（化学工艺专业论文）径向整体柱的制备与色谱性能研究.pdf

摘要 摘要 整体分离材料被誉为第四代色谱固定相，代表了生物大分子分离所采用色谱固定相 的最新进展。其内部相互连通的多孔网络由大孔( 孔径 5 0n m ) 、中孔( 5 0 n m 孑l 径 2n m ) 及微孔( 孔径 5 0n m ) ，m e s o p o r e s ( p o r t d i a m e t e r sb e t w e e n5 0n ma n d2n m ) a n dm i c r o p o r e s ( p o r ed i a m e t e r s 2n m ) t h ( m a c r o p o r e sc a ne n s u r e e x c e l l e n tc o n v e c t i v em a s st r a n s f e rb e t w e e nt h em o b i l ea n dt h ( s t a t i o n a r yp h a s e s ，w h i c hs u b s t a n t i a l l yi n c r e a s et h em o b i l i t yo ft h em o l e c u l e st ob es e p a r a t e c b ys e v e r a lo r d e r so fm a g n i t u d ec o m p a r e dt ot r a d i t i o n a lb e a dc o u n t e r p a r t s w h i l em e s o p o r e , a n dm i c r o p o r e sc a na f f o r de n o u g ha c t i v es i t e sf o rg r a f t i n gf u n c t i o ng r o u p st h a te n d o wt h ( m o n o l i t h i cs u p p o r tw i t hs o m ec l l r o m a t o g r a p h i cs e p a r a t i o nc a p a b i l i t i e s t h eh i 【班r e s o l u t i o r a n dc a p a c i t y , w h i c ha r ei n d e p e n d e n to ff l o wr a t e ，c a l lb ea c h i e v e di nm o n o l i t h s ，a n de v e r u n d e rt h eh i g hf l o wr a t e ，t h ep r e s s u r ed r o pi sm o d e r a t e d u et os u c hc h a r a c t e r i s t i c s ，t h e ya “ s u i t a b l ef o rt h eq u i c kp r e p a r a t i v es e p a r a t i o no fb i o p o l y m e r s ，s u c ha sp r o t e i n s ，p o l y p e p t i d e , , a n do l i g o n u c l e o t i d e s g l y c i d y lm e t h a c r y l a t e - b a s e dm o n o l i t h s w e r ei n t r o d u c e di nt h e1 9 9 0 s ，w h i c hw e r p o l y m e r i z e df r o mg l y c i d y lm e t h a c r y l a t e ( g m a ) a n de t h y l e n ed i m e t h a c r y l a t e ( e d m a ) i nt h p r e s e n c eo fp o m g e n sa n di n i t i a t o r s t h ep o l y m e ri sc h e m i c a l l ya n dm e c h a n i c a l l ys t a b l ea n l c o n t a i n se p o x yg r o u p st h a tc a nb ef u r t h e rm o d i f i e dt op r e p a r et h es e p a r a t i o nu n i t ss u i t a b l ef o ： i o ne x c h a n g e ，h y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o n ，r e v e r s e d - p h a s e ，o ra f f i n i t ys e p a r a t i o n s i nt h i sp a p e r ，w ed e s i g n e dat h e r m o s t a t e da n n u l a rr e a c t o rt oe n h a n c et h eh e a tt r a n s f e ra b i l i t ： b e t w e e nt h ep o l y m e r i z a t i o ns y s t e ma n dt h ec i r c u m s t a n c e ，a n da d o p t e da na p p r o a c hf o c o n t i n u o u sa n ds l o wa d d i t i o no ft h em i x t u r et or e d u c et h eh e a te v o l v e di nu n i tt i m e b yt h m e t h o d ，a3 8m lp o r o u sp o l y m e rm o n o l i t hw i t hh o m o g e n o u sp o r es i z e d i s t r i b u t i o nw a o b t a i n e d s e mr e s u l t ss h o w e dt h eh o m o g e n e o u sp o r o u ss t r u c t u r ei nd i f f e r e n tp o r t i o n so f l - m o n o l i t h ，a n dt h eb i m o d a lp r o f i l eo fp o r es i z ed i s t r i b u t i o nw a sa b t a i n e db yb o t hm e r e u e i n t r u s i o np o r o s i m e t r ya n dr e v e r s e ds i z ee x c l u s i v ee x p e r i m e n t i d e n t i c a lr e s u l t sf r o mt h et w ( m e t h o d sp r o v e dt h ea p p l i c a b i l i t yo fr e v e r s e ds i z ee x c l u s i v em e t h o di nd e t e r m i n gt h ep o r es i z ( d i s t r i b u t i o no fm o n o l i t h i cs t a t i o n a r yp h a s e f u r t h e r m o r e ，t h ep r e s s u r ed r o po nt h ec o l m m i i 摘要 i n c r e a s e sl i n e a r l yw i t ht h ei n c r e a s eo ff l o wr a t ea n dd o e sn o te x c e e d2m p ae v e na taf l o wr a t e o f5 0m l m i n w h i c hp r o v e dt h a tt h ep r e p a r e dm o n o l i t hc a nb eu s e di nt h eq u i c ks e p a r a t i o n a n dp r e p a r a t i o no f b i o p o l y m e r s w e a kc a t i o n a n i o ni o n - e x c h a n g er a d i a lm o n o l i t h i cc o l u m n sw e r ep r e p a r e db yf u r t h e r s u r f a c em o d i f i c a t i o no ft h es t a t i o n a r yp h a s e i na d d i t i o n ，as p e c i a lh o u s i n gw a sd e s i g n e dt o p r o v i d eau n i f o r mf l o wd i s t r i b u t i o ni nt h er a d i a ld i r e c t i o no v e rt h ee n t i r em o n o l i t hb e d e x c e l l e n ts e p a r a t i o no f p r o t e i n sw a sa c h i e v e dt h r o u g ht h i ss y s t e m a n ds y s t e m i ce x p e r i m e n t a l r e s u l t si n d i c a t et h a tt h ed y n a m i cc a p a c i t ya n dr e s o l u t i o no fr a d i a lf l o wm o n o l i t h i cc o l u m na r e i n d e p e n d e n to ff l o wr a t e ，s a m p l ec o n c e n t r a t i o na n ds a m p l ev o l u m ei nab r o a dr a n g e ，w h i c h b r e a ku pt h em a g i ct r i a n g l er e l a t i o n s h i po ft h et h r e em a i np a r a m e t e r si nt r a d i t i o n a lp r e p a r a t i v e c h r o m a t o g r a p h y i th a sb e e ns h o w nt h a tp r e p a r a t i v ec h r o m a t o g r a p h i cs e p a r a t i o n so fb o v i n e s e r u m ，g o a ts e r u ma n d b o v i n eh e m o g l o b i nc a nb eo p e r a t e da tm a x i m u m p r o d u c t i v i t yw h e n t h e s y s t e mi su s e da th i g hf l o wr a t e ，b i n d i n gc o n c e n t r a t i o na n ds a m p l ev o l u m e s ow ec a np r e d i c t t h a tt h er a d i a lm o n o l i t h i cc o l u m nw i l lp l a ya ni m p o r t a n tr o l e i nb i o s e p a r a t i o n s ，n o to n l y g r e a t l yr e d u c et h eo p e r a t i n gp r e s s u r e ，b u ta l s oi n c r e a s et h et h r o u g h p u t si nu n i tt i m ea n d s h o r t e nt h ep e r i o d so f p r o d u c i n gn e wp r o d u c t s k e yw o r d s ：r a d i a lf l o w ；m o n o l i t h i cs t a t i o n a r yp h a s e s ；c o n t r o l l i n gp o r o u ss t r u c t u r e ； g m a - e d m a ；b i o p o l y m e r ；p r e p a r a t i v ec h r o m a t o g r a p h y i i i 前苦 前言 进入2 l 世纪，随着人类基因组计划的完成，世界发达国家对生物技术产业投资的 逐年加大，预示着2 1 世纪将进入生物技术高速发展的时代。由于分子和细胞生物学的 发展，在生产及科研过程中大量的蛋白质、多肽及核酸等生物大分子的分离和纯化工 作，已成为影响生化产品价格的主要控制因素，其费用通常占生产成本的5 0 7 0 ， 有的甚至高达9 0 。分离步骤多、耗时长，是制约生化产品产业化的“瓶颈”之一，因 此，迫切需要经济适用的高效、快速的分离和制备技术。 沉淀、超滤及液相色谱等技术广泛用于生物大分子的分离与纯化。相比之下，高效 液相色谱的分离效率之高、应用范围之广，是其它方法无可比拟的，通常只有液相色谱 才可以使生物产品的纯度达到g m p 所要求的水平，制备色谱己成为生物工程下游中必不 可少的纯化步骤。国际色谱界广泛关注生物样品的制备色谱研究，致力于使生物工程下 游产品的纯化和制备过程向低成本、高产出的方向发展。世界各国都对其予以高强度的 投资，我国则把生物技术一直列为高新技术，重点支持，特别是面对2 l 世纪，生物高 新技术的开发和发展更是方兴未艾。 色谱是从混合物中分离各组分的重要方法，色谱技术甚至能够分离物化性能差别微 小的组分，如消旋体等产品的纯度标准只有色谱技术爿1 能达到。较慢的液相色谱分离过 程常会导致不。i 。! 。- 。，。e a l 的显著降解，影响产品的性能和收率，提高分离成本。对于 传统的多孔颗粒填充柱，传质扩散过程严重制约了其分离速度，增加洗脱速度会使分辨 率显著下降。另一方面，对于不稳定、高附加值的生物分子的有效分离，要求在温和条 件下分离。所用这些约束条件，都对色谱过程提出了更高的要求，促进了新型色谱填料 和新柱型的研制开发。 自液相色谱技术问世以来，色谱填充材料经历了4 个发展阶段，包括从形状不规则 的填充颗粒到球形颗粒、从大的颗粒到小的填充颗粒、从不纯的填充材料到高纯的球形 硅胶颗粒以及目前的整体柱，一直在向着提高柱效和实现快速分离的方向发展。具有贯 通孔网络的整体固定相( m o n o l i t h i cs t a t i o n a r yp h a s e ) 可以有效克服生物大分子在 传统的多孔颗粒填充柱中的缓慢扩散过程，打破了传统的流速、分辨率及容量川的三角 关系即流速增加的情况下柱容量和分辨率均不会降低，且压力也不会升高。是色谱 人连理t 人学博i 学位论义 柱技术的一个最主要革新，也是色谱领域中产生的最重要突破之一。与传统的层析技术 相比大大节约了分离时间，降低了不稳定蛋白失活的可能性，使生物大分子的快速分离 纯化成为可能。 传统的轴向流动管式结构色谱柱，流体在色谱柱内沿轴向从一端流向柱的另一端， 这类色谱柱具有分离效率高，柱容量大的特点，但存在着流速慢、压降大、不易线性放 大等缺陷。为适应生物样品制备分离的要求，对于色谱柱结构的改进，尤其是上世纪八 十年代中期问世的径向流动色谱柱( r a d i a lf l o wc h r o m a t o g r a p h y ) ，解决了传统轴向 色谱技术所存在的问题。与传统的轴向柱相比。其流通的截面积增大，高流速操作时， 压力降仍很低；另外，在保持柱直径不变而只增加柱长时，可以线性增加样品的处理量 而样品韵保留和分辨率无明显变化。 本文旨在实现采用整体固定相的径向流动模式色谱操作，为此设计了适合于大体积 环形整体固定相制备的反应器及流程，用以制备孔结构均匀的整体填料：设计了适合于 承载整体固定相的径向流动模式的柱系统，用以实现整体固定相基质的成孔：研制了不 同色谱分离模式整体固定相的表面化学改性流程，用以满足不同生物样品对色谱分离模 式的要求。虽然有很多工作尚需进一步改进、完善，但毕竟为生物：亡程下游的制备色谱 技术开阔了新的思路，实现高分离速度、高处理量、高分辨率的完整统一。 文献综述 1 文献综述 1 1 引言 2 0 世纪后期，随着分子和细胞生物学的发展，在科研及生产过程中，存在大量蛋白 质、多肽及核酸等生物大分子的分析、分离和纯化工作，迫切需要高效、快速的分析、 分离和制各技术。特别是用于l 临床的生化药品，不仅要达到很高的纯度，而且在分离过 程中要最大限度地保持其生物活性。据统计，目标生物分子的分离和纯化过程( 下游过 程) ，是生物大分子制备过程中最重要同时也是最昂贵的一步，约占其总成本的5 0 以 上。国内外在这方面进行了大量的研制及开发工作，并作为科技投资的重点。沉淀、超 滤及液相色谱广泛用于上述过程，但只有液相色谱可以使产品纯度达到满意的水平。生 物样品的纯化要达到预期的水平，通常需多步色谱过程，对于任何给定的分离纯化过程， 分离步骤的减少或分离速度的提升，都将大幅度降低产品的成本。因此，伴随分子生物 学的发展，必须同时发展更为有效的生物分离技术。 液相色谱己成为实验室和工业生产中分离与纯化生物大分子的最有效和常用方法。 对于生物大分子的分离，液相色谱填料应尽量满足以下要求： 1 快速有效分离，以降低由于生物分子降解而引起的活性损失： 2 高吸附量且不受流速影响： 3 良好的分辨率且不受流速影响： 4 高渗透性，降低操作负荷： 5 方便、快捷的放大能力； 6 苛刻条件下具有足够的稳定性； 7 批次问的高度重复性。 传统的多孔颗粒填料仅能在一定程度上满足上述要求，大分子在颗粒内的缓慢扩散 过程，是实现快速分离的一个主要瓶颈。传质扩散过程严重制约了其分离速度，增加洗 脱速度和上样量会使组分的分辨率显著下降，缓慢的分离过程通常会导致产品的显著降 解。另一方面，对于不稳定、高附加值生物分子的有效分离，要求在温和条件下快速完 成，所有这些制约因素都对色谱过程提出了更高的要求。 对于色谱分离介质的研究，近年来在理论和实践等方面取得了长足发展。新的用于 克服传质限制的最主要方法是最近发明的整体色谱固定相，整体柱( m o n o l i t h i cc o l u m n ) ， 又称整体固定相( m o n o l i t h i cs t a t i o n a r yp h a s e ) 、连续床层( c o n t i n u o u sb e d ) 等，是1 1 1 t s w e t t 一个世纪以前发明色谱以来孩领域产生的最重要突破之一。有机聚合物整体固定相由含 单体、引发剂和致孔剂的混合物通过原位聚合制备而成，具有制备过程简单、孔结构均 大连理工人学博士学位论义 匀、重现性好、柱效高及快速分离等优点，在多种色谱模式下获得了成功的应用，- 并已 应用于制备色谱，尤其在蛋白质、多肽、低聚核菅酸等生物大分子的制备分离方面显示 了突出的优越性，是近年来色谱填料研究的热点之一。 传统的色谱柱是管式结构，流体在色谱柱内沿轴向从一端流向另一端，这类色谱柱 存在以下缺点： 1 流速慢，生产效率低，蛋白质在长时间分离过程中易变性失活； 2 压降大，对分离系统的操作负荷要求高： 3 当放大制备规模时，需逐级摸索分离条件，开发周期长，这是大规模分离纯化 的突出困难之一。 对于色谱柱结构的改进，尤其是上世纪八十年代中期问世的径向流动色谱( r a d i a l f l o wc h r o m a t o g r a p h y ) 的出现，为解决轴向色谱技术所固有的缺陷开辟了新的途径。径 向色谱柱与轴向柱相比，增大了流动相与固定相间的接触截面积，使高流速操作时系统 的背压下降：另外，保持柱直径不变而增加柱长可线性增大样品的处理量，但组分的 保留时间及分辨率保持不变。理论研究和实验证明，径向色谱柱具有以下特点： 1 分析速度快、处理量大、压降小，流动相与固定相间的接触面积大，且流动相流 程短，因而可用于高通量快速制备分离： 2 可按实际生产需要线性放大其生产规模，而不影响其分离性能。因此，径向色谱 柱非常适合于大体积原料如基因工程、发酵工程中产生的大体积低浓度的蛋白质、核酸 等生物大分子的富集与纯化。 本章将对径向色谱柱的结构、流体的流动模式及传质特征等方面进行介绍，同时对 固定相的制备方法、成孔机理、结构特征、流通特征、传质特征及其在生物工程领域中 的应用等方面加以系统综述。 1 2 径向流动色谱柱 虽然径向色谱技术是近十几年发展起来的一种新型色谱分离系统，但其原理和方法 可以追溯到五十年前。1 9 4 7 年h o p f f q 发明了一种借助离心力分离液体溶液的装置，此 装置及其成功的应用示例1 2 ，结构庞大且笨重，主要用于大规模工业制各分离。1 9 7 2 年 h e f f m a n n 等【3 ) 对这种液体分离器的尺寸和结构进行了改进，使转速增加到1 9 5 0 转分钟， 分离效率也得到较大提高。颗粒填充床径向流动离心分离器最早应用于化学反应器，后 来才被引入到分析型色谱领域【4 j 。 s a x c n a l 5 1 发明了采用压力驱动流体沿色谱柱径向流过色谱填料。a n d r e s e n 和 s a x e n a 6 j 研究了通过薄分离床层的径向流动，类似于薄层色谱的分离行为。后来。r i c e 等1 对径向色谱柱的发展作出了杰出贡献。颗粒填料在杠内被紧密压实，解决了流体 在分离床层的均匀分靠问题，同时可以降低颗粒问的缝隙，以减小谱峰展宽，使其在上 文献综述 样量、分离速度等诸多方面的优势明显体现出来，使径向色谱真正走向成熟。 ： 1 2 1 径向色谱的流型 、 色谱法是生物样品分析分离中最常用的分离技术之一。自其发明后的一百余年，无 论是经典低压、中压色谱柱，还是现代高效液相色谱柱，其结构大致类似。色谱柱由柱 管及填料组成，流体在柱内从一端流向另一端，借助溶质与固定相问的相互作用完成分 离任务。以制备为目的的色谱分离，为增加样品的处理量，必须对柱尺寸进行相应的放 大，主要有两种放大方式：( 1 ) 保持色谱柱直径不变，增加柱长；( 2 ) 保持色谱柱长度 不变，增大柱直径。这两种放大后的色谱柱都可以提高样品的处理能力，增加制备量。 然而采用第一种放大方式时，随着色谱柱长度的增加，样品在柱内的保留时间延长，系 统的背压也相应增加，因此，将增大系统的操作负荷，给分离操作带来诸多不便。 图1 1 轴向色谱 j ( 左) 和径向色谱柱( ) 中流体的流动方向 f i g ，i ，1f l o wd i r e c t i o n w i t h i na x i a l f l o wc o l u m n ( 1 e f t ) a n dr a d i a lf l o wc o l u m n ( r i g h t ) 目前常用的方法是通过增加柱直径，以达到增加处理量的目的。由于径向色谱柱采 用特殊的流体流向，弥补了传统色谱柱的诸多不足，从柱结构上解决了传统轴向色谱柱 所存在的固有缺吲”。5 1 。 图1 1 给出了轴向色谱柱和径向色谱柱中流体的流型。可以看出，由于流动相沿径 向流经色谱柱床层，增加了流动相与固定相的接触面积，因此使单次操作的上样量提高。 此外，由于流动相在固定相中的行程大为缩短，降低了样品在固定相中的停留时问，减 小了生物样品降解或失活的可能性，同时使色谱操作系统的背压下降。 1 2 2 径向色谱柱的结构 径向色谱柱中样品和流动相沿径向流经色谱柱，可以分为向心式径向流动( 如图 1 1 ) 和离心式径向流动两种。在一般径向柱结构设计中，考虑到柱外效应、样品富集等 园烈”i 通常采用向心式径向流动模式。 径向色谱柱由固定相承载腔体、流体分布器，中心样品收集器及密封组件等构成。 大连理t 大学博：t 学位论文 图1 2 为s e p r a g e n ( 美国) 公司用于承载颗粒固定相的s u p e r f l o 径向色谱柱【5 1 。l 其流 动原理可用图1 3 加以说明。流动相携带样品由色谱柱上部的流体入1 2 1 引入，经径询流 体分布器在外通道上均匀分布，外通道的内壁由多孑l 材料构成，样品及流动相经多 孔材料沿径向进入分离床层，床层的中心由另一个多孔管构成样品收集器，样品 经多孔管进入内通道引出色谱柱，而完成分离任务。 幽i 2s e p r a g e n 公司径向色谱柱 f i g 1 2r a d i a lf l o wc o l u m no f s e p r a g e nc o r p o r a t i o n 样品由多孔管的外表面进入到整个床层，色谱柱的有效“床层高度”为外多孔管和 内多孔管问的距离，由于外多孔管的大外表面积及较小的“床层高度”，使色谱分离可 在较低压力下实现高速操作。在保证“床层高度”恒定的条件下，增加色谱柱的柱长， 即可实现操作规模的线性放大。 豳1 3 径向枉中流体流动的不意图 f i g 1 3s c h e m a t i cp r e s e n t a t i o no f t h ef o l wd i r e c t i o nw i t h i nr a d i a lf l o wc o l u m n 随着径向色谱技术的不断推广应用，出现了多种新型结构的径向色谱柱 1 6 - 1 9 1 ，用于 取载不同性质的色谱分离介质。图1 4 是一种新型径向色谱柱的结构示意图”6 1 ，用于承 陇大孔连续床层。图1 5 为b i as e p a r a t i o n s 公司用于承载聚合物整体固定相的径向色谱 生的结构图i l ”。 1 文献综述 图1 4 用于人孔床层的径向柱结构简图 a 型：可用于两种流动模式( 离心、向心) ：b 型：向心流动模式 f i g i 4d r a w i n g so f r a d i a lf l o wc o l u m n su s e dw i t hc o n t i n u o u ss u p e r p o r o u sb e d s ( a ) t y p eic o l u m nc o n s t r u c t e dt ow o r ki nb o t hf l o wd i r e c t i o n s ( c e n t r i f u g a la n dc e n t r i p e t a lf l o w ) ( b ) t y p e2 c o l u m nw i t hs i m p l i f i e dd e s i g nu s e dw i t hac e n t r i p e t a l ( i n w a r d ) f l o w 酗1 5h ；i 整体崩定相的径向色谱枉 f i g i 5t h e r a d i a lf l o wc o l u m no fb i as e p a r a t i o n su s e di nm o n o l i t h i cs t a t i o n a r yp h a s e s t 2 3 径向色谱的传质特征 径向色谱应用予生化分离，具有两个明显的优势：快速及压降低。n u a n g 等【2 0 l 对径 向色谱中的传质过程进行了初步的理论探讨并与轴向色谱进行了比较，同时阐明了径 向色谱过程中流体的输运特征。g u 等【2 l 随后对径向色谱中多组分的流动及分离行为进 行了理论探讨，同时证实了向心式和离心式径向流动模式中，流体的传质行为存在差别。 t s a u r 等吲对径向色谱和轴向色谱中，流体的传输特征进行了对比。m u n s o n 【冽对流体在 大连理工大学博七学位论文 颗粒填充径向柱中的流动行为进行了理论研究，同时探讨了提高分离效率的可能逡径。 图i 6 径向色谱中动力学传质过程 f i g 1 6t h ed y n a m i cp r o c e s so f m a s st r a n s f e ri nr a d i a lf l o wc o l u m n 对径向色谱传质过程的早期理论研究中，r a c h i n s k i i 2 4 1 考虑了热力学平衡，但未考 虑分子扩散的影响。这旱主要对h u a n g 等的工作进行简要介绍。 h u a n g 等f 2 0 1 分别针对分子扩散作用可以忽略和分子扩散作用不可以忽略建立了相 关的模型。第一种模型中径向色谱与轴向色谱的传质方式存在对称性，以体积坐标表达 的方程形式完全相同。第二种模型不存在这种对称性，并用脉冲与前沿法进行了分析。 所得l a p l a c e 解为第二类变型贝塞尔函数形式，纵向扩散对一阶矩，即对溶质的保留时 间有影响。 径向色谱分离过程的质量传递过程可用图1 6 表示。z 的坐标方向与流动相流动方 向一致。根据质量平衡方程，径向色谱中溶质输运的动力学方程用半径表达的形式为： 盯( 詈) ，州一曲，( 孰= 积 z 虿d c l + d ，( 等) ，+ ( 爿 q 山 同理，由体积坐标v 表达的径向色谱动力学方程为： 矿( 爿+ ft 一忐渤一上4 z h d f 、, 蚓a tj v 一急( 詈) ，= 。 m ：， 其中：c ，q 分别为流动相和固定相中溶质的浓度，h 为径向色谱的有效高度，d 为 广散系数，为半径。 再考虑两相间传质过程的细节： 1 假设传质速率无穷大，即色谱分离过程处于热力学平衡状态： q = k c ( 1 3 ) k + = 型足 f l 一4 ) 2 假设传质速率有限，在界面处可达到热力学平衡，整个系统稍偏离于热力学平 目，则有： 文献综述 一塑a t = ( g k c ) 其中1 3 为动力学系数。 ( 1 - 5 ) 3 把流动相和固定相视为两块相互紧密接触的平面薄膜，在色谱过程中，传质阻 力可以理解为由流动相膜的传质阻力与固定相膜的传质阻力所构成。由于流动相、固定 相内中溶质的分布与平衡分布存在偏离，故溶质在两相间发生迁移，其迁移的速度和物 质在流动相与界面间的浓度差( c c i ) 成正比( c i 表示物质在界面上的浓度) ，也与 固定相的表面积成正比。设其传质系数为k 。，那么径向色谱的动力学方程可写为： 占等+ 等( c - c ) = ( 丽v 删；等+ 出等 ( 1 - s ) q ，= k c ，( 1 7 ) c ( r ，f ) = f ( t )( i - 8 ) 等2 等c c - 驴扣确， m ， 其中d ，为液膜厚度，d i 为组分在液膜内扩散系数，q 。为液膜底部组分浓度。通过 l a p l a c e 变换，可解出以上三种情况所对应方程的一阶原点矩和二阶中心矩。 三种情况下的一阶原点矩相同，皆为： 一 ( 1 + i ) ( r2 一r2 ) 2 = v 2 ( 丽+ 2 肼 对于以上三种情况0 0 - g i - 中, b 矩分别为： ：善型幽三翌一 2 ( 去+ 2 d ) 2 ( 丽v + 4 d ) , u 2 2 正1 ( r2 一，2 ) v ( 芝历+ 2 d ) 丛墨：二盟。 ( 1 1 0 ) ( 1 一1 1 ) 望! ! 生! ：塑二尘 ( 去删毛删： a 。2 k d ，( r 2 一，2 ) + d ( i + 七) 2 ( r4 一，4 ) 骷c 嘉m ，q c 志删z c 翕一志删z u j 3 k m 善荔历+ 2 d ) d f 矗历+ 2 d ) 2 芝赢五十4 d ) ( 赢历+ 2 d ) 2 出一阶原点矩的表达式可以看出，径向色谱流出曲线的一阶原点矩与柱体积成正 9 大连理工大学博= l 学位论文 比，与体积流速成反比，且与溶质的扩散系数d 有关。显然由于扩散作用，一阶矩比保 留时间小，且随着d 值的增加偏差逐渐增大。在轴向色谱中，流动相线速在柱内各处相 同，纵向扩散作用在各点也相同，扩散作用不会改变流出曲线一阶矩。而在径向色谱中， 由于线速随通过截面半径的减小而增加，扩散的影响也必然随着线速的增加而减小，因 而扩散作用使谱带的区域扩张是非对称的。当流动相的流动为向心式时，一阶矩倾向于 减小，小于保留时间：当流动相的流动方向为离心式时，一阶矩倾向于增大，大于保留 时间，这也是一般采用向心式径向流动模式的原因。由模型l 二阶矩的表达式也可以看 出，流动相的流向为由柱内流向柱外时，与轴向色谱相比，可以在一定程度上抑制由扩 散、传质等过程引起的谱带展宽。 模型3 从多方面考虑了影响径向色谱溶质传质过程的因素，其二阶中心矩表达式由 三项构成，分别表示流动相传质阻力、固定相分子扩散及纵向扩散所引起的谱带展宽。 流动相传质阻力项、固定相滞流层的传质阻力项所引起的谱带展宽可看作与柱半径成正 比，而纵向扩散作用所引起的谱带展宽比较复杂，可近似看作与柱半径成正比。 若v h 值不变，即体积流速随h 线性增加，理论上溶质的迁移时间和流出曲线的方 差保持不变，因此可直接线性放大生产规模。保持径向色谱柱柱径不变，只增加柱长时， 其处理能力将线性增加。 在前面的讨论中，均假设纵向扩散系数、传质阻力系数等均为不受线性流速影响的 常量。实际上，径向色谱中，这些参数均随流动相线速在分离过程中不断变化，因而对 径向色谱动力学输运过程的深入研究，必须考虑这些动力学参数与线速的变化关系。但 方程的求解将更困难，只能采用计算机数值计算。 1 2 4 径向色谱的分离介质 生物样品分离纯化的一个重要课题是研究适合于生物大分子分离纯化的分离介质。 在高效液相色谱发展初期问世的色谱填料，对于生物样品的分离大多数己不适用，它们 的孔径小、极性高，对生物大分子常造成不可逆吸附，有时即便能使组分完全分离，但 因所用的冲洗条件过于苛刻而导致组分活性丧失。因此，径向色谱通常需采用特殊设计 的填料作为分离介质。 1 3 色谱固定相的发展 传统的颗粒填料用于生物工程的下游过程时，扩散过程制约了其分离速度，增加洗 脱速度会使分辨率快速下降1 2 卯，因此使分离时间延长，产量降低，同时可能使生物分子 的结构产生改变，进而改变生物分子的抗原性。色谱纯化，尤其是离子交换色谱( i e c ) 和亲和色谱( a c ) 的引入，可以实现生物分子的高纯度分离。改进色谱柱的设计，尤 其是径向柱的出现，显著降低了分析分离所需的时间。然而，即使采用这些方法，纯化 过程中仍存在生物分子结构改变和活性损失的风险分离科学在面对大规模生物大分子 0 文献综述 的分离时，必须有快速可靠的控制手段。液相色谱填料应尽可能满足高吸附量、高分离 速度、良好的分辨率且不受流速影响、低操作负荷等要求1 2 “”j 。 大分子在传统的多孔颗粒填充柱内的缓慢扩散过程，是实现快速分离的一个主要瓶 颈f 3 0 1 。自液相色谱技术创立以来，为提高柱效和实现快速分离，色谱填充材料主要经 历了4 个发展阶段：( 1 ) 从形状不规则的填充颗粒到规则的球形颗粒：( 2 ) 从大颗粒 到小的填充颗粒；( 3 ) 从不纯的填充材料到高纯的球形硅胶颗粒；( 4 ) 目前的整体填 料。与整体柱相比，传统的液相色谱柱存在种种弊端和限制，为了提高颗粒填充柱的柱 效而使用粒径越来越小的填料，但柱压降随填料粒度的减小而急剧增大，综合柱效和分 离速度两方面因素，较为折中的3 5i t1 t i 填料被广泛使用。换言之，传统的高效液相色 谱( h p l c ) 填充柱很难同时实现高效快速分离。用于克服传质限制的方法包括： 1 改善传统色谱填料： 2 多微孔膜： 3 整体一连续床填料。 1 3 1 改善传统色谱填料 为提高传统多孔颗粒填料的分离效率，出现了多种新型的颗粒固定相和相关技术， 主要致力于改善( 加速) 溶质在流动相和固定相闻的传质过程，如微薄膜( m i e r o p e l l i c u l a r ) 3 1 - 3 3 1 、超多孔材料( s u p e r p o r o u s ) 【1 6 3 4 。6 1 、超薄多孔材料( s u p e r f i c i a l l yp o r o u s ) 1 3 7 - 3 9 1 ， 以及超大孔材料( g i g a p o r o u s ) 如“灌注”载体等【4 0 “1 。由于微薄膜固定相的容量较低， 不利于生物样品的制各分离，主要用于分析领域：超多孔和超大孔颗粒具有较高的容量， 可用于制备规模。 ” 1 3 2 多微孔膜 生物领域中的膜分离技术，结合了膜过滤( 超滤) 和固定床液相色谱两方面技术的 进展。超滤膜( 过滤器) 主要采用截断装置，分离分子尺寸至少相差一个数量级的生物 分子，主要用于下游过程中清除细胞碎片、胶质、悬浮的固体、细菌及从小分子中分离 目标大分子，如脱盐过程等。将亲和 4 2 1 、离子交换、疏水作用和反相f 4 3 1 等配基与此类膜 过滤器相结合，可显著提高其选择性。z e n g 等t “1 、k l e i n i ”i 、v a i k o m i 及g h o s h 4 7 1 等对膜 技术在生物分离领域中的应用进行了详细综述。 一般认为，在膜中的色谱作用与在多孔颗粒中的作用类似，两种“柱”型的主要区 别在于其流通性质。膜色谱填料与颗粒填料具有明显的区别，对于多孔颗粒而言，溶质 和配基之间的作用是发生在一端封闭的孔隙中，而膜填料两者间的作用主要发生在膜的 通孔中。在一端封闭的孔隙中所发生的质量传递必须依赖于扩散作用，而流体在膜的通 孔中依靠对流进行传递。显著地降低了从流动相到周定相及反向质量传递所需的时间， 因此膜分离过程通常较快，事实上与多孔颗粒相比其分离速度快一个数量级或更快 大连理工大学博i j 学位论文 p j 。与传统的多孔颗粒填充柱相比，由于膜非常薄( 通常用于色谱分离，是将几个薄的 膜粘在一起，具有几毫米高) ，使色谱操作单元的压力降下降，可以实现高流速操作， 从而使单位时间的产量提高。 1 3 3 整体一连续床 除扩散限制外，颗粒填料不能充满整个色谱柱空间，也是谱峰展宽的主要影响因素 之一，同时使柱效降低。通过引入高度连续的整体或连续床，如经典的大圆柱型刚性颗 粒及多孔聚合物，柱内的空隙体积可以降至最小【48 4 9 o 此种介质的最重要特征是流动 相由介质的大孔通过，因此，质量传递借助对流作用而得以增强，对分离过程产生正面 影响。对于整体填料内质量传递的理论研究，可参见文献 5 0 - 5 4j 。 此种整体结构的色谱填料出现至今已有十几年，主要有三个课题组活跃于此研究领 域，每个课题组所研究的填料基质和特性各不相同。n a k a n i s h 等 5 5 1 和h j e r t e n 等【5 q 试图用 具有对流传递特征的新型载体取代标准色谱柱，但效果并不理想。较为合理的t e n n i k o v a 等【6 3 1 的课题组，结合了连续床填料和短柱长( 如膜色谱) 两者的优点，由此发展了短柱 层的理论。基于蛋白质梯度色谱和其他生物大分子色谱，存在临界长度，使得分离能力 最大而谱峰展宽最小，随脱洗速度的增加，柱长可降低至膜厚度的数量级【5 8 】。此即短柱 层理论的基本构想。 整体固定相按合成基质可以分为：硅胶基质整体柱、软有机凝胶基质整体柱及刚性 有机凝胶基质整体柱。 1 3 3 1 硅胶基质整体柱 n a k a n i s h i 等”5 】首先提出了硅胶基质整体柱，随后该研究小组对制各过程、孔结构的 均匀性及控制方法等进行了改进 5 9 。6 3 】，现在由m e r c k 公( d a r m s t a d t ，g e r m a n y ) 商品化， 品名为“c h r o m o l i t h 。此类柱子从前的品名为“s i l i c a r o d ”，由溶胶一凝胶法在水溶性 聚合物存在的条件下，通过烷氧基硅烷水解和缩聚制得。 t a n a k a 等f 6 3 】对硅胶基质整体柱的制各方法、结构特征及应用等进行了详尽的综述。 溶胶一凝胶法所制的“棒”是由独立一块硅胶所构成，具有双峰孔结构1 6 “，当用于分析 目的时，大孔的尺寸约为2l am ，中孔约为0 0 1 3um 。这类柱子的主要特点是其孔隙 率约为8 0 ，比传统的颗粒填充柱高1 5 ，因此，压降相当于3um 或5 “m 颗粒填充 眭的l 3 到1 4 ，可以在高流速下操作，而最优的分离效率可与4pm 颗粒填充柱相比m j 。 ；e h u l t e 等1 6 5 1 首先报道了用于半制各规模的整体硅胶柱，其大孔孔径约为4um 。中孔孔 陉约为0 0 1 4um ，可以在极高流速下操作，同样可用于分析目的。作者报道了其最优 分离效率与l oui n 颗粒填充柱相当，而压降要低几个数量级。所有的硅胶整体柱都可进 一步改性，与常规h p l c 的化学衍生方法相同，如c 1 8 键合相适用于反相色谱。 文献综述 1 3 3 2 软有机凝胶基质整体柱 将溶胀的聚丙烯酰胺凝胶压缩成柱型，由此得到的连续床由h j e r t e r 的课题组首次提 出1 5 “6 7 j 。将适当的单体和离子