（应用化学专业论文）环孢菌素A二聚体及人工抗原合成.pdf

四川人学顾t 学位论文 挚s 8 q 环孢菌素a 二聚体及人工抗原合成 应用化学专业 研究生昊琼英指导老师戴晓雁 本文在提出环孢菌素a 夹心型酶联免疫吸附分析方法检测程序的基础上， 合成了环孢菌素a 的二聚体和人工抗原，为建立环孢菌素a 的酶联免疫吸附分 析技术提供了关键的物质基础。 为了制备环孢菌素a 的二聚体，本文提出了通过环孢菌素a 与光敏化交联 剂4 一苯甲酰基苯甲酸的光化学反应在环孢菌素a 分子上引入活泼羧基，然后将 经过化学修饰的环孢菌素 分子和乙二胺反应，在2 一溴一1 一乙基吡啶四氟硼酸 盐缩合剂的作用下生成环孢菌素a 的二聚体的合成路线，并在实验室合成了环 孢菌素a 的二聚体。 环孢菌素f t 人工抗原的合成是将化学修饰后的环孢菌素a 分子在卜一乙基 3 一( 3 一二甲氨基丙基) 碳二亚胺盐酸盐作用下与聚一l _ 赖氨酸大分子载体 反应生成的，化学合成的环孢菌素a 人工抗原通过间接酶联免疫吸附分析方法 检测，证明该人工抗原能与特异性极高的环孢菌素a 单克隆抗体发生特异性亲 和反应，有望获得高质量的环孢菌素a 抗体。 本文不仅在总结蔚人工作的基础上提出环孢菌素a 夹也型酶联免疫吸附分 析方法检测程序，并合成了环孢菌素a 的二聚体和人工抗原，而且在合成研究 中结合环孢菌素a 的二聚体和人工抗原具体实验和相关理论对合成涉及的光化 学反应，酰胺化反应的具体反应机理进行分析探讨。 本文针对缺少活泼官能团的环孢菌素a 半抗原分子建立酶联免疫吸附分析 方法研究，合成了环孢菌素a 的二聚物和人工抗原，其合成方法和技术可用于 其他物质的二聚物和人工抗原合成，特别是缺少活泼官能团的物质。 关键词：环孢菌素am - 聚体人工抗原 ! ! ! l ! 查兰堡：! 兰些堕兰 s y n t h e s i so ft h eb i s a n a l o g u ea n d t h ei m m u n o g e n o fc y c l o s p o r i na s p e c i a l t y ：a p p l i e dc h e m i s t r y p o s t g r a d u a t e ：w uq i o n g 。y i n gs u p e r v i s o t ：d a i x i a o 1 y a n g i nt h i sp a p e rt h ep r i n c i p l eo f s a n d w c he n z y m ei m m u n o a s s a y o f c y c l o s p o r i na ( c s a ) u s i n gb i s a n a l o g u e o ft h ec s ah a sb e e n d e s c r i b e d f t m h e r m o r e ，t h e b i s - a n a l o g u eo f c s a a n dt h ei m m u n o g e n o f c s a ，w h i c h a r et h e n e c e s s a r ym a t e r i a lt o e s t a b l i s ht h e p r o m i s i n ga n a l y t i c a lt e c h n i q u e ，h a v e b e e n p r e p a r e d t h er o u t ew e d e s i g n e dt op r e p a r et h eb i s a n a l o g u eo ft h ec s a w a sa sf o l l o w s ： c s ar e a c t e dw i t h4 - b e n z o y l b e r g o i ca c i du n d e ru l t r a v i o e tr a d i a t i o nt og 锄e m mt h e c o n j u g a t eo fc s a - b b a , w h i c h h a sar e a c t i v ec a r b o x y l t h e n , t h eb i s - a n a l o g u eo f c s aw a sp r e p lb yt h er e a c t i o nb e t w e e nt h e c o n j u g a t e o fc s a - b b aa n d e t h y l e n e d i a m i n ew i t ht h e a c t i o no f2 - b m m o 一1 - e t h y lp y r i d i n i u mt e t r a f l u o m b e r a t e ( b e p ) a sar e s u l t , w es y n t h e s i z e dt h eb i s - a n a l o g u eo ft h ec s as u c c e s s f u l l yi n l a b o r a t o r y i nt h e e x p e r i m e n t t o s y n t h e s i z e t h e i m m u n o g e n o f c s a ，1 - e t h y - 3 一 ( 3 - d i m e t h y l a r n i n op r o p y l ) - c a r b o d i i m i d eh y d r o c h l o r i d e ( e d c i ) w a ss e l e c t e da sa c o u p l i n gr e a g e n t ；t h ec o 琦u g a c eo f c s a b b a w a s , l i n k e dt op o l y - l 一 y s i n et og e n e r a t e c s a i m m u n o g e n w h e nc s a - b b a - p l w a st e s t e db yi n d i r e c te l i s a ，t h es p e c i f i c a f f i n i t yr e a c t i o n o c c u r r e db e t w e e nt h e c o n j u g a t eo f c s a - b b a l p l a n dt h em o n o e l o n a l a n t i b o d i e st oc s a i t s u g g e s t e d t h a tt h em e t h o d so fa n t i g e n s y n t h e s i s w e r e p r a c t i c a b l e i nt h er e s e a r c ht op 瑶p a r et h eb i s - a n a l o g u eo f c s aa n dt h e i i m m u n o g e no f c s a , n 网川人学坝l 学位论文 t h em e c h a n i s mo ft h ep h o t o c h e m i s t r ya n dc o u p l i n gr e a c t i o nh a db e e nd i s c u s s e do n t h eb a s i so f t h e e x p e r i m e n t a ld e t a i la n dr e l a t e dk n o w l e d g e i no r d e rt o d e v e l o p t h es a n d w i c h e n z y m ei m m u n o a s s a yo fc s a ，t h e b i s a n a l o g u eo fc s a a n dt h ei m m u n o g e no f c s aw e r e p r e p a r e d t h ec o r r e s p o n d i n g m e t h o da n dt e c h n o l o g yw i l lt h r o wt h el i g h to n o t h e r , e s p e c i a l l y , t h eh a p t e nl a c k i n gi n r e a c t i v ef u n c t i o n a lg r o u p s k e yw o r d ：c y c l o s p o r i n a ，b i s a n a l o g u e ，i m m u n o g e n i i i i n ! 川1 人学硕卜学位论文 1 前言 1 1 检测环孢菌素a ( 0 s a ) 血药浓度的意义 环孢菌素a ( c y c l o s p o f i na ，简记为c s a ) ，商品名为山地明 ( s a n d i m m u n e ) ，由瑞士s a n d o z 公司于1 9 7 0 年从真菌代谢物中首次发现，是 一种具有强大免疫抑制活性的抗生素。与传统免疫抑制剂相比较，c s a 具有选 择性强，毒副作用相对较少，感染危害性低等优点。该药物在临床上应用以来， 促进了器官移植手术的进步，被称作是器官移植发展过程中的一个里程碑i l j ， 使器官移植进入了新的纪元，大大提高了临床上各种器官移植的成功率，特别 是在肝脏、心脏移植方面发展迅速，多年来徘徊不前的肾移植也登上一个新台 阶。目前，环孢菌素a 是世界范围内器官移植临床手术使用最广泛的抗排斥药， 此外还用于治疗某些自身免疫疾病，如类风湿、牛皮癣、i 型糖尿病等1 2 】。 在临床上，为了防止移植器官的排斥，要求病人血液中c s a 的含量长期保 持在正常治疗窗范围，浓度过低易导致排斥或诱发自身免疫性疾病，高浓度容 易引起肝脏、肾脏毒性以及高血压、高钾血症、神经系统毒性等不良反应【3 】， 可见其治疗作用，毒性反应与血药浓度关系密切，安全范围窄。加上本药大多 数供长期预防性用药，肝脏、肾脏毒性在肝脏、肾脏移植时，难以和排斥反应 区别。而且，c s a 药物的动力学个体差异很大【4 】，c s a 药物的分配和代谢在每 个人体中的情况有很大不同，即使是在同一个病人体内，在整个治疗过程中， 这种差异也很大。因此，在环孢菌素a 治疗中，监测c s a 的血药浓度对指导医 生用药，实现给药方案个体化具有十分重要的意义。 1 2 检测环孢菌素a 血药浓度的方法 ，为达到个体化给药方案，避免毒副作用发生，在临床用药时应实行环孢菌 素a 血药浓度的检测。目前常用的检测方法主要有高效液相色谱法( ，l c ) 、 放射免疫分析法( r i a ) 、荧光偏振免疫分析法( f p 队) 、酶联免疫吸附分析法 ( e l i s a ) 等。h p l c 法是物理方法，后几种方法都属于免疫标记技术。 h p l c 法测定的是环孢菌素a 原形药物浓度，其结果不受代谢物影响，具 有特异性高的特点。但是不能一次测定大量样品，而且需要花很大功夫作样品 前处理以除去样品中的干扰物f 5 】，操作繁琐，成本高，对设备和操作技术也有 特殊要求，因此不适合常规分析。通常h p l c 法测定值作为测量值的参考标准。 四川人学硕l 学位论文 r i a 法【6j 是先在抗体中引入放射性元素( 如氘，碳1 3 等) ，使标记抗体与 待测样品中的抗原结合，除去多余的标记抗体后，再用相应的仪器检测待测液 中抗体量，从而知道样品中抗原的量。用r i a 来测量c s a 的浓度，其系统性 估计比h p l c 高2 - 4 倍。该法具有标记法的高灵敏度( 达到n g 和p g 水平) ， 反应速度快，容易观察，能定性、定量甚至定位的优点。但r i a 的缺点是需特 殊的仪器设备，有放射性危害，试剂有效期较短等，在一定范围内逐渐被其他 方法代替。 f p i a 法f 7j 是把c s a 、c s a 的代谢产物和荧光示踪物( 一般是在c s a 上 连有荧光基团的c s a 的衍生物) 与对它们有特异性的抗体混和，那么c s a 及 代谢物与荧光示踪物在有限的抗体结合部位将发生竞争结合，生成c s a ( 代谢 物) 一抗体复合物和荧光示踪物抗体复合物。如保持示踪物和抗体的浓度为常 数，那么c s a ( 代谢物) - 抗体复合物与荧光示踪物抗体复合物浓度的比值将 与c s a 和其代谢物的数量成正比。因此，用偏振光激发该混合物，测量荧光示 踪物与荧光示踪物抗体复合物发出的偏振荧光，就能定量的求出样品中c s a 与其代谢物的总量。与r i a 比较，此法即具有r i a 法的优点，而且稳定性好。 但此法中制备c s a 的荧光衍生物较为复杂。而且需要特殊仪器，价格昂贵。 e l i s a 法e6 1 是用酶( 如辣根过氧化物酶h p r ，碱性磷酸酶等) 代替放射 性物质或荧光物质作标记物来测量c s a 。由于酶的催化作用，可使原来无色的 底物通过水解、氧化或还原反应而显示颜色，根据显色的程度来确定样品中c s a 的浓度。e l i s a 法不但具有其他超灵敏度检测技术所具有的检测灵敏度高、特 异性强的优点，而且还可避免其他方法的不足之处。e l i s a 法是以抗原或半抗 原与抗体之间特异性亲和反应为基础的免疫标记技术，不需要象h f l c 法那样 对样品进行特殊处理，也不需要特殊设备。相对于r i a 法、f p i a 法来说，e l i s a 法是以酶做标记物，具有标记物稳定，有效期长，重复性好，不污染环境，自 动化程度高，操作简便快捷，应用范围广的优点，是一种很有发展前途的方法。 1 3 酶联免疫吸附分析法 e l i s a 法【8 1 是1 9 7 1 年由荷兰学者v a nw e e m a n 与s c h u r r s 和瑞典学者 e n g v a l l 与p e r l m a n 几乎同时提出的。基本原理是固定在合适载体上的抗原或 抗体与相应的酶标抗体或抗原形成酶标记的抗原抗体复合物，在酶底物参与 四川丈学硕士学位论文 下，复合物上的酶催化底物使其水解，氧化或还原成另一种带色物质。在一定 条件下，酶降解底物和呈现颜色成正比，因此可通过显色程度知道反应的抗体 抗原的含量。酶联免疫吸附分析法是以抗原或半抗原与抗体之间特异性亲和反 应为基础的免疫标记技术。抗原物质分为完全抗原和半抗原。完全抗原同时具 备免疫原性( i m m u n o g e n i c i t y ) 和免疫反应性( i m m u n o r e a c t i v i n g ) 。前者指具有 刺激机体产生免疫应答能力的特性，既抗原性( a n t i g e n i c i t y ) ：后者指具有与相 应抗体发生特异性亲和反应的特性。完全抗原是指具有免疫原性和免疫反应性 的一些大分子物质，如蛋白质、多糖等，其分子量一般都大于1 0 0 0 0 d a 。半抗 原是指有免疫反应性而无免疫原性的物质。环孢菌素a 是半抗原，分子量为 1 2 0 2 6d a 。 e l i s a 法根据抗体抗原反应动力学可分为竞争性e l i s a 法和非竞争性 e l i s a 法，其基本设计程序如图1 1 所示【9 】。 非竞争法 1 双位点夹心法检测抗原 ha b ( b ) e 洗涤弃去 s a b ( a ) + a g + a b ( b ) e 1 分析物过量l s a b ( a ) _ a r a b ( b ) e + s b + p 2 双位点夹心法检测抗体 r a b 2 e 洗涤弃去 s a g + a b l + a b 2 e 1 分析物过量l - + s a g - - a b l - - a b 2 e + s b + p 竞争法 3 酶标抗原法检测抗原 s a b + a g 分析物驾a 舭s a b - - a g e + s a b 飞s a b + + a g e + + 一a g a g e 洗涤弃去 矗 i p ! ! 型查兰堕! ：兰竺堡兰 4 酶标抗体法检测抗原 s a g + - a g 分析物垄兰竺宝a 旷眦+ s a 旷a b e + a l 广 口匕十3 a f a o l a b 6 洗涤弃去 矗 p 图1 。1 非均相固相酶免疫分析的基本设计程序 f i g i ib a s i cp r o g r a m o f s o l i dp h a s ee n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n t a s s a y s 代表固相支持物，e 代表酶，s b 代袭酶的相应底物，p 代表底物在酶的 作用下产生的产物，a g 代表抗原，a b 代表抗体。a b ( a ) 和a b ( b ) 分别是舨 的抗体，a b 是a g 的抗体，同时又是a b ：的抗原，a b ：是a b ；的单克隆抗体。 根据反应体系与检测体系之阔的关系也将e l i s a 法分为直接e l i s a 法和 间接e l i s a 法。直接法是将抗原吸附于固相载体，用酶标抗体来检测，而间接 法是将抗体吸附于固相载体，用酶标抗原来检测。 e l i s a 法发展迅速，比较常见的有浸测试剂条法，免疫浓缩法，多层免疫 试剂条法等检测模式，基本上都是双位点夹心法。 1 4 小分子的夹心e l i s a 法 e l i s a 法已经广泛用于蛋白质等大分子抗原和抗体以及药物，激素等小 分子的灏定。对于大分子物质，由于具有多个抗原决定簇，可使用常见的夹心 型免疫检测方法，能提高检测的灵敏度和特异性。而c s a 是小分予半抗原，对 于小分子物质，由于其与抗体结合的“单价”特性，与一分子抗体结合后，就 不能再跟另外的抗体结合，所以不适合用夹心法测定。 小分子半抗原的酶免疫分析技术多采用液相竞争法，但操作繁琐，重复性 差。为开发出理想的小分予半抗原酶免疫分析技术，人们作了很多努力。最近， 有用小分子夹心法酶免疫技术测定小分子的报道fn 1 4 】。 a l i 等人【n “】提出小分子夹心法酶免疫技术测定。他们在化学合成小分子 二聚体的基础上，建立了检测睾酮的夹心酶免疫实验。大大提高了睾酮测定的 敏感性和特异性。在检测中，先用睾酮特异的抗血清包被固相载体，再加入睾 4 p qj 1 1 人学坝j j 学位论文 酮分子的二聚体和待测睾酮以及酶标抗睾酮抗体，根据与固相抗体结合的睾酮 二聚体的量和待测睾酮成反比的关系可算出待测睾酮的量。在这种检测方法 中，睾酮二聚体连接固相抗体和酶标抗体，形成双抗体夹心复合物。 t a n a k a 等人【1 2 】建立了小分子t 4 两位点酶免疫检测方法。在检测中，合成 的小分子t 4 一亲合素结合物起到连接固相抗体和生物素一酶结合物的作用。这一 方法由于亲合素一生物素一酶的放大作用，检测的灵敏度较高。 李金命【1 3 】等用地高辛( d i g ) 为指示分子，化学合成地高辛和t 3 的二聚体， 用抗t 3 抗体、t 3 一地高辛结合物和抗d i gf ( a b ) 2 - h p r 建立了t 3 小分子 的夹心e l i s a 法，并探讨了t 3 双抗夹心酶免疫测定方法。这一方法使用了不 均一的二聚体t 3 一地高辛结合物把表面看来不相关的两部分结合起来实现t 3 的双抗体夹心e l i s a 法的检测。 另外李金命等【1 4 】还用地高辛一人血清白蛋白为中介体，建立了地高辛小分 子夹心e l i s a 法。与普通e l i s a 法比较，该方法具有更高的灵敏性，特异性好。 在这检测中，用小分子一蛋白质取代小分子二聚体，蛋白质只起到载体作用。 通常，这类检测程序设计是先将半抗原通过化学方法连接到一个化合物 上，形成具有两个或多个半抗原的稳定结合物。测定时将半抗原结合物与待测 样品竞争性地和固相抗体结合，洗涤后加酶标抗体，再洗涤后加底物显色。研 究表明该检测方法不仅简单易行，而且能提高检测的灵敏度和特异性。 前人的工作虽然只是针对某一种小分子建立了夹心e l i s a 法，但他们的研 究为后人进行小分子的酶免疫检测技术的研究开拓了思路。总结他们的工作， 不难发现其共同的地方，即通过化学合成的方法生成小分子半抗原的二聚体、 多聚体，使其具有二价性、多价性，并在此基础上建立小分子半抗原的夹心 e l i s a 法。比较二聚体、多聚体做中介建立小分子夹心e l i s a 法的特点，本文 认为虽然小分子一蛋白质的合成及分离纯化比小分子二聚体的合成及分离纯化 要简单，但是因为小分子蛋白质结合物中小分子数量的批间差异较大，而且同 一批结合物中每个蛋白质分子上结合的小分子数量也常有较大差异，所以在 建立c s a 小分子夹心e l i s a 法研究中，用多价的c s a 半抗原结合物建立小分子 夹心酶免疫分析方法可能导致检测重复性差，效果并不理想，而是选择c s a 二 聚体作中介物较好。 删川1 人学硕卜学位论文 1 5 研究目的和任务 目前还没有成功开发出c s a 酶联免疫吸附分析方法的报道，到底什么样的 检测程序设计才能更好地实现c s a 酶联免疫吸附分析还需要继续研究考察。前 人针对某一种小分子建立了夹心型e l i s a 法的研究表明，该方法能提高检测的 灵敏度和特异性，这就为建立c s a 的夹心型e l i s a 法检测提供了思路。本文研 究工作的目标就是提供建立环孢菌素a 的夹心型e l i s a 法所需要的物质基础， 以建立环孢菌素a 的e l i s a 法，并通过建立环孢菌素a 的e l i s a 法的研究工 作，为以后建立其他物质的e l i s a 法探索合适的思路和技术。具体在环孢菌素 a 的夹心型e l i s a 研究中需要做的相关研究内容及相互关系如下图1 2 所示。 图1 2 建立e l i s a 的研究工作内容 f i g 1 2m a i nr e s e a r c hi nt h ef o u n d a t i o no fe l i s 从图1 2 可见，获德环孢菌素a 的二聚体以及人工抗原的合成是建立环孢 菌素a 的夹心型e l i s a 的关键和基础。本文重点是进行c s a 的二聚体合成路 线与工艺的研究，同时对合成的c 蚺人工抗原进行检测鉴定，并为抗体制备提 供c s a 人工抗原合成产物。 6 囡囤 型型查兰堡：! ：兰些堡兰 一，一 2 环孢菌素a 二聚体的合成研究 2 ，1 合成环孢菌素a 二聚体的目的和意义 以c s a 二聚体为基础建立的c s a 夹心e l i s a 法的基本原理如图2 1 示【1 0 】。 皓嚣e l e l 攀 怍 + d 钿+ 掣 阡 咖 卢 固相 半抗原 抗体 二聚物 帅夕 k 夕一物 咖夕 图2 1 夹心酶免疫检测法基本原理 f i g 2 1p r i n c i p l e o f s a n d w i c he n z y m ei m m u n o a s s a yo f h a p t e n s 在环孢菌素a 人工抗原合成研究中，本文采用了将化学修饰后的c s a 与聚 l - 赖氨酸发生偶联反应生成环孢菌素a 人工抗原的路线( 见第三章) 。c s a 的 化学修饰作用在c s a 的1 位残基侧链，这与环孢菌素a 二聚体合成研究中c s a 的化学修饰位置相同。当生成的c s a 人工抗原用于动物免疫实验后，获得的c s a 单克隆抗体应是针对c s a 的非化学修饰部位的。因此，在检测过程中，一个待 测抗原与一个抗体结合后就不能再与其他抗体结合，而一个c s a 二聚体与一个 抗体结合后，仍可以和另外一个抗体结合，形成抗体一二聚体一抗体复合物，用 于检测。 标体酶抗 原 物 测抗 闭潦廨 制燃 铂潞一 几u 一型型查兰堕主兰竺堕苎一 夹de 。【s a 法正是基于抗体一半抗原二聚体酶标抗体复合物的形成和检测 而建立的。而半抗原二聚物在检测中起到联结抗体和酶标抗体的桥梁作用，合 成c s a 二聚体是建立c s a 夹心e l i s a 法的基础和关键。 2 2 确定环孢菌素a 二聚体合成方案 19 7 0 年，瑞士s a n d o z 药厂首次发现了c s a ，19 7 6 年p e t c h e r 等确定了其结 构【l s l 。c s a 是山十一个氨基酸残基组成的环状多肽，其分子结构式如图2 2 所示。 m 。c j h e 2 h h 3 褥1 1 鹊h ch2ch3-n-ch-co-n-chc-n-ch-co-n-毪ch-5,-严n-qh23 1 口足 ： 。ch一：琶妻三一n一。一二一i一。)-llch-n-c-(：h-n-一。三莹ch。 靶一蓼艇叱冬怠 图22 环孢菌素 分子结构式 f i g22s t r u o t u r a id i a g r a mo fc y c i o s p o r l n 在肽链的十一个氨基酸残基中，有七个是n 端甲基化的。1 位氨基酸残基 是c 认分子中唯一含有活性基团的( 4 r ) 一4 一 ( e ) 一2 一丁烯基 一4 ，n 一 二甲基一l 一苏氮酸( m c b m t ) 。由于空间俺胆的影响。c s a ! 位残基上羟基和 双键的活性也比较低。所以要舍c s a 的人工抗原，必须通过化学方法对c s a 分子作出一定的改造，引入活性基团如羧基、氨基等，进而实现c s a 的二聚体 8 塑型叁堂堡! ：兰丝堡苎 的合成。 2 2 1 确定环孢菌素a 化学修饰的路线 为了在c s a 分子上引入活性基团，人们进行了不少探索和努力。由于在 c s a 分子中，只有1 位残基侧链上有活泼基团。所以，对于c s a 化学修饰的报 道通常是在1 位残基侧链上进行的。其中羟基由于受到空间位阻的影响，反应 活性降低，所以目前关于利用c s a 上羟基的活性进行化学修饰的报道较少。大 多数关于c s a 化学修饰的成功报道都是基于双键的反应活性而进行方案设计 的。 w 锄g n a i y i 等人f 4 】于1 9 8 8 年提出一种氧化双键形成羧酸的合成方法。先 将c s a 上的羟基通过乙酰化保护，然后用四氧化锇把c s a 上的双键氧化成顺 式二醇，再用高碘酸钠将其氧化断链成醛，分离纯化后将醛与羧甲基羟胺半盐 酸盐( h 2 n o c h 2 c o o h ) 在碳酸氢翎盐溶液中反应形成希夫碱，从而引入羧基。 m i g u l l ah e i f l z 等人【16 j 在1 9 9 1 年提出将c s a 上的羟基保护后，用过氧乙酸 对c s a 上的双键进行环氧化。利用双键环氧化后的产物的活性可继续进行其他 反应。 p a p r i c a 等人【l 7 】于1 9 9 2 年提出将羟基保护后的c s a 分子与高锰酸钾高碘 酸钠复合氧化剂反应，使双键氧化断键生成可供偶联的羧酸。 c h e r tp e i q i n 等人8 l 于1 9 9 5 年提出以6 氨基己酸为桥在臭氧化处理双键后 的c s a 分子上引入氨基。 l u z h e n g - r o n g 等人【l 州于2 0 0 0 年报道了在c s a 分子l 位残基上进行结构 改造的方法：环孢菌素a 与m 一氯化过苯甲酸在碳酸钠存在下发生氧化反应， 由于c s a 的环氧化物不稳定，重排为更稳定的五元环结构内酯衍生物，再经过 与过量乙二胺开环反应得到环孢菌素a 的氨基衍生物。 江辉等人t 剐于2 0 0 1 年对以上方法进行改进，合成了c s a 的氨基衍生物。 在叔丁醇反应溶剂中，碳酸钠存在下，c s a 与高锰酸钾偷碘酸钠复合氧化剂反 应，然后再与n a 2 s 2 0 5 反应。产物与过量乙二胺反应，得到c s a 的氨基衍生物。 这些方法都是在氧化双键的基础上引入活泼羧基的。通过氧化方法对c s a 进行化学修饰的方法都有一定的缺点，如涉及的反应步骤多，反应时间长，氧 化反应的条件不容易控制，副产物多给分离造成困难，反应收率低等。 9 四川人学硕l 学位论文 此外，e r l a n g e r 等人2 1 】于1 9 8 9 年还提出了一种利用光反应引入活泼基团 的合成路线。将c s a 与光敏化交联剂4 - 苯甲酰基苯甲酸( b b a ) 溶于苯中，用 b 1 0 0 紫外灯产生3 2 0 n m 的紫外光，在室温下光照7 小时，发生光解反应将含 有羧基的b b a 连在c s a 上，生成c s a b b a 共轭物，引入羧基。 采用光化学反应引入活性基团的方法具有条件温和，不需要特殊的反应和 分离设备等优点，而且光激活的中间体不会断开肽键，更大程度地保存了c s a 的结构特征。 在本文中，由于c s a 的e l i s a 检测法是以抗原和抗体的特异性亲和反应 为基础的，所以应该在化学修饰中尽量少的对c s a 分子结构进行改造，特别是 要保证c s a 环状结构的完整性。在对前人工作的总结基础上，结合对相关化学 反应特点的理论分析，本文选择采用光化学反应引入活性基团的方法，在c s a 上引入羧基，即在紫外光的照射下，c s a 与光敏化交联剂4 一苯甲酰基苯甲酸 ( b b a ) 反应，生成c s a - b b a 共轭物，在c s a 上引入羧基。 2 2 2 确定合成环孢菌素a 二聚体的路线 通过化学方法在c s a 上引入活性基团后，可幂0 用活泼基团的化学反应活性 来实现c s a 二聚体的合成。目前还没有查到将两个c s a 连接在一起的成功报道。 由于c s a b b a 上羧基直接联在苯环上，受到共轭效应的影响，反映活性不 高，加上空间位阻的影响，可能较难直接反应生成二聚体，可考虑用双官能团 分子联结，如乙二胺、己二胺等。从c s a 夹心e l i s a 法检测技术的角度考虑， 双官能团分子的长度对检测结果是有一定影响的。长度太短，可能造成两个c s a 分子过于接近，从而在空间结构上产生变化，影响抗原和抗体在空间结构上的 对应，不利于抗原抗体间的反应；如果双官能团分子过长，可能会出现c s a 二 聚物中两个c s a 分子由于在空间上自由伸展过大，同时与固相抗体结合而造成 检测误差。因此本文初步选择7 , - - 胺做双官能团分子，这主要是考虑到c s a 经 过光化学反应接上b b a 后分子侧链长度已经有一定的延长，使用链长较短的乙 二胺分子有利于避免桥链过长造成的不良后果，而且乙二胺分子结构简单，价 格便宜，使用方便。a l i 等人【l l j 在建立检测睾酮的夹心酶免疫检测方法时，就 是以乙二胺为桥，利用睾酮上羧基的反应活性，实现了睾酮二聚体的合成。 c s a 二聚体的生成是基于羧基和氨基的反应。羧基和氨基的反应称为酰胺 1 0 心川人学硕l 学位论文 化反应。反应机理如图2 3 所示。 8 ：2 f n 一8 一。+ m 一；= 一n 一6 。 ，：裔 1 5 ： ( z ，n 羔b n 一8 一w 。+ ：。一 酰胺化反应一般通过以上两步来进行，第步是羰基的碳上发生亲核加 成，形成一个带负电的中间体，中心碳原子为s p3 杂化，是一个四面体结构。 第二步，反应中间体消除一个离去基团，形成羧酸衍生物。因此将此类羰基化 合物的亲核取代反应叫做羰基的亲核加成一消除反应。 通常，从酸酐或者酰卤化物可制备高产率的酰胺化合物，但对于自由羧 基和氨基来说，它们的酰胺化反应往往要求某一种反应物质过量并且要通过 加热等方法连续除去反应中产生的水，这就给反应操作带来很多麻烦，特别 是对于某些对温度敏感的物质，这类方法显然是不适用的。 因此多年来，人们一直在寻找新的方法，使等摩尔量的自由羧基和氨基 的酰胺化反应的条件更温和，操作更简便。为了使酰胺化反应较易发生，可 活化氨基，也可活化羧基，但迄今为止，普遍使用的是活化羧基的方法。常 用的活化羧基的方法有混合酸酐法、活泼酯法、碳二亚胺法等【2 2 】。 混合酸酐法：在低温和叔胺存在下将羧基组分同氯甲酸酯反应制成混合酸 酐，然后将生成的混合酸酐与氨基组分反应。 m o o 叶t c 即c o 吼- 删茹o 混合酸酐法简单，反应释放出c 0 2 和醇，有利于产物分离纯化。但是由 于活泼中间体很不稳定，所以在制备酸酐时要严格保持低温，保持所用的仪 四川i 大学硕：j j 学位论文 器和溶剂干燥。 活泼酯法：在低温下，羧基组分和n 一羟基丁：酰亚胺反应生成活泼酯， 然后与氨基组分反应。 g9 r c o o h + r n o h _ r n - o c o r 否召0u 活泼酯中间体具有一定稳定性，可以分离纯化保存，但是活泼酯立体效 应大，反应活性不高，反应速度幔。 碳二亚胺法：在低温下，羧基组分同n ，n 二环己基碳二亚胺反应生 成活泼中间体0 酰基脲，然后与氨基组分反应生成酰胺化合物，并释放一分 子n ，n 一二环己基脲( d c u ) 。 唧o 拈c = n o 一言篡柑。 碳二亚胺法反应生成的d c u 在多数有机溶剂中溶解度小，很难完全除去， 后来发展了水溶性的碳二亚胺缩合剂，可避免这一麻烦。 近年来，随着多肽物质的发展，人们设计、合成了更多新的多肽缩合剂， 简化了酰胺化反应的操作，提高反应产率，反应条件温和。碳二亚胺法、活 泼酯法、混合酸酐法等渐渐被各类鲶盐法所代替。其中用毗啶鲻盐做缩合剂 可以高效促进酰胺键的形成，具有反应速度快、收率高、反应条件温和、操 作简单等优点，特别在生成商空间位阻的酰胺键时有令人满意的结果【2 4 j 。 本文通过光化学反应在c s a 分子上引入羧基，再利用羧基的反应活性通过 酰胺化反应实现c s a 二聚体的合成。酰胺化反应中的亲核取代步骤发生在与 苯环相连的羧基的羰基碳上。羰基碳原子是s p 2 杂化，它的三个键以三角形结 构分布在同一平面上。羰基碳的正电性是亲核试剂对这个碳进攻的原因。羰基 碳上连接的基团对反应有一定影响，吸电子基将增强羰基碳的正电性，有利于 亲核试剂的进攻。如果是推电子效应则效果相反。在本文中，c s a - b b a 中的羧 基接在苯环上，由于受到共轭效应的影响，羰基碳的正电性减弱，不利于亲核 试剂的进攻。亲核加成后所生成的中间体其碳原予由s p 2 杂化变为s p3 杂化。 即e h - 2 角结构转变为四面体结构。如果原来羰基碳原子上连接的基团过于庞 1 2 p q 川人学明士学位论文 大，在四面体结构中就显得空间过于拥挤面不利于反应的进行。本文中苯环与 c s a 大分子相连，空间位阻较大，不利于c s a b b a 的酰胺化反应。上述电子 效应和空间效应都将对第一步的反应速度有所影响。总的反应速度与两步反应 速度都有关系，但第步较重要。第二步反应是否进行，取决于离去基团的碱 性，碱性越弱。越易离去。当c s a b b a 直接与氮基组分反应肘，离去基是羟 基，不是个很好的离去基。 从以上分析可知，对于c s a b b a 分子来说，很难直接通过自由羧基和氨 基的反应来生成二聚体，需要对羧基迸行活化，根据c s a b b a 分子上羧基反 应活性低，空间位阻大的特点，本文最终选择2 一溴1 一乙基一吡啶四氟硼酸盐 ( b e p ) 做缩合剂，以实现c s a b b a 分子二聚体合成。 2 ，2 ，3 环孢菌素a 二聚体合成方案 通过对c s a 化学修饰以及酰胺化反应进行分析，本文卒刀步确定了c s a 二 聚体的合成方案，实验部分合成路线如下： h v 乙二胺 c s a + b b a _ c s a b b a _ c s a 一- - 聚体 b e p 即在光照条件下条件下，c s a 与光敏化交联剂4 - 苯甲酰基苯甲酸( b b a ) 反应，生成c s a - b b a 共轭物，分离纯化后，c s a - b b a 在2 溴1 一乙基- 吡啶四氟硼 酸盐( b e p ) 作用下，与乙二胺反应生成c s a 二聚物。反应分为光解反应和酰 胺化反应两步。 心川火学硕：卜学位论文 2 3 环孢菌素a 二聚体的合成 2 3 1 试剂和器材 表21 实验所用试剂 t a b f e21 r e a g e n t s 名称规 格生产厂家 环孢菌素a ( c s a ) 杭州中美华东制药有限公司 4 一苯甲酰基苯甲酸( b b a )a r a c r o so r g a n i c s 丙酮a r 中国成都金山化工试剂厂 无水甲醇 a r 成都化学试剂厂 三氯甲烷a r 成都化学试剂厂 二氯甲烷a r 重庆东方试剂厂 厶 酸a i l 四川德阳化学试剂厂 l 一乙基一3 一( 3 一二甲氨 基丙基) 碳二亚胺盐酸盐 a r a c r 0 s0 r g a n i c s 二甲基甲酰胺( d m f )a r 天津德信化工公司试剂分厂 商纯氮气 成都无缝钢管有限 塞堡垒望堡! 墨 硅胶g f 2 “( 6 0 型)c a 中国青岛淘弹化工集团公司 叔丁醇c a 上海化学试剂站中心化工厂 l - - 胺a r 广东西陇化工厂 三乙胺a r 成都科龙化工试剂厂 一氰基一4 一羟基一肉桂酸 s i g m a 公司 兰型坠兰至薹堕鐾璺堑塑墼垫! ! 坚! 奎塞些堕三些堡塞叁垫 硼酸 a r 成都化学试剂厂 三羟甲基氨基甲烷( t r i s )c a f a r c oc h e m i c a l s u p p l i e s = 一 一 竺坚些坚 乙二胺四乙酸二钠( e d t a )a r 成都化学试剂厂 1 4 叫i 大学预j 学位论文 表22 实验所用主要器材 t a b i e22i n s t r u m e n t s 名称 型号及生产厂家 红外光谱仪 n i e o l e t5 6 0 型 紫外光谱仪 b e c 肼a nd u 一7 型或 b e c k m a n5 3 0d n a 蛋白质分析仪 核磁共振仪v a r i a nu n i t yi n o v a 一4 0 0 型 显微熔点仪x r c l 型，四川大学科仪厂 水环真空泵 s i z d 型，河南巩义市英峪豫华仪器厂 旋转蒸发器e y e l ar o t a r ye v a p o r a t o rn - 1 0 0 0 型 碘镓灯 3 0 0 w ，成都灯泡厂 电子天平a e l - - 1 2 0 型，x i a n g y ib a l a n c e 公司 医用氧气袋 y d - - 4 2 型，上海医疗器械工业公司 飞行质谱仪8 i f l e x i i i 型，b r u k e r 公司 2 3 2 光化学反应 2 3 2 1 反。应机理 在光化学反应中，本文选用4 - 苯甲酰基苯甲酸( b b a ) 作光敏交联剂。b b a 分子式如下： 在光激发下，羰基化合物通常会出现两种类型的激发：。* 、。一。* 对于带有强的释放电子基团的某些芳酮类和醛类，也可能出现电荷最终迁移到 羰基氧上而产生的电荷转移态( c t ) 态冽。这三种类型的激发态( n 一“) 、( 。 一n + ) 、( c t ) 具有不同的电子分布： 1 5 叫川人学硕_ j ：学位论文 r i 巧+6 一 = = 0 f 一- g 当发生n 一“* 跃迁时，氧上的非键电子对中的一个电子，从定域在羰基平 面中的轨道跃迁到离域在羰基之上的反键n * 轨道。t * 轨道中电荷更多地离域 在碳上，激发态时碳上的电子密度比基态高。两氧原子激发态时电子相对不足， 使氧原予带有局部形式的正电荷，羰基氧原子表现出良好的亲电性。在n n * 跃迁中，羰基不明显参与作用，因此保持了羰基的正常极化。而在c t 跃迁 中，羰基是电子受体，氧原子上出现形式上的负电荷。 原则上，所有酮类的n n * 态都具有“n * 的某些特征，而在反应溶剂 和其他实验条件相同的情况下，一定结构的酮类具有相应的主要最低三线态激 发态形式。研究1 2 9 认为二苯酮以n n * 态为主要贡献结构，从结构分析，b b a 为羧基对位取代的二苯酮，其激发态以n n * 态为主要贡献形式。 具有亲电子中心的a a a 激3 t 态可能发生氢提取反应和双键的加成反应膦 。 c s a 侧链有一个不饱和双键，b b a 激发态还可与双键发生光环化加成，生 成c s a - b b a 产物。反应机理如图2 4 所示。 9 8 c 。一 激发三线态矗一 双自由基中间体 图2 。4 环化加成反应 f i g 2 4c y e i l ca d d i t i r e a c t l d n 1 6 一o 一 口 u。 戳 r 心川大学坝j 二学位论文 羰基化合物与烯烃的光环化加成一般是以羰基化合物的1 1 一n * 态进攻一 个不饱和化合物的方式进行的【2 ”。在反应中，羰基氧非协同地加成到烯烃的n 体系上，形成双自由基中间体，双自由基电子自旋反转配对后形成第二个键， 生成氧杂环丁烷。 如果在附近存在适当的氢供体，具有亲电子中心的b b a 激发态则可发生氢 提取反应，理论上c s a 分子中的各个氢原子都可以发生氢提取反应，反应的效 率取决于氢供体的亲核性。由于共轭效应和空间位阻的影响，双键末端a 位的 氢活性更大，将优先被提取 2 8 j ，即最可能的结构为： 影父 夺氢反应机理【2 7 - 2 9 】如图2 5 所示： 9 b c o o h + 蠢k ! _ , j 9 婚c o o 2 。o 一；土c 。一k k 3 ( 3 ) 0、人赢 篙 广01。一竖( 笛 叫川大学硕上学位论文 鼍q c o o 一+