺点。而通过水溶性w s t - 3 的应用和测定体系的抗干扰能力考 察，提出了w s t - 3 比色法测定糖化血清蛋白并进行了方法学研究和文献法相比，测定试剂的水溶性和抗干 扰能力均显著提高。 1 3 2 抗癌化疗药物的敏感性测定 水溶性四氮唑盐类化合物还可对抗癌化疗药物的敏感性进行测定，例如：采用可溶性噻唑盐w s t - 8 检测细胞病变【1 6 i ，结果表明：w s t - 8 法适用于以微量细胞病变法为基础的溶细胞型病毒滴度检测及抗肿瘤 或抗病毒药物效果的检测。 用m t s 比色法测n k m 4 5 细胞株也可对抗癌化疗药物的敏感性进行测定【1 7 】：用m t s 比色法测定胃癌 卜t 订4 5 细胞株对临床常用的9 种抗癌药物的敏感性。结果表明：胃癌n k m - 4 5 细胞株对盖诺高度敏感； 对阿霉素、5 氟脲嘧啶、羟基喜树碱、丝裂霉素中度敏感；对足叶乙甙低度敏感；对顺铂、平阳霉素、甲 氨喋呤不敏感。所以m t s 比色法是一种新型的四氦唑盐类化合物，在肿瘤药敏试验上有广阔的应用前景。 1 3 3 细胞的生长与活性状态的测定 细胞的生长与活性状态测定也离不开水溶性四氮唑盐【1 8 9 1 ，如：利用3 种不同来源的成纤维细胞( 大 鼠肾上皮细胞，人胎肺成纤维细胞，人成纤维细胞) 的活细胞线粒体脱氢酶在电子偶联剂硫酸酚嗪甲酯 ( p h e n a z i n e m e t h o s u l f a t e ，p m s ) 的协同作用下，还原四氮唑盐复合物( x t d 形成可溶性的棕黄色甲膜( f o r m a z a n ) 产物，测定细胞甲膜的生成量来反映细胞的生长与活性状态，并与传统的四甲基偶氮唑盐( m t t ) 方法作比 较。结果表明，x t t 方法直接测定水溶性的甲膜产物，敏感度高于m t t 法，具有操作简单、快速、灵敏 度高、结果准确的优点，为成纤维细胞的研究建立了新的检测方法。 1 3 4 关键试剂毒性分析 应用在生物体的关键试剂的毒性研究是一个很重要的方面，水溶性四氮唑盐可以辅助应用在该类试剂 毒性检测上，如：c h i a - h a os u 等a t 2 0 1 在研究a u 3 c u l 纳米壳磁性共振成像对比试剂时，就用w s t - l 作为辅 4 东南大学硕士学位论文 助试剂检测它对细胞的毒性，在细胞酶催化还原生成中间体甲膜的浓度与代谢中的活性细胞的数量相关， 可以计算出细胞存活率，实验中测试不同剂量a u 3 c u l 试剂的对细胞存活率的影响，从而可以检测出 a u 3 c u l 对细胞的毒性。 1 3 5 市场需求及部分常见的四氮唑盐 目前随着四氮唑盐类化合物在生物医学领域辅助应用的广泛发展，尤其是国外近年来合成研究的水溶 性四氮唑盐的应用更扩大了该类化合物的应用领域：包括定量或定性的检测分析各种脱氢酶、氧化还原酶 的活性，细胞增殖突变及毒性，蛋白质及核酸等，但目前国内仅限于其应用方面的研究，未见关于合成方 面的报道，院校、研究单位的科研及大医院用的该类诊断试剂全靠进口，因此，该系列产品价格相当昂贵， 故研究这类化合物的合成对于填补国内空白及增强我国自产这类医疗关键试剂在国际市场上的竞争力具 有重大的意义。 近年来研究合成并已经商品化的几种主要非水溶性四氮唑盐如表1 1 和水溶性四氮唑盐如表1 2 所示： 5 第一章绪论 表1 1 非水溶性四氮唑盐 m l b 1 1n ow a t e r - s o l u b l et e t r a z o l i u ms a l t s 英文名称 结构 3 一( 4 ，5 一d i m e t h y l - 2 一t h i a z o l y l ) 一2 ，5 - d i p h e n y l - 2 h - t e t r a z o l i u mb r o m i d e 2 - ( 4 i o d o p h e n y l ) 3 - ( 4 - n i t r o p h e n y l ) - 5 - p h e n y l - 2 h - t e t r a z o l i u mc h l o r i d e 2 , 5 - d i p h e n y l 一3 ( 1 n a p h t h y l ) - 2 h - t e t r a z o l i u mc h l o r i d e 3 , 3 - d i m e t h o x y - 4 ，4 - d i p h e n y l e n e - 3 ”，3 ” 一b i s ( 2 一( 4 一n i t r o p h e n y l ) - 5 一p h e n y l t e t r a z o l i u mc h l o r i d e ) 3 , 3 - d i m e t h o x y - 4 ，4 - d i p h e n y l e n e 一3 ”，3 ” 一一b i s ( 2 ，5 - d i p h e n y l t e t r a z o l i u m c h l o r i d e ) 4 ，4 - d i p h e n y l e n e 一3 ”，3 - b i s ( 2 ，5 d i p h e n y 1t e t r a z o l i u mc h l o r i d e ) c r 2 c l - 2 c 1 2 c 1 6 东南大学硕士学位论文 表1 2 水溶性四氮唑盐 t a b 1 2w a t e r - s o l u b l et e t r a z o l i u ms a l t s 英文名称化学结构式 2 - ( 4 - i o d o p h e n y l ) - 3 - ( 2 , 4 - 0 2 n d i n i t r o p h e n y l 5 ( 2 4 b e n z e n e d i s u l f o n a t e s o d i u m ) 2 h - t e t r a z o l i u m ，m o n o s o d i u ms a l t 2 - ( 4 - n i t r o p h e n y l ) 5 一( 2 一s u l f o p h e n y l ) 一 3 一【4 - ( 4 - s u l f o p h e n y l a z o ) 一2 一s u l f o p h e n y l 】2 h - t e t r a z o l i u m ，d i s o d i u ms a l t k s u l f o e t | l y l ) c a r b 踟o y l p h e n y l 】- 3 ，3 - ( 3 ， l 3 一d i m e t h o x y 一4 ，4 - b i p h e n y l e n e ) d i t e t r a l z o l i 岫，d i s o d i u ms a l t l 2 - ( 4 - n i t r o p h e n y l ) - 5 p h e n y l - 3 一【4 一( 4 一s u l f o p h e n y l a z o ) 2 - s u l f o p h e n y l - 2 h - t e t r a z o l i u m ，m o n o s o d i u ms a l t 0 2 n 心 q 喇 s 0 3 s 0 2 n a l2 n a + j = n s 0 3 。 n b s 0 3 j l n a + j 2 1 妇 7 第一章绪论 表1 2 ( 续) t a b 1 2 l a t e r - s o l u b l et e t r a z o l i u ms a l t s 英文名称化学结构式 0 一f 2 , 5 一d i - ( 4 - n i t r o p h e n y l ) - 3 一【4 一( 4 一s u l f o p s 。s n a + h e n y l a z o ) - 2 - s u l f o p h e n y l - 2 h - t e t r a z o l i u m ，m o n o s o d i u ms a l t 协p n 酬 2 , 3 b i s ( 2 - m e t h o x y - 4 - n i t r o 5 - s u l f o p h e螬n 滩o q c 。 n a + n y l ) - - 5 - ( p h e n y l a m i n o ) c a r b o n y l - 2 h - t 。o c 如一 e t r a z o l i u mh y d r o x i d e 1 4 合成文献综述 1 4 i 中间体甲腹的制备方法【1 i 妊- n n 弋j n _ n1 汀u d 葑一f r 0 0 h + b d 乳n 望r 即- - 一基- - c h 2 地+ 占n 一渣l 叫5 8 东南大学硕士学位论文 占+ 。h d 怍n 龟。h d 卅hkb + 一d 怍n 乇。h d 卅k ( 卜衬一n 一七旦二 一n ：n 一x 、= = = ， 一 c o o h c o o h n 三n _ 伊x 峋 1 4 1 1 3 重氮盐与脂肪族含氮化合物反应 重氮盐可以和有可取代基团的脂肪族含氮化合物缩合。这一反应和上述方法基本是相同的，但是，有 些脂肪族含氮化合物可以再和一个重氮盐反应。这样脂肪族化合物上就可以连上两个不同的芳香基。以苯 偶氮乙酰醋酸酯与重氮盐反应为例，其反应式如下： ， 曰 p c h 3 n - c - - c - - o - c 2 h 5 h + o + h n 一r n = n 0 1 4 1 2 由芳香肼反应 苯肼可和多种化合物反应生成f o r m a z a n 。这个反应需要两分子苯肼，一分子形成苯腙，还有一分子形 成叠氮基，然后被氧化为偶氮基。 1 4 121 苯肼与甲酸乙酯反应 甲酸乙酯盼1 6 】和苯肼反应生成1 ，5 一= 苯基f o r m a z a n ，反应式 n h n h ，n h n h c h o o+ h c o o c 2 h 5 一o d n 哪 n 弘h n h - - o 庐 n h n h ： 1 4 1 2 2 苯肼和亚氨基醚反应 亚氨基醚和苯肼蒯2 f o r m a z a n t 2 1 1 。但是有些反应有很多副产物产生，这与所使用的亚氨基醚有关， 例如，当使f f j p h e n y la e e t i m i d a t e 和肼反应时，很容易产生对应的f o r m a z a n ，而用p h e n y l2 - p h e n y l a e e t i m i d a t e 9 一 n 三 + n r o 举州 今 第一章绪论 和肼反应则生成f o r m a z a n 和相关的氨基腙，如： o 一2 俨2 + + h 3 一 p h e n y la c e t i m i d a t e p h e n y l2 - p h e n y l a c e t i m i d a t e 1 4 1 2 3 苯肼和卤化叠氮物反应 口9 h n n c n h n h b f o r m a z a n h 2 co 6 砖帕 严r 9 2 o 妇2 苯肼和卤化叠氮物反应生成f o n n a z a n 【2 2 1 ，这个反应应该有着广泛的应用前景，但是文献仅有两个反应 报道过，一个r i = r 2 = r 3 = 苯基，另一个r 1 = r 2 = 苯基，r 3 = 2 ，4 二溴苯基。 h h o s c iliip c ih 气 i r 2 一n n c - r 1 二r 2 _ n n 2 ( 、一r l h n r i j hn i h r 2 一n n 2 c r l 1 4 124 苯肼和二氯乙酰苯胺反应 r 3 一n h n h 2 二氯乙酰苯胺和苯肼混合加热生成l ，5 一二苯基f o m a z a n 反应】如： h 萨n - cc 1 2 + 矿一簪一帕 d n ： 6 一+ 子帅 1 4 1 2 5 苯肼和三氯甲苯反应 苯肼和三氯甲苯在乙醇中加热反应生成三苯基f o r m a z a n ，并且有很高的产率，如： l o 鹏 内r _ nh 附p 东南大学硕士学位论文 c 1 3 n h n h 2 o + 0一 子m + h 2 n - 慰乒- n h 2 n 一萏怍 咐 a +一a h v n k 萨村一葑。骨6 嘏一葑。 o 两u r 蝎n n m 一萨一帕 0“5 h 1 n 0 2 一a 一 1 4 2 从f o r m a z a n 氧化制备四氮唑盐 常用的氧化剂有：四醋酸铅或亚硝酸异戊酯、次氯酸叔丁酯、n b s l 2 2 - 2 5 f2 6 】等，这几种方法经证明都 l l o n i v c q 扩 。 腓舀 第一章绪论 可以得到产品，但产品的收率差别较大，得到的产品中因存在结晶溶剂，熔点差别也较大。在我们的研究 中用氯气作为氧化剂氧化f o r m a z a n 制备四氮唑盐，取得了很好的效果【2 7 1 。 综上所述，在众多的合成方法中，主要的合成方法为：由重氮盐和含活性亚甲基或次甲基的化合物反 应生成f o r m a t _ ，舳，然后在氯化氢存在下氧化成四氮唑盐。或者由重氮盐和芳香腙反应生成f o r m a t _ 狮，然后 再氧化成四氮唑盐。 目前国内还没有这类物质的生产，院校、研究单位的科研及大医院用的该类诊断试剂全靠进口，因此 研究这类化合物的合成对于填补国内空白及增强我国自产这类医疗关键试剂在国际市场上的竞争力具有 重大的意义。 1 5 本论文的主要内容 本课题的主要内容是研究六个水溶性四氮唑盐类生物细胞活力染色剂的合成方法，见表1 3 ，并对其进 行工艺优化；结合紫外和电化学测试结果对其与生物医学领域应用相关的性质进行讨论，为其在细胞活力 检测领域的应用提供重要依据。根据结构特点本课题研究合成的水溶性四氮唑盐类化合物采用两条不同的 合成路线：第一条是5 ( 2 ，4 二磺酸苯基) 水溶性四氮唑盐，其合成方法是由芳胺类化合物的重氮盐和芳 香腙反应生成中间体甲膜，然后再氧化成四氮唑盐；第二条是5 腈基水溶性四氮唑盐及其衍生物，其合成 方法是芳胺类化合物的重氮盐和含活性亚甲基的腈基乙酸反应生成中间体甲膳，然后再氧化成四氮唑盐， 部分还要水解。 表1 3 本论文合成研究的水溶性四氮唑盐 t a b 1 3s y n t h e s i so fw a t e r - s o l u b l et e r t r a z o l i u ms a l t si nt h i sp a p e l 英文名称结构 2 一( 2 一m e t h o x y 一4 - n i t r o p h e n y l ) - 3 - ( 4 一n i t r o p h e n y l ) - 2 h - 5 - t e t r a z o l i u m - 2 ，4 - b e n z e n e d i s u l f o n a t em o n o s o d i u mi n n e rs a l t 2 - ( 4 一i o d o p h e n y l ) - 3 一( 4 n i t r o p h e n y l ) 一2 h - 5 - t e t r a z o l i u m - 2 ，4 - b e n z e n ed i s u l f o n a t e m o n o s o d i u mi n n e rs a l t n a o a n a o a n 0 2 n 0 2 1 2 口n 一 一f 忏 东南大学硕士学位论文 表1 3 ( 续) t a b 1 3s y n t h e s i so fw a t e r - s o l u b l et e r t r a z o l i u ms a l t si nt h i sp a p e r 英文名称 结构 2 一( 4 一m e t h p h e n y l ) - 3 - ( 4 一n i t r o p h e n y l ) 一2 h 5 - t e t r a z o l i u m 一2 ，4 一b e n z e n ed i s u l f o n a t e m o n o s o d i u mi n n e rs a l t n 2 ，3 - b i 8 ( 4 - m e 峥铋y 眵c 烹x y l - 2 h - o o c t e t r a z o l i u mi n n e rs a i t 2 , 3 一b i s ( 4 一i o d o p h e n y l ) - 5 e a r b o x y l - 2 h - t e t r a z o l i u mi n n e rs a l t 2 3 一b i s ( 2 - s u l f o n a t e - 4 一m e t h p h e n y l ) - 5 - c y a n - 2 h t e t r a z o l i u mm o n o s o d i u mi n n e r s a l t n 0 2 一一 n a 0 3 s = o a s - 1 3 r 萨 第二章5 ( 2 ，4 二磺酸苯基) 水溶性四氮唑盐的合成和结构表征 第二章5 ( 2 ，4 二磺酸苯基) 水 溶性四氮唑盐的合成和结构表征 本章合成的5 - ( 2 ，4 二磺酸基苯基) 四氮唑盐是由于5 位上引入水溶性基团磺酸基而大大增大其水溶性， 2 ，3 位是不同取代基的一类四氮唑盐，结构式如图2 - 1 。 n a o n a 0 3 s n 0 2 r 2 1 ：r l = o c h 3 , r 2 = n 0 2 ；2 ：r l - - h ，r 2 - i ；3 ：r 1 2 h ，r e 2 c h 3 图2 - 15 ( 2 ，4 二磺酸基苯基) 水溶性四氮唑盐 f i g 2 - l5 一( 2 ，4 - d i s u l f o n i c p h e n y l ) - w a t e r - s o l u b l et e t r a z o l i u ms a l t s 2 1 主要药品与仪器 对甲苯胺乙醇甲醇盐酸分析纯上海凌峰化学试剂有限公司 n a o h对碘苯胺分析纯国药集团化学试剂有限公司 亚硝酸钠分析纯上海振兴试剂厂 邻甲氧基对硝基苯胺 工业品上海沃尔化工有限公司 2 ，4 二磺酸苯甲醛工业品温州龙胜化工有限公司 对硝基苯肼 工业品上海常必鑫贸易公司 机械搅拌器、磁力搅拌器、旋转蒸发仪、真空循环水泵、上海2 k 0 8 2 a 型真空干燥箱： v a r i a n1 n o v a - 4 0 0 型核磁共振仪( d 2 0 为溶剂，t m s 为内标) ； i r - 4 3 5 型红外光谱仪( k b r 压片) ； w r s 1a 型显微熔点测定仪。 1 4 东南大学硕士学位论文 2 2 合成路线 n a c h o 9 8 0 3 n 三p 洲洲2 一n n a 0 3 s n a n a 0 3 s r 1 ；j o ( 1 ) n a 0 3 s 一村。慨三 n n r 2 r 1 n 0 2 ( 4 ) r 2 l ：r l = o c h 3 ，r 2 - - n 0 2 ；2 ：r l = h ，r 2 = i ；3 ：r 1 = h , r 2 2 c h 3 图2 2 合成路线 f i g 2 - 2c h a r to fs y n t h e s i sr o u t e 2 32 ( 对甲苯基) 3 ( 对硝基苯基) 5 ( 2 ，4 二磺酸苯基) 。2 h 四氮唑单钠 内盐的合成和结构表征 2 ( 对甲苯基) 3 ( 对硝基苯基) 5 ( 2 ，4 二磺酸基苯基) 2 h 四氮唑单钠内盐是一个新结构的四氮 唑盐，是在文献【7 2 6 】报道的水溶性四氮唑盐的启发下设计合成出来，具有较好的水溶性，在生物医学领域 有潜在的应用价值。 2 3 1 苯甲醛2 ，4 二磺酸钠对硝基苯腙的合成i 硐 在三口瓶中加入1 0 0g ( 0 0 6 5 3t 0 0 1 ) 对硝基苯肼和3 0 0m l 甲醇，加热搅拌至回流溶解，降温到5 0 ， 把2 5 4g ( 含量8 0 ，0 0 6 5 3m 0 1 ) 的苯甲醛- 2 ，4 - 二磺酸钠缓缓加入到上述对硝基苯肼溶液中。保持温度5 0 ， 继续搅拌2h 后过滤，少量甲醇洗涤，以乙醇水= 2 3 ( v v ) 的混合溶剂重结晶，真空干燥，得到橙红色固体 2 4 4g ，收率8 3 8 ( 文献7 2 ) ，m p 3 0 0 。 1 5 南圆一 2 311 反应机理1 2 7 l 醛酮和伯氨基的化合物反应生成，形成一个新的双健生成亚胺、肟、腙等的类似反应属于加成消除 反应类型。 厂g o - 爿妨、。，。 l + h + r c h + n h 2 n h 2 r 2 = ；! !r 亡hi 唧2 n h r 2 ；= 苎= 其中 r c h n h 2 卜m r 2 q ： r c h l m 噩1 2 r c h = n + h n h r 兰r c h _ 1 2 n n h k 2 ；= ：=k l h 芦 n a 0 3 s c h o s 0 3 n a 2 3 1 2 合成影响因素研究 ( 1 ) 反应温度的影响 n h 2 n h r 2 2 考察了不同温度对产率的影响，其他实验条件为实验方法所述，结果