（光学工程专业论文）扫描探针显微镜生物成像研究与光镊的fdtd模拟.pdf

犬连理j ：人学博士学位论文 摘要 本文描述了扫描探针显微镜在生物领域的应用和光镊的数值模拟研究。对于前者， 阐述了原予力显微镜( a f m ) 对生物样品的成像研究，原子力与光子扫描隧道组合显微 镜( a f p s t m ) 的实验操作及其对各种样品的成像，特别是生物样品的成像。对于后者， 探讨了时域有限差分法在光镊理论研究中的应用。 扫描探针显微镜是对固体表面进行高分辨研究的工具。原子力显微镜由于对样品的 导电性没有特殊要求，并且能在接近生理条件下测量活的生物样品，从而成为生物领域 的重要研究工具。本文通过对变形杆菌、狗肾上皮细胞和流感病毒的原子力显微镜成像 研究，说明了原子力显微镜对临床医学和环境科学的应用。在对狗肾上皮细胞成像时， 观察到细胞表面的小孔凹陷和突起，并获得了细胞膜表面细胞被( 糖萼) 的结构。在对 流感病毒成像时，观察到了病毒表面的糖蛋白突起。 原子力与光子扫描隧道组合显微镜结合了原予力显微镜与光子扫描隧道显微镜的 功能，能够在获得原子力显微镜形貌和相位图像的同时，通过对称照明样品，减少了原 有光子扫描隧道显微镜所存在的假象；通过图像分解，可以获得样品的透过率和折射率 图像。本文探讨了原子力与光子扫描隧道组合显微镜的实验操作，即如何具体实现原子 力显微镜与光子扫描隧道显微镜的功能。文章通过对各种样品成像，验证了原子力与光 子扫描隧道组合显微镜的功能。论文探讨了原子力与光子扫描隧道组合显微镜在生物领 域的应用，揭示出它也能成为生物应用的重要研究工具。特别是在对海湾扇贝雄性生殖 腺切片成像时，不仅观察到了海湾扇贝精子切片的表面形貌，通过光子扫描隧道显微镜 透过率和折射率图像，还观察到精子头部细胞核内的精细结构。 光镊是利用光的辐射压来研究微观及介观粒子的工具。光镊能对生物样品进行非侵 入式微操作。本文利用光镊对酵母菌细胞进行了捕获与操作。 光镊的理论是不完备的，特别是对于微米尺度( y e 波长) 的粒子，至今尚没有较好 的理论来描述。本文用三维时域有限差分法，探讨了微米尺度粒子所受的光辐射压力。 光辐射压力由m i n k o w s k i 电介质中的动量转换推出，入射聚焦光场用r i c h a r d s w o l f 散 射场理论来确定。计算所得的辐射压力与实验结果非常符合。 论文的研究结果表明： ( 1 ) 用a f m 对生物样品成像，可以得到样品表面精细结构的信息；用自行研制的 a f p s t m 不仅可以得到表面形貌，还可以得到生物体内部的结构信息。以a f m 为基础 的显微成像工具在生物领域具有广阔的应用前景。 孙伟：扫描探针显微镜生物成像研究与光镊的f d t i ) 模拟 ( 2 ) r i c h a r d s w o l f 矢量衍射理论与三维f d t d 方法结合可获得光束焦点区域小球所 产生的散射场。利用m i n k o w s k i 电介质中光子动量表达式所得到的光子动量转换可得出 小球所受的辐射压力。计算结果与实验结果相符，验证了此方法的正确性和计算的可靠 性。 关键词：扫描探针显微镜；原子力显微镜：光子扫描隧道显微镜；光镊；时域有限差分 法 大连理工大学博士学位论文 s c a n n i n gp r o b em i c r o s c o p yi m a g i n go fb i o l o g i c a lo r i g i n a n df d t ds i m u l a t i o no fo p t i c a lt w e e z e r s a b s t r a c t t 1 1 i st h e s i sd e s c r i b e st h eb i o l o g i c a la p p l i c a t i o n so fs c a n n i n gp r o b em i c r o s c o p y ( s p m ) a n dt h es t u d yo ft h eo p t i c a lt r a p p i n g 也e o r y f o rt h ef o r m e r ，b i o l o g i c a li m a g i n gs t u d yo f a t o m i cf o r c em i c r o s c o p y ( a f m ) ，a t o m i cf o r c e p h o t o ns c a n n i n gt u n n e l i n gm i c r o s c o p e ( a f p s t m ) o p e r a t i n g ，a n db i o l o g i c a li m a g i n go fa f p s t ma r ee l u c i d a t e d f o rt h el a t e r ， a p p l i c a t i o nf o rt h eo p t i c a lt w e e z e r st h e o d ru s i n gt h ef i n i t ed i f f e r e n c et i m ed o m a i n ( f d t d ) m e t h o di sd i s c u s s e d s c a n n i n gp r o b em i c r o s c o p yi s o n eo fp o w e r f u lt e c h n i q u e ss t u d y i n gt h es o l i db o d y s u r f a c e 、i t l l h i g hs p a t i a lr e s o l u t i o n a f m o v e r c o m i n g t h el i m i t a t i o n si n i m a g i n g n o n - c o n d u c t i n gs a m p l e s ，a n da l l o w i n gm e a s u r e m e m so fn a t i v eb i o l o g i c a ls a m p l e s i n p h y s i o l o g i c a l l i k ec o n d i t i o n s ，b e c o m e sa ni m p o r t a n tt o o lt ot h es t u d yo fs a m p l e so fb i o l o g i c a l o r i g i n t h i st h e s i si l l u s t r a t e st h ec l i n i c a la n de n v i r o n m e n t a lr e s e a r c h e s o fa t o m i cf o r c e m i c r o s c o p y ，u t i l i z i n ga f mi m a g i n go fp r o t e u s ，c a n i n er e n a le p i t h e l i a l c e l la n di n f l u e n z a v i r u s e s i nt h ea f mi m a g e so fc a n i n er e n a le p i t h e l i a lc e l l ，t h eg r a n u l e sa n dt h eh o l eo nt h e c e l ls u r f a c ea r es h o w n ，a n dt h es t r u c t u r eo fg l y c o c a l y xo nt h ec e l lm e m b r a n ei so b t a i n e d i n t h ea f mi m a g e so fi n f l u e n z av i r u s e s ，t h eg l y c o p r o t e i np r o t m s i o n so nt h em i n i ss u r f a c ea r e s h o w n a t o m i cf o r c e p h o t o ns c a n n i n gt u n n e l i n gm i c r o s c o p ew h i c hc o m b i n e sa f ma n dp h o t o n s c a n n i n gt u n n e l i n gm i c r o s c o p e ，c a ni m p l e m e n tt h ea f mi m a g i n g ，a n de l i m i n a t et h es p u r i o u s i m a g ew i t ht w o - b e a ms y m m e t r i ci l l u m i n a t i o ns y s t e m w i t ht h em e t h o do fs e p a r a t i n gi m a g e ， t h et r a n s m i t t i v i t ya n dr e f r a c t i v ei n d e xi m a g e so fs a m p l ea r eo b t a i n e du s i n ga f p s t m i nt h i s t h e s i s ，t h eo p e r a t i n go fa f p s t mi sd i s c u s s e d ，t h a ti sh o wt op e r f o r mt h ef u n c t i o n so fa f m a n dp s t mi m a g i n gs i m u l t a n e o u s l y t h ef u n c t i o no fa f p s t mi sv a l i d a t e db yi m a g i n g r e s e a r c ho fav a r i e t yo fs a m p l e s b i o l o g i c a la p p l i c a t i o n su s i n ga f p s t ma r es t u d i e d a n di ti s s h o w nt h a ta f p s t mi so n eo fp o w e r f u lt e c h n i q u e si nt h es t u d yo fl i f es c i e n c e e s p e c i a l l y ，i n t h ea f p s t mi m a g e so ft h es p e r m a r yo fr e p r o d u c t i o ns y s t e mo fa r g o t e c t e ni r r a b i a n s 。t h e u l t r a m i c r o s c o p i cs t r u c t u r e s o ft h es p e r m k a r y o n i ss h o w nt h r o u g ht r a n s m i s s i v i t ya n d r e f r a c t i v ei n d e xi m a g e s ，w h i l et h ei t st o p o g r a p h yi so b t a i n e d o p t i c a lt w e e z e r si s at e r md e s c r i b i n gt h em a n i p u l a t i o no fm i c r o s c o p i ca n dm e s o s c o p i c p a r t i c l e su s i n gt h el i g h tr a d i a t i o np r e s s u r ef o r c e n o ni n v a s i v em a n i p u l a t i o no fb i o l o g i c a l 孙伟：扫描探针显微镜生物成像研究与光镊的f d t d 模拟 p a r t i c l e sc a r lb ep e r f o r m e du s i n go p t i c a lt w e e z e r s i nt h i st h e s i s ，t h ey e a s tc e l l sa r et r a p p e d a n dm a n i p u l a t e d t h et h e o r yo fo p t i c a lt w e e z e r si sn o tc o m p l e t e e s p e c i a l l y ，f o rt h em i c r o n s i z e dp a r t i c l e ， t h e r ei sn o tap r e t t yt h e o r ys of a r i nt h i st h e s i s ，t h el i g h tr a d i a t i o np r e s s u r ef o r c ee x e r t e do n t h em i c r o n s i z e dp a r t i c l ei sc a l c u l a t e du s i n gt h et h r e ed i m e n s i o nf i n i t ed i f f e r e n c et i m ed o m a i n ( f d t d ) m e t h o d o p t i c a lr a d i a t i o np r e s s u r e f o r c ei sd e t e r m i n e d a c c o r d i n g t ot h e e l e c t r o m a g n e t i cm o m e n t u mi n t e r p r e t a t i o nd u et om i n k o w s k i t h er i c h a r d s w o l fv e c t o rf i e l d e q u a t i o n sa r ea p p l i e dt ot h es c a t t e r e df d t da p p r o a c ht os p e c i f ya r ti n c i d e n tf o c u s e db e a m t h e s er e s u l t sa r ei na g r e e m e n tw i t ht h ep u b l i s h e de x p e r i m e n t s t h er e s u l t ss h o w ： ( 1 ) mu l t r a m i c r o s c o p i cs t r u c t u r e so fb i o l o g i c a ls a m p l es u r f a c ec a r lb eo b t a i n e du s i n g a f m w i t l la f p s t m ，n o to n l yt h et o p o g r a p h yo ft h eb i o l o g i c a ls a m p l es u r f a c e ，b u ta l s ot h e i n f o r m a t i o nb e n e a t ht h es u r f a c ec a r lb eo b t a i n e d 1 1 1 ei m a g et o o l sb a s e do na f mh a v eb e e n d e m o n s t r a t e dt oh a v eg r e a tp o t e n t i a lf o ra p p l i c a t i o nt ot h es t u d yo f b i o l o g i c a ls y s t e m s f 2 1u s i n gt h r e e d i m e n s i o nf d t dm e t h o dc o m b i n e d 谢t 1 1r i c h a r d s w o l fv e c t o r d i f f r a c t i o nt h e o r y t h es c a t t e r e df i e l dd i s t r i b u t i o no fb e a d s1 0 c a t e dn e a rt h ef o c u s e ds p o ti s c o m p u t e d o p t i c a lr a d i a t i o np r e s s u r ef o r c ei sd e t e r m i n e di nt e r m so ft h ee l e c t r o m a g n e t i c m o m e n t u mi n t e r p r e t a t i o nd u et om i n k o w s k i n l er e s u l t sd e m o n s t r a t et h a tt h i sm e t h o di s c o r r e c t k e yw o r d s ：s p m ；a f m ：p s t m ；o p t i c a lt w e e z e r s ；f d t d i v 独创性说明 作者郑重声明：本博士学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作及取得研究成果。尽我所知，除了文中特另r i j h 以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得大连理 工大学或者其他单位的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 作者签名：呈三! 至日期：竺! i ! ：! ! 人近理i 人学硕十研究生学位论文 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解“大连理工大学硕士、博士学位论文版权使用 规定”，同意大连理工大学保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连理工大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，也可采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论 文。 作者签名堡! 圭 聊虢m 丛年月卫日- 人连理工大学博士学位论文 引言 1 9 8 1 年，g b i n n i g 、h r o h r e r 等发明了扫描隧道显微镜( s t m ) ，在二十世纪八 十年代早期，s t m 第一次对硅表面获得了真实空间原子分辨图像。现在，在它基础上 形成的扫描探针显微镜家族( s p m ) 己被用在许多领域，包括基础表面科学、常规表面 粗糙度分析、以及从硅原子到活细胞表面微米突起的三维成像等等。 根据探针类型的不同，s p m 方法可分为：扫描隧道显微学( s t m ) 、原子力显微 学( a f m ) 和扫描近场光学显微学( s n o m ) 等。s t m 仅适合导电样品，而a f m 和 s n o m 对样品的导电性质没有要求。这为a f m 和s n o m 研究生物样品打开了方便之门。 在s n o m 中，有一类被称为光子扫描隧道显微镜( p s t m ) ，尽管在其初始时，光 学图像中存在假象，但与目前最普遍使用的s n o m 小孔s n o m 相比，通光效率和 分辨率更高。1 9 9 3 年以来，吴世法教授提出用非相干p 偏振光束对称照明的方式来减小 早期p s t m 中的假像。在此基础上，研制了原子力与光子扫描隧道组合显微镜 ( a f p s t m ) 。 用强聚焦激光所产生的力来操纵微观和介观粒子的装置称为光镊。1 9 8 6 年，a r t h u r a s h k i n 发现由于光的三维强度梯度，聚焦到衍射极限的单束激光光斑能够把透明的物体 限制在光强最强的区域。在过去二十年里，光镊系统已成为生物研究的重要工具，能够 操作的粒子范围从细胞内结构，如染色体或马达蛋白，到整个细胞。 本文正是在这两种在生物方面有重大应用的领域内，进行了研究。探讨了a f m 和 a f p s t m 在生物领域中的应用，重点在a f m 生物成像和a f p s t m 的实验研究与生物 成像，同时在理论上，用时域有限差分( f d t d ) 方法探讨了光镊中的光捕获力及捕获 效率。相关的基金包括国家自然科学基金( 3 0 2 7 0 3 6 7 ) 、教育部博士点基金( 2 0 0 2 0 1 4 1 0 1 8 ) 和科技部仪器开发基金( g n 一9 9 15 ) 。 本文主要可分为前后两大部分。前半部分是扫描探针显微镜的成像研究。后半部分 主要关注光镊的研究，特别是光镊的理论研究。 前半部分共分三章。 第一章介绍了扫描探针显微镜的基本原理。该章从扫描探针显微镜历史发展的角 度，分别介绍了s t m 、a f m 和s n o m 。分别探讨了它们的基本原理，成像中的局限， 以及在各方面的进展，包括探针、测量传感器和各种方法结合。 第二章主要综述了a f m 在生物领域中应用。该章先在第一章的基础上，从生物应 用特别是生物成像的角度对a f m 的基本原理，包括工作原理、成像模式和分辨率进行 了说明。然后对a f m 的生物成像进行了概述，分别从a f m 对d n a 、蛋白质、质膜和 l i 孙伟：扫描探针显微镜生物成像研究与光镊的f d t d 模拟 细胞的角度进行了阐述。综述了不同样品的样品制备、成像条件和成像模式，并说明了 不同样品的图像解释。在该章的最后，用p i c o p l u s 扫描探针显微镜对临床应用与环境科 学的几种样品：变形杆菌、狗肾上皮细胞和流感病毒进行了成像研究。 第三章是本文的主要部分，探讨了a f p s t m 及其实验研究。该章首先从p s t m 的 成像原理出发，阐述了p s t m 所获得的信号实质。然后介绍了吴世法教授的p s t m 消假 象和图像分解方法。在这基础上，对a f p s t m 的光纤探针、主体框架、扫描器、电子 系统、工作软件等方面进行了介绍。着重探讨了光纤探针在a f p s t m 中的各种实验特 征。该章对a f p s t m 的成像应用进行了阐述。对标准样品：光栅和氟化镁膜进行了成 像研究，以测验a f p s t m 的基本功能。a f p s t m 更重要的研究是生物成像研究，该章 对超薄切片、细胞和病毒进行了研究，显示了其在生物应用领域的潜力。 后半部分共分两章。 第四章综述了光镊的基本原理和应用进展。该章首先从历史角度介绍了光学捕获的 源起与发展。紧接着介绍了光镊对捕获力的测量与定标。然后概述了光镊在生物领域的 应用进展。最后，用光镊对酵母菌细胞进行了捕获与操作。 第五章是本文的重要部分，探讨了光镊的f d t d 数值模拟。首先综述了光镊理论发 展。然后，用散射场三维f d t d 方法，计算了微米尺度粒子所受的光辐射压力及光捕获 效率。经过与实验结果和其他理论对比，发现计算结果与实验极为符合。相对于其他理 论，计算结果更接近于实验检测。 在论文的最后，总结了主要工作，提出了存在的问题，并对所研究领域的前景进行 了展望。 大连理工人学f 尊+ 学位论文 1 扫描探针显微学 扫描探针显微学( s c a n n i n gp r o b em i c r o s c o p y ，s p m ) 是对固体表面局域的形态和性 质进行高分辨研究的方法。二十多年来，扫描探针显微学从极少数研究者手中的新奇方 法，成为了研究表面性质广泛使用的工具。扫描探针显微学也成为纳米技术创造纳 米尺度结构的技术新方法发展的基础。目前，扫描探针显微学是正在迅速发展的技术， 属于应用科学研究领域。 扫描探针显微镜( s p m ) 按探针类型的不同可分为：扫描隧道显微镜( s c a r m i n g t u n n e l i n gm i c r o s c o p e s t m ) 、原子力显微镜( a t o m i c f o r c em i c r o s c o p e ，a f m ) 、扫描 近场光学显微镜( s c a n n i n gn e a r f i e l do p t i c a lm i c r o s c o p e ，s n o m ) 以及其他许多有着类 似工作原理的仪器。本章对s p m 家族的主要成员分别进行介绍。 1 1 扫描隧道显微学 扫描隧道显微镜( s t m ) 是扫描探针显微镜家族的第一个成员，1 9 8 1 年由瑞士科 学家b i n n i g 、r o h r e r 、g e r b e r 等【1 发明。它为我们研究原子分辨的物体提供了帮助：可 以在真实空间看到平整表面的原子分布。在其发明的那一年，利用其解决了表面科学一 个很吸引人的问题：s i ( 111 ) ( 7 7 ) 表面结构【2 j 。1 9 8 6 年，s t m 的发明者g b i n n i g 和 l r o h r e r 被授予诺贝尔物理学奖。 图1 1 所示为扫描隧道显微镜( s t m ) 的通常装置：尖锐的探针固定到可以在x 、y 、 z 方向进行亚原子精度三维移动的扫描器上。探针通常是一根经过化学腐蚀或机械加工 得非常尖的导线。探针材料是钨、铂铱合金或纯铱。 图1 1 扫描隧道显微镜示意图 f i g 1 1s c h e m a t i co fs t m 孙伟：扫描探针显微镜生物成像研究与光镊的f d t d 模拟 对样品外加偏压，当探针与样品距离几埃( 几个原子直径) 时，隧道电流，流过探 针与样品。，是针尖与样品之间距离z 的函数，用其作z 反馈环路的反馈信号。根据量 子力学， ，( z ) = l o e 。”。 ( 1 1 ) 厶是外加电压与针尖和样品态密度的函数， k = j 2 m o h ， ( 1 2 ) 其中m 是电子的有效质量，a 是普朗克常数，o 是功函数。对于金属，oz4 e v ，所以 k z 1 0 n m 。当z 增加o 1 n m 时，电流降低一个数量级。 测量隧道电流的是电流一电压转换器( 图1 2 ) ，简单的转换器仅由一个低噪音、低 输入偏置电流的单运算放大器( o p a ) ，与一个阻抗r = 1 0 0 m q 且寄生电容小的反馈电 阻组成。 五 图1 2 电流电压转换器 f i g 1 2ac u r r e n t - t o v o l t a g ec o n v e r t e r s t m 有两种工作模式：恒电流模式和恒高模式。在恒电流模式，l 是常数，探针 在x y 平面扫描，记录z 的位置，从而获得图像。在恒高模式，探针迅速扫描，不需要 反馈沿着样品起伏，样品表现为，的变化。通常以光栅模式扫描，有一个快扫描方向( 锯 齿或正弦信号) 和一个慢扫描方向( 锯齿信号) 。计算机控制x y 平面的表面扫描，记 录针尖的z 位置( 恒电流模式) 或l ( 恒高模式) ，从而获得z ( x ，y ，* 常数) 或( x ， y ，三“常数) 的图像。 1 2 原子力显微学 1 9 8 6 年，在s t m 的基础上，b i n n i g 、q u a t e 和g e r b e r 3 1 发明了原子力显微镜( a f m ) 。 a f m 克服了s t m 无法对非导电样品成像这一限制。除了把隧道探针换成力传感器，a f m 与s t m 类似。力传感器( 探针针尖) 与样品之间的势能为v 。针尖一样品力的z 分量 人连理工大学博七学位论文 f t 。= 一0 v t 。赴，针尖一样品弹性常数k ，；= 一o f , 。龙。取决于工作模式，a f m 使用f t 。或 某种从k 导出的量作为成像信号。 1 2 1 针尖一样品力 与隧道电流有非常短的作用范围不同，f l 。有长程和短程作用。真空中，存在短程的 化学力( n m 以内) 和长程的范德瓦耳斯力、静电力和磁力( 大到1 0 0 n m ) 。空气中， 还可能存在由针尖与样品表面的粘附层( 水或碳氢化合物) 形成的毛细作用力。 描述化学键有如下几种：m o r s e 势 4 】 v m o 。= 一e b o n d ( 2 e 一。( 二一一e - 2 ( ：1 ) ( 1 3 ) 描述了键能为e 6 。d 、平衡距离为仃和衰减常数为k 的化学键。l e n n a r d j o n e s 势4 】 v l 。一e h d f2 了o - o 一譬l ( 1 4 ) 。 z 为原子之间的距离。m o r s e 势可用来定性描述化学力，但不满足化学键是各向异性这 一重要性质。化学键，特别是共价键，键强度与角度相关。考虑共价键方向性的经验模 型是s t i l l i n g e r w e b e r 势【5 1 、t e r s o f f 势等【6 】。 范德瓦耳斯相互作用是由原子的电偶极矩变化和它们的相互极化引起的。对于距离 为z 的两个原子，能量按1 z 6 变化 4 1 。使用h a m a k e r 方法【7 1 可以计算宏观物体之间的范 德瓦耳斯相互作用。对于接近平整表面，半径为r 的球形针尖，范德瓦耳斯势为【4 u 。w ：一_ a h r 。 ( 1 5 ) o z z 是表面原子中心所在平面与最接近的针尖原子中心之间的距离，a 。是常数。所以球形 针尖的范德瓦耳斯力正比于1 z 2 ，而对于金字塔和圆锥针尖，l z 定律成立【8 1 。范德瓦耳 斯相互作用非常大，是力显微学的主要影响因素。 当针尖与样品都是导体，如存在静电势差u 0 ，则有静电力。如果平整表面与半 径为r 的球形针尖之间的距离小于r ，力大约是【9 1 e 。( z ) = - - 石e o r _ u 一2 。 ( 1 6 ) c f 与范德瓦耳斯相互作用类似，静电力也可能引起较强的相互作用。 ii，l， 孙伟：扫描探针显微镜生物成像研究与光镊的f d t d 模拟 1 2 2 力传感器( 悬臂) 力传感器是a f m 的核心部件，也是与扫描隧道显微镜的主要差别之一，检测针尖 与样品之间作用力的是弹力臂。为了检测垂直方向的针尖一样品力，探针必须在两个轴 向上是刚硬的，而在第三个轴向上是相对柔软的。悬臂梁满足这种性质( 图1 3 ) 。 图1 3 微加工悬臂的俯视图与侧视图 f i g 1 3t o pv i e wa n ds i d ev i e wo f a m i c r o f a b r i c a t e dc a n t i l e v e r 对于尺寸为w 、t 、l 的长方形悬臂，弹性常数k 为 1 0 l ， y w t k 百 其中y 是杨氏模量。基模本征频率【1 o 】 f o = o 1 6 2 t 。，犀p - ， ( 1 7 ) ( 1 8 ) 其中p 是悬臂材料的质量密度。 悬臂的重要特性是劲度k 、本征频率矗、品质因子q 、本征频率随温度的变化 色，；l a r ，当然还有针尖的化学成分与结构。最初，a f m 多数工作在接触模式，悬臂劲 度应该小于固体的原子间弹性常数【1 1 1 ，k l o n m 。这种限制被认为对动态原子力显微 学也成立。然而后来动态原子力显微学显示，k 值大于几百n m 有助于减少噪音，增加 稳定性1 1 2 】。q 因子取决于悬臂的阻尼机制。对于工作在空气中的微机械加工悬臂，q 主 要受限于粘滞拉力，其数量为几百，然而在真空中，悬臂材料的内部和表面效应对应着 阻尼，q 达到几十万。 最初，悬臂由粘有金刚石针尖的金箔【1 3 】制成。简单的悬臂甚至可由切割铝箔【1 l j 或腐 蚀钨导线而成。后来，采用硅的微机械加工技术来制作悬臂。在动态原子力显微学 中，探针的某些要求类似于钟表控时元件所需的性质：相对于时间和温度变化极高的频 率稳定性及非常少的能量消耗。石英音叉具有这样的特性，a f m 发明后不久，就进行 了石英探针的实验研究 m 1 。石英音叉有许多优点，但是作为力传感器，其结构有明显缺 火连理： 大学博士学位论文 陷。音叉的重要优势是q 值高，这是两股叉相反振动的结果，两股叉振动所需的动力正 好抵消。然而这仅在两股叉的本征频率精确匹配时才成立。固定在一股叉上的针尖，与 针尖和样品的相互作用破坏了音叉几何结构的对称性。通过固定两股中的一股，把音又 对称变为单悬臂对称，另一悬臂粘到大质量的低损耗衬底上，可以避免这种问题 1 + 7 。 理想的针尖前端应该只有与样品剧烈作用的单个原子，因此针尖半径应尽可能小。 由于s i 和s i 0 2 的腐蚀速率不同，可把这些针尖腐蚀得非常尖”。近来发现，除了针尖 的尖锐程度，针尖前端原子的配位也很关键。针尖与样品可认为是两个大分子【1o 】，在两 种原子或分子之间的化学反应中，化学式和空间结构起非常重要的作用。所以，对于高 分辨的原子力显微学，前端原子的化学式和键的结构很重要。在 0 0 1 方向硅针尖中，前 端原子受到两个虚悬键作用，与针尖的其余部分仅有两个键相连。而指向【1 11 方向的针 尖前端原子有三个键与针尖其余部分相连，很明显更稳定。实验显示这种针尖非常接近 表面而不受损【1 9 】。 在第一代a f m 中，用s t m 来测量悬臂的偏转。悬臂的背面是金属，隧道针尖逼近 它来测量悬臂偏转【3 1 。尽管隧道效应对距离变化非常灵敏，但这种方法有许多缺陷：难 以确定隧道针尖的位置以便对准悬臂前端非常小的区域；不可能区分作用力是悬臂样 品还是悬臂一隧道针尖相互作用引起的；当悬臂偏转时，也移动针尖在悬臂背面的横向 位置，悬臂背面的粗糙度加上横向运动产生非线性信号。后来，使用光学( 干涉仪、光 束反射) 或电学方法( 压阻、压电) 来测量悬臂偏转。最通常测量硅悬臂的偏转是通过 干涉仪，或通过一束光从悬臂反射并测量光束偏转( 光杠杆) 2 0 ，2 ”。悬臂的偏转常受到 热漂移和其他噪音因素的影响。这可用偏转噪音密度随频率变化来表示，典型的噪音密 度如图1 4 。用低热膨胀系数材料制造a f m ，或在低温下工作有助于减少1 f 噪音。 | | 1 ：；一 f 哪z l 图1 4 悬臂偏转探测器的噪音谱 f i g 1 4n o i s es p e c t r u m o fat y p i c a lc a n t i l e v e rd e f l e c t i o nd e t e c t o r 孙伟：扫描探针显微镜生物成像研究与光镊的f d t d 模拟 温度的变化可以引起悬臂变形及其本征频率的变化。在动态工作模式中，温度变化 引起f n 漂移，增加了垂直噪音。本征频率是由悬臂的弹性常数和有效质量决定的。由于 热膨胀和杨氏模量y 随温度变化，弹性常数随温度变化。通常悬臂包含至少10 1 4 个原 子，所以从样品得到几个原子或一些原子从针尖转移到样品，有效质量变化是可以忽略 的。悬臂的共振频率由方程( 1 8 ) 给出。因为悬臂材料中的声速v 。= y p ，方程( 1 8 ) 可表示为【1 0 】 f o = o 1 6 2 v s f t 。 ( 1 9 ) 那么本征频率随温度的变化为 土坠：上盟一a ，( 1 1 0 ) t j d i v 。i 其中a 是热膨胀系数。 1 2 3a f m 的工作模式 ( 1 ) 静态原子力显微学( 接触模式，c o n t a c tm o d e ) a f m 中，针尖与样品之间的力f 忸是成像信号。在接触模式中，力转化为悬臂偏转 q = r k 。因为悬臂偏转应该比针尖与样品的形变大得多，所以限制了k 的范围。固体 原子间力常数的范围为1 0 n m 1 0 0 n m ，对生物样品，可以小到o 1 n m 。通常，静态 模式中k 是o 0 1 5 n m 。本征频率f n 应高于所需的探测带宽，以避免悬臂的共振激励。 静态原子力显微学能实现原子分辨m - 2 4 ，但是这种方法可能仅在特殊情况。在低温 工作，或用热膨胀系数小的材料搭建a f m ，可以减少1 f 噪音。把针尖样品浸入液体中 【列，或在跳触( j u m p - t o c o n t a c t ) 发生后，回缩悬臂来部分补偿引力 2 3 】，可消除长程引 力。j a r v i s 等【2 5 】通过对悬臂加电磁力来消除长程引力。 尽管如此，静态a f m 图像的物理解释是简单的：图像是图z ( x ，y ，f t 。= 常数) 。 ( 2 ) 动态原子力显微学 在动态工作模式，悬臂振动。悬臂固定到振动装置上，以便外加振动激励。有两种 基本动态操作方法：振幅调制( a m ) 和频率调制( f m ) 。在a m a f m 中【2 6 】，用固定 的振幅a 。在固定的频率。驱动致动器，其中l 。接近但不同于厶。当针尖趋近样 品时，弹性与非弹性相互作用引起悬臂振幅和相位( 相对于驱动信号) 的变化。这些变 化可用作反馈信号。a m 模式的振幅变化并不马上随着针尖一样品相互作用变化而变化， 而是在时间范围f a m “2 q f 0 。真空中，q 因子达到1 0 00 0 0 ，a m 模式工作非常慢。 夫连理f 大学博士学位论文 a l b r e c h t 、g r u t t e r 、h o m e 等 2 ”解决这个问题是引入频率调制( f m ) 模式，本征频率的 变化在单个振动周期内，时间范围为f ，。z 1 f o 。 最初，a m 和f m 模式都意味着“非接触”模式，即针尖前端原子与样品之间的合 力是引力。后来，在包含斥力的针尖一样品相互作用的更近的距离范围，a m 模式非常成 功( 轻敲模式，t a p p i n gm o d e ) 2 8 ，1 9 9 6 年e r l a n d s s o n 等1 2 9 】用腐蚀钨悬臂工作在a m 模式获得了真空中s i 的原子分辨图像。真空中使用f m 模式显著提高了分辨率，最终实 现了原子分辨【3 0 】。 1 2 4 存在的困难 在扫描隧道显微学中，针尖必须以皮米的控制精度扫描表面，同时用反馈机制调整 z 位置以使隧道电流为常数。然而，要实现高分辨a f m ，有更多困难。对比两类显微镜 中使用的物理量特性，某些困难变得清楚。图1 5 显示了隧道电流和针尖样品力随距离 的变化。隧道电流是针尖样品距离的单调函数，随距离的减小迅速地增加。相反，针 尖样品力有长程与短程分量，并不单调。 写 o 0 j 鼍 ： o 芝 ： n m ) 图1 5 隧道电流和力与针尖前端原子中心和表面原子层中心平面距离的关系 f i g 15p l o to f t u n n e l i n gc u r r e n ta n df o r c ea saf u n c t i o no f d i s t a n c eb e t w e e nc e n t e ro f f r o n ta t o ma n dp l a n e d e f i n e db yt h ec e n t e r so f s u r f a c ea t o ml a y e r ( 1 ) 稳定性 真空中范德瓦耳斯力总是引力，如果针尖与样品之间产生化学键，其距离大于平衡 距离，化学力也是引力。因为针尖固定在弹力臂上，当悬臂的劲度小于特定值时，趋近 针尖可能引起跳触。 如果 孙伟：扫描探针显微镜生物成像研究与光镊的f d t d 模拟 k m a x ( - k ) = 硭“， ( 1 1 2 ) 即使是软悬臂，也可以避免跳触。如果f 。z ) 关系中发生滞后现象，每个振动周期需要 给悬臂提供能量a e 。如果这种能量损耗大于悬臂固有能量损耗，幅度控制可能变得困 难。那么关于k 与a 的新推测是f 3 2 】 墨a 2 a e 。q 。 ( 1 1 3 ) 2”2 z 所以满足稳定性需要大振幅，或使用弹性常数大的悬臂，或两者都需要。 ( 2 ) 非单调成像信号 隧道电流值随针尖样品距离减少连续地增加，即隧道电流是距离的严格单调递减 函数。这种性质使得反馈环路容易实现：隧道电流迸入对数放大器产生与针尖一样品距 离成线性的误差信号。 相反，针尖一样品力不是单调的。通常，距离大时是引力，距离减小变为斥力( 图 1 5 ) 。稳定反馈仅可能在力曲线是单调的一侧。 ( 3 ) 长程力 针尖与样品之间的力由许多成分组成：在真空中有静电力、磁力、范德瓦耳斯力和 化学力。在空气中，还有毛细作用力。尽管通过使针尖与样品的静电势相等、使用非磁 性针尖和工作在真空来消除静电力、磁力和毛细作用力，但是范德瓦耳斯力不可能抵消。 在s t m 中，即使是相当钝的针尖，由于隧道电流随距离迅速衰减，自然排除了与距离 较远的针尖原子的贡献。相反，在静态原子力显微学中，长程与短程力组成成像信号。 在动态原子力显微学中，通过选择合适的悬臂振幅a ，可以减少长程力成分。 1 3 扫描近场光学显微学 1 3 1 概述 光学显微镜自问世以来，己历经四百年的演变。十七世纪，列文虎克( l e e u w e n h o e k ) 首次通过玻璃透镜看到“a n i m i c u l e s ”。这是人类有史以来第一台光学显微镜。到十九 世纪，光学显微镜的发展已有长足的进步，并奠定今天显微镜的规格，如z e i s s 致力于 显微镜的制作，a b b e 提出了显微光学原理的理论基础，s c h o t t 对光学玻璃详尽地研究。 人