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浙江工业大学硕士学位论文 裂解甲基化气相色谱法的若干影响因素探讨 及其应用研究 摘要 水溶液体系中有机酸、醇和酚类等极性物质的分析中，一般需要 衍生化、萃取、浓缩等复杂繁琐的前处理，然后采用气相色谱法分析。 而采用裂解甲基化气相色谱法能够一步完成上述操作步骤。该技术通 过衍生化试剂如氢氧化四甲基铵( t m a h ) 在色谱进样口的高温下把 羟基、羧基、氨基等极性基团转变成其相应的甲基化衍生物，从而能 由气相色谱测定这类极性物质。但该技术对含羧基化合物的研究较 多，衍生化效果显著，对醇类化合物的定量研究较少。此外，该技术 采用t m a h 为衍生化试剂的报道较多，但该试剂在分析不饱和有机 酸时会产生降解和异构化作用。本文主要探讨了水溶液体系中羟基化 合物的裂解甲基化气相色谱法的若干影响因素及其应用。并研究了醋 酸四甲基铵( t m a a c ) 为衍生化试剂的裂解甲基化技术的应用。 第一章为文献综述部分。主要介绍了裂解甲基化技术的发展历 史、反应机理及其该技术的优点和不足等。此外，对该技术在油脂、 蜡、天然树脂、木质素、多聚糖、蛋白质等方面的应用进行了综述。 第二章，讨论了反应温度、衍生化试剂的量和种类、以及进样方 式这四种因素对苯甲酸、苯酚、1 ，4 丁二醇和白杨黄酮裂解甲基化反 应的影响。结果表明，在反应温度为4 0 0o c ，t m a h 过量的条件下， 浙江工业大学硕士学位论文 苯甲酸、苯酚、白杨黄酮及l ，4 丁二醇能生成其相应的甲基化产物。 甲基化程度与化合物的酸性强弱及结构有关。由于t m a a c 的碱性较 弱，不能使1 ，4 丁二醇衍生化。 第三章，裂解甲基化气相色谱法应用于同时检测发酵液中的二羟 基丙酮和甘油。生物发酵样品一般都是水溶液，并且基质复杂，一般 的分析方法均需繁琐费时的前处理，定量误差大而且不能同时检n - - 羟基丙酮和甘油的含量。而采用裂解甲基化技术，二羟基丙酮和甘油 在t m a h 的作用下被转化成其相应的甲基化产物，从而能被气相色 谱高灵敏度的检测。二羟基丙酮和甘油在浓度为1 - 1 0 0 酣的范围内 具有良好的线性，其检测限分别为0 0 1 2 和0 0 1 6g l ；实际发酵液测 定中相对标准偏差( r s d ) 在5 1 以内，回收率在9 4 - 9 6 之间。 结果表明该方法能应用在生物发酵液中二羟基丙酮和甘油的实时监 测。 第四章，应用t m a a c 为试剂的裂解甲基化气相色谱法同时测定 饮料中的防腐剂一苯甲酸和山梨酸。采用以t m a a c 为衍生化试剂可 以很好地抑制当用t m a h 时山梨酸的异构化和降解，因此能同时检 测饮料中的苯甲酸和山梨酸。苯甲酸和山梨酸在浓度为5 或1 0 - 2 5 0 0 r a g 1 的范围内具有良好的线性，其检测限分别为o 1 3 和o 8 5r a g 1 。 同时，在实际样品的分析中两者的相对标准偏差( r s d ) 在5 6 之 内，回收率在9 1 9 1 1 0 o 之间。结果表明该方法能同时检测饮料中 苯甲酸和山梨酸。 第五章对论文的主要研究成果进行了总结并提出了论文的不足 i i 浙江工业大学硕士学位论文 与值得再深入研究的问题 关键宇：裂解甲基化，气相色谱，t m a h ，t m a a c ，二羟基丙酮， 防腐剂 m 浙江工业大学硕士学位论文 s t u d i e s0 nt h ei n f l u e n c eo fs o m ef a c t o r sa n d a p p l i c a t l 0 nf o rp y r o l y t i cm 匣t h y l a t l 0 n g a s c h r o m a t o g r a p h yt e c h n i q u e a bs t r a c t t h ea n a l y s i so fp o l a rc o m p o u n d si na q u e o u ss o l u t i o ns u c ha so r g a n i c a c i d ，a l c o h o la n dh y d r o x y b e n z e n er e q u i r e se x t e n s i v es a m p l e - p r e t r e m e n t i n c l u d i n gd e r i v a t i z a t i o n ，e x t r a c t i o n ，e v a p o r a t i o ne t c ，a n dt h e nh a sb e e n d e t e r m i n e db yg a s c h r o m a t o g r a p h y o t h e r w i s e ，u s i n g t h e p y r o l y t i c m e t h y l a t i o n g a sc h r o m a t o g r a p h yt e c h n i q u e ，t h ep r o c e s s e sa b o v ec a nb e c o m p l e t e db yo n l yo n es t e ps u c c e s s f u l l y o nt h eo n eh a n d ，a l t h o u g ht h i s t e c h n i q u ea p p l i e df o rc a r b o x y lc o m p o u n d si sw e l lr e p o r t e dd u et oi t s r e m a r k a b l ee f f e c to fd e r i v a t i z a t i o n ，t h e q u a n t i f i c a t i o n a l r e s e a r c ho n h y d r o x y lc o m p o u n d s i sl i m i t e d s os o m ei n f l u e n c ef a c t o r sa n d a p p l i c a t i o no nh y d r o x y lc o m p o u n d si na q u e o u ss o l u t i o n sb yt h ep y r o l y t i c m e t h y l a t i o n g a sc h r o m a t o g r a p h yt e c h n i q u eh a v eb e e ns t u d i e d o nt h e o t h e rh a n d ，p o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d sc a nb ep a r t i a l l yi s o m e r i z e do r d e g r a d e du s i n gt h et e c h n i q u ei nt h ep r e s e n c eo ft m a h d u et oi t ss t r o n g a l k a l i n i t y t h e r e f o r e ，t h ea p p l i c a t i o no ft h et e c h n i q u ei nt h ep r e s e n c eo f t m aaca l s oh a sb e e nd i s c u s s e d i nt h ef i r s tc h a p t e r , t h eh i s t o r y , c h e m i c a lp r o c e s s ，a n dt h ea d v a n t a g e i v 浙江工业大学硕士学位论文 a n ds h o r t a g eo ft h ep y r o l y t i cm e t h y l a t i o n g cw e r eb r i e f l yd e s c r i b e d t h e n ，a p p l i c a t i o n so ft h i sm e t h o dt oa n a l y s i so fl i p i d s ，w a x e s ，n a t u r a l r e s i n s ，w o o dp r o d u c t s ，c a r b o h y d r a t e s ，p r o t e i n se t c w e r ed i s c u s s e d i nc h a p t e r2 ，i no r d e rt oo b t a i n e dt h eh i g h e s ty i e l do fm e t h y l d e r i v a t i v e so fb e n z o i c a c i d ，p h e n o l ，b u t a n e 一1 ，4 一d i o la n dc h r y s i nb y p y r o l y t i cm e t h y l a t i o n - g c ，f o u ri m p o r t a n t f a c t o r ss u c ha sr e a c t i o n t e m p e r a t u r e ，t h ea m o u n ta n dt h ek i n do f d e r i v a t i v er e a g e n ta n dt h ew a yo f i n j e c t i o nw e r ed e t e r m i n e d 。t h eo b t a i n e dr e s u l t ss h o w e dt h a te x c e s s i v e 2 5 t m a ha q u e o u ss o l u t i o na t4 0 0o ce n a b l e dt h elg lm i x t u r eo f b e n z o i c a c i d ，p h e n o l ，b u t a n e 一1 ，4 一d i o l a n d c h r y s i n a t5 0 0 m g 1 ， r e s p e c t i v e l y ，w e r ec o n v e r t e di n t ot h e i rc o r r e s p o n d i n gm e t h y lc o m p o u n d s t h e y i e l d o f m e t h y l d e r i v a t i v e so fs t u d i e d c o m p o u n d s w e r e c o r r e s p o n d i n gt o t h e i rc h e m i c a ls t r u c t u r e sa n da c i d i t y t h em e t h y l d e r i v a t i v e so fb u t a n e 一1 ，4 一d i o lw e r en o to b s e r v e do nt h ec h r o m a t o g r a m o b t a i n e du s i n gt m a a ca sr e g e n t ，m a i n l yd u et ot m a a c b e i n gaw e a k b a s e i nc h a p t e r3 ，am e t h o dt od e t e r m i n ed i h y d r o x y a c e t o n e ( d h a ) a n d g l y c e r o li nf e r m e n t a t i o nb r o t hw a sd e v e l o p e do nt h eb a s i so fp y r o l y t i c m e t h y l a t i o n g a sc h r o m a t o g r a p h y ( g c ) u s i n gav e r t i c a lm i c r o f u r n a c e p y r o l y z e r t r a d i t i o n a la n a l y t i ct e c h n i q u e s s u c ha s e n z y m i c ， s p e c t r o p h o t o m e t r i cm e t h o d sa n dt h i n l a y e rc h r o m a t o g r a p h yf o rd h a a n d g l y c e r o la n a l y s i s ，u s u a l l yr e q u i r e de x t e n s i v es a m p l e p r e t r e m e n t ，w h i c h v 浙江工业大学硕士学位论文 m i g h tr e d u c et h ea n a l y t i c a lp r e c i s i o n ，b e c a u s ef e r m e n t a t i o ns a m p l e sw e r e a q u e o u ss o l u t i o n sc o m m o n l ya n dt h es a m p l em a t r i xw a sa l s ov e r y c o m p l i c a t e d i na d d i t i o n ，d h aa n dg l y c e r o lc o u l dn o tb ed e t e r m i n e db y t h e s et r a d i t i o n a la n a l y t i ct e c h n i q u e ss i m u l t a n e o u s l y w i t ht h eo n l i n e p y r o l y t i cm e t h y l a t i o n i n t h e p r e s e n c e o f a l l o r g a n i ca l k a l i ， t e t r a m e t h y l a m m o n i u mh y d r o x i d e ( c h 3 ) c n o h ，t m a h ) ，d h a a n d g l y c e r o lw e r ec o n v e r t e di n t ot h e i rc o r r e s p o n d i n gm e t h y le t h e r s t h u s ， o b t a i n e dr e s u l t ss h o w e dt h a tt h ea c h i e v e dc a l i b r a t i o nc u r v e se x h i b i tg o o d l i n e a r i t yw i t hr e g r e s s i o nc o e f f i c i e n t so fo 9 9 6a n d0 9 9 8f o rd h aa n d g l y c e r o la tt h ec o n c e n t r a t i o nr a n g ef r o m1 t o10 0e d l ，r e s p e c t i v e l y t h e l i m i to fd e t e c t i o nr e a c h e do 0 1 2a n d0 0 1 6g 1f o rd h aa n dg l y c e r o l ，a n d t h ep r e c i s i o nw a sq u i t eh i g hw i t ht h er s d w i t h i n5 1 t h er e c o v e r i e s o fd h aa n dg l y c e r o lw e r e9 4t o9 6 ，r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t sp r o v e d t h a tt h i s o n l i n e p y r o l y t i cm e t h y l a t i o n g ct e c h n i q u ew a sar a p i d ， c o n v e n i e n ta n dh i g h l ys e n s i t i v em e t h o df o rm o n i t o r i n gt h eb i o p r o c e s s e s o f d h a i nc h a p t e r4 ，am e t h o dt od e t e r m i n et h ep r e s e r v a t i v e so fb e n z o i ca c i d a n ds o r b i ca c i di ns o f td r i n k sw a sd e v e l o p e do nt h eb a s i so fp y r o l y t i c m e t h y l a t i o n g a sc h r o m a t o g r a p h y ( g c ) w i t h o u tu s i n ga n yp r e t r e a t m e n t p r o c e d u r e s w i t ht h eo n l i n ep y r o l y t i cm e t h y l a t i o ni nt h ep r e s e n c eo fa n o r g a n i ca l k a l i ，t e t r a m e t h y l a m m o n i u m a c e t a t e ( c h 3 ) c n o o c c h 3 ， t m a a c ) ，t h ei s o m e r i z e d a n d d e g r a d e do fs o r b i c a c i d sc o u l d b e v i 浙江工业大学硕士学位论文 m i n i m i z e d u n d e ro p t i m u m c o n d i t i o n s ，t h el i n e a rr a n g ea c h i e v e dw e r e5 a n d10 - 2 5 0 0 m g 1 f o rb e n z o i ca n ds o r b i c a c i d ，r e s p e c t i v e l y t h e d e t e c t i o nl i m i to fb e n z o i ca c i da n ds o r b i ca c i dc o u l dr e a c h0 13a n d0 8 5 m g l ，r e s p e c t i v e l y t h er s d o ft h ed e t e r m i n a t i o nw a s5 6 f o rt h et w o p r e s e r v a t i v e si nr e a ls o f td r i n ks a m p l e s t h er e c o v e r i e so fb e n z o i ca n d s o r b i ca c i dw e r er a n g e df r o m91 9t o110 o ，r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t s p r o v e dt h a tt h e o n l i n et e c h n i q u ec o u l dd e t e r m i n e db e n z o i ca c i da n d s o r b i ca c i di ns o f td r i n k ss i m u l t a n e o u s l y i nt h el a s tc h a p t e r ，t h em a i nr e s u l t so b t a i n e df r o mt h i sr e s e a r c h w e r es u m m a r i z e d t h e n ，t h ep r o b l e m st ob ec o n s i d e r e df o rt h i sr e s e a r c h a n dt h ep o s s i b l ef u t u r et r e n d si nt h i sf i e l dw e r ea l s od i s c u s s e d k e yw o r d s ：p y r o l y t i cm e t h y l a t i o n ，g a sc h r o m a t o g r a p h y , t m a h ， t m a a c ，d i h y d r o x y a c e t o n e ，p r e s e r v a t i v e v 浙江工业大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工 作所取得的研究成果。除文中已经加以标注引用的内容外，本论文不包含其他个 人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得浙江工业大学或其它教育 机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均 已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。 作者签名：钱挝 日期：“年岁月2 7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权浙江工业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密0 在兰年解密后适用本授权书。 2 、不保密口。 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名钱捷 日期砌6 年岁月2 7 日 导师签名：三而丽日期：加l 年岁月1 日 浙江工业大学硕士学位论文 第一章文献综述 样品前处理在色谱分析过程中是一个既耗时又极易引进误差的操作步骤，是 色谱分析技术发展的一个重要领域，样品前处理的好坏直接影响色谱分析的最终 结果，所以色谱样品的前处理一直是广大色谱工作者十分关注的问题【l 】。裂解甲 基化气相色谱联用技术( n _ i m g c ) 是近年来迅速发展起来的一种快速分析酸 性化合物，包括有机酸、多羟基醇和胺类物质的有效分析方法。这一方法是通过 在线衍生化试剂如氢氧化四甲基铵( t m a h ) 、醋酸四甲基铵( t m a a e ) 等在高温 条件下把羟基、羧基、氨基等极性基团转变成其相应的甲基化产物，从而降低其 极性和沸点，以满足气相色谱测定的条件。该方法无需复杂、繁琐的样品前处理， 具有操作简单、分析时间短并且定量准确等优点。因此，它在快速分析带有极性 基团化合物的复杂样品中发挥着越来越重要的作用。 1 1 热辅助一甲基化气相色谱法的概述 1 1 1 引言 所谓热辅助一甲基化气相色谱法是指在气相色谱进样口处分解由酸和衍生 化试剂所形成的季铵盐，从而得到该酸的可挥发性甲基化衍生物。随后，这种甲 基化衍生物在载气的吹扫下进入气相色谱柱，通过分离后被检测。这种快速的气 相色谱法适合于分析含有酸性官能团的各种有机化合物【2 1 。 1 1 2 热辅助一甲基化技术的发展 热辅助一甲基化最原始的概念起源于有机酸和四甲基铵成盐后，受热时可产 生三甲胺和近乎于纯的甲酯，这一现象是由p r e l o g 等人【3 1 于1 9 3 6 年报道的。此 后，k o s s a 等人于1 9 6 3 年提出了一个著名的反应，称之为“裂解甲基化”( p y r o l y t i c 浙江工业大学硕士学位论文 m e t h y l a t i o n ) 过程【2 1 。它是指含有酸性基团的化合物与氢氧化四烷基铵相混合后， 注射入气相色谱进样口中。在反应过程中生成了该化合物相应的烷基化衍生物。 这一反应特别适合于分析甘油三酸酯中的脂肪酸【4 】。并且对其反应过程中最佳的 实验条件也进行了研究【5 】。 1 9 8 9 年，c h a l l i n o r 首次使用裂解器分析了合成聚合物和t m a h 溶液的化学 反应过程 6 1 。这一反应过程是把碾成粉状的聚合物和2 5 w w 的t m a h 水溶液 放入7 7 0o c 的居里点裂解器中进行的。随后，各种类型的裂解器都得到了应用。 此时，这类反应被称作同时裂解甲基化反应( s i m u l t a n e o u sp y r o l y s i sm e t h y l a t i o n , s p m ) 。 接着，l e e u w 和c h a l l i n o r 等人对同时裂解甲基化的反应机理进行了研究订】。 从实验中发现：这一反应包含高温的水解过程。其酯键和醚键在强碱氢氧化四烷 基铵的作用下发生了水解作用。季铵盐快速形成后裂解并形成各自的烷基化产 物。根据这一机理，为了避免与同时裂解甲基化相混淆，这一反应被称为热辅助 一水解甲基化反应( t h e r m a l l ya s s i s t e dh y d r o l y s i sa n dm e t h y l a t i o n ，a 唧v t ) 。 随后的十几年，该热辅助一水解甲基化技术得到了蓬勃的发展，被应用于法 庭科学2 1 ，天然有机聚合物 t 3 - t s 】，土壤化学 1 9 - 2 2 】，石油化学 2 3 - 2 6 1 等方面，成为 对合成或天然物质( 合成或天然树脂、油脂、蜡、多聚糖、蛋白质、沉淀物、腐 殖质、油质) 化学成分和结构鉴定的快速高效的分析方法。 1 1 。3 常用的在线衍生化试齐j j t 2 1 从广义土说热辅助甲基化属于热辅助烷基化的一种。目前，常用的甲基化试 剂有：氢氧化四甲基铵( t m a h ) ，醋酸四甲基铵( t m a a c ) ，氢氧化三甲基( 间三 氟甲基) 苯基铵( t m 吓t h ) ，近年来氢氧化三甲基锍( t m s h ) 和氢氧化三甲基 苯基铵( t m p a h ) 也被用于热辅助一甲基化的研究。在这五种衍生化试剂中， 氢氧化四甲基铵的碱性最强；而醋酸四甲基铵的碱性最弱，它只能使羧基甲基化， 而不能使羟基和氨基甲基化；氢氧化三甲基( 间三氟甲基) 苯基铵、氢氧化三甲 基锍和氢氧化三甲基苯基铵这三种衍生化试剂的碱性相当，介于氢氧化四甲基铵 和醋酸四甲基铵之间。五种衍生化试剂的结构如下所示。 浙江工业大学硕士学位论文 邺半c n s 函 邺一芦毒 t r i m e t h y l s u l f o n i u mh y d r o x i d e ( t m s h ) 臀 一 e 卜1 叫心吗。 c h a t e t r a m e t h y l a m m o n i u ma c e t a t e ( t m a a c ) 芒3 e _ c h 3o h l 。 c h a t r i m e t h y p h e n y l a m m o n i u mh y d r o x i d e ( t m p a h ) 冒3 e 攀c h 3o h l 。 c h 3 c f 3 ( m t r i f l u o r o m e t h y l p h e n y l ) t r i m e t h y l a m m o n i u mh y d r o x i d e ( t m t f t h ) 1 1 4 化学反应过程【2 】 以硬脂酸的热辅助一甲基化为例，采用季铵碱为甲基化试剂，反应方程式如 下所示： o | l h 3 c ( c h 2 ) 1 6 c o h- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 卜 2 5 ：c h ，。二h 2 ，。c 多c n c h 3 一即执。b o ，+ 码n r j 3 傣渺 o n 父f 如 h 浙江工业大学硕士学位论文 这个化学反应包含两个连续的过程：第一步是在季铵碱的作用下，酸性物质去质 子形成相应的季铵盐；第二步是上述季铵盐在气相色谱进样口处进一步分解成三 甲胺和相应的羧酸甲基化衍生物，该步反应属于阴离子的亲核反应。 在室温条件下，酸性化合物在过量的季铵碱水溶液或甲醇溶液中完成了去质 子过程。在这种条件下，酸性较强的有机酸( p k a 1 2 ) 在这一条件下去质子速度很慢，甚至不发生去质子反应，因此，一般而言 这类化合物很难进行甲基化反应。 季铵盐热分解的反应温度主要取决于铵基部分的结构。一般而言，季铵盐的 最小热分解温度从t m t f t h 、t m p a h 、n 压a h 依次增加。对于m 研t h 和 t m p a h 的最小热分解温度大约从1 8 0 到2 5 0o c ，而t m a h 的最小热分解温度大 约从2 5 0 到3 4 5o c 。当然最佳的热反应温度需要通过实验来确定。 热分解反应最显著的特点是热分解的效率在很大程度上受样品溶液注入速 度的影响。在一般情况下，进样速度较慢( 大约2 - 5s p 1 ) 时，峰高和峰保留值 均能得到较好的结果；进样速度太快，则会使样品在完全反应前即被带出进样口， 从而导致反应不完全。 另外，在进样口的衬管中松散放置少量玻璃纤维能够显著提高热辅助一甲基 化率。这是由于玻璃纤维能够减慢样品通过进样口的速度，从而能够更好地起到 传热效果，使热辅助一甲基化反应更加完全。此外，还有一些影响传热及样品在 进样口停留时间的因素，例如载气流速、色谱柱接口的特性、进样口体积及几何 构型等。因此，对于一个特殊样品的最佳进样方式必需通过实验来确定。 样品中过量的季铵碱在进样口处进一步热分解。对于不同的季铵碱其分解产 物不同，例如氢氧化四甲基铵其分解产物主要为三甲胺和甲醇，反应方程式如下 所示： 邺竺h l h 3 c - n 。- c h a 。0 ：h 占h 3 c h a 而氢氧化三甲基苯基铵热分解方式可能有三种，具体如下所示： 4 浙江工业大学硕士学位论文 方式一： c h 3 0 h - i - 方式二： 并h 2 c h 3 0 h + h 3 方式三： c h 3 0 h4 - 。c h 2 e o h h 3 。；= = h 2 0 + o 早h 3 1 1 5 实验装置 + e o h h 3 ；= = h 2 0 + 9 o h h 3 ；= = = = h 2 0 + 田 c h 3 0 h h 3 + h 3 c o c h 3 + h 3 c z 二 h 3 c h 3 0 h + h 3 c c - h 3 c h 3 图l 一1 删g c 窟涯s 仪器装置图。 5 3 一 而m 3-c，j h 一一i cin上，) 一 多吣n 子 浙江工业大学硕士学位论文 t m a h 甲醇 溶液 样品 图l 一2 在线衍生化的进样演示图。 图l l 所示的是t h m - - g c m s 检测系统装置图。在g c 的进样口上装有 一个竖式微型炉裂解器。该裂解器与传统的裂解器的明显不同在于：第一，将卧 式改为立式，这样置于样品勺中的样品可加注重力的作用迅速降落至加热区，实 验重复性大为提高；第二，裂解室改为锥形石英管，大大减少了死体积，增加了 载气线流速，从而抑制了二此反应。通常样品在2 0 0 - - 一7 0 0o c ，氮气或氦气保护 下加入甲基化试剂后进行反应。反应产物经毛细管柱分离，通过f i d 检测得到 气相色谱图；或将反应产物引入质谱仪中，获得总离子流图及相应物质的分子结 构信息。图1 2 为在线衍生化的进样过程：将适量的样品和甲基化试剂( 例如 俐a h ) 用进样器分别注射入同一个样品勺中，随后将样品放于裂解器，并按下 裂解器按钮1 ，样品勺夹松开，于是样品勺2 迅速降落至加热区，同时启动气相 色谱仪。 1 1 6 热辅助一甲基化气相色谱法的优点【2 】 在以往的气相色谱分析中，由于羟基、羧基、氨基类化合物极性较大，不易 挥发。所以，传统的分析方法需经过水解、皂化、酯化、提取等繁琐步骤，这一 过程一般需3 4 小时b7 1 。而热辅助一甲基化气相色谱法具有如下优点： ( 1 ) 不需额外的操作步骤，可一步同时完成水解、皂化、酯化等程序。 ( 2 ) 过量的衍生化试剂无需除去，其进一步分解成甲醇、三甲胺等可挥发性物质。 6 浙江工业大学硕士学位论文 ( 3 ) 水份不干扰热辅助一甲基化反应，因此可在含水的情况下进行衍生化反应。 ( 4 ) 只需较少的操作步骤，使样品丢失或污染的可能性大大降低，同时也减少了 样品分析时间。 ( 5 ) 在定量分析中，该方法只需准确测量两个物理量：样品大小( 重量或者体积) 和样品中添加的内标的量( 如果使用了内标) 。 因此，采用热辅助一甲基化气相色谱法可以很好地解决传统分析方法的不 足。该技术通常能够在最简单的设备和样品前处理的情况下得到快速分析。在最 简单的情况下，我们仅需要的是：所要分析的酸性化合物的水溶液或甲醇溶液， 一种衍生化试剂，一根进样针和一台气相色谱仪。样品处理过程包括：把酸性化 合物和衍生化试剂以一定比例混合，然后用进样针抽取一定体积的样品，最后注 入气相色谱仪进行分离，这一处理过程仅需数分钟便可完成。 1 1 7 热辅助一甲基化气相色谱法存在的不足【2 】 尽管热辅助一甲基化气相色谱法对于分析有机酸具有无可比拟的优点，但它 也存在着一些问题。这种方法最大的不足是某些化合物在高碱度和高温的条件下 易于异构化和降解，其中一个最显著的例子是多不饱和脂肪酸。它们的形成是通 过稀丙基阳离子重排得到的，这个稀丙基阳离子是原始的菲共扼酸的稀丙基去质 子后形成的。以亚油酸为例，说明此反应的可能机理： o i l h 3 c ( c h 2 ) 4 c h = = c h c h 2 c h = = c h ( c h 2 ) 7 c o h h 3 c ( c h 2 ) 4 c h = = c h c h 2 c h = c h ( c h 2 ) 7 7 + 2 h 2 0 浙江工业大学硕士学位论文 对于消除异构化和降解这一现象的方法目前主要有以下几种： ( 1 ) 用5 乙酸将四甲基铵盐样品调节到p h 为7 5 8 0 加以消除异构化的“酸中 和法”。即在样品的铵盐液注射入气相色谱之前，通过滴加适量的酸性缓冲液、 稀释的盐酸或短链游离酸( 例如乙酸) 来中和，一般控制在p h 为7 5 8 0 。另 外，还可用短链脂肪酸甲酯消除这一现象称之为“酯中和法”。这种方法无须碱中 和，而是加入适量的短链脂肪酸甲酯与样品一同注入一定温度的色谱仪进样口 中，通过某种反应来中和过量的甲基化试剂。一般常用的短链脂肪酸甲酯中和剂 有乙酸甲酯、丙稀甲酯、戊酸甲酯。从上述两种处理方法看，因为“酸中和法” 涉及样品的酸碱滴定，当样品量较小时滴定困难，所以“酯中和法”似乎要优于“酸 中和法”，但在使用“酯中和法”时，样品溶液注入速度的快慢、色谱仪汽化室的 几何形状、温度、载气流速等方面都会对色谱峰形产生影响【2 8 1 。 ( 2 ) 另外一种改进方法是改变四元甲基氢氧化铵阳离子的结构，增加阳离子被亲 核体进攻的几率。用推电子基团苯基取代吸电子基团甲基，就可在较低的反应温 度下进行甲基化。而在较低的反应温度下，就能降低季铵n 甲基氢氧化铵的去 质子能力，从而降低了碱催化的碳碳双键异构化现象。因此，降解和异构化程度 是随着氢氧化四甲基铵、氢氧化三甲基苯基铵、氢氧化三甲基( 间三氟甲基) 苯 基铵的顺序而降低的。 ( 3 ) 降低t m a h 溶液浓度可以减少异构化。但是，由于在这样的条件下也降低了 水解效率故也减少了生成相应甲酯的产率。 ( 4 ) 把试剂的溶剂从甲醇变换成水，可以减少所给试剂的碱度。但这个影响不是 很显著。 1 2 热辅助一甲基化气相色谱法的应用 热辅助一甲基化气相色谱法这一技术已被应用于研究各种形态的化合物。其 中包括油脂、蜡、天然树脂、木质素、多聚糖、蛋白质、腐殖物、沉淀物、页岩 油、染料等。本节主要对热辅助一甲基化气相色谱法在以上这些方面的应用进行 8 浙江工业大学硕士学位论文 了综述。 1 2 1 油脂 j m c h a l l i n o r 对各种植物油中长链的饱和和不饱和的脂肪酸成分用 t h m g - c 法进行了描述1 2 9 1 。通过比较各种植物油中的长链羧酸，例如油酸、亚 油酸、亚麻酸、蓖麻油酸或月桂酸甲脂的含量，可方便地区别各种植物油。例如， 橄榄油中具有含量较高的油酸成分，而大豆油、向日葵油、红花油具有高含量的 亚油酸；椰子油含有大量的月桂酸和肉豆蔻酸。 在大豆油中含有大量的多不饱和脂肪酸，yi s h i d a 等人p o 】对t m a h 作甲基 化试剂与t m s h 作甲基化试剂以及用离线的转甲基化方法对大豆油中脂肪酸的 化学成分进行了对比研究。o ，0 5m 的t m a h 溶液作为甲基化试剂得到的大豆油 成分与用离线的方法所得到的分析结果基本一致，但是由于t m a h 的溶液浓度 太低，其回收率小于2 0 ，当提高t m a h 甲基化试剂的浓度时，回收率相应的 增加，但其c 1 8 ：2 ，c 1 8 ：3 的异构化程度就显得相当显著。 人们可以对浮游动物的脂肪酸成分进行分析，从而研究各种浮游动物个体的 新陈代谢和它们的生命历史。而在浮游动物中所包含的脂肪酸成分不仅与环境条 件，例如季节改变、地理起源等有关，而且还与浮游动物所摄取的食物有关。 y i s h i d a 等人【3 1 埔t m a h 作为甲基化试剂的p y - t h m g c 对所得到脂肪酸成分用 p c a 的方法进行评价，得出浮游动物中饱和脂肪酸成分与它所食用的海藻之间 有密切的关系。这些结果说明水蚤个体中的脂肪酸成分反应了它们所食用的植物 不同。 在4 0 0o c 下，在t m a h 存在下的p y - g c 法被用于区别在不同食物浓度下培 养的浮游动物个体【3 2 】。用p y - g c 法得到的饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸分布的 相对标准偏差小于4 5 。因此，这种方法对于区分在不同环境中生长的浮游动 物个体是足够灵敏的。 微生物体中的脂肪酸成分可通过在微生物体中添加氢氧化三甲基苯基铵，然 后采用p y g c m s 法进行分析【3 3 1 。微生物细胞与氢氧化三甲基苯基铵反应得 到的脂肪酸甲酯的结果与用传统的g c 方法对微生物体中的油脂进行萃取得到 的脂肪酸甲酯的结果相吻合。 9 浙江工业大学硕士学位论文 删一p y m s 法也用于研究啤酒泡沫微生物中的脂肪酸成分，它不需要脂 肪酸萃取和层析步骤【3 4 】。使用同样的技术，四种细菌病原体用p y 一离子阱质谱 技术对整个细菌中的脂肪酸甲酯进行描述，每一种油脂的的分析时间少于1 0 分 钟【3 5 】。 丁军凯等人跚采用t m a h 甲醇溶液( t m a h ：甲醇= l ：1 0 ，v ) 对人体脂肪、 猪、鸡、牛、羊的脂肪酸的构成进行了分析。根据7 种主要的脂肪酸( 肉豆蔻酸、 棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸) 甲酯的百分含量可方便地 对它们进行区别鉴定。采用此方法可将传统的油脂酯化法时间由2 个小时缩短为 现在的1 分钟左右。 s o k u y a m a 等人【3 6 】以十一种植物油：大豆油、油菜籽油、玉米油、芝麻油、 花生油、橄榄油、车辘油、向日葵油、棉仔油和红花油为研究对象，并使它们在 各种条件下氧化变质，例如在室内窗户附近分别暴晒1 个月、2 个月、3 个月； 在室内阴凉的地方分别放置1 个月、2 个月、3 个月；在荧光灯下照射1 个月、2 个月、3 个月等。以大豆油样品为例，未变质的大豆油样品在t m s h 作为甲基化 试剂的条件下进行n m g c 反应，结果得到了五个显著的峰：硬脂酸、软脂 酸、油酸、亚油酸和亚麻酸；而在变质的大豆油样品中，不饱和脂肪酸如c 1 8 ：1 、 c 1 8 ：2 、c 1 8 ：3 的峰消失或者峰强变弱。这主要是由于不饱和脂肪酸的反应性能 活泼，在氧化的条件下发生了结构改变。为了区分变质的植物油的归属，作者对 1 3 2 种油脂样品以软脂酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸的含量为变量进行了 p c a 和s i m a c 两种方法分析。其结果显示：p c a 法能够成功的把亚麻酸进行归 类，但对于其它的油脂样品很难进行归类。相反，s i m c a 法能够成功的把各种 油脂样品包括变质的油样品归属于它们原先的类别。 d o m i n i q u es c a l a r o n e 等人0 7 1 通过对比新鲜亚麻子油的t h m g c 的色谱图 和经过老化处理2 4 小时、2 8 2 小时的亚麻子干油脂的t h m 。g c 的色谱图，从中 可以得出它们之间的主要区别在于：经过老化的干油脂的色谱图中多了许多 c 5 c l o 范围内的羧酸a n - 羧酸甲酯的峰。这些羧酸和二羧酸是在油脂老化过程 中空气中的氧进攻油脂样品中的不饱和脂肪酸时得到的降解产物，其主要的降解 产物是壬二酸，干油脂具体的产生过程也通过裂解试验得到了阐述。作者还对油 脂老化不同时间的t h m g c 的色谱图进行了比较。结果显示：随着老化时间的 1