（应用化学专业论文）米渣蛋白成分分析及蛋白提取研究.pdf

我国淀粉糖生产和味精发酵工业每年产生1 0 0 0 万吨米渣、米糠及米胚等副产品， 而米渣中蛋白质也即大米蛋白，含量约占4 0 6 0 。大米蛋白作为一类营养价值极高的 蛋白质，由于其溶解、乳化性能不佳等原因，多作为动物饲料使用，造成蛋白资源的极 大浪费。因此，有必要研究米渣中的蛋白组成并对其进行提取。 本文以产糖后的米渣为原料，首先系统分析了米渣组成成分及含量，然后总结各分 析方法，得到测定相关产品中该类成分的规律。最后研究了分步法提取米渣蛋白的工艺 条件。研究结果如下： ( 1 ) 米渣中总糖含量、蛋白含量分析 运用d n s 法与苯酚硫酸法测定米渣中总糖含量，其测糖的浓度范围分别为( o 0 1 6 ) m g m l 、( 0 2 ) m g m l ；在此范围内，米渣中存在的蛋白质对总糖含量分析无影响。 运用考马斯亮蓝法、双缩脲法分析米渣中的蛋白含量，其测定蛋白浓度的线性范围 分别为( o 0 0 5 ) m e d m l 、( 0 - - - 1 2 ) m g m l ；在此范围内，待测物中存在糖类物质对蛋白含 量测定无影响。 ( 2 ) 采用上述两种方法测定米渣中四种蛋白( 清蛋白，球蛋白，醇溶蛋白，谷蛋 白) 的含量，并通过单因素实验和正交实验研究了各蛋白的提取条件。 ( 3 ) 米渣组成成分 其主要成分为蛋白质、糖类、脂肪，含量分别为5 2 , - - 5 6 、2 5 、1 2 。这三类物 质约占米渣总含量的9 2 。 ( 4 ) 确定分步法提取米渣中蛋白质的工艺条件。 研究了提取顺序对米渣中蛋白含量的影响，结果表明：当顺序为清蛋白一醇溶蛋白 一球蛋白一谷蛋白时，得到的蛋白提取率最大。此时总蛋白含量达6 8 2 ( 湿基) 。 ( 5 ) 探究米渣中四类蛋白的溶解作用。 清蛋白在乙醇、n a c l 溶液中存在部分溶解。提取清蛋白时，若提取液中的乙醇 浓度q 时，会促进清蛋白的溶解。 提取球蛋白时，提取液中乙醇浓度“时，球蛋白部分溶解于乙醇溶液。 提取醇溶蛋白时，n a - 对醇溶蛋白有增溶作用。 最后在研究所得工艺条件下，采用分步法提取米渣中这四种蛋白质。 ( 6 ) 通过响应面法分析各提取因素对谷蛋白含量影响的显著水平，探讨了各因素 间的交互作用。 研究表明：固液比、碱浓度、固液比与碱浓度交互项、碱浓度与温度交互项对谷 蛋白提取率的影响均为高度显著，提取温度显著影响谷蛋白提取。 ( 7 ) 通过对比未处理米渣与浸提后米渣的扫描电镜图与红外图谱，表征提取蛋白 i 江南大学硕士学位论文 前后米渣的形态变化。 研究结果表明：提取各蛋白时，米渣表面形态变化为连续致密结构专片状骨架结构 专凝胶颗粒结构；红外图谱表明提取前后米渣的组成物质未变化，但各成分的含量会相 应减少。 关键词：米渣蛋白；蛋白含量分析；总糖含量分析；逐步提取；响应面分析 a b s t r a d a b s t r a c t i nc h i n a si n d u s t r yo fs t a r c hs u g a rp r o d u c t i o na n dm o n o s o d i u mg l u t a m a t ef e r m e n t a t i o n , i t p r o d u c e s 10m i l l i o nt o n sb y p r o d u c t ss u c ha sr i c er e s i d u e ，r i c eb r a na n dr i c e g e r m a n n u a l l y t h ep r o t e i nc o n t e n ti nf l e er e s i d u ei sb e t w e e n4 0 一6 0 r i c ep r o t e i ni so n eo f p r o t e i n sw h i c hh a v et h eh i g h e s tn u t r i t i o n a lv a l u e h o w e v e r , i ti su s e df o ra n i m a lf e e dm o s t l y ， d u et oi t sp o o rp e r f o r m a n c ei nd i s s o l u t i o na n de m u l s i f i c a t i o n , w h i c hm a k e sal a r g ea m o u n to f p r o t e i nr e s o u r c ew a s t e d i nt h i sp a p e r ，t h ef l e er e s i d u ef r o ms u g a rp r o d u c t i o nw a su s e da sr a wm a t e r i a l s ，t h e p r o t e i nc o m p o s i t i o na n dt h ec o n d i t i o n so fs e q u e n t i a le x t r a c t i o nm e t h o di nt h ep r o t e i n e x t r a c t i o np r o c e s sw e r es t u d i e d n l er e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) a n a l y s i so fs u g a ra n dp r o t e i nc o n t e n ti nr i c er e s i d u e d n sc o l o f i m e t r ym e t h o da n dp h e n o ls u l f u r i ca c i dm e t h o dw e r eu s e dr e s p e c t i v e l yt o a n a l y s et h et o t a ls u g a rc o n t e n ti nf l e er e s i d u e 1 1 1 em e a s u r er a n g eo fs u g a rc o n c e n t r a t i o ni s ( 0 0 16 ) m g m l ，( o - o 0 2 ) m g m l i nt h e s er a g e ，t h e p r o t e i ni nr i c er e s i d u eh a sn oe f f e c to n s u g a rc o n t e n t b r a d f o r dm e t h o da n db i u r e tm e t h o dw e r eu s e dr e s p e c t i v e l yt oa n a l y s et h ep r o t e i n c o n t e n ti nr i c er e s i d u e t h em e a s u r er a n g eo fp r o t e i nc o n c e n t r a t i o nw e r e ( o o 0 5 ) m g m l ，( 0 - 12 ) m g m l ；t h es u g a ri nr i c er e s i d u eh a sn oe f f e c to np r o t e i nc o n t e n ti nt h e s er a g e ( 2 ) t h e nt h e s et w om e t h o d sw e r eu s e dt od e t e r m i n et h ec o n t e n to ff o u rp r o t e i n si nr i c e r e s i d u e 刃彤e f f e c to fe x t r a c t i o nc o n d i t i o n so np r o t e i nc o n t e n tw e r es t u d i e dt h r o u g hs i n g l e f a c t o ra n do r t h o g o n a le x p e r i m e n t s ( 3 ) t h ec o m p o n e n t so ff i c er e s i d u ew e r eo b t a i n e d 1 1 璩m a i nc o m p o n e n t so fr i c er e s i d u ew e r ec a r b o h y d r a t e s ，p r o t e i na n df a t t h ec o n t e n t w e r e5 2 5 6 ，2 5 ，12 ，r e s p e c t i v e l y ( 4 ) t h ee x t r a c t i o nc o n d i t i o no fp r o t e i ni nr i c er e s i d u ew a ss t u d i e d ，u s i n gs t e pe x t r a c t i o n m e t h o d 1 1 1 ee f f e c to fe x t r a c t i o ns e q u e n c eo np r o t e i nc o n t e n tw a ss t u d i e d n er e s u l t ss h o w e dt h a t ： t h em a x i m u me x t r a c t i o nr a t eo fp r o t e i n sw a so b t a i n e dw h e nt h ee x t r a c t i o ns e q u e n c ew a s a l b u m i nf i r s t l y ，g l o b u l i ns e c o n d l y ，p r o l a m i nt h i r d l y ，g l u t e l i nl a s t l y a tt h i sp o i n t , t h et o t a l p r o t e i nc o n t e n tw a s6 8 2 ( w e tb a s i s ) ( 5 ) t h ed i s s o l u t i o no ft h e s ef o u rp r o t e i n sw e r eb e e ns t u d i e d ( 芏) a l b u m i nc a nd i s s o l v ei ne t h a n o la n dn a c ls o l u t i o n d u r i n gt h ee x t r a c t i o no fa l b u m i n ， e t h a n o lw i l lf a c i l i t a t ei t sd i s s o l u t i o nw h e nc o n c e n t r a t i o ni nt h ee x t r a c t i o ns o l u t i o nw a sb e l o w 2 i h 江南大学硕士学位论文 ( 室) o l o b u l i nc a n d i s s o l v ep a r t l yi ne t h a n o lw h e ne t h a n o lc o n t e n ti nt h ee x t r a c t i o ns o l u t i o n w a sb e l o w4 ( 耍) d u d n gt h ee x t r a c t i o no fp r o l a m i n ，n a + w h i c he x i s t e di nt h ee x t r a c t i o ns o l u t i o nc a n f a c i l i t a t ei t sd i s s o l u t i o n f i n a l l y ，t h es e q u e n t i a le x t r a c t i o nm e t h o d w a su s e df o rp r o t e i ne x t r a c t i o ni nr i c er e s i d u e ( 6 ) r e s p o n s es u r f a c em e t h o dw a su s e d t oa n a l y s et h es i g h i f i c a n tl e v e lo fe x t r a c t i o n f a c t o r sw h i c ha f f e c tg l u t e l i nc o n t e n t , a n dt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nt h e s ef a c t o r s w e r e r e s e a r c h e d d u r i n gt h ee x t r a c t i o no fg l u t e l i n , t h em i x t u r er a t i o ，e x t r a c t i o nt e m p e r a t u r e ，n a o h c o n c e n t r a t i o n , t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nm i x t u r er a t i o a n dn a o hc o n c e n t r a t i o na n dt h e i n t e r a c t i o nb e t w e e nn a o hc o n c e n t r a t i o na n dt e m p e r a t u r ec a na f f e c tg l u t e l i n c o n t e n t s i g i n i f i c a n t l y 目录 目录 摘要i a b s t r a c t i i i 第一章绪论一1 1 1 大米蛋白概述1 1 1 1 大米蛋白的组成、结构与性质1 1 1 2 大米蛋白的营养价值：2 1 1 3 大米蛋白的应用领域2 1 2 大米蛋白的成分分析及制备：3 1 2 1 蛋白质含量分析4 1 2 2 总糖含量测定：5 1 2 3 脂肪含量测定6 1 2 4 水分、灰分含量测定6 1 3 大米蛋白提取方法6 1 3 1 碱法提取6 1 3 2 酶法提取7 1 3 3 排杂法7 1 3 4 化学方法提取7 1 3 4 分析蛋白提取的实验设计方法9 1 4 国内外研究现状。9 1 4 1 大米蛋白组成成分分析研究进展9 1 4 2 大米蛋白提取、纯化研究进展l o 1 4 3 实验设计方法研究进展1l 1 5 本课题立题依据和意义“1 1 1 6 本课题的研究内容1 2 第二章米渣中非蛋白成分含量分析研究13 2 1 引言13 2 2 实验材料和方法13 2 2 1 实验材料和主要试剂1 3 2 2 2 实验仪器1 4 2 2 3 实验方法1 4 2 3 实验结果和讨论l5 2 3 1 总糖含量分析条件d n s 比色法1 5 l 江南大学硕士学位论文 2 3 2 总糖含量测定条件研究( 苯酚硫酸法) 。1 7 2 3 3 米渣中的蛋白质对总糖含量分析影响。1 8 2 3 4 蛋白浓度与吸光值线性关系1 8 2 3 5 米渣中糖的提取与精制1 9 2 3 6 换算因子测定。j 2 0 2 3 7 米渣中总糖含量分析。2 0 2 3 8 精密度及重现性试验。2 0 2 3 9 回收试验2 1 2 3 1 0 米渣中脂肪及水分、灰分含量测定2 l 2 4 本章小结o 2 l 2 4 1 总糖含量测定条件：。2 l 2 4 2 两法分析总糖含量比较2 2 2 4 3 米渣常规成分含量2 2 第三章米渣中蛋白质含量分析研究2 3 3 1 引。言2 3 3 2 实验材料和方法2 3 3 2 1 实验材料和主要试剂。2 3 3 2 2 主要仪器2 3 3 2 3 试剂配制2 4 3 2 4 实验方法2 4 3 3 实验结果与讨论2 5 3 3 1 检测条件对蛋白含量测定影响2 5 3 3 2 蛋白质浓度与吸光度线性关系。2 7 3 3 3 平行试验2 8 3 3 4 回收试验2 8 3 3 5 米渣中各蛋白提取条件2 8 3 3 6 米渣中各蛋白含量分析实验设计3 l 3 4 本章小结3 7 3 4 1 考马斯亮蓝法分析蛋白含量3 8 3 4 2 双缩脲法分析蛋白质含量3 8 3 4 3 米渣中各种蛋白质提取条件3 8 3 4 4 米渣常规成分含量分析。3 9 第四章米渣蛋白提取工艺研究4 1 4 1 引。言。4 1 4 2 材料试剂与方法4 1 目录 4 2 1 实验试剂与设备4 1 4 2 2 实验方法4 2 4 3 实验结果与讨论4 4 4 3 1 水洗时间对总糖溶出率、清蛋白含量影响。4 4 4 3 2 米渣脱脂：4 4 4 3 3 提取剂种类对谷蛋白含量影响。4 5 4 3 4 提取顺序与蛋白含量关系研究。4 5 4 3 5 各蛋白质的溶解作用研究4 6 4 3 6 溶解作用验证4 7 4 3 7 各测量方式比较4 9 4 3 8p h 值对蛋白含量影响5 0 4 3 9 米渣中各蛋白含量5 0 4 4 本章小结51 第五章米渣提取分析及形态表征5 3 5 1 引言。5 3 5 2 实验材料和方法5 3 5 2 1 材料试剂与方法。5 3 5 2 2 主要仪器5 3 5 2 3 实验方法5 3 5 3 结果与讨论5 4 5 3 1 响应面分析谷蛋白提取时各因素影响。5 4 5 3 2 米渣蛋白提取物的电镜扫描图谱5 8 5 3 3 红外光谱分析米渣中糖与蛋白存在方式5 9 5 4 本章小结“6 0 第六章结论与展望6 1 6 1 结论6 1 6 2 展望6 2 致谢。6 5 参考文献。6 7 附录t 作者在攻读硕士学位期间发表的论文。7 1 h i 第一章绪论 1 1 大米蛋白概述 第一章绪论 水稻是全世界1 0 0 多个国家人民的主食，也是我国的第一大粮食作物。2 0 0 9 年我国 稻谷年产量为1 9 5 亿吨，大约可加工成大米1 3 1 4 亿吨，居世界第一位。谷类食物营 养丰富，人体每日所需蛋白质有5 0 7 0 由谷类及其相关制品来提供【l 】。 大米蛋白是一种营养价值极高的蛋白质【2 ，3 1 ，其具有独特的结构与保健功效1 4 ，且在 食品、饮料工业中应用广泛。 1 1 1 大米蛋白的组成、结构与性质 普通稻米( 未经碾压处理的糙米) 由种皮、胚乳及胚三个部分组成。胚乳是组成稻 米最重要的部分，其含有大量的淀粉、蛋白质；胚中含有丰富的蛋白质、脂质、小分子 糖类、纤维素、维生素、核酸酶及各种微量元素等物质【5 】。其中，大米的两个最重要组 成成分分别是蛋白质和淀粉，其含量分别接近8 、8 0 。大米经过淀粉酶液化处理后， 其中残留成分主要是蛋白质及未水解完全的糖类物质。 图1 - 1 大米蛋白 f i g 1 1r i c ep r o t e i n 1 1 1 1 大米蛋白的基本组成 图1 - 2 稻米组成及结构 f i g 1 - 2c o m p o s i t i o na n ds t r u c t u r eo f f i c e 本世纪初，o s b o r n e l 6 1 按溶解性质的不同对小麦蛋白质进行了系统分类( 连续提取 法) ，此法对其他谷物蛋白质同样适用。依据其分类方法，组成大米的蛋白质可分为如 下四种： 清蛋白( a l b u m i n ) ，大米粉用水浸泡后，溶解出来的蛋白质；球蛋白( g l o b u l i n ) ，大 米粉去除清蛋白后，能在低浓度盐中溶解的蛋白质；醇溶蛋i 兰t ( p r o l a m i n ) ，米粉去除上 述两类蛋白后，能在浓度为5 0 - 7 0 乙醇溶液中溶解的蛋白质；谷蛋f 兰t ( g l u t e l i n ) ，大 米粉去除上述三类蛋白后，可被低浓度酸或碱溶液溶解的蛋白剧7 1 。 江南大学硕士学位论文 据报道，将大米经过液化处理后得到的米渣，其蛋白质的成分、结构与常规大米有 所不同。组成米渣的蛋白质主要是胚乳蛋白，由清蛋白( 3 5 ) 、盐溶性球蛋白( 9 - - - 1 8 ) 、醇溶性蛋白( 5 - - - 9 ) 和谷蛋1 兰t ( 5 6 - - 7 2 ) 组成。 1 1 1 2 大米蛋白的存在状态 此后，对组成大米的四类蛋白质进一步研究表明：大米中，清蛋白、球蛋白为代谢 活性蛋白【引，其由单条肽链组成，分子量较小。相对分子量一般分别分布在1 0 k d a 2 0 0 k d a 和1 6k d a - - 1 3 0k d a 之间。相反，其余的两种蛋白为储藏活性蛋白【9 】，醇溶蛋 白是由单条肽链在分子内形成二硫键连接起来，其相对分子量大约为7k d a - - , 1 2 6k d a ； 谷蛋白由多条肽链在分子间形成二硫键连接而成，其相对分子量在1 9k d a 9 0 l a 之 间，更高可达上百万。 1 1 2 大米蛋白的营养价值 大米蛋白是一类营养价值高的植物蛋白。因为在谷物蛋白质中，它具有独特的抗过 敏性和优质的蛋白质配比( 含有人体所需的各种必需氨基酸，且配比合理，赖氨酸含量 也较丰富f l o 】) ，其蛋白利用效比为1 3 6 2 5 6 ，消化率比一般谷物蛋白高。同时，大米蛋 白的生物价( b v ) 和蛋i 兰t f f t ( p v ) 均高于其它植物蛋白。另外，其低过敏性【1 2 1 和高营养 价值使得大米蛋白浓缩物或大米蛋白分离物在婴儿配方食品市场中极具竞争力。 大米蛋白除了基本的营养功能外，还有一些保健功能。如大米蛋白能提高机体抵抗 高血压及胆固醇的能力。m o r i t a 等 1 3 , 1 4 研究还表明：通过提取得到的大米分离蛋白能显 著降低小鼠血清中胆固醇、甘油和磷脂的浓度，此间接说明大米分离蛋白可防治胆固醇 和高血脂。 1 1 3 大米蛋白的应用领域 由于大米蛋白的独特功效，其市场前景广阔。目前对其研究较多，大米蛋白的应用 领域也越来越广泛。大米蛋白产品主要有：食品添加剂”1 、蛋白类饮料 1 6 , 1 7 】、高纯度蛋 白粉【1 8 】、可食用蛋白膜1 2 3 ，2 4 ，2 5 】等。由于其利用率低且对其性质了解不全，使得其在食品 中应用有限。 ( 1 ) 大米蛋白食品添加剂 蛋白质因分子量分布或氨基酸组成种类的不同，其表现出来的物化性能如溶解性、 起泡性、乳化性等差别很大。将大米蛋白添加在食品或者饮料中，不仅可改善食品的口 感、加工特性，还使得食品具有保键功效，会大大增加食品的营养价值。 大米蛋白本身溶解性差，但经酶消化水解后，可得到小分子肽或者氨基酸。此类物 质的极性比蛋白质大得多，故在增加大米蛋白溶解性的同时，还能改善其发泡、乳化等 性能。若将其制成吸收性好的氨基酸营养液，可作为添加剂应用于食品、饮料及化妆品 工业。 2 i t - 辛绪论 ( 2 ) 大米蛋白浓缩物 大米浓缩蛋白是理想的婴幼儿食品，因为其具有高营养和低过敏性的特点。如加入 在婴儿配方米粉中，可为幼儿提供成长所需蛋白质。美国路易斯安娜南部研究中心将大 米蛋白制成对大豆蛋白、牛奶等过敏的婴幼儿食品，在国外市场上反响强烈。大米浓缩 蛋白还可为蛋白摄入量不足或存在蛋白质消化功能障碍的患者补充能量，维持人体 内氮元素的平衡【l9 1 。 大米浓缩蛋白可以采用如下方式制备t 将米粉或水稻加工副产品如米糠或米渣加入 碱液提取得到。另一种方法是将米粉用酶处理以消除主要成分一淀粉后，使蛋白富集。 然而大米浓缩蛋白由于溶解性等功能特性不佳，相比于其他植物蛋白产品，目前对其开 发、利用并不充分。 ( 3 ) 大米蛋白营养补充剂 大米蛋白营养补充剂是将大米蛋白经过蛋白酶等深度水解、提高其溶解度后，将其 作为蛋白补充剂，以增加产品的食用和保健价值。目前市场上相关产品主要有：即冲即 食的蛋白粉和短肽营养口服液【2 们。过去将蛋白质水解后主要用于制备游离氨基酸，但现 有研究表明，将大米制成小分子肽【2 1 刀1 更容易被人体肠道消化和吸收。 ( 4 ) 可食用大米蛋白膜 用微生物发酵大米中的糖和淀粉可得到许多功能性多糖。将蛋白浓缩物与功能性多 糖( 如普鲁兰多糖等和海藻酸盐) 结合，可得到大米蛋白增值产品大米蛋白可食用 膜。可食性薄膜可作为风味载体或营养添加剂，或作为分离、保护和防腐的屏障。 近年来对于大米蛋白可食用膜的研究很活跃，文献中有很多类似报道。如1 9 9 6 年 f r e d e r i c kf s h i h l 2 3 】将米粉用淀粉酶处理，得到蛋白浓缩物与普鲁兰多糖结合后，制备的 食用膜具有一定抗拉强度，还可抑制水蒸气。例如，从大豆蛋白中得到的腐竹膜( 这是 一种在亚洲国家广泛流行的食品配料) ，当将其浸泡在水中时质地和口感皆理想，故常 将其用作食品外包装。 大米蛋白广泛应用于化妆品及食品、医药中，国外市场上已有各种大米蛋白产品， 且价格不菲；而国内除开发出大米蛋白发泡粉外，尚未见到其它大米蛋白质的应用产品， 主要是大米蛋白利用率低且对其性质了解不全，使得其应用受限。 1 2 大米蛋白的成分分析及制备 本研究中采用的米渣蛋白来源于：味精厂将碎米经过4 0 温水浸泡后，进行磨浆， 调节波美度与p h 值，并在淀粉酶作用下液化、喷射( 温度1 0 5 11 0 ( 3 ) ，再经过板框 过滤后得到米渣，烘干后其蛋白含量为5 5 左右( 水分8 左右) 。在淀粉糖或味精生 产中，每处理7 吨碎大米，可产生约1 吨米渣。 主要工艺流程如图1 3 所示。 米渣经过高温液化处理后，其组成成分与与常规大米相比，差异很大。主要含有溶 3 江南大学硕士学位论文 解性差的谷蛋白，其次是醇溶蛋白，而可溶解在盐或水中的清蛋白、球蛋白含量已很少， 故需对米渣的组成成分进行分析。分别分析米渣中蛋白质、总糖、脂肪及水分、灰分的 含量。 大米- - - 4 0 c 温水浸泡2 h - + 机磨碎一乳状米浆 l 调p h 、调波美度 固液混合物一1 2 0 蒸汽米浆喷射 淀粉酶液化一带渣液体一静置、板框过滤一滤渣即为米渣( 含大米蛋白) l 糖化生产糖一滤液 图1 - 3 米渣蛋白来源工序 f i g 1 - 3t h e5 0 u r c et r e a t m e n to f f i c er e s i d u ep r o t e i n 1 2 1 蛋白质含量分析 1 2 1 1 凯氏定氮法 凯氏定氮法【g b 厂r5 0 0 9 5 1 9 9 6 1 该法测定蛋白质含量总共有样品消化、蒸馏、吸收和滴定4 个操作。其检测原理是 存在于样品中的含氮有机物与浓硫酸在硫酸铜的催化作用下共热消化，分解产生氨气， 接着溶液中的硫酸与生成的氨作用，得到硫酸铵。然后与加入碱液反应蒸馏出氨，反应 物用过量的硼酸溶液吸收，最后用盐酸溶液滴定，计算出样品中蛋白质含量。 此法适用范围广、重复性好，但操作复杂，试剂消耗量大。主要适用于固体物中蛋 白含量的测定。现在市场上已有凯氏定氮试剂盒或者半自动凯氏定氮仪器，可大大提高 操作效率。 1 2 1 2 考马斯亮蓝 法- ( b r a d f o r d ) 该法测定蛋白质含量的原理 2 7 1 为：考马斯亮蓝g 2 5 0 为一种染色剂，存在着两种不 同的颜色形式棕红色和蓝色。当和蛋白质上的肽键通过范德华力结合后，在一定的浓 度范围内，蛋白质与染料的络合物符合郎伯比尔定律( l a m b e r t b e e r sl a w ) 。此染料 本身为棕红色，当与蛋白结合后，颜色由红色变蓝色，最大光吸收波长由4 6 5 n m 变成 6 0 0 n m 。通过测定吸光值，可计算出与其结合的蛋白含量。 1 2 1 3 双缩脲试剂法 蛋白质是具有两个或两个以上肽键的化合物，皆会产生双缩脲反应【2 7 2 引。因此在碱 性溶液中，蛋白质的肽键与双缩脲试剂中c u 2 + 形成浅蓝色络合物。在一定浓度范围内， 络合物的颜色深浅与蛋白质含量呈线性关系，因此可用双缩脲法测定物质中蛋白含量。 浅蓝色铜蛋白质复合物分子结构为： 4 善i h k 2 0 i c 6 h 1 2 0 6蔓- c s h l 。0 5蔓- c h o + 3 - 1 2 0 & u + 3 h 2 0 图1 - 5 苯酚硫酸法测定总糖含量原理 f i g 1 5t h es c h e m a t i co f t o t a ls u g a rm e a s u r e m e n tu s i n gp h e n o ls u l f u r i ca c i dm e t h o d 1 2 2 2d n s 比色法 d n s 法即3 ，5 二硝基水杨酸比色法【3 2 1 。其测定原理是：在p h i 7 条件下，米渣中 多糖水解为还原性单糖，然后与3 ，5 二硝基水杨酸共热，其被还原成棕红色氨基化合 物。在一定浓度范围内，米渣中还原糖含量和生成有色物的颜色呈正比。通过吸光值， 换算得到米渣中总糖含量。 江南大学硕士学位论文 + 还原糖 + 糖酸 3 ，5 二硝基水杨酸( 黄色) 3 一氨基一5 一硝基水杨酸( 棕红色) 图1 - 6d n s 法测定总糖含量原理 f i g 1 - 6t h es c h e m a t i co f t o t a ls u g a rm e a s u r e m e n tu s i n gd n sm e t h o d 1 2 3 脂肪含量测定 索氏抽提法g b 5 0 0 9 6 2 0 0 3 。 本研究采用经索氏抽提改良的残余法【3 ”，即用低沸点有机溶剂( 乙醚或石油醚) 回 流，抽提出待测物中的脂肪，以提取前样品与提取后残渣的重量之差来计算脂肪含量。 由于抽提物中除含有脂肪外，还或多或少溶解有游离脂肪酸、磷脂、糖脂及脂蛋白等类 脂物质，因而本法测定得到的是粗脂肪含量。 1 2 4 水分、灰分含量测定 水分含量测定方法g b t5 0 0 9 3 2 0 0 3 灰分含量测定方法g b t5 0 0 9 4 2 0 0 3 1 3 大米蛋白提取方法 为了得到高纯度的蛋白，需对米渣中蛋白质进行提取、纯化。目前大米蛋白提取方 法主要有：溶剂提取( 酸法【3 4 1 、碱法1 3 5 , 3 6 ) 、酶法提取 3 7 , 3 8 , 3 9 】、复合提取法【4 0 ，4 1 1 及排杂 法【4 2 1 。处理过程中，还可结合物理法 4 3 , 4 4 , 4 5 】增加提取率。比较常用的是碱法提取和酶法 提取。 1 3 1 碱法提取 碱法提取蛋白质为蛋白提纯的传统方法。此法提取米渣蛋白的原理是【3 7 】：米渣组成 蛋白中8 0 以上为可溶于碱的谷蛋白，这些蛋白分子间通过大量的二硫键和疏水基团进 行交联、凝聚，使得蛋白溶解性下降；另外，米渣蛋白主要是胚乳蛋白，其内部结构紧 密( 蛋白质在胚乳中与淀粉结合形成l u m 3 u m 的粒子) ，也导致蛋白溶解难度加大。 采用一定浓度的碱液，可将大米中蛋白与淀粉的紧密结构变得疏松，同时碱液能破坏蛋 白质分子中的氢键，并可解离某些极性基团，从而促进蛋白质分子溶解，得到高纯度的 米渣蛋白。 碱液提取米渣蛋白的工艺流程如下： 6 第一章绪论 沉淀一多次提取 tl 米渣+ 碱液浸泡一离心一上清液中含有蛋白质酸沉一离心一沉淀 水洗、调p h 一干燥一大米蛋白粉 碱法提取工艺简单，成本较低，同时碱法提取得到大米蛋白其色泽及乳化性较好， 故在工业中应用广泛。但大米蛋白的氨基酸结构会被碱液破坏，影响其营养价值，且操 作过程中溶剂消耗量大，提取得到蛋白有溶剂残留等。 1 3 2 酶法提取 酶法提取原理：利用蛋白酶对大米蛋白质分解作用，使其变成氨基酸或小分子肽， 增加大米蛋白溶解度，从而提取出来。按照提取酶的作用条件不同，可分为酸性蛋白酶、 中性蛋白酶、碱性蛋白酶和复合蛋白酶。 酶法提取反应条件温和，保留其营养成分，且相比碱法其液固比小，降低了用于提 取液的溶剂消耗，有利于生产中节约能源。酶法提取时，大米蛋白经蛋白酶水解不仅提 高了营养价值，得到短肽利于被人体消化、吸收，而且大米蛋白中特定肽链的降解还能 产生多种具有生理活性的功能肽。但蛋白酶价格较高，故应用于工业化生产存在困难。 1 3 3 排杂法 排杂法是以去除大米中其他组成成分为目标，采用各种手段移除米渣中的非蛋白成 分，最终获得高纯度的大米蛋白。基本工艺路线图如下： 米渣一加石油醚抽提一脱脂米渣 l 水洗除去残留糖类 米渣( 已除去脂肪、多糖) 一抽滤、干燥 l 木质素酶、淀粉酶水解 离心一沉淀一冷冻干燥一大米浓缩蛋白粉 图1 7 排杂法提取大米蛋白工艺流程 f i g 1 - 7t h ep r o c e s so f r i c ep r o t e i ne x t r a c t i o nu s i n gs e p a r a t i n gm e t h o d 1 3 4 化学方法提取 分离纯化蛋白质的化学方法很多，主要分为以下几类： 、 根据蛋白质溶解性不同的分离方法，如：蛋白质盐析】、有机溶剂提取 4 7 1 等；根据 其带电性质进行分离，如电泳法【4 引、离子交换法 4 9 , 5 0 ；根据分子量大小差异来分离，如 透析与超滤 5 1 】、凝胶过滤法圈等。 1 3 3 1 分段盐析法 用无机盐( 如硫酸钠或硫酸铵) 从蛋白溶液中沉淀分离蛋白是一种常规方法，能很 7 江南大学硕士学位论文 便利地从蛋白混合液中分离出目标蛋白。由于不同的蛋白质其溶解度与等电点不同，沉 淀时所需的p h 值与离子强度也不相同。改变盐溶液浓度与p h 值，可将蛋白混合液中 各种蛋白质分别盐析分开，这种分离方法称为分段盐析法。 盐析原因如下：蛋白质分子内部或表面存在电荷，而极性基团有静电引力，故盐液 中的盐离子与水分子影响蛋白质分子上的极性基团，使其溶解度增大。但当盐液离子强 度增大到一定程度时，蛋白质表面电荷大量被中和，于是就发生聚集而沉淀析出。 影响蛋白盐析的因素【4 7 】有很多：如盐液的浓度、p h 值、介电常数和温度等。其中 盐浓度是影响盐析的首要因素。不同蛋白质盐析时采用盐液的浓度不同。分离蛋白混合 物时，盐的浓度常由稀到浓渐次增加，每过滤分离得到一种蛋白质沉淀后，再调节盐的 浓度，使第二种蛋白质沉淀。而p h 值影响蛋白质的溶解度，需将盐液p h 值调节在被 分离蛋白质的等电点附近。 1 3 3 2 有机溶剂提取法 有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而增加蛋白分子间的引力，使蛋白质溶解度降 低而析出；另外，有机溶剂可破坏蛋白质分子表面的水化膜，故蛋白质可用有机溶剂进 行分离【4 引。使用的有机溶剂多为与水可混溶的有机溶剂，如甲醇、乙醇和丙酮。 某些蛋白质在水中的溶解度能被有机溶剂显著降低；而且在一定温度、p h 值下， 能使蛋白沉淀的有机溶剂浓度有所不同。因此，控制有机溶剂的浓度可以分离纯化蛋白 质。高浓度有机溶剂易引起蛋白质变性失活，影响其营养价值，故操作必须保持低温。 另外，在有机溶剂中添加中性盐能明显改变蛋白质的溶解度，减少变性，但要控制好盐 浓度。 目前，国内提取大米蛋白的溶剂主要有：表面活性剂( 十二烷基硫酸钠，十六烷基 三甲基溴化铵) ；弱酸如乳酸或醋酸；脂肪酸盐如水杨酸钠、n a h s 0 3 ；碱液( n a o h 溶液、 k o h 溶液) ；氢键破坏剂( 尿素) ；还原剂( n n 二甲基甲酰胺，巯基乙醇) 。但若大米蛋白 以食用为目的提取，多半采用碱液。 1 3 3 3 离子交换法 蛋白质为两性物质，调节其p h 值，可使蛋白表面带电荷，因此可用离子交换剂进 行分离、提纯，特别对初步纯化后的蛋白质采用此法效果尤为显著【5 1 1 。在酸性条件下， 蛋白质以阳离子形式被阳离子树脂