（光学工程专业论文）无创血糖检测方法研究.pdf

哈尔滨工程大学硕士学位论文 摘要 无创血糖检测方法的研究是当今国际医疗和传感器领域十分 关注的热门课题之一。它将使糖尿病检测手段产生质的飞跃，对糖 尿病的治疗具有重要的实际意义。 本文阐述了无创血糖检测研究的目的、意义及其背景：并对无 创血糖测量技术的现状进行了综述和分析介绍了几种具有代表性 的无创血糖检测方法的原理，分析了它们的主要优缺点：指出了未 来血糖无创检测技术的发展方向。唾液中葡萄糖含量仅为血液中葡 萄糖含量的l 5 0 l 1 0 0 ，所以通过人的唾液测量血糖值，其精度 要达到o 0 1 m m o l l 。本文基于光谱分析技术，用分光光度计进行测 量，采用拉格朗日多值插入法对所测数据进行处理，实现了葡萄糖 的微量检测，精度高，可重复性好。为实现无刨血糖检测奠定了良好 的基础。 关键词：光谱分析；无刨血糖：微量检测；葡萄糖 哈尔滨工程大学硕士学位论文 a b s tr a c t t h er e s e a r c ho fn o n i n v a s iv e9 1 u c o s em e a s u r e m e n tiso n e o ft h ep o p u l a r1 e s s o n si nt h em e d i c a lt r e a t m e n ta n dt h es e n s o r f ie l d i tw i l lm a k eaq u a l i t a t i v ep r o g r e s si nt h em e t h o do f d e t e c t i n gt h eb l o o d 9 1 u c o s e d is e a s e a n da ls oi tw i l l h a y e a v e r yi m p o r t a n ta n dp r a c t i c a lm e a n i n gt ot h et r e a t m e n to f i t t h ea r t i c l eg i v e st h ep u r p o s e 、m e a n in ga n db a c k g r o u n do f n o n i n v a s i v eb l o o dg l u c o s em e a s u r e m e n ti nt h er e s e a r c h 。i t a ls od i s c h s s e s c u r r e n tr e s e a r c h e sa n da n a l y s ist h e a d v a n t a g e sa n ds h o t t a g e so fd i f f e r e n tm e t h o d so fm e a s u r e m e n t t h ef u t u r ed e v e l o p m e n to ft h en o n i n v a s i v em e t h o dr e s e a r c h isa ls od is c u s s e d t h ed e n s i t yo fg l u c o s eint h es a i i v ao fp e o p l eiso n l v l 5 0 l 1 0 0o ft h a t i nt h eb l o o d ，w h i c hi n d i c a t e st b a tw e c a nm e a s u r et h eb l o o d9 1 u c o s eb y o n e ss a liv aa n d t h e a c c u r a c vs h o u l db e0 0 1 m m 0 1 u an o v e lm e t h o db a s e so nt h e s p e c t r a la n a l y s i su s e df o r t h em e a s u r e m e n to f t h eb l o o d 9 1 u c o s eo fp a t i e n t s is r e p o r t e di nt h i s p a p e r m e a s u r e db y s p e c t r o p h o t o m e t e r a n dc o n t r 0 1 1 e dd a t ab yl a g r a n g e i n s e r t m e t h o d ，t h ea d v a n t a g e s o ft h ism e t h o di n c l u d et r a c e m e a s u r e m e n t h i g hp r e c is i o n ，g o o dr e p e a t a b i l i t y i t is w is h e dt h a tt h ism e t h o dc o u l dp r o v id eag o o db a s i sf o rt h e n o n - i n v a s i v eb l o o dg lu c o s em e a s u r e m e n tt e c h n o l o g y k e yw o r d s ；s p e c t r a la n a l y s i s t r a c em e a s u r e m e n t ： l i o n in v a s i v eb l o o d9 1 u c o s e g l u c o s e 哈尔滨工程大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：本论文的所有工作，是在导师的指导 下，由作者本人独立完成的。有关观点、方法、数据和文 献的引用已在文中指出，并与参考文献相对应。除文中已 注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已 经公开发表的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个 人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到 本声明的法律结果由本人承担。 作者( 签字) ：蚀织洚 日期：矿绛弓月驴目 哈尔滨工程大学硕士学位论文 第1 章绪论 1 1 无创血糖检测方法概述 糖尿病是危害人类健康的四大主要疾病之一，已成为一个全球 性的健康问题。患糖尿病的人数在世界范围内正逐年增加。世界卫 生组织估计，1 9 9 8 年全球约有1 4 3 亿糖尿病患者，到2 0 2 5 年，随 着人口增长、老龄化和地区城市化，这一数字将达到3 亿。我国糖 尿病患者总数已达3 0 0 0 万之多，尚有半数以上的患者未被发现。 糖尿病的病因比较复杂，并会引起多种并发症，医学上还没有 切实可行的方法根治糖尿病。由于糖尿病患者的胰腺不能正常地分 泌胰岛素，使血液中的葡萄糖( 血糖) 浓度不能保持在正常水平。 因此必须经常检测血糖浓度，通过口服降糖药物和注射适量的胰岛 素，来维持血糖的正常水平，因而准确测量血糖浓度非常重要。过 量和过少的服药和注射胰岛素对患者来说都是非常不利的。 而现有的血糖检测方法因需要采取血样，限制了血糖的检测频 率，还存在着病毒通过血液感染的危险，影响了糖尿病患者及时、 快速的诊断治疗。由于糖尿病人本身伤口就不易愈合，甚至严重时 肌体会出现溃烂，所以这种检测方法对糖尿病的治疗非常不利。患 者急需一种无痛、连续、方便的血糖监测仪器。 目前的尿糖检测方法，尽管是无创的，但局限性较大。对于 那些血糖低于肾阈值而又高于正常值的人群不能即时提出警告，且 检测结果不够准确。 与其相比，无创血糖检测则表现出截然相反的优点。故用无创 血糖检测方法取代现在普遍采用的化学检测方法已成为必然趋势。 它将使糖尿病检测手段产生质的飞跃，对糖尿病的治疗具有重要的 实际意义。 哈尔滨工程大学硕士学位论文 因此众多的研究人员把注意力集中在无创检测方式上，国外血 糖无创检测研究的单位与人数较多，目前尚未推出商品化仪器，而 国内却仍处于空白状态。 无创血糖检测结合了光谱分析技术、化学计量学、光信息处 理技术和统计分析技术，是一项交叉学科的高科技研究项目，是当 今国际医疗和传感器领域十分关注的热门课题之一。其产品中包含 很高的技术附加值。它不仅开辟了糖尿病检测手段的新途径，并且 国内外市场巨大，其潜在的经济效益十分可观。 近年来，国际上对血糖检测仪的研发均已呈现出激烈的竞争态 势，并向轻便、创伤小、出血少的方向发展。 最近，b o e h r i n g e rm a n n h e i l l l 公司将一种微型的血糖测量仪投 放市场，它具有体积小、操作简单的特点，只需要取指尖一滴血， 放到仪器的试剂条上，就能很快地测出血糖浓度，它在一定程度上 给患者提供了方便，但患者仍需忍受针刺的痛苦。为了解决上述问 题，人们发展了微创血糖检测方法，世界上有代表性的主要有 s p e c t r xin c 公司的s p e c t r xs y s t e m 仪器。它利用光在皮肤表面 打一个小坑。然后用生化方法测量组织渗出液：而c y g n u si n c 公 司生产的g 1 r i c ow a t c h 则利用电场来刺激皮肤，利用皮肤渗透作 用，使一部分血糖分子穿过皮肤集聚在电极周围，然后用生化法测 量。 与上述方法相比，无创检测显然是最理想的方式。目前，国际 上特别是以美国为首的西方国家已投入大量的人力与财力从事无 刨血糖仪的研制开发工作，有些科研单位已研制出样机，但距实用 还有一定的距离。采用无创伤的方法检测血糖是人们长期以来追求 的目标，人们对无创血糖检测方法的研究一直没有停止过。 1 2 检测方法研究 1 吸收光谱分析方法 哈尔滨工程大学硕士学位论文 由于各种物质有各自特殊的光谱吸收特性，利用血糖的光谱吸 收特性，就可以把它的光谱信号与血液中其它物质信号区分开来， 而它的浓度与光的吸收谱有直接的对应关系。f u t r e xi n c 公司研 制的产品样机d r e a mb e a m 就是利用这种原理制作的。患者只要将 一个手指插入仪器的测量小孔中，仪器马上就能显示测量数据，经 过电路处理后可显示出血糖浓度值。其装置如图1 1 所示。 由红外光源发出的光入射到患者的手指根部，透过手指的光被 能揣黧畿忠器茹麓訾黜麟黼格管嚣嚣器：怒， 图1 1基于吸收光谱分析方法的血糖仪装置图 光电探测器接收，经过电路处理后可显示出血糖浓度值。吸收率的 幅值大小直接与血糖浓度有关，所以只要测得某些光谱频率上的吸 收率，就可以计算出被测血糖的浓度。 为了提高测量精度，尽量排除血液中其他成份对测量的影响， 经常选择多个频率的光同时测量。由于人体组织对近红外光透过效 果相对较好，同时存在水窗现象，所以经常选用6 0 0 1 1 0 0 n m 范围 内的光谱线，并且选择一部分谱线对血糖浓度变化敏感，另部分 谱线对血糖变化不敏感，这样才能最大限度地减小血液中其它成份 的影响。这种仪器的优点是结构简单，体积小，易于携带，可以用 哈尔滨工程大学硕士学位论文 电池作为驱动电源，患者可以在家庭使用。它能够对患者进行实时 监测，保障患者得到及时治疗。 2 旋光法 当一束线偏振光射到含有血糖的溶液中时，其透射光也是线偏 振光，而且偏振方向与原入射光的偏振方向有一个夹角，这是葡萄 糖的旋光特性。利用这个特性可以制成血糖检测仪器。以e o lir l c 公司为代表的研究就采用了这种原理，结构如图1 2 所示。 图i 2 旋光法原理图 由激光光源发出的光经起偏器后成为线偏振光，将这束光入射 到被测者的手指或者耳垂等部位，透过的光由检偏器和光电元件接 收，利用偏振方向的转角与血糖浓度存在的对应关系，就可测得血 糖浓度。为了提高测量精度，在偏振光入射到被测部位之前将其进 行调制，首先让它通过l 4 波片，使线偏振光变成圆偏振光，然后 再通过锂钽晶体。同时在锂钽晶体两端施加方波的调制电压，锂钽 晶体将圆偏振光变为线偏振光，出射的线偏振光的偏振方向与经过 1 4 波片之前的线偏振光的偏振方向呈4 5 。角，其符号根据锂钽 晶体上施加的电压极性决定。因此当施加交变的方波电压后，就可 以产生相互垂直的两个偏振状态，调节方波电压，可使两偏振状态 的光脉冲周期相等，用偏振方向为两偏振光夹角平分线方向的检偏 器就可以得到两种相等的信号，两路信号之差等于零。当偏振光经 过有血液的人体组织( 如手指，耳垂等) 时，偏振方向就会改变，其 4 哈尔滨工程大学硕士学位论文 中个偏振方向产生的信号分量增加了，而另一个偏振方向产生的 信号分量减少了，这样两个差值就容易测得。另外，为了减少光源 波动和被测介质对光能量吸收的影响，它采用两路等光程光路，一 路作为测量光路，另一路作为参考光路。这类仪器的特点是光路简 单，操作容易。但由于其中使用的锂钽晶体等元件受温度影响较大， 所以对环境温度要求较高，给家庭使用带来不便。 3 赖曼光谱分析方法 当一束激光照射某种物质时，光子的能量被物质分子吸收，激 发起分子中原子的振动能级，就会产生赖曼散射光。利用这种光子 和分子之间的相互作用可咀有效的分析物质的成分，在这里我们可 以利用赖曼效应测量血糖的浓度。下面以g e o r g i at e c hr e s e a r c h c o r p o r a t i o n 公司的仪器为例介绍这种仪器的工作原理。 当用束激光照射血糖时，一部分光能被吸收，一部分被散 射，一部分透射。散射光中一小部分光的波长与入射光相比有所改 变，改变的多少与糖的分子结构有关。这部分波长改变的光叫赖曼 散射光。要想测得这一小部分散射光并非易事。因为它向各个方向 散射，而且能量很小。为了解决这个问题，采用两束波长不同的单 色激光来测量，一束光作为参考光束，另一束作为探测光束，使两 光束的频率之差等于赖曼散射所产生的频率变化，这样测量探测光 束幅值的波动就可测出赖曼散射光的变化。仪器原理如图1 3 所 刁i 。 由两个激光器分别发出两束单色光，首先经过耦合器1 变成一 束光，再经过空间光滤波器2 。空间光滤波器将光强变成高斯分布， 这样使得光束聚焦更精确而且使两个频率的光耦合的更充分。由于 赖曼散射光相对能量很小，而血液的透光性很差，所以直接测量血 液组织是不可能的。由于眼球的透光性好。所以此仪器选择眼球作 为测试对象。当两个频率耦合的光束射入眼球后，一部分光反射出 来，其中包含赖曼散射光，光经过一个干涉滤波器3 ，这个滤波器 将参考光滤除，只有探测光通过。探测光的幅值变化就反映了血糖 浓度的变化，经过光电转换和数字信号处理就可测出血糖浓度。为 哈尔滨工程大学硕士学位论文 了提高抗干扰性，提高测量精度，此仪器对激发激光加以方波脉冲 调制，然后使用同步检出电路将信号输出。 由于此仪器直接由探测激光与赖曼散射光幅值的相互作用叠 加进行测量，所以对探测光要求较高，探测激光光源必须保持稳定 不变。因为不同物质的赖曼散射光不同，所以测量信号受血液或眼 输出 图1 3赖曼光谱分析方法原理图 球中其他物质的影响较小。但它的结构相对复杂，而且对眼球的测 量不象对手指和耳垂的测量那样容易被患者接受。 4 多变数分析方法 人类的视觉对颜色的分辨力极强，并且在辨别颜色时几乎不受 颜色光的强度影响。它能够连续不断地接受在可见光谱范围内的各 种颜色光谱。它对光强度变化的感受也非常灵敏。在暗视觉条件下， 能够极精确地分辨亮度的变化。这些都是分光光度计等仪器无法达 到的。 血糖测量的关键难题就是血糖浓度很低，测得的信号十分微弱， 甚至测不到信号，因此提高信噪比就是研究的关键。模拟人眼的功 哈尔滨工程大学硕士学位论文 能是解决问题的好方法。将光源发出的具有连续光谱的光照射到被 测人体的某一位置上，然后将透射光分成四柬，分别由四个光电元 件接收，四个光电元件分别接收不同光谱范围内的光。而且接收的 光谱范围彼此有一部分重合，这样四个元件就接收到了相当宽的连 续的光谱范围的光信号，而且它们之间有定的相关函数，存在着 一定的可比性。根据色度学理论，测得的每一组光谱能量分布及幅 值都代表了一定的色调、饱和度和明度，也就是对应品图上的一个 点。通过神经网络建立起血糖浓度与测得的每一组光谱能量分布及 幅值的对应关系，然后就可用遗传算法测出血糖的浓度。这种方法 有效地减小了背景噪声对测量信号的影响，提高了信噪比。它与光 谱吸收方法比较有较大的优势，因为对测量血糖来说，虽然光谱幅 值变化很小，但在很宽的光谱范围内都有信号，利用几个覆盖宽光 谱范围的探测元件相当于将小信号累集起来，不象光谱吸收方法那 样只针对某一个或几个频率光谱上的吸收值进行测量。因此它是一 个多通道实时相关的多参数分析方法。 1 3 无创血糖检测技术的研究方向及存在的问题 1 提高测试精度，增加补偿措施，简化实用程序。 由于各人之间皮肤颜色厚度等许多参数的不同而致使同样的 仪器对不同病人测量的结果有很大分散性，这就需要在使用仪器之 前针对特定的病人进行仪器标定，另外同一个人在不同时期的状态 也会影响测量结果，所以还需要对仪器定期进行标定。这个标定过 程实际上是取血化验结果和仪器测得结果比对的过程，所以必须由 经过专业培训的人员在化验室中进行，这给使用者带来不便，所以 迸一步研究解决这个问题的方法，减少校准次数延长使用周期是进 一步研究的发展方向。 2 使其具有实施控制胰岛素注射的能力。 由于测量一次的周期极短，测量数据实时地反映血糖浓度的变 化，相对于当前的测量手段具有很大优越性。将测量仪器的信号与 哈尔滨工程大学硕士学位论文 胰岛素注射控制装置连接，则可以实施的控制药物的注射的剂量。 这样可以实现一个闭环的控制系统，更有效的保障患者的健康，对 于糖尿病患者来说它相当于一个人工胰脏。 3 向多功能方向发展。 血液中成份很多而含量都较少，诸如血氧，酒精等成分对光子 都有一定的调制作用，可以用类似的光学方法测量，对光信号的分 析同时也可得到其他微量成分的信息，这种通过一次测量得到多个 成份参数的方法也是未来研究的发展方向。 1 4 用唾液测量血糖方法的提出 针刺取血是目前唯一可行的检测血糖的方法。按照要求，糖尿 病人每天最少需检测3 4 次血糖，以便根据情况及时口服降糖药物 或补充胰岛索。能够有一种不通过取血来检测血糖的方法是糖尿病 人长期以来的一个梦想。在无创血糖检测方法的探索过程中，人们 首先想到了体液，因为体液与血液的关系是最密切的，经研究已知 体液中的葡萄糖含量与血糖含量非常接近，通过体液检测血糖的工 作也已付诸实施，近期出现的种g l u c o w a t c h 就是其中一例， g l u c o w a t c h 是一种类似于手表的装置，主要通过电刺激的方法将 体液从皮肤析出，该方法已获得美国专利，但由于有一定的副作用 目前尚未推广使用。另外一种方案是将一种体积很小的检测装置植 入体内，直接检测体液的葡萄糖值，同时与一种控制胰岛素注入的 泵体结合，自动控制胰岛素的注入。类似的方法实质上只能算是微 创检测方法，而且还有一系列的问题需要解决。除体液之外，尿液、 泪液、汗液及唾液等都曾经作为考虑对象，其中，泪液的分泌量有 限，测量有定困难；汗液的提取受条件限制，并非总是随心所欲 的。至于尿液，第l 章已经提过，只能作为参考而不能作为血糖值 的依据。实际上，唾液是这一努力的最后一线希望。长期以来，人 们对唾液中葡萄糖含量的研究不多。这项工作之所以没有深入展开 的原因之一是唾液中的葡萄糖含量很低，检测有一定困难。日本广 哈尔滨工程大学硕士学位论文 岛大学医学部的山口昌树教授对唾液糖值与血糖的关系进行了系 统研究，山口昌树教授对6 名健康人与1 1 名糖尿病患者的血糖值 和唾液糖值进行了测量。初步的结论是：健康人的唾液糖值约为血 糖值的1 1 0 0 l 5 0 ，个人相关值为0 9 9 4 0 0 0 3 ；而糖尿病人唾液 糖值约为血糖值的1 1 5 0 ，个人相关系数是0 9 4 0 0 0 7 。但唾液糖 值相对于血糖值的变化有一个时间上的延迟。 山口昌树教授的测量结果对唾液糖值与血糖值的变化关系做 出了肯定的结论。但在历史上，也有人做出了相反的结论。如 m e h r o t r ak k 等人在1 9 6 8 年，f o r b e tl n 在1 9 8 1 年得出的结论是 被测者不存在相关性。从历史背景分析，可能是因为他们采用氧化 还原法测量葡萄糖值时，其测量结果中包含了葡萄糖以外的其它种 糖份的结果，因此影响了结果的可靠性。需要进步深入研究的问 题还很多。诸如：唾液腺体中与葡萄糖传递有关的功能的变化与个 人差异，口腔病变等其它因素的影响等，都有必要进行深入的研究。 基于唾液测量血糖的可能性及潜在的应用前景，我们在该项研 究中将唾液作为重点研究对象，对其相关的问题进行了一系列的研 究。 1 5本文所作主要工作 本文基于光谱分析技术，采用紫外一可见分光光度计对不同浓 度的葡萄糖溶液吸光度值进行了多次测试，用拉格朗日多值插入法 对实验数据进行处理，经过多次实验摸索出一套关于溶液温度的控 制，时间的选择以及溶液量的选取的实验方法，得到标准葡萄糖溶 液浓度与其吸光度之间的曲线关系，并将得到的关系曲线作为下面 将要进行的唾液浓度的测量的标定依据，由所得的关系曲线以及经 过特定处理的唾液的吸光度值即可得到唾液中葡萄糖的含量，为下 面将要进行对唾液的测定做好了必要的准备工作。并且试着用各种 方法减少唾液中各种大分子的干扰。比较了唾液中葡萄糖溶液浓度 与用微创血糖仪所测含量之间的关系，寻找能够将唾液中其他各种 哈尔滨工程大学硕士学位论文 大分子分离出来的最佳方法。 1 6 本章小结 本章主要介绍了目前国际及国内血糖仪研究现状及进展情况， 简单介绍了一下目前普遍研究的各种血糖仪的基本原理及结构，并 且分析了唾液方法测量血糖的可能性与可行性，指明了我们在血糖 检测中的研究方向。 1 0 哈尔滨工程大学硕士学位论文 第二章分光光度法基本知识 分光光度法是基于被测物质的分子对光具有选择性吸收的特点 而建立起来的分析方法。其中主要包括比色法、可见分光光度法和 紫外分光光度法等。与化学分析法相比分光光度法具有以下特点。 ( 1 ) 灵敏度高。适用于微量组分的测定，一般测定下限可以达到 1 0 4 l o 一5 ( 2 ) 准确度高。相对误差可达2 5 ，若使用精密仪器，误 差可降至l 2 ，完全能满足微量组分的测定要求。 ( 3 ) 应用广泛。该法主要应用于微量组分的测定，若采用适当 的方法也可用于高含量组分的测定；几乎所有的无机离子和 许多有机化合物都可直接或间接地用分光光度法进行测定： 除此之外，该法还可用来研究化学反应的机理以及溶液化学 平衡等理论，如测配合物的组成，弱酸、碱的离解常数等。 ( 4 ) 仪器设备简单，操作简便、快速。 2 1 物质的颜色和对光的选择性吸收 1 物质的颜色 任何物质都具有一定的颜色，这是因为各种物质对不同波长的 光具有选择性吸收的结果。当一束白光( 如太阳光) 照射某溶液时， 如果该溶液对各种波长的可见光均不吸收，即入射光全部透过，则 溶液透明无色。如果溶液选择性吸收了可见光中某一波段的光。而 让其他波段的光全部透过，这时溶液则呈现出透射光的颜色。在透 射光中，只有与溶液选择性吸收光色的互补光才会引起人们视觉的 特殊色感，其他部分光仍为互补，给入以白光的感觉，所以溶液呈 现出的颜色恰恰是它所吸收光的互补色。例如，黄光和蓝光为互补 光，硫酸铜溶液因吸收了白光中的黄色光而呈现蓝色；又比如，绿 光和紫光为互补光，k m n o ；溶液因吸收了绿光而呈现紫红色。表2 1 哈尔滨工程大学硕士学位论文 列出了溶液的颜色与吸收光颜色的互补关系。 溶液颜色的深浅，决定于溶液选择性吸收光的量，即与溶液中 吸光物质的浓度有关。比如，当一束白光照射某溶液时，该溶液 吸收光 溶液颜色 颜色波长范围n m 黄绿紫4 0 0 4 5 0 臾蓝4 5 0 4 8 0 橙绿蓝4 8 0 4 9 0 红蓝绿4 9 0 5 0 0 红紫绿5 0 0 5 6 0 紫黄绿5 6 0 5 8 0 蓝黄 5 8 0 6 0 0 绿蓝橙 6 0 0 6 5 0 蓝绿红 6 5 0 7 5 0 表2 一i 溶液的颜色与吸收光颜色的互补关系 吸收了白光中的蓝光和绿光，而允许红光透过，这时溶液呈现红色。 如果溶液中吸光物质的浓度越高，对蓝光和绿光吸收的也就越多， 其透过的红色光的强度也就越大，溶液的颜色也就越深；相反，溶 液的颜色就浅。因此，可以借助比较溶液颜色的深浅来确定溶液中 吸光物质的含量，这就是比色分析法的理论依据。 2 吸收曲线 以上只是粗略地由物质所呈现的颜色说明物质对不同波长的光 选择性吸收的现象，实际上任何一种物质对不同波长的光吸收程度 是不相同的。如果让一系列不同波长的单色光照射一定浓度的有色 溶液，并测量每一波长下物质对光的吸收程度( 吸光度) ，以波长( ) 为横坐标，以吸光度( a ) 为纵坐标作图，即可得到一条曲线，该曲 线称为吸收曲线或吸收光谱，它能更形象地描述物质对光的吸收情 哈尔滨工程大学硕士学位论文 况。图2 1 即为k m n o 。溶液的吸收曲线。 从图中可以看出，在可见光范围内。k m n o 。溶液对波长5 2 5 n m 附近的绿光吸收最强，而对紫色和红色光几乎不吸收。通常将吸收 曲线的峰值处称为最大吸收，其所对应的波长称为最大吸收波长， 以九表示。如k m n o 一的最大吸收波长 = 5 2 5 n m 。吸收曲线的形 状和 的位置与物质的分子结构有关。由于各种物质的分子结构 各不相同，对不同波长的光具有选择性吸收，所以吸收曲线的形状 和 的位置也不相同，即具有各自的特征吸收曲线，据此可以对 物质进行定性分析。另外，对于同一物质，浓度不同，其吸收曲线 的形状和 位置不变，只是在同一波长下物质对光的吸收程度随 浓度增大而增大，据此，可以通过测量同一波长下物质对光的吸收 程度，对物质进行定量分析。由吸收曲线的形状还可以看出，在最 大吸收波长下测量物质的吸光度，其灵敏度最高。因此，制作各种 物质的吸收曲线是分光光度法中选择测量波长的依据，如果没有其 他干扰，一般都是选择九。为测量波长。 图2 一i k m n o t 溶液的吸收曲线 3 吸收光谱产生的实质 要了解各种物质之所以对光具有选择性吸收并具有各自的特征 哈尔滨工程大学硕士学位论文 吸收曲线首先要了解分子吸收光谱产生的实质。由物质结构可知， 在物质分子内部具有一系列不连续变化的特征能级，其中包括电子 能级、振动能级和转动能级，每种能级具有一定的能量。就电子能 级而言，又可分为能量较低的基态和能量较高的激发态。通常，物 质在不受外界作用时，总是处于能量最低、最稳定的基态；当外界 给它一定的能量，比如用一定波长的光照射物质，并且该波长的光 所具有的能量正好等于物质分子中两个能级间的能量差a e ，此时 处于基态的物质分子就有可能吸收照射光子的能量，而由基态e 跃迁到能量较高的激发态e ：。这种现象称作光的吸收，由此产生 的光谱称为吸收光谱。由此可见由于各种物质内部的分子组成及 结构不同，所具有的能级及能级间的能量差业也不同，所以分子 发生能级跃迁时，所吸收的能量也就不同。也就是说，并不是任何 一种波长的光照射到物质上都能够被物质所吸收只有当照射光的 能量与物质分子的某一能级差缸恰好相等时，物质才会吸收这份 能量产生能级跃迁，即产生吸收光谱。因此，物质对光具有选择性 吸收，由此产生的吸收光谱( 或吸收曲线) 的形状也各不相同。 分子吸收光谱是由分子的电子能级跃迁、振动能级跃迁和转动 能级跃迁产生的，因此分子吸收光谱为带状光谱。 2 2 光吸收定律 2 2 1 光吸收定律一郎伯一比耳定律 郎伯一比耳定律是分光光度法定量分析的理论依据，它建立了 物质对光的吸收程度与液层的厚度及溶液浓度间的定律关系，是由 郎伯( j h l a m b e r t ) 和比耳( a b e e r ) 分别于1 7 6 0 年和1 8 5 2 年研 究之后提出的，故称为郎伯一比耳定律。 1 郎伯一比耳定律的推导 当一束平行的单色光垂直地照射到某一均匀、非散射的吸收介 哈尔滨工程大学硕士学位论文 质时，假设吸收层的厚度为b ，吸光物质的浓度为c ，入射光强度 为厶，通过吸收物质时，其中一部分光被物质所吸收( 五) ，一部分 透过( l ) ，一部分被器皿表面反射( i ，) ，它们之间的关系为 l = i 。七i t j r1 在比色或分光光度分析中，比色皿的质料、厚度均相同，反射 光的强度l 基本不变，其影响可以互相抵消，于是上式可简化为 i q = l 。七i t 如图2 2 所示。假设将吸收层厚度b 分为众多的小薄层，每一 薄层的厚度为d x ，截面积为s 。其体积为s d x ，其中所含吸光物质 的质点数为d n 个。若照射到该薄层上的光强度为厶。通过薄层后， 由于物质的吸收光强改变了d 五，d 则是薄层中光被吸收程度的 i o d x 图2 - 2 单色光通过溶液示意图 度量，根据光学理论，它与入射光强厶、吸光质点数d n 成正比， 印 一d 厶= 五l d n 式中负号表示光强度因吸收而减弱。由于整个吸收介质是均匀的 故薄层中吸光物质的总数为 d b6 0 2 x 1 0 ”c s d x 代入上式 一d 厶= 6 0 2 1 0 ”肝强甜j 令凰= 6 0 2 x 1 0 2 3 置s 哈尔滨工程大学硕士学位论文 故一等啦出 将上式积分则可求得吸收层厚度为b 、截面积为s 、吸光质点总数 为n 的吸光物质对光的吸收程度，即 f i d i b = r k 2 c d x l n ! l ：心的 i o 将自然对数换算成常用对数，并令 k ：坠 2 3 0 3 则叫哇蛹c 一， 式中l l 定义为透光率，以符号，表示，即 7 = lfi 。( 2 2 ) 它表示透光强度与入射光强度的比值用以度量物质进光程度的大 小。透光率也可用相对透光强度( 力表示，即 ，；i _ l 1 0 0 i 。 透光率与物质对光的吸收程度( 即吸光度) 之间的关系为 a = 一1 s 芦一l s i i t ( 2 - - 3 ) 将此式代入式( 2 1 ) ，即得 a = 肋c( 2 4 ) 此式便是朗伯一比尔定律的数学表达式。其物理意义为：当一束平 行单色光垂直通过某一均匀的、非散射的吸光物质溶液时，溶液的 吸光度a 与吸光物质的浓度c 和液层厚度b 的乘积成正比。 此定律不仅适用于溶液，也适用于其他均匀非散射的吸光物 质。 6 哈尔滨工程大学硕士学位论文 2 2 2 偏离郎伯一比耳定律的因素 根据郎伯一比耳定律当液层厚度( b ) 固定后，溶液的吸光度( a ) 与溶液的浓度( c ) 呈正比如果配制一系列不同浓度的标准溶液， 并测其吸光度值，以吸光度为纵坐标，以标准溶液的浓度为横坐标 作图，应得到一条通过原点的直线，该直线称为标准曲线或工作曲 线。但在实际工作中，常常会出现标准蓝线偏离直线而发生上弯或 下弯现象，如图2 - 3 所示，这种现象称为偏离郎伯一比尔定律。采用 光度法测量样品时，如果被测样品的吸光度值落在标准曲线的弯曲 部分，由此得到的测量结果将会产生较大的测量误差，因此，有必 要对偏离郎伯一比耳定律的原因有所了解，以便在实际测定中，正 确地控制和选择测量条件。 偏离郎伯一比耳定律的原因、概括起来主要有两方面，一个是 物理因素，另一个是化学因素。 圈2 - 3 标准曲线的偏离 ( 一) 物理因素 1 单色光不纯引起的偏离 郎伯一比耳定律的基本假设条件是入射光为单色光，但目前所使 用的光度分析仪器提供的入射必实际上是有一定波长范围的光谱 带，而并非单色光。如果光度计的单色器性能较好，所得到的谱带 哈尔滨工程大学硕士学位论文 较窄，此时、可将入射光近似地看作为单色光，由此所作的工作曲 线也近似符合郎伯一比耳定律。相反，如果光度计的单色器性能较 差，所得到的谱带较宽，于是所得的工作曲线就偏离郎伯一比耳定 律。实际分析中，由于光度计分光系统的分光能力所致，不可能得 到很纯的单色光。这时，对入射光波长的选择是很关键的。一般 情况下，总是选择吸光物质的最大吸收波长( ) 的光为入射光， 这不仅可取得最大的灵敏度，而且吸光物质的吸收曲线在此处有一 较小的平坦区，因此，能够得到较好的线性关系。 2 介质不均匀引起的偏离 郎伯一比耳定律的另一基本假设条件是吸光物质的溶液应是均 匀的、非散射的。如果溶液不均匀，例如，产生胶体或发生混浊， 当入射光通过溶液时，一部分光将会产生散射而损失，使得实测吸 光度比没有散射现象时的吸光度增大，那么，工作曲线将发生偏离， 向吸光度轴弯曲。 ( 二) 化学因素 当被测溶液的浓度较高时，标准曲线会发生弯曲。这是由于吸 光质点的相互作用，直接影响它的吸收能力，浓度越高，相互作用 越大，偏离郎伯一比耳定律的程度越严重。因此，郎伯一比耳定律只 适用于稀溶液。 另外，吸光质点往往不够稳定，常因环境或介质的条件的变化 而发生化学反应，形成新的化合物或改变原来吸光质点的浓度，因 而导致工作曲线发生弯曲。 2 3 本章小结 本章介绍了本文所应用的理论知识，分析化学中的分光光度法 的基本理论，在本章，我们首先对朗伯一比尔定律进行了推导，然后 分析了各种可能导致试验偏差的原因及可采取的避免方法，是我们 对葡萄糖溶液进行测试的理论基础。 哈尔滨工程大学硕士学位论文 第三章紫外一可见光谱分析 3 1 紫外一可见吸收光谱的产生 分子的紫外一可见吸收光谱是由价电子能级的跃迁而产生的， 通常电子能级间隔为1 至2 0 e v ，这一能量恰落于紫外与可见光区。 每一个电子能级之间的跃迁，都伴随分子的振动能级和转动能级的 变化，因此，电子跃迁的吸收线就变成了内含有分子振动和转动精 细结构的较宽的谱带。 3 。2 紫外一可见分光光度计 测量紫外光，可见光光区吸光度的仪器目前仍以色散型的紫外 一可见分光光度计为主。几十年来，随着光学和电子学技术的发展， 仪器的测量精度、功能和自动化程度在不断地提高，但是以光源、 单色器、样品室、检测器、放大和控制系统和显示系统等六个组件 按直线排列方式组合的结构却仍基本不变。以微型电子计算机控制 的紫外一可见分光光度计始于7 0 年代中期，微型电子计算机不仅 能够有效控制光度计的操作、运行、自动调整工作参数、实现自动 重复扫描、光谱累加、自动收集存储光谱等性能，还能够进一步对 数据进行计算、求导和统计处理等，因而得到了迅速的发展。以微 处理机控制的新一代的单光束自动扫描型分光光度计现已问世，它 利用光电二极管阵列作检测器。具有快速扫描吸收光谱的特点，可 代替结构复杂而操作繁琐的停流分光光度计。 在紫外一可见光谱区，傅里叶变换的应用受到理论和技术上某 些因素的限制，进展较为缓慢。近年来傅里叶变换的紫外可见光谱 仪的实验室仪器和商品仪器已相继推出，它将以其自身的优点和独 特的应用价值受到人们的重视。 哈尔滨工程大学硕士学位论文 3 2 1 紫外一可见分光光度计的结构概述 紫外一可见分光光度计是度量介质对紫外一可见光区波长的单 色光吸收程度的分析仪器，按照不同的分类标准所作的分类见下面 表3 l 所示 分类标准分类 ( 1 ) 真空紫外分光光度计( 0 1 2 0 0 n t o ) ( 2 ) 可见分光光度计( 3 5 0 n m 7 0 0 n m ) 根据工作波段的不同 ( 3 ) 紫外一可见分光光度计( 1 8 5 n m 9 0 0 n m ) 分类 ( 4 ) 紫外一可见一近红外分光光度计 ( 1 8 5 n n a 2 5 0 0 n m ) 根据光度学和记录系( 1 ) 单光束手动式分光光度计 统不同分类( 2 ) 双光束自动记录式分光光度计 根据同时提供的波长( 1 ) 单波长分光光度计 数不同分类( 2 ) 双波长分光光度计 根据扫描速度的不同 动力学分光光度计 分类 ( 1 ) 傅里叶变换紫外一可见光谱仪 根据是否分光分类 ( 2 ) 色散型紫外一可见分光光度计 表3 一l 紫外可见分光光度计的分类 3 。2 。2 单光束分光光度计 单光束紫外一可见分光光度计的低波段延伸到l 8 5 2 1 0 n m ， 高波段延伸到8 5 0 1 0 0 0n m ，钨灯( 或碘钨灯) 和氢灯( 或氘灯) 两 2 0 哈尔滨工程大学硕士学位论文 种光源互换使用，大多数仪器用光电倍增管作接收器，也有用光电 管作接收器，用棱镜或光栅作色散元件，采用数字显示或仪表读出。 作为这类仪器的典型代表是b e c k m a nd u 一2 型单光束紫外一可见 分光光度计，是1 9 4 1 年世界上首次研制成功的分光光度计，上海 分析仪器厂生产的7 5 1 型，7 5 1 6 ，7 5 2 0 型，u n i c a n s p 5 0 0 型( 英 国) ，c 中一2 6 ( 苏联) ，q v 一5 0 ( 日本岛滓) ，e p u 一2 a ( 日立) ，h i l g ern 7 0 0 ( 英国) 等属于这类仪器。 单光束分光光度计只有单色器色散后的一束单色光，它是通过 改变参比池和样品池的位置进行参比溶液和样品溶液的交替测量 来测定样品溶液的吸光度。优点是具有较高的信噪比，光学、机械 及电子线路结构都比较简单，价格比较便宜，适合于在给定波长处 测量吸光度或透光率，故常用于定量分析。但不能作全波段光谱扫 描( 单光束分光光度计与计算机联用的仪器例外) ，欲绘制一个全波 段吸收光谱，需要在一系列波长处分别测量吸光度，因而费时较长， 该仪器要求有一个性能很好的稳压电源，以确保光源和检测系统工 作的稳定性。目前国内普遍应用的7 2 1 型和7 5 l 型的分光光度计就 是属于这类仪器。该类仪器因光源强度波动和检测系统不稳定而能 引起测量误差，故必须配备稳压电源。图3 1 为7 2 1 型仪器结构 示意图，图3 2 为7 2 1 型仪器光路系统原理图，图3 3 为7 5 1 型紫外一可见分光光度计光路系统示意图，图3 4 为7 5 l 型分光 光度计结构示意图。 7 5 l 型其工作波段为2 0 0 一1 0 0 0 n m ，在3 2 0 1 0 0 0 n m 波段。以 钨灯作光源，2 0 0 3 2 0 n m 波段用氢灯作光源。 由光源w 或h 发出的连续辐射射到凹面反射镜m ，经聚光后再反射到平面反射 镜m 2 上，经狭缝s 进入单色器；狭缝s 正好位于球面准直镜l 的 焦面上，入射光束经l 反射后以一束平行光射人棱镜p 。入射角为 最小偏向角，入射光穿过3 0 角石英棱镜，被棱镜镀铝面反射，又 重新穿过棱镜，色散后的光束返回准直镜l 经聚焦后射到出射狭 缝的焦平面上，旋转棱镜的角度，即可获得任一波长的单色光。为 了消除杂散光对测量结果的影响，在出射狭缝后面装有滤光片，单 2 1 哈尔滨工程大学硕士学位论文 色光束经过滤光片后进人试样室，经样品溶液吸收后透射光射到 光电管p h ，或p h ：阴极面上产生光电流，光电流在一2 0 0 0 m f l 高阻 上产生电位降，经微电流放大器放大后用电位差计测量吸光度或透 光率 图3 17 2 l 型分光光度计结构方块图 一光源；2 一单色器 3 一吸收池；4 一光亮调节器；5 一光电管暗盒 6 一微安表：7 一光电管；8 一放大器；9 一稳压电源 公c 3 2 f 。i，in 同咖小 警 5y _ 一1 眼1 瀑 图3 27 2 1 型分光光度计的光学系统 1 一钨灯( 1 2 v ，2 5 w ) ：2 一透镜；3 一玻璃棱镜；4 一准直镜 5 、1 2 一保护玻璃；6 一狭缝；7 一反射镜：g 一光栏； 9 一聚光透镜；1 0 - 吸光池；1 1 一光闸；i 3 一光电管 哈尔滨工程大学硕士学位论文 图3 37 5 l 型冯光光度计光学系统示意图 1 一氢弧灯；2 一钨灯 3 一凹面反射镜l4 一石英棱镜；5 一准直镜 6 聚光镜；7 ，8 一上下狭缝；9 一平面反射镜；1 0 一吸收池 1j 蓝敏光电管；1 2 一红敏光电管；1 3 一光源室；1 4 一单色器 15 一滤光片架；1 6 一样品室；17 一光电管暗盒 图3 47 5 i 型分光光度计仪器结构方框图 3 2 3 双光束分光光度计 ( 一) 双光束自动记录式分光光度计 哈尔滨工程大学硕士学位论文 双光束分光光度计是将单色器色散后的单色光分成两柬，一 束通过参比池，一束通过样品池，一次测量即可得到样品溶液的吸 光度。双光束分光光度计的特点是便于进行自动记录，由于样品和 参比信号进行反复比较，消除了光源不稳定、放大器增益变化以及 光学和电子学元件对两条光路的影响。该类仪器适合于结构分析， 单色光分为两束的方法又有时间分隔和空间分隔两种。 时间分龋式双光束分光光度计结构见图3 5 。 | 、 光躁 、 图3 5时间分隔式双光束分光光度计 单色器和样品室之间装置一切光器，使单色器射出的单色光转 变为交替的两束光，分别通过参比池和样品池，然后将两透射光束 聚焦到同一检测器，它交替接收两光路的光信号，检测器输出信号 的大小决定于两光束强度差。 空间分隅式双光束分光光度计结构见图3 - 6 ，它是利用光束分裂 器和反射镜来获得两个分离光束，然后分别进入参比池和样品池， 通常采用两个匹配得很好的检测器测量二光束强度之比。目前采用 分时双光束形式的分光光度计较为普遍。 双光束分光光度计是自动记录仪器，其电子测量系统有两种类 型：光学零位平衡式和电学比例记录式。在光学零位平衡式仪器中， 来自样品和参比的信号直接输到伺服马达，当两者信号不等时，伺 哈尔滨工程大学硕士学位论文 服马达带动位于参比光路中的光楔，使参比光束和样品光束达到平 衡。在电学比例双光束系统中，斩波器置于样品池和参比池之前， 将单色光调制成一定频率的断续光后交替通过样品池和参比池，然 后在检测器中产生相应的样品信号和参比信号，由解调器将两个信 号分开，并测量两信号的比例。 ， 丽 - 一 图3 6 空间分隔式双光束分光光度计 ( 二) 双波长分光光度计 双波长分光光度计可同时提供两种不同波长的单色光，经切光 器后，这两束光被分时交替照射于同一样品池，然后由检测器测量 和记录样品溶液对波长九i 和九2 两条光束的吸收差a ，国产 w f 2 8 0 0 - - s 型双波长分光光度计光学系统见图3 7 。 一般双波长分光光度计可以双波长方式工作，亦