（应用化学专业论文）蛋白质核酸的生物印迹及酶的电驱动催化研究.pdf

蛋白质核酸的生物印迹及酶的电驱动催化研究 摘要 本论文是对酶蛋白质催化机制的研究。课题包括两部分内容：( 1 ) 对蛋白质和核酸 进行生物印迹，通过构建新的活性部位来探索静态形状的契合对催化活性的贡献；( 2 ) 以 交变电场刺激智能高分子材料所包埋的蛋白酶，研究电刺激频率对催化活性的影响。 利用蛋白质在水溶液中的柔性，分别采用热变性法对蛋清蛋白质进行生物印迹和沉 淀法对b s a 进行生物印迹，并在b s a 印迹的基础上又印迹了鲱鱼精脱氧核糖核酸。实 验结果表明，热变性法制备的印迹酶在水溶液中依然保持其活性，且反应物印迹的蛋白 质催化性能较高；沉淀法生物印迹的生物大分子表现了一定的酶活性，b a e e 印迹的 b s a ，随所用b a e e 的量的增大，b s a 印迹酶的催化性能越高；但a c - p h c o h 印迹的 b s a ，在催化a c p h e o h 酯化时，催化活性与所用的a c - p h e - o h 量并无明显关系。所 用的鲱鱼精脱氧核糖核酸在2 6 0n m 处的吸光度与2 8 0n m 处的吸光度的比值小于1 9 ， 所以其纯度不够，含有蛋白质等杂质，被印迹的主体分子可能仅是其中的蛋白质，致使 b a e e 印迹的核酸这种印迹酶的催化活性明显不高。 为了研究胰蛋白酶在交变电场中活性的改变，采用了包埋法将其固定在聚合物内， 通过反应体系电场频率的改变刺激电场敏感性聚合物的收缩，来控制胰蛋白酶的运动以 改变其活性。本文分别以a m p s 和m a a 为单体，b i s 为交联剂，过硫酸铵为引发剂， t e m e d 为加速剂及在最适用量比的情况下进行了聚合。实验分析表明p a m p s 要比 p m a a 包埋酶性能好；在交变电场下胰蛋白酶催化b a p a 时，各频率之间吸光度的变化 基本上无规律；而p a m p s 固定化酶在交变电场频率为1 0 0h z 时有明显的改善，而在 1 0h z 和3 0 0 h z 时较小，还不如无电刺激时p a m p s 固定化酶的催化效果，说明通过改 变反应体系所在的交变电场的频率可以改变胰蛋白酶的活性。 关键词：生物印迹；活性部位；胰蛋白酶；催化反应；活性；固定化酶；交变电场 b i o i m p r i n t i n go fp r o t e i n d n am a c r o m o l e c u l e sa n d e l e c t r o - d r i v e nc a t a l y s i so fe n z y m e a b s t r a c t m e c h a n i s mo fp r o t e i n sa se n z y m e sw a ss t u d i e di nt h et h e s i s t h er e s e a r c hc a l lb e d i v i d e di n t ot w oa s p e c t s ：( 1 ) t h ep r o t e i n sa n dn u c l e i ca c i da r et a i l o r - o f fb yb i o i m p r i n t i n gt o c r e a t en e wa c t i v es i t e s ，s oa st oe x p l o r et h ec o n t r i b u t i o no fe n z y m ea c t i v i t yb ys t a t i c p r o t e i n d n a - l i g a n ds h a p ef i t ；( 2 ) i n t e l l i g e n tp o l y m e r - i m m o b i l i z s e de n z y m e sa r ea p p l i e db y a l t e r n a t i n ge l e c t r i cf i e l d ，a n dt h ei n f l u e n c eo fe l e c t r i cf r e q u e n c yo nc a t a l y t i cp o w e ri s i n v e s t i g a t e d u s i n gt h ef l e x i b i l i t yo fp r o t e i n s ，e g gw h i t ea l b u m i nw a sp o r e - f o r m e da n dh e a t - d e n a t u r e d i nt h ep r e s e n c eo fs u b s t r a t et e m p l a t e b s ap r o t e i na n dh e r r i n gs p e r md n aw e r et r a s t e db y p r e c i p i t a t i o nm e t h o di no r g a n i cs o l v e n t t h er e s u l t so ft h ee x p e r i m e n t sd e m o n s t r a t e dt h a tt h e p r o t e i nw h i c hw a sb i o i m p r i n t e x lw i t hr e a c t a n th a sh i g hc a t a l y z e da c t i v i t y , a n db i o i m p r i n t e d e g gw h i t eh a sa c t i v i t y i n a q u e o u sa s w e l la si no r g a n i ce n v i r o n m e n t b i o i m p r i n t e d b i o - m a c r o m o l e c u l e sh a v ec a t a l y t i ca c t i v i t y ，a n dt h ec a t a l y t i ca c t i v i t yo fb i o i m p r i n t e db s a w i t hb a e ew o u l di n c r e a s e da sw ei n e r e a s c dc o n c e n t r a t i o no fb a e e , b u tt h er e l a t i o n b e t w e e nc a t a l y z e da c t i v i t yo fb i o - i m p r i n t e db s aw i t ha c p h e - o ha n dc o n c e n t r a t i o no f a c - p h e o hw a si n d e f i n i t e b i o - i m p r i n t e dh e r r i n gs p e r md n ah a sp o o rc a t a l y z e da c t i v i t y , i t j sp o a s m l et h a tb i o - i m p r i n t e dh o s tm o l e c u l ew a so n l yp r o t e i nw h a th e r r i n gs p e r md n a c o n t a i n e d , i n , c a u s et h er a t i oo f a 2 6 0t oa 2 a of o rh e r r i n gs p e r md n aw a s1 9 ，w h i c he x p r e s s e d t h a tp u r i t yq u o t i e n to fh e r r i n gs p e r md n aw h a tt h ee x p e r i m e n ta p p l i e dw a sl o w i no r d e rt os t u d yt h ec h a n g eo ft r y p s i n sa c t i v i t yi na l t e r n a t i n ge l e c t r i cf i e l d , t r y p s i n s w e r ei m m o b i l i z e di np o l y m e r s , e l e c t r i cf r e q u e n c yo fr e a c t i o ns y s t e mw a sc h a n g e di no r d e rt o s t i m u l a t ep o l y m e rt os h r i i l l 【，a n dc h a n g e dt r y p s i n sa c t i v i t yb yc o n t r o l l e dt h e i rm o v e m e n t i m m o b i l i z e de n z y m ec o u l d 啪b co b t a i n e di nt h ec o n d i t i o no f a m p so ri v t a a w a sa p p l i e da s m o n o m e r , b i sa sc r o s s l i n k i n ga g e n la p s a si n i t i a t o r , t e m e da sa c c e l e r a t o r , a n do p t i m a l l y r a t i of o rd o s a g eo fm o n o m e rt oc r o a s l i n k i n ga g e n t n er e s u l t so ft h ee x p e r i m e n t se x p r e s s e d t h a tp a m p sw a ss u p e r i o rt op m a aw h e nt h e yw e r eu s e dt oe m b e de n z y m e t h e r ew a sn o t o b v i o u sr u l ef o ra m p l i t u d eo ff l u c t u a t i o no fa b s o r p t i o ni ne v e r yf r e q u e n c yw h e nt r y p s i n c a t a l y z e d b a p ai n a l t e r n a t i n g e l e c t r i cf i e l d i m m o b i l i z e d e n z y m e h a s p r o m i n e n t i m p r o v e m e n tw h e nt h ef r e q u e n c yw a s1 0 0h z ，b u ti tw o u l db en o ta sg o o da si n1 0h za n d 3 0 0h zt h a nt h e r ew a sn o te l e c t r o s t i m u l a t i o n t h er e s u l t so ft h ee x p e r i m e n t sd e m o n s t r a t e d t h a tt h ea c t i v i t yo ft r y p s i nc o u l db ea l t e r e da st h ec h a n g eo ff r e q u e n c yo fa l t e r n a t i n ge l e c t r i c f i e l do fr e a c t i o ns y s t e m k e y w o r d s ：b i o i m p r i n t i n g ；a c t i v es i t e ；t r y p s i n ；c a t a l y t i cr e a c t i o n ；a c t i v i t y ；i m m o b i l i z e d e n z y m e ；a l t e r n a t i n ge l e c t r i cf i e l d 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取 得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得云洼翌王太堂或 其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 盘著，乙 签字日期：渺1 年月夕日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解云洼堡王太堂有关保留、使用学位论文 的规定。特授权丞洼理王太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编， 以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复本和电子 文件。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 叼 学作：蕴最弓翩虢瑶盱怜 辩醐：一引刖7 日辩醐：节湖7 日 刖舌 近年来在纳米结构生物材料制备技术研究中，从仿生构思出发的模板技术引人注 目，而模板法由于孔的大小和形状由模板决定，因此只要制得合适的模板就能控制孔的 大小和形状，从而得到可识别原来模板或类似物的材料。模板物可以选择低分子化合物、 低聚物、聚合物、分子聚集体、金属离子和金属络合物甚至细菌等微生物。生物印迹是 从仿生角度，采用人工方法制备对特定分子( 模板) 具有专一性结合的印迹的生物分子 的技术。用此法制得的印迹的生物分子带有许多固定形状和大小的孔穴，孔穴内通常带 有确定排列的功能基团，它对印迹分子的立体结构具有记忆功能，有望在特异生物材料、 免疫分析、模拟酶、抗体受体结合模拟、吸附分离、生物及化学传感器、检测芯片技 术等方面获得应用。 另一方面，酶作为一种生物催化剂因其具有高效、高选择性、催化反应条件温和、 无污染等诸多特点，在食品加工、医药和精细化工等产业中的重要性已经得到了广泛的 认同。然而，游离酶出于不稳定和易变性等缺点，使它们难以在工业中得到更为广泛的 应用。此外，分离和提纯酶以及它们的一次性使用也大大增加了其作为催化剂的成本。 正是在这种背景下，固定化酶的概念和技术得以提出和发展。酶的固定化技术使得上述 的缺点得以克服。在过去的3 0 多年中，酶的固定化己成为酶工程中一大主要研究领域， 并且己经从实验室的研究探索阶段进入了实际应用阶段。可以运用可靠的方法将酶方便 且稳定地连接到不溶性或可溶性载体上，通过这种方法制得的生物催化剂可广泛用于工 业、环境、分析和医药等领域。 包埋法是酶的固定化方法的一种，具体的是把酶包埋在凝胶的微细格子中或被半透 性的聚合物膜所包围，使酶分子不能从凝胶的网格中漏出，而小分子的底物和产物则可 以自由通过凝胶网格。p a m p s 和p m a a 是具有良好水溶胀性的水凝胶。水凝胶是一类具 有亲水基团，能被水溶胀但不能溶解于水的聚合物，它们在水中可溶胀至平衡体积仍保 持其形态。其亲水性来源于结构中的亲水基团，不溶性和溶胀形状稳定性来源于聚合物 分子的三维网状结构。水凝胶中可使溶于其中的低分子量物质从其网格间渗透扩散而具 有膜的特性。 第章文献综述 第一章文献综述 生物工程技术是近年来发展起来的一门新兴学科。它是借助生物体及其机能，以先 进的科学和工程技术人工进行生物转化，从而运用于物质生产的技术体系。生物工程将 是二十一世纪最有发展前途的学科。举世瞩目的生物工程己列入我国重点科研项目之 一。生物工程主要包括四大技术体系：基因工程，细胞工程，酶工程和微生物工程，其 核心是酶工程和基因工程。真正发挥经济效益还是要靠酶工程来实现。酶工程实质上是 酶学和工程学的相互渗透和结合，即设计一定的反应器和反应条件，利用酶的催化功能 进行催化反应生产的一门应用技术。 一切生物体包括人体要维持生命活动，就必须要在生物体内完成一系列变化使其获 取能量以维持生命。这些复杂的变化是由一种生物催化栽一酶的存在并发挥作用才得 以完成的。从我国记载的资料得知，4 0 0 0 多年前的夏禹时代酿酒已盛行，酒是酵母发 酵的产品。约30 0 0 年前，古人利用含淀粉酶的麦曲将淀粉降解为麦芽糖，制造了糖。 但对它的认识却始于1 0 0 多年前。1 8 5 7 年微生物学家巴斯德等人对酒精发酵进行研究， 认为酒精发酵是完整的酵母细胞生命活动的结果，提出了“活体酵素”和“非活体酵素” 的名称。瑞典化学家b c r z e l i u s 最早把酶称作“催化剂”。随着科学的发展，才把这种在 生物体内只起加速反应，本身不发生变化的催化剂称为酶。1 9 2 6 年才发现酶是一种蛋白 质，直到现在为止，所有的酶都是单纯的或结合的蛋白质，只有那些具有催化功能的蛋 白质才称为酶。酶是一种高效、高度专一的生物催化剂。目前，酶己广泛应用于酿造i l l ， 检测1 2 - 3 1 ，医药，生物化工等领域。虽然酶能够催化许多化学反应，但用作上业催 化剂仍存在一些缺陷 z o - 1 1 l 。因为酶是由蛋白质组成，其高级结构对所处的环境十分敏感。 一般情况下，对热、强酸、强碱、有机溶剂等均不够稳定，在反应中容易失活。而且酶 一般在水相中与底物反应，反应结束后，即不易回收酶，又不易分离纯化产物。这些都 限制了酶促反应的广泛应用 化学模拟酶催化剂与天然的生物酶催化剂相比，具有抗恶劣环境的能力，表现出高 度的稳定性和长的使用寿命。用生物印迹法制备印迹的主体分子可以产生类似于酶活性 中心那样的孔穴，而且，通过选用适当的配体在孔穴内可以定做出与底物结合的结合位 点和起催化作用的活性基团，这些基团以最佳取向在空间进行确定排列。尽管在催化速 度上印迹的生物大分子还不如天然酶，但它却具备天然酶无法比拟的诸多优点：与有机 溶剂良好的相容性、可设计性等，因此大大补充了天然酶在应用中的不足，丰富了酶催 化反应的内容。酶在水环境中，由于蛋白质表面的亲水残基受水分子的作用而产生运动， 故使蛋白质外壳显示出一定的柔性1 1 2 l 。溶于水溶液中的模板化合物在与蛋白质表面的碰 撞就会使柔性的表面暂时留下一个凹陷。在水溶液中这个凹陷会逐渐恢复原形。但无论 是在冻干法【1 3 】中水分子真空中的逃逸，还是沉淀法【1 4 l 中蛋白质在有机溶剂中的硬化，模 板化合物印迹所产生的凹陷均可被保留下来，形成所谓的“分子记忆”1 1 5 1 6 1 而这个酶 表面的凹穴在形状和静电上皆与模板化合物互补，可被视为人为地在蛋白质表面制造了 一个活性部位。该活性部位能以模板化合物为底物，识别并结合模板化合物，且进行催 2 第一章文献综述 化反应1 1 7 - 2 0 i 。 另外，上世纪六十年代发展起来的酶固定化技术既克服了上述天然酶的不足，又在 一定程度上保持了酶特有的催化活性，从而成为生物技术中最为活跃的研究领域之一。 固定化酶技术是本世纪六十年代才发展起来的，它涉及到材料科学、化学、生物学三个 学科的交叉渗透。目前这种多学科的交叉，促进了多种科技人才的技术交流，是新世纪 科学技术发展的强大推动力。酶的固定化和固定化酶的应用是目前国际上的前沿课题， 是国际上研究的热点。通过物理或化学的方法，将酶固载于载体上，不仅保留了酶原有 的高活性、高选择性，并且克服了天然酶的缺点，还便于反应的连续化和自动化，在工 业生产上具有极高的应用价值，因而引起人们的广泛重视。载体骨架的结构和性能对固 化酶起重要作用。用于固定化酶的聚合物载体应有一定的亲水性、多孔、与酶有很高的 结合量，在酶促反应时无不良副反应等。在载体合成时需加入一定量的交联剂以形成不 溶性网状交联结构。交联度小，载体力学稳定性差；交联度过大，稳定性较好，但酶促 反应时，底物在其中的扩散会受限制，使反应不完全致孔剂的存在可以使载体有更大 的溶胀度，形成一个可以延伸的网络结构并能提高其孔度。 i i 酶简介 酶是具有特殊催化功能的蛋白质，但酶和其它蛋白质一样，主要由氨基酸组成，具 有一、二、三和四级结构另外酶与其它蛋白质一样，根据它的组成成分可分为单纯蛋 白质和结合蛋白质两类。有些酶的组成成分只有蛋白质，其活性取决于它的蛋白质结构， 这类酶属于单纯蛋白质；另一些酶的活性成分除了含有蛋白质外，还有一些小分子即辅 助因子，二者结合起来才具有活性，这类酶属于结合蛋白质。结合蛋白质的蛋白质部分 称为酶蛋白，非蛋白质部分称为辅助因子。酶蛋白与辅助因子单独存在时均无催化活性， 只有这两部分结合起来组成复合物才能显示催化活性。此复合物称为全酶。 生物体内酶的种类繁多，但辅酶的种类却较少。同一种辅酶往往能与多种不同的酶 蛋白结合，组成催化功能不同的多种全酶，但每一种酶蛋白只能与特定的辅酶结合成一 种全酶。可见决定酶的专一性的是酶蛋白部分。辅酶在酶促反应中通常担负电子、原子 或某些化学基团的传递作用，决定反应的性质。 近年来，已经发现，除了蛋白质外一些r n a 和d n a 分子也具有催化作用。这对酶 的化学本质是蛋白质的观念产生了强烈的冲击。虽然如此，现在已知的酶基本上都是蛋 白质性质的，或以蛋白质为主导核心成分，酶是蛋白质性质的生物催化剂这一概念并不 排斥还存在其他类型的催化剂。因此更正确地，可以给酶下这样的定义：酶是生物体内 一类具有催化活性和特殊空间构象的生物大分子物质，包括蛋白质和核酸等。 1 1 1 酶的结构与功能 酶蛋白的结构，包括一级结构和高级结构，与酶的催化功能密切相关，结构的改变 会引起酶催化作用的改变或者丧失。酶蛋白上只有少数氨基酸残基参与酶对底物的结合 和催化，这些相关氨基酸残基在空间上比较靠近，形成一个与酶显示活性直接有关的区 3 第章文献综述 域，称为酶的活性中心。构成活性中心的化学基团实际上就是酶蛋白氨基酸残基的侧链， 有时尚包括肽链末端的氨基酸残基。这些基团在一级结构上并不互相毗邻或靠近，而往 往分散在相距较远的氨基酸顺序中，甚至分散在不同的肽链上，依靠酶分子的二级、三 级结构，即肽链的折叠，包括肽链间的二硫键，才使这些互相远离的基团靠近，集中在 酶分子表面上具有三维结构的特定区域，故活性中心又称活性部位( a c t i v es i t 曲，以表示 其占有一定空间体积。 酶活性中心的一些化学基团为酶发挥催化作用所必需，称为必需基团。但在酶活性 中心以外的区域，尚有不和底物直接作用的必需基团，称为活性中心外的必需基团。这 些基团与维持整个酶分子的空间构象有关，可使活性中心的各个有关基团保持于最适的 空间位置，间接地对酶的催化活性发挥其必不可少的作用。 大多数酶的活性中心上有8 种氨基酸的频率最高，即丝氨酸、组氨酸、胱氨酸、酪 氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和赖氨酸。蛋白酶和酯酶的活性中心一般含有丝氨酸 和组氨酸，如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶等，称为丝氨酸蛋白酶。但也有些 蛋白酶的活性中心不含丝氨酸而有半胱氨酸，如胃蛋白酶和木瓜蛋白酶，称为半胱氨酸 蛋白酶。半胱氨酸的巯基参与很多酶的活性中心的构成，特别是氧化还原酶和转移酶类。 不同酶含有不同数量的巯基，其中参与活性中心的巯基数也不同。并且巯基在酶分子中 所处的位置不同，有的和巯基试剂( 共价修饰剂) 反应迅速，引起酶的快速抑制，有的 反应缓慢，抑制也较慢或不抑制。酶分子的巯基是多功能的，其功能可有亲核催化作用、 底物结合作用、辅基结合作用和维持构象作用。 所有的酶分子都是蛋白质，但蛋白质分子不都具有催化功能。一个蛋白质分子的表 面可以可逆的结合小的溶质分子或离子分子的区域，借用有机金属化学的概念，这些溶 质分子被称为配位基，酶的底物、辅酶或辅基以及各种调节因子等，都可以成为配位基， 所以每一个酶蛋白分子表面上通常有多个配位基结合部位，而这同酶分子本身的结构密 切相关【2 l l 。 酶在生物系统的代谢反应中，具有降低起始反应活化能的作用。所谓活化能 ( a c t i v a t i o ne n e r g y ) 即是断裂化学键起始反应所需的最低能量由于酶降低了反应的活化 能，也就加快了生物反应的速度。细胞中有几千种不同的酶，能够催化几千种不同的化 学反应。应强调的是，酶作为催化剂，仅能使反应速度加快，并不能改变反应的方向。 酶只能催化可以自发进行的反应，而不可能催化不能自发进行的反应，也不可能改变反 应的平衡点。 1 1 2 酶的作用机制 酶一般是通过其活性中心( 通常是其氨基酸侧链基团) 先与底物形成一个中间复合 物，随后再分解出产物，并放出酶。酶的活性部位是它结合底物和将底物转化为产物的 区域，通常是整个酶分子相当小的部分，它是由在线性多肽链中可能相隔很远的氨基酸 残基形成的三维实体活性部位通常在酶的表面空隙或裂缝处，形成促进底物结合的优 越的非极性环境。在活性部位，底物被多重的、弱的作用力结合f 静电相互作用、氢键、 范德华力、疏水相互作用1 ，在某些情况下被可逆的共价键结合。酶结合底物分子，形 4 第一章文献综述 成酶一底物复合物( e n z y m e s u b s t r a t ec o m p l e x ) 。酶活性部位的活性残基与底物分子结合， 首先将它转变为过渡态，然后生成产物，释放到溶液中。这时游离的酶与另一分子底物 结合，开始它的又一次循环。 已经提出有两种模型解释酶如何结合它的底物1 8 9 4 年e m i lf i s c h e r 提出锁和钥匙 模型( 1 0 c k a n d k e ym o d e l ) ，底物的形状和酶的活性部位被认为彼此相适合，像钥匙插入 它的锁中【图1 - 1 ( a ) 】，两种形状被认为是刚性的和固定的，当正确组合在一起时，正好 互相补充。诱导契合模型( i n d u c e d f i t m o d e l ) 是1 9 8 5 年由d a n i e l e k o s h l a n d j r 提出的， 底物的结合在酶活性部位诱导出构象变化【图1 - 1 ( b ) 】。此外，酶可以使底物变形，迫使 其构象近似于它的过渡态。氨基酸残基的性质和空间排布形成酶的活性部位，它决定哪 种分子能成为酶的底物与之结合。底物专一性( s u b s t r a t es p e c i f i c i t y ) 通常是由活性部位 相关的少数氨基酸的变化所决定。 雇扬s + - - e s 复合物 囊物s + ，2 i 、i 、1 竺 诱导契台桓翌 图1 - 1 底物与酶的结合 f i g 1 - 1 b i n d i n go fe n z y m ew i t hs u b s t r a t e 硝复合物 研究酶的催化作用，一般采用两种方法。一种方法是从非酶系统模式获得催化作用 规律，其优点是反应简单，易于探究，而缺点是非酶系统与酶系统不同，其实验结果不 一定完全适合于阐明酶的催化作用；另一种方法是从酶的结构与功能研究中得到催化作 用机理的证据根据两种方法的研究结果，酶的催化作用可能来自五个方面，即广义的 酸碱催化、共价催化、邻近效应及定向效应、变形或张力以及活性中心为疏水区域1 2 2 1 。 1 2 人工模拟酶 早在2 0 世纪中叶，人们就已经认识到研究和模拟生物体系是开辟新技术的途径之 一，并自觉地把生物界作为各种技术思想、设计原理和发明创造的源泉，通过对生物体 系的结构与功能的研究，为设计和建造新的技术提供新思想、新原理、新方法和新途径。 酶是自然界经过长期进化而产生的生物催化剂，它能在温和条件下高效、专一地催化某 些化学反应。设计一种像酶那样的高效催化剂是科学家们一直追求的目标，而对酶功能 的模拟是当今自然科学领域中的前沿课题之一 酶是高效催化剂，它的应用同趋广泛。但是，对热敏感、稳定性差和来源有限等缺 点限制了它的开发和利用。于是新的催化剂模拟酶就逐渐被研制和开发了。2 0 世纪 5 第一章文献综述 8 0 年代以来，化学家对利用简单的分子模型构建酶的特征进行了深入研究。这除了它的 应用前景之外，另一个主要原因是化学模型可以帮助我们认识酶的作用机制，即酶为什 么具有如此高的催化效率事实上，在生物体内，模拟酶的研究使酶催化的许多反应得 到详细的解释。基于上述原因，人们对酶的模拟越来越感兴趣l 咎瑚。 模拟酶是生物有机化学的一个分支。由于天然酶的种类繁多，模拟的途径、方法、 原理和目的不同，对模拟酶至今没有一个公认的定义。一般说来，它的研究就是吸收酶 中那些起主导作用的因素，利用有机化学、生物化学等方法设计和合成一些较天然酶简 单的非蛋白质分子或蛋白质分子，以这些分子作为模型来模拟酶对其作用底物的结合和 催化过程，也就是说，模拟酶是在分子水平上模拟酶活性部位的形状、大小及其微环境 等结构特征，以及酶的作用机理和立体化学等特性的- - i j 科学。可见，模拟酶是从分子 水平上模拟生物功能的一门边缘学科。 2 0 世纪7 0 年代以来，由于蛋白质结晶学、x 射线衍射技术及光谱技术的发展，人 们对许多酶的结构有了许多较深入的了解，对酶的结构及其作用机理能在分子水平上做 出解释。动力学方法的发展以及对酶的活性中心、酶抑制剂复合物和催化反应过渡态等 结构的描述促进了酶作用机制的研究进展，为人工模拟酶的发展注入了新的活力。 仿效生化过程并模拟酶的功能，发展新的非生物的催化剂，从而实现普通化学的高 效性和高选择性，即在分子水平上模仿酶的活性部位、微环境等结构特征及作用机理。 它必须借助物理化学的方法和手段研究生物酶本身的特殊性，并探讨模拟酶在促迸化学 反应中的行为其基本方法是从酶中拣选出那些起主导作用的因素，来设计并模拟能表 现酶功能的分子模型，以便进一步研究这些因素对化学过程的影响。制备模拟酶的配位 物有两个主要方法：自组装法和全合成法。自组装法主要是将金属离子和适当的配体混 合反应，然后分离出配位物，该法主要用来研究金属离子和配体的固有特性。全合成法 则是先设计、合成出能按预定方式结合金属离子的有机配体，再与金属离子结合形成目 标配位物1 2 c , - 2 q 。 目前，较为理想的小分子仿酶体系有环糊精、冠醚、环番、环芳烃和卟啉等大环化 合物等；大分子仿酶体系有聚合物酶模型，分子印迹酶模型和胶束酶模型等1 2 1 1 此外， 科学家们利用化学修饰，基因突变等手段改造天然酶产生了具有新的催化活性的半合成 人工酶。而抗体酶的出现和快速发展为酶的人工模拟又开辟了一条新的道路。 1 2 1 模拟酶的理论基础 对酶的催化机制，人们提出了很多理论，试图从不同角度阐述酶发挥高效率的原因。 在众多的假说中，p a u l i n g 的稳定过渡态理论得到了广泛的承认，因此，目前对酶的催 化机制解释是：酶先对底物结合，进而选择性稳定某一特定反应的过渡态( 1 s ) ，降低 反应的活化能，从而加快反应速度。 设计模拟酶一方面要基于酶的作用机制，另一方面则基于对简化的人工体系中识 别、结合和催化的研究要想得到一个真正有效的模拟酶，这两方面就必须统一结合 催化基团的定向引入对催化效率的提高至关重要。 在设计模拟酶时除具备催化基团外，还要考虑到与底物定向结合的能力。模拟酶和 6 第章文献综述 酶一样，能够在底物结合中，通过底物的定向化、键的扭曲及变形来降低反应的活化能。 此外，酶模型的催化基团和底物之间必须具有相互匹配的立体化学特征，这对形成良好 的反应特异性和催化效力是相当重要的。 p e d e r s o n 和c r a m 报道了一系列光学活性冠醚的合成方法。这些冠醚可以作为主体 而与伯铵盐客体形成复合物。c r a m 把主体与客体通过配位键或其他次级键形成稳定复 合物的化学领域称为主客体化学( h o s t g u e s tc h e m i s t r y ) 。本质上，主客体化学的基本意 义来源于酶和底物的相互作用，体现为主体和客体在结合部位的空间及电子排列的互 补，这种主客体互补与酶和它所识别的底物结合情况近似。另一位著名的法国科学家 k l l l i 也在这方面做出了非凡的贡献，他在研究穴醚和大环化合物与配体络合过程中， 提出了超分子化学( s u p r a m o l e c u l a rc h e m i s t r y ) 的概念，并在此理论的指导下，合成了 更为复杂的主体分子。主客体化学和超分子化学已成为人工模拟的重要理论基础，是 人工模拟酶研究的重要理论武器。根据酶催化反应机理，若合成出能识别底物又具有酶 活性部位催化基团的主体分子，就能有效地模拟酶的催化过程 2 s 1 在设计模拟酶之前，应当对酶的结构和酶学性质有深入的了解：( 1 ) 酶活性中心- 底 物复合物的结构；( 2 ) 酶的专一性及其与底物结合的方式与能力；( 3 ) 反应的动力学及 各中间物的知识。 1 2 2 模拟酶的研究进展 人工酶的设计在很大程度上反映了对酶的结构以及反应机制的认识。研究人工酶模 型可以较直观地观察与酶的催化作用相关的各种因素，如催化基团的组成、活性中心的 空间结构特征、酶催化反应的动力学性质等。人工模拟酶的研究，是实现人工合成具有 高性能模拟酶的基础，在理论和实际应用上却具有重要意义。由于对酶的结构及其作用 机制取得了重大进展，对许多酶的结构及其作用机理都能在分子水平上得到解释，大大 促进了人工模拟酶的发展。人工模拟酶这一研究领域已引起各国科学家的极大关注。世 界发达国家( 如美、德、日、英、法等) 都把模拟酶作为重点课题列入未来的研究计划， 我国也将对模拟酶的研究列入国家自然科学基金重点资助的高技术、新概念、新构思探 索性课题。在模拟酶研究初期，由于对酶结构认识的局限性，以及研究者只注意催化功 能，忽略底物的结合功能。因而很难制备出具有天然酶活力的人工酶。 近年来，人们以酶结构认识、酶动力学研究为基础，采用多种新型技术如抗体酶制 备技术，在分子水平上模拟酶对底物的结合催化，取得了许多重要成果。人工模拟酶的 实践证明，利用环糊精、大环化合物、抗体、印迹蛋白质等为基质已制备出大量的人工 酶，部分人工酶的催化效率及选择性己能与天然酶相媲美。但也应该看到，大多数人工 酶催化活性并不高，这主要是由于目前尚缺乏系统的、定量的理论为指导；另外的原因 是，大多数人工酶模型过于简单，缺乏对催化因素的全面考虑。 分子印迹技术( m o l e c u l a rh n p r i n t i n gt e c h n i q u e ，m m ，也叫分子模板技术( m o l e c u l - a rt e m p l a t et e c h n i q u e ，m y r ) 是制备对特定目标分子( 模板分子也称印迹分子) 具有特 异预定选择性的高分子化合物分子印迹聚合物( m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r ，m 1 p ) 的技术1 2 9 - 3 0 1 。m i p 技术发展迅速，主要是因为它有三大特点：即预定性 7 第一章文献综述 ( p r e d e t e r m i n a t i o n ) 、识别性( r e c o g n i t i o n ) 和实用性( p r a c t i c a b i l i t y ) 。预定性决定了人们 可以根据不同的目的制备不同的m i p ，以满足各种不同的需要；识别性是因为m i p 是按 照模板分子( t e m p l a t em o l e c u l e ) 定做的，它具有特殊的分子结构和官能团，能选择性 地识别印迹分子；其实用性表现在它与天然的生物分子识别系统如酶与底物、抗原与抗 体、受体与激素相比，具有抗恶劣环境的能力，表现出高度的稳定性和长的使用寿命， 且制备过程简单。由于m 1 p 具有如上这些优点，它在许多领域，如色谱中对映体和位置 异构体的分离、固相萃取、化学仿生传感器、模拟酶催化、临床药物分析、膜分离技术 等领域展现了良好的应用前景1 h - 3 5 】。 分子印迹技术是设计新型人工模拟酶材料的最有效手段之一1 3 6 - 3 7 ，运用分子印迹技 术对酶的人工模拟是最宫挑战性的研究课题之一。目前，应用此技术已成功地制备出具 有酶水解、转氨、脱羧、酯合成、氧化还原等活性的分子印迹酶。虽然用分子印迹法制 备的聚合物印迹酶的催化效率同天然酶相比普遍不高，但他们却具有明显的优点：制备 过程简单、易操作；印迹分子的选择范围广，不像抗体酶的半抗原设计主要依赖于反应 过渡态；具有明显的耐热、耐酸碱和稳定好等优点i 强冽。随着分子印迹技术的不断发展， 新型聚合单体的不断出现，会创造出更高催化效率的分子印迹酶。 近年来，生物印迹技术的出现为分子印迹酶的发展注入了新的活力，尽管用此方法 制备的生物印迹酶种类不多，但其高效催化活性显示它是一种很有前途的人工模拟酶制 备技术。用此技术制备生物印迹酶时，印迹分子的选择范围广，被印迹的宿主蛋白也不 仅限于有活性的天然酶，而且可用无活性的普通蛋白。利用蛋白质等为骨架印迹酶的活 性中心使生物印迹酶更接近于天然酶。 目前，生物印迹酶的研究还处于初级阶段，除进一步制备多种类型的生物印迹酶外， 研究印迹分子的结构与印迹的活性中心结构关系、印迹分子的结构与酶活力的关系，寻 找印迹酶高活力的理论基础则相当重要。在这一新领域里，有许多未知方面需要进一步 研究和探索。生物印迹酶与分子印迹酶的发展，为人工酶的发展开辟了又一新的研究方 向，这一新技术与酶的作用机制、酶的结构知识、酶动力学联系起来，会创造出高效率 的人工酶。 人工模拟酶的研究属于化学、生物学等领域的交叉点，属交叉学科。化学家利用酶 模型来了解一些分子的复合物在生命过程中的作用，并研究如何将这些仿生体系，应用 于有机合成，这就是近年来开展的微环境与分子识别的研究。对于高效率、有选择性进 行的生化反应生命现象的探索是充满魅力的课题，而开发具有酶功能的人工模拟酶， 是化学领域的主要课题之一。仿生化学就是从分子水平模拟生物体的反应和酶功能等生 物功能的边缘学科，是生物学和化学相互渗透的学科。对生物体反应的模拟就是模仿其 机理，进而开发出比自然界更优秀的催化体系，主，客体酶模型、胶束酶模型、肽酶、 分子印迹酶和半合成酶就是这一研究的重要成员，已取得长足进展，近年来又出现了抗 体酶、分子印迹酶、杂化酶和进化酶。目前，对酶的模拟已不是仅限于化学手段，基因 工程、蛋白质工程等分子生物学手段正在发挥越来越大的作用。化学和分子生物学以及 其他学科的结合使酶模拟更加成熟起来。随着酶学理论的发展，人们对酶学机制的进一 步认识，以及新技术、新思维的不断涌现，理想的人工酶将会不断产生。 8 第一章文献综述 总之，综合运用化学、分子生物学和遗传学知识会大大加强人工催化剂设计方法的 威力和可用性。从而产生医药，工业上有用的高效催化剂。显然，只要在分子工程这个 令人激动的前沿领域里持续工作，就会越来越接近这样的目标：能为任何一种化学转化 设计类酶催化剂。 1 3 生物印迹酶 蛋白质是一切生命活动的物质基础。各种蛋白质都具有其特异的生物学功能。而所 有的这些功能又都与蛋白质分子的特异结构密切相关。总的来说，蛋白质分子的一级结 构是形成空间结构的物质基础，而蛋白质的生物功能是蛋白质分子特定的天然构象所表 现的性质或具有的属性。2 0 世纪8 0 年代，结构生物学揭示了大量蛋白质分子的精确立 体结构及其复杂的生物功能关系，为设计和改造天然蛋白质提供了广阔的前景1 4 0 4 3 1 。无 论是改造现有的蛋白质还是设计全新的蛋白质，都必须以蛋白质分子的结构规律和其与 生物功能的关系及天然蛋白质的三维结构为基础1 4 4 4 5 1 天然蛋白质作为模拟酶不仅具有 酶的活性中心，并且有蛋白质的三维空间结构等特点，具备较高的酶活性，可以克服天 然酶在储存、操作条件和价格等方面的不足i 拍l 。 1 3 1 生物印迹技术概述 生物印迹是指以天然的生物材料蛋白质、糖类物质等为骨架，对一些酶的配体如底 物、抑制剂、过渡态类似物等进行分子印迹，制备生物印迹酶。所选择的蛋白也不仅限 于有活性的天然酶，而且可用无活性的普通蛋白。利用蛋白质等为骨架印迹酶的活性中 心使生物印迹酶更接近于天然酶。生物印迹原理与分子印迹相似，只是生物大分子代替 了聚合物。在非水相中有较好的应用。因为印迹分子与生物大分子在水溶液中相互作用 产生的构象变化所得到的高活性状态在移入非水相后可被保持 4 7 4 9 1 。 r u s s e l l 等 5 0 l 提出的生物印迹的过程被广泛地接受与应用。其过程如下：( 1 ) 将酶溶 于含有其配体的缓冲溶液中，这一步使酶的构象被诱导而发生变化；( 2 ) 将此酶液冷冻 干燥，形成酶粉，水分不经融化直接升华，可以固定酶的构象；( 3 ) 用有机溶剂冲洗冻 干的酶粉，除去印迹分子，即洗脱过程；此法的基本原理是酶在有机溶剂中具有刚性构 象1 5 l 】，但在水中，印迹效应即消失，印迹酶在有机溶剂中对新构象的记忆时问相当长( 可 达几周) 【5 2 1 。 ( 1 ) 以蛋白质为基础的生物印迹 k l i b a n o v 小组用酒石酸作用于牛血清白蛋白，然后冷冻干燥，再用有机溶剂溶剂抽 捉酒石酸，最后得到酒石酸印迹的牛血清白蛋白。印迹的白蛋白在无水乙酸乙酯溶剂中 结合酒石酸的量是未印迹蛋白质结合酒石酸的3 0 倍。后来，他们用各种生物分子研究 了印迹机理发现，配体( 印迹分子) 在蛋白质水溶液与多肽链的多个部位发生氢键相互 作用，使多肽链围绕配体折叠，形成新的构象，此构象在除掉配体后仍能在无水有机相 得以保持，因而印迹的分子带有恰似配体形状的空穴，可以在有机相中通过氢键结合配 9 第一章文献综述 体。这就要求印迹对象既是氢键又是氢键受体，又是氢键供体，而且链长不能太短，否 则不能被印迹1 5 3 l 。这种生物印迹现象对开发独特的吸附剂和新的生物催化剂无疑是大有 帮助的。要注意的是，印迹的生物分子只能在无水有机相中起作用，若将其移入水相， 则没有任何印迹效果。k l i b a n o v | s 4 l 等还用枯草杆菌蛋白酶的抑制剂a d t y r - n h 2 ) 在 水缓冲溶液中与这