（植物病理学专业论文）几丁质酶和内切葡聚糖酶编码基因的克隆及重组芽孢杆菌的构建.pdf

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3 0 k b 的片段，与同s a u 3 a 具有撵圈糙魏寒壤懿b a m h i 完全酶甥蒡趱磷羧纯瓣质粒p b l u e s e r i p t l i 连 接，转化e c o l iy m l 0 9 ，蓝囱斑筛选得到1 0 8 株菌株，通过羧甲基纤维素 培养基簿选炱有内甥麓聚糖酶活性的蘧株有7 4 个，选取其中酶活投表达 最强的阳性克隆子，质粒分析并进行测序，诞媚外源播入片段大小为o 7 k b 左杏。测序莽序列比较结聚表弱该基因片段同已发表的撼草芽孢杆菌 峨黻燃 几丁骚酶靼虎甥碗聚糖酶编玛幕圳柏克爆发醺纽芽斑杆氆的午句建 g l y b a p r e 之怕j 的同源性是最商的，为3 5 ；同施c j l 晒s p b p 2 3c e z b 、 且p u m i l u s 内切葡聚糖酶和酋p o l y m v x a8 1 ，4 一内切葡聚糖酶的编确基 因的同源骸只有2 7 。虽然同源性较低，德酶活性表达较强，认为该基因 是编码内仞葡聚糖酶的一个新基因片段。 丽e c o r l 稻s a l i 对含有凡丁虢酶基因静羹组璇粒t v c h i ( 含凡丁震 酶编碣基因的p m d l 8 - t 载体) _ j 丞穿梭质敉p h y 3 0 0 p l k 进行双酶切并连 接，转纯嚣l c o l id h 58 ，遴过凡丁震培券蒸平板簿选缪到2 拣转化子，提 取其中懿穗，震粒酶甥分辑糖入的外源嚣段嬲p c r 产物大小接近一致。 将鼗耋组震粒p h c h i 转化巨大芽孢抒莲b m e g a t e r i u ma p 2 5 ，提到两株转 化予，分别命名为p 2 5 1 1 3 9 ，p 2 5 1 1 3 - 1 0 。转化子进舒酶活性检测，同时 具有几丁质酶靼壤聚糖酶的酶活性。撇据水勰圈的大小可以看到，几丁质 酶的表达活性不如e c o l id h 5a 中的表达活性商。平板接抗实验同野生菌 株楣比，转化予对麦长蠕孢菌的抑制作用最明显，抑制西分数最高w 达 3 3 3 ，而a p l l 3 和a p 2 5 分别是2 3 1 和2 5 6 ，同时转化予对小麦纹 明显 的防 病作用强干野生菌株，尤其是对小麦全蚀病的防治作稽，其防治效果间野 ，主菌株a p l l 3 和a p 2 5 相比，分剐增长了2 2 s 4 和2 0 。 对芽孢秤菌凡丁质酶稚肉切黼聚糖酶编褥基因的竟隆及其转亿实验 表明獠病生防芽豫秆菌的作精柄l 铜之一就怒产生尼了质虢和篱聚糖酶这 两种抗菌物质，邑证实这两释抗蓠物质之阉其宥懿同效应，这必今后靛生 簖蘸遗传改良提供了一个薪途径。 关键谈：建丁震酶蠹攒麓装藉薅基 2 抒越擅痍生防 山东农业人学顺i ：论立 a b s t r a c t t h i sa r t i c l ed e a l tw i t hc l o n i n ga n ds e q u e n c i n go fc h i t i n a s e a n de n d o g l 罐e a n a s eg e n e s o f 参台o j i ? 始s p p 。a n dr e c o m b i n a n tb i o c o n t r o l i s o l a t e so fb a c i l l u ss p p b yt r a n s f o r m a t i o nw i t ht h eg e n e s p l a n td i s e a s eb i o c o n t r o lb a c t e r i ab a c i l l u ss u b t i l l s a p l 1 3a n d 最m e g a t e r i u r aa p 2 5w e r ei s o l a t e df r o mw h e a tf i e l ds o i l sc o l l e c t e d f r o ms o u t ha u s t r a l i aa n dt a ia n e n z y m ea c t i v i t ya n a l y s i so nc h i t i n a g a ra n da b pm e d i as h o w e dt h a t 置s u b t i l l sa p l l 3s e c r e t e dc h i t i n a s e a n d 最m e g a t o r i u ma p 2 5s e c r e t e de n d o g l u c a n a s e ，r e s p e c t i v e l y p c rm e t h o d o l o g yw a sa d o p t e df o rc l o n i n go fc h i t i n a s ee n c o d i n g g e n e s b a s e do nt h es e q u e n c e so fc h i t i n a s eg e n ef r o m6 e n e b a n k ，t h e p r i m e r s f o rc h i t i n a s e g e n ea m p l i f i c a t i o n w e r e d e s i g n e d p c r f r a g m e n t w a s 1 i g a t e dw i t hp m d l 8 一t v e c t o ra n dt r a n s f o r m e di n t o 置c o l id h 5 旺。f o u rc o l o n i e so ft r a n s f o r m e d 置c o t id h 5aw i t hc l e a r h y d r o l y z i n gz o n e o nt h ec h i t i na g a rw e r eo b t a i n e d t h eg e n ef r a g m e n t i nt h e s ei s o l a t e sw a si d e n t i f i e d b y t h em e t h o d so f p l a s m i d p r o c e s s i n g d n as e q u e n c i n ga n a l y s i ss h o w e dt h a ts e q u e n c eh o m o l o g y b e t w e e np c rf r a g m e n ta n dc h r o m o s o m a ld n ao f 曼s u b t i l i sf r o m2 5 9 9 4 5l t o2 8 1 2 8 7 0w a s8 5 a n dw a s3 0 9 6b e t w e e nt h ef r a g m e n ta n dt h eg e n e s e n c o d i n g f o rc h i t i n a s eo f b a c i l l u s ( i n c l u d i n g 黩s u b t f l i s ) i n g e n e b a n k i tw a st h o u g h tt ob ean e wg e n ee n c o d i n gf o rc h i t i n a n s e o f & s u b t i l i s g e n o m eli b r a r y m e t h o d o l o g y w a s a d o p t e d f o r c l o n i n g o f e n d o g l u c a n a s ee n c o d i n gg e n e s g e n o m i cd n ao f 丑m e g a t e r i u mw a s p a r t i a l l yd i g e s t e db yr e s t r i c t i o ne n z y m e s a u 3 aa n dw a su s e dt o e s t a b l i s ht h eg e n o m i cl i b r a r yi np l a s m i dp b l u s c r i p t s s e l e c t i o nf o r e n d o g l u c a n a s ep o s i t i v ec l o n e sf r o mt r a n s f o r m e d c o l i w a sc a r r i e d o u to nt h ec m cm e d i u m s e v e n t y f o u rc l o n e st h a ts h o w e dh y d r o l y s i s a b i l i t yo nt h ec m cp l a t e w e r eo b t a i n e d s e q u e n c i n ga n a l y s i ss h o w e d 3 凡丁旋酶和内切葡聚藉酶编筠箍海的觅隆及羲鳃芽斑释菌斡构建 t h a tt h es e q u e n c eo fe n d o g l h e a n a s ef r a g m e n te x h i h i t s3 5 h o m o l o g y w it h 最s u b t i l i sc h r o m o s o m a ld n a ( f r o mg l y bt oa p r e ) ，a n d2 7 h o m o l o g y w it hb a c i l l u ss p 。b p 2 3c e l bg e n e s ，丑p u m i l u se n d 0 9 1 u e a n a s ea n d 盥p o l y m y x ab e t a 一1 ，4 - e n d o g l u c a n a s eg e n e s ，r e s p e c t i v e l y i tw a s r e c o g n i z e d a san e w g e n ee n c o d i n g f o r e n d 0 9 1 u c a n a s e o f 屈m e g a t e r i u 搋 t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dt v c h i ( p m d l 8 。ti n s e r t e dw i t hc h i t i n a s e e n c o d i n gg e n e f r o m a p l1 3 ) a n dec o l i - b a c i l l u ss h u t t l ev e c t o r p h y 3 0 0 p l k w e r e d i g e s t e db y e c o r ia n ds a li c o m p l e t e l y ，a n dt h e c h i t i n a s eg e n ew a s1 i g a t e dw i t hs h u t t l ev e c t o r ，a n dt h er e c o m b i n a n t v e c t o rw a su s e dt ot r a n s f o r m 艘m e g a t e r i u m a p 2 5c o m p e t e n tc e l l p c r a n de n z y m ea c i t i v i t yc h e c ko nc h i t i n 鞠1 8 rs h o w e dt h a tt h ec h i t i n a s e g e n ef r a g m e n t e x i s t e da n d e x p r e s s e d i nt h e w i l d t y p e s t r a i n s a n t a g o n i s t i ca c t i v i t yt e s ti n 妊t t os u g g e s tt h a tt h et r a n s f o r m a n t s r e m a i n e dt h ea b iii t yt o p r o d u c ea n t i b i o t i c s t h er e c o m b i n a n t s t r a i n ss h o w e da ni n c r e a s e db i o c o n t r o l e f f i c a c ya g a i n s tw h e a t t a k e a l la n dr h i z o c t o n i as h e a t hb l i g h ti ng r e e n h o u s e 。 k e y w o r d s ：c h i t i n a s e ；e n d o g l u c a n a s e ：g e n e ；b a c i l l u s ：b i o l o g i c a l c o n t r o l 4 山东农业人举坝 ：论文 1 引言 作物土传病害是农业生产的主要限制因子之一，随着农业集约化程 度黥爨商，幸擎物传筑害强趋严重。剿鑫嚣为止， 筝扬病害静防治仍以纯 学防治为主。虽然在一定的程度上对病害的防治起了獯要的作用，但农药 大量瓣镬霸，不仅对舔凌造戒了严重瓣污染，对太畜懿瘫造成了危害，同 时还导致病原菌抗药性的上升，增加了防治难度。基于以上事实，人们迫 切震婺一耪安全奏效熬瘸害羧到措憨。 植物病害生物防治是指利用天然的或改造过的生物体、基因产物来 疑低鸯害生物瓣 乍用，保护农佟甥f 1 2 1 。不少野生缨莹、敖线毯敷真筮逐过 产生代谢产物或争夺营养等黻止病害的发生、整延，这些野生生防菌目前 已经旃商品化产最。例如，撼革芽孢枉菌( b s ) 是一种微生物杀菌刻，珏 本用b s 及其分泌物防治番茄斑枯病获得良好防效；豳内北京大学和河南 省农科院报告b s 对小麦赤霉瘸、珏瓜桔萎瘸、烟草鬻桔病、棉花桔接病 等多种病害有良好的羽闯防治效果，并有明显的增产效应h 硼。但这些天然 菌株，抑菌机制单一，抑菌谱窄，产晶的有效成分含缀不稳定。因此利用 生物技术研究瘸原萤、寄主和生防萤兰者静美系，改选生防蓠躐寄主激提 高其防病效果。例如，程爱丽等【3 l 将几丁质酶慕因导入到野生菌株b a c i l l u s s u b t i l i s b 母0 8 中，扩宽了生骑藿静静麓谱，畿够有效浆茨治求稻绞稿瘸。 目前，许多发达国家竟相投资来发掘微生物基因资源，目的就是要通过基 因资源、基霆菠本手段，对羰艇凌送行重缀，发展逶瘸子不窝惩途赘多功 能的离效的基因工程微生物制剂。 剃用生携手段貉浚蓬物瘸害鑫玺妻要磷究逡骞之一裁是美于菝蘩凝鑫 的研究，在抗菌蛋白中研究的晟多的熄几丁质酶和葡聚糖酶。属于水解酶 类戆足丁矮懿寒蔫聚糖酶分别降鼹瘸原墓缨巍壁豹囊要戏分尼丁屡 和葡聚糖，导教病原茵细胞破裂，生长爱阻，不能继续侵染和危害农作物。 但单一的熙几丁质酶竣壤聚糖酶，绍熙效果不佳，不能完全抑制痍原藤， 将几丁质酶和葡聚糖酶共同作用于瘸原菌，可以很好的消解病原菌细胞 壁，搦毒病原蕊的生长。例如，将烟鼙几丁质酶和葡浆糖酶编码基因冈对 在番茄中表_ 遮，转双基因番茄对真菌痛害( 如f u s a r i n mo x y s p o r u m ) 抗性 几丁质酶和内剀衙聚糖酶蝻鹤基闪的兜降及重组芽他杆菌的构建 明显高于转单基因植株的抗性( j o n g e d q k 等1 5 3 1 ，1 9 9 5 ) 。王盏氏”嘲1 9 9 7 年将几丁质酶和b 1 ，3 葡聚糖酶的编码旗因同时转化b s u b t i l i s b 。9 0 8 ，获 得的转仡子与野垒型菌株相眈，辩r i z o c t o n i as o l a n i 的抑稍作莆燹完全。 1 1 几丁质酶的研究 a 丁震( c h i t i n ) 又称甲壳豢或季焘葳，广泛分蠢予鑫然器中，在天 然聚合物中其储艇仅次于纤维索，占第二位【l9 1 。现今，已确定有三种以氨 键相连载结嚣搭：a 。咒t 震，窿两条爱淘平嚣镶缀戒；t 3 死t 蔟，由爨 条同向平行链组成：y - 几丁质，由三条链组成，两条同向，一条反向。 在生豹髂中蔻了矮豢与其宅结揍镑震交联，真蕊细戆壁巾熬凡丁震与 黼聚糖麸价结合l ：6 ：i 。 几丁质酶( 嚣c 3 。2 1 4 ) 是继纯降职几丁震蠹孽一类瓣基承勰酶，它可 将由1 3 1 ，4 - n - 忍酰d 葡聚糖( n a g ) 残基组成的几丁质降解为低分子 爨的n a g 。丸丁质酶广泛存在于有机物中，这魑有机糖本身可能不产生 几丁质，例如细菌( s e r a t i am a r c e s c e n s ，o r d e n t l i c h 等【硼，1 9 8 7 ；p s e u d o m o n a s s p 。，h o - e e o n gl i m 等1 5 1 1 ，1 9 9 1 ) 、真菌( t r i c h o d e r m ah a r z i n u m ，c h r i s t o p h e r k h a y e s t 3 5 ，1 9 9 4 ；r i d o u t 等l s 4 l ，1 9 8 6 ) 、瑟虫( c h e l o n u s s p r e a c u r v i m a c u l a t u s ，a n u r a d h ak r i s h n a n 等1 2 6 1 ，1 9 9 4 ) 、离等植物( p r 瑕 爵) 和动物( g e m m am 等社懿，1 9 9 5 ) 等，对防治病源粪菌具有莛要的体 用。顾真荣嘲曾报道三种产几丁质酶的势孢杆菌( 短芽孢杆菌、地衣芽孢 释菡、稻草芽稳秆蓍) 对瘸原蘩的手乖萤作震，认为这三静蕾对b o t r y t d s c i n e r e a ，f u s a r i u m g r a m i e a r u m ，詹s o l a n i ，s c l e m t i n i as c l e r o t i o r u m 具有强 翔静捧镧作用，龙其是穗苹芽豫耱藿，褒舞发磷潮生防制裁蔽醣治多释主 传植物瘸害方面舆有很犬的潜力。 投瓣建丁袋酶毽纯送域氨蒸酸枣列稳餐链，在糖蘩窳簿酶分类系绞 中将几丁质酶分为两类：f a m i l y l 8 和f a m i l y l 9 ( h e m - i s s a t 等【4 8 】 4 9 1 ：t a k e s h i w a t a n a b e 等 9 6 1 ，1 9 9 9 ；d a v i e s 等 3 9 】，1 9 9 5 ) 。嚣避，霉嘏撂足了壤酶拳瓣 几丁质底物类型的不同，可以分为内切酶和外切酶。内切酶的水解产物一 般分为死丁二糖、三糖、靼耱或冀聚是了多糖，矮韬酶戆零鳃产貔常为挚 糖，微生物产，圭的几丁璇酶一般多为外切酶，也有一些微生物产生内切酶 ( p a u l 等i 7 6 】，1 9 7 8 ) ，糖物几丁质酶多为内切酶。m i d d e t s e n 等搬据几丁 6 山东农业人学顺i ：论文 质酶氨基酸序列的不同，将植物几丁质酶分为三类，第一类为碱性多肽， ( b e n 等1 2 ”，1 9 9 3 ；l o g e m a n n 等【6 3 j ，1 9 9 4 ) 。第二类几丁质酶缺少富含半 胱氨酸的氨基末端，但它的其他结构与第一类几丁质酶很类似，第三类几 丁质酶主要是木瓜、三1 1 p 橡胶、爬山虎等具有裂解酶、几丁质酶这种双重 活性的蛋白质分子，同时还包括黄瓜，拟南芥的酸性几丁质酶等。( p e g g 等【7 8 】，1 9 8 2 ；g e o r g e 等【4 6 1 ，1 9 9 0 ；r o b e hl e a t h 等【8 7 】，1 9 9 1 ；m a r ks w e g l e 等f 6 3 1 ，1 9 8 9 ；高必达，1 9 9 6 j ) 。芽孢杆菌种的几丁质酶具有多样性，不 同芽孢杆菌产生的几丁质酶的类别、组分、性质不尽相同，如地衣芽孢杆 菌( b 1 i c h e n i f o r m i s ) 可产生五种几丁质酶【l “j ，环状芽孢杆菌( b c i r c u l a n s w l 1 2 ) 则产生六种几丁质酶【9 6 l ，巨大芽孢杆菌( b m e g a t e r i u m ) 能产生 三种脱乙酰几丁质酶【7 9 1 ，大多数产几丁质酶的芽孢杆菌对真菌都具有拮抗 作用，而且多数几丁质酶在离体情况下也能抑制真菌的生长。 几丁质酶为一诱导酶，当培养基中含有几丁质，脱乙酰几丁质，几 丁质二糖时，可以诱导某些真菌、细菌、放线菌等产生几丁质酶。许多研 究t r i c h o d e r m as p p 的几丁质酶的表达调节表明几丁质酶的合成和活性表 达是在转录水平上受到调节的，几丁质可以诱导微生物中的几丁质酶的高 水平的合成。b a c i l l u sc i r c u l a n sw l 1 2 在以几丁质为碳源时，在培养的悬 浮液中至少能够检测到1 0 种几丁质酶，已克隆了三种几丁质酶的编码基 因：c h i a ，c h i c 和c h i d t 2 4 1 1 0 4 1 。c h i n m i n 等【3 4 l ( 2 0 0 2 ) 在b a c i l l u s n c t u 2 中纯化了一种胞外几丁质酶，这种几丁质酶的酶活性很稳定，改变p h 和 温度很难引起其相关的酶活性变化，以几丁质为底物诱导表达，当几丁质 含量超过o 5 时，酶活性变化也很小，不仅如此，如果向培养基中加入 额外的营养物质( 例如2 蛋白胨) ，酶活性也没有什么意义上的变化。通 过几丁质酶氨基酸的n 端序列( 舢州l g s k l l v g y w h n ) 克隆了此酶的 编码基因。 微生物的几丁质酶的分子量变化很大。s e r r a t i am 盯c e s c e n s 是目前 产几丁质酶比较丰富的一类菌，它可产生五种具有不同分予量的几丁质 酶，分别是2 l 、3 2 、3 6 、4 8 和5 7 k d a ( r l f u c h s 等，1 9 8 6 卸) 。1 9 9 6 年， l e s y aa t 掣5 6 1 发现最l i e h e n i f o r m i sb - 6 8 9 3 也有五种不同分子量的几 丁质酶，分别是6 6 、6 2 、5 3 、4 9 和4 2 k d a ，而从a r t h r o b a c t e r s p t a d 2 0 虎丁蜃酶辩盘馋嚣囊藏簿鳊薅麓黼鹩宽瘴袋委鳃聋热释漪瓣搀建 孛餐到魏a r c hi a 器a r c h i b 魏分子藿分鄹是ll o k d a 黎8 0 k d a p “。捷物魏 咒丁袋酶戆分予溪一般在2 0 4 0 k d a ，铡瓤熠攀的殴种几丁质酶，其中黼 独酸瞧见丁矮瓣靛分予璧蹩2 7 5 k d a 帮2 8 。5 k d a ，碱性鬟窦酶鞠分予量分 瓤憝3 2 k d 和3 4 k d l 。尼丁爝酶疑蠢缀薅酌热稳定幢，a r t h r o b a c t e r s p 。t a d 2 0 程最逡蹦6 1 熊条传下，温度在澌庄裔，箕a r c h i a 鄹a r c h i b 鹣酶活为袭蕊最太。h 妒g e u n i 霜 等予2 0 0 0 举献一嗜热一陡b a c i l l u ss p 突 隧翔藏己酝见丁疆酶韵编稻基鬻c h o k ，浚簇露缡弼靛臻程6 0 - 1 0 0 酶涵 缝袭达较嵩。a t 矮酶靛磷一般京3 一? ，5 辩其意酶活谴，翻鸯6 霹遮弱 最大氇。s t r e p t o m y c e s 妇一d i f i c a n s 豹死丁凝酶嶷蛾为8 瓣，蔟酶滤 搀是最大毽，0 6 8 u s l ，藤磷舞3 辩，莲莰i i 玎屈i 。r ，l p a c h s 8 5 壤1 9 8 6 霉逶过褥建c o s m i d 文鬻麸s m a r c e s c e n s 审戆漶戮了5 7 k d a 氏t 臻薅豹镳 筠蒸困，莠褒太酝鞲蓠孛褥戮了鞭穗竞隆予。 荚予努憨转蘩压了壤懿的磷究始予1 9 0 5 冬l l l ，b e n e c k e 懿訾次势蹙 捌了憨够嚣簏尼丁痰作舞营养耪霞煞擞垒铸，荠定惠蔻b a c i l l u s c h i t i n o v l r o u s ( 滚凡t 矮努憨姆蘩) ，健鹭嚏没弩关予几了凌酶溪瞧方瓣 戆囊接证攥。璇籍，箕鏊嚣豹宠篷骚究羧多匏楚8c i r c u l a n s o1 9 9 0 零， 薯酞e 憩i l 蛳秘麓簸傣质粳p k k 2 3 3 - 3 跌躜c i r c u l a n s w l - 1 2 中竞隧了几丁趱 憋袅i 数簸秘基蔽c h i a 。d n a 穿列缀嚣晁t 鬟簿戤麓袭这黟嚣经禽翥2 0 9 7 b p 黪西藏阙读耀勰，编礤a 了质酶a l 的髓体，j 琢蘸体鸯裔一个缀长戆僚母 序列( 4 1 b p ) ，n - 端篷纯嫠箍势i 5 个鬣基簸，端为足丁霾豹终金辩瞧 ( c h b d ) 。随震n 霉孛黼该酶殿蕊缔礤萋蔽研巍的铰雾。m a s a y u k i 等【6 5 1 瓣几丁攒酶矗l 的a 丁璇结会邋域麴特性帮袭遮佟一研必。羁髑p e t 裘迭 系统在大耩释蔫审大蠢产堡c h i a t 瓣c h b d ( c h b d 。；) 。弗逶过凡下壤隶帮 瑟辑 奎梅劐纯纯，缝他麓的( c h b d o 。) w 班褥舅幢豹缡会各糖嚣溶嬲泣 黪死丁旗，健幂熊臻合其余懿参累糖类，锈懿蠢聚耱，稽维豢等。( c h b 。 静缝合滔力的磷藏盈京争l l 乏鬻，爨龋接避予p i l l 雩，葵酶滋瞧最灏， 表麓( c h 嚣隗。) 翁疆念童蓑霆娃蔬承传餍舞麦。袋失c h b d 戆c h i a l 拳麟 瑟一尼t 震，发甏哭是焱最按熬装羹拿藤漆零解。6 0 分镑淡嚣，承熬速炭燮 镬甚至襻斑，藤携静瀵鼹豢鹱翌多子宠熬黧c h i a l 瓣纛耪耱漓麓爨，所缢 c h b d 谯一是了壤熬蹲绥每县海鬟要熬铭疆。郑滋武【2 3 1 骧予1 9 9 8 冬扶 8 最c i r c u l a rc - 2 中克隆了一个几丁质酶编码撼因c h t l ，大小为3 o k b ， 其中备煮一个k p n i 、s a c i 帮s s d i 豹黪凌位点，将该篾段反爨矮人到质粒 载体上进行活性检测，同样具有几丁质酶基因的表达活性，说明该片段含 毒一令宠整斡几丁质懿躲编码基毽，冀蠡身静囊动予可被大肠抒菌豹转录 系统所识别。比较酶切图谱，发现几丁质酶基因同从矗c i r c u l a n sw l - 1 2 中克隆到的c h i a l 昶c h i d 鸯缀大差剐，c h i a l 和c h i d 功能医内的p s t i 和b a m h i 位点均未在c h t i 的功能区中发现，丽c h t i 中的k p n i 和s s p i 位 点在c h i a l 和c h i d 的功能区中也没脊发现。所以初步剡定c h t i 是一个别 于c h i a l 和c h i d 的新的死丁质酶。鼠c i r c u i a n sw l - 1 2 中除了克隆到的 c h i a 旗因外，w a t a n a b e tc , o ”予1 9 9 2 馨克隆了c h i a 的同工酶c h i d 的编码 基因c h i d ，该基因位子c h i a 簇因豹下游区域。序列比较认为该基因编码 4 8 8 个氨基酸，c h i a 和c h i d 之间相距1 0 8 b p ，而且几丁质酶dn 一端的三 分之疆秘死丁葳辫a 静c - 臻兰分之一处穗钕程度缀高。强靖 w a t a n a b e t “删还认为s e r 一1 6 0 、a s p - 2 0 0 、g l u 一2 0 4 这三个氨基酸是 最c i r c u l a n s w l - 1 2 静凡丁震酶矗l 承懿部霞煞蓬要嚣予，鲮失这三个懿基 酸中的任何一个，尤其是a s p - 2 0 0 、g l u 一2 0 4 ，几丁质酶a l 的表达都会受 到影嫡。 1 2 葡聚糖酶的研究 镌残囊蘩绥腿壁瓣成分除了足了震终，逐毒蘸凝糖，蘩聚糖酶靛是 一种将葡聚糖降解为黼萄糖的一类水解酶。1 9 7 9 年，s i e t s m a l 9 4 1 等分剐用 凡丁璇薅靼碱处理s c h i z o p h y l t u mc o m m u n e 缨腿壁，诞粳几丁质和麓聚糖 之间以共价键相连接。根据葡聚糖酶作用于糖营键位点的不同，可分为b 1 , 2 、e 1 , 3 、b 1 , 4 、e 1 , 6 甍聚糖酶。葡聚糖酶切点位壁魄不同，又 可分为内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶，外切葡聚糖酶囊要是水解菲还原端 断裂的葡聚糖残基，内切葡聚糖酶沿篝多糖镳可以随意水解b 一键，释放 出寡糖，真菌中一葡聚糖的降解通常是内翻和外镯葡聚耱酶共同彳乍潮豹 结果。事实上，在许多微生物中发现多种葡聚糖酶的存在，葡聚糖的水解 是肉切蓠聚游酶( e c 3 。2 1 3 9 ) 和矫镯蘩聚耱瓣( e c 3 2 。1 5 8 ) 共同律蠲的 结果。同几丁质酶一样，葡聚糖酶也广泛存在于细菌( b a c i l u s m a c e r a n s r n i c h o l a s 等，1 9 9 7 强1 ；显a m y l o l i q u e f a c i e n s ，t h o m a s 等，1 9 9 3 u 0 1 ) 、 簪 几丁矮熊彝l 内切葡聚孵瓣编磷旗蝴的克隧粳重组芽斑枵藩的构建 真藏( 魏t r i c h d e r m a , r e e s e i ，h i r o f u m io k a d a 等，1 9 9 8 t s 0 1 ) 、藻类( c l a l d o p h o r a r u p e s t r i s ，d u n c a n 等，t 9 5 6 攀2 i 、攘镪( 承稻，秘蘸残等，1 9 9 2 1 5 】 及动 物( 无脊搬动物皴蜗牛等) 中。哭予裁聚糖酶在缨菌b a c i l l u s 、真菌 t r i c h o d e r m a 霸爆孳中磷究戆较多。 - 麓聚糖酶差畦几丁质酶常鬻表现出类似的调节功能。狸被玛铃薯晚疫 瘸餐馒染静马铃薯缀绞孛稷羧寒垒三疫鬈或t m v 缦染熬烟擎缀缎中以及乙 烯处理后的篥妲中两种酶凿可被诱导。f e l i x e 4 3 l 研究认为，组织培弊中， 洇蘩孛一辩特簿的蠹切* l ，3 蘩凝糖酶受曩生长索积分裂索豹调麓，当 两种激素同时加到墒养基中时，9 0 的酶活性被抑制，而将含有任何一种 激素或苓禽激豢鲍培养基热入到此壤养基巾时，此酶的表遮璧在第7 天时 眈以前增加了约l o 倍。e i e h h o l z 认为建激动素( k i n e t i n ) 隰礴了蚤1 ，3 麓聚穗酶翁燕薪会成，焉l i x 帮认魏单燕激动素芬不能陋礴1 3 。l ，3 葡 聚糖酶的合成，这；降隧遏怒出分裂索和生长索两者共瀚决定静 3 9 1 。1 ， 3 一葡聚糖酶氇憝一诱导酶，这点褥建丁蕊薅样。徽生褥只有在 美蟪衣 多糖、茯苓多糖、器稚多糖等这样鹃一l ，3 - 鬻聚糖酶为辕源麓培养蕊主 垒长，耋毽蓑一般3 - 4 天，囊麓一般l o 天敬爱，酶活性迭簸大攘。v o g e t i 。l a n g e 零l 援熬苹瓣l 获躐榷t ，3 - 蘩聚耩酶b 基因瓣t 6 k b 熬寝囊予，冬g u s 基嚣融合，对谡空序列在苓网诱导祭传下进嚣缺必分瓠，结果表明：嬲动 予瓣l 菸2 至1 1 9 3 区羧卺食有嚣令簿瓣熬电豢竣骜羧，a g c c g c c ，京奁 与躲追和骆御摆关豹基因巾具有糍发保守性，并是时中1 3 1 ，3 馥聚糖酶 毫拳警表遮辑磐爨戆。髓澎劐熬下霪- 5 0 3 歪- 3 5 8 瓣孩营羧送羧对予蠢爝 的落导表逸是特异性蠹勺，若将1 4 5 2 至1 1 9 3 区段删除，则艺烯对葡聚糖酶 熬诱导表遮囊萋辫甄h 麓。爨漫【2 璐磷究了旗攀棼建挺蘩突交攘c w - 0 6 产生 b - 葡聚糖酶的条件，发现只有大袭的1 3 简聚糖能够诱导此酶的表达，只 g 部分懿水解缝衣多糖，键苓戆农解终缨豢，就辩懿最逶鲢l 必7 0 7 ，5 ， 最遁温度柱5 0 5 5 。 谗多耱糠聚拣酶浆缡褥蒸爨获一缀缋擒融被谬缎的麟究，尤其菸微 生物方面的研究。d e m a r t i n l 鞠 予1 9 8 0 年分析了爵葡聚糖酶在b a c i l l u s 中翡分布，在b a c i l l u s 中，已肽燕c i r c u l a n s w l 1 2 、矗s u b t i l i s 、置p o l y m y x 及嗜碱性分离袜中分离弼了母- 葡聚糖酶，这些酶在生态举上襄有羹要 由衷农韭天学颁l ：论文 的意义，它们可以作为探针来分析酵母细胞壁的结构及为酵母原生质作准 备，而且，微生物0 葡聚糖酶在真菌生物防治和啤酒生产上具有熏要的 商业价值。1 9 8 5 年，r o b i s o n 和c h a m b l i s s 从成s u b t i l i s 中分离到了b 1 ， 4 一葡聚糖酶的编码基因，并导入到大肠杆菌细胞中得到表达f 4 “。这个基因 存在于一段2 k b 大小，两端为e c o r i - h i n d l i i 切点的片段上，如果单独用 e c o r i 处理，将得到一段长3 k b 的片段，这一片段含有葡聚糖酶基因的启 动子重组大肠秆菌细施产生的葡聚糖酶为外分泌整，分子量为3 5 2 0 0 道 尔顿。中番农娩大学酌毛毯宏h2 l 掇取b c i r c u l a n s 豹染色体d n a ，选用 e c o r i 进幸亍部分酶韬，获得浆片段与载体p u c k 9 楣连，转亿大肠杼鼙， 获褥鼹株鬻性壳隆予。c 。t a b e 臻e r o 3 7 1 跌一嗜溅栏b a c i l l u s ( n 1 3 7 ) 中竞隆 了海韬8 。l ，3 - l ，4 - 蘩聚糖酶戆基匿b a g a ，该片羧含有鑫赛缒窟动予， 大肠疑蕴可以识别其襄动予，馒之能有效躲表达酶溪性。会b a g a 的1 4 1 6 b p d n a 片段的核蟹酸序列编码8 2 8 个氨纂酸灼野放阅读框絮，具寅3 1 个氨 基酸的信号肽；b a g a 蛋白走要处予细胞周质部位，其透宣的p h 为6 1 2 ， 适宜温度为6 0 。7 0 ，7 0 c 保濑一小时，仍具有6 0 的酶活性，并且c 端具有一个富禽l y s 区域。r m m e c k e y t 拍】从b s u b t i l i s ( a p l l 5 ) 中分离到 了含有内切1 3 - l ，4 葡凝糖酶基因的3 k b 大小的p s t i 片段，并进行测序。 该基因编码的蛋白含有4 9 9 个氨基酸残基( m r = 5 5 ，2 3 4 ) ，并具有典型的 b s u b t i l i s 的信学肽。转蒸因后的大肠秆菌产生的胞外内切葡聚耩酶具有一 个大约3 0 个氨基酸的n 端，同时该基因隐藏的阅读框架中具有不依赖于 p 因予的终止结构，测得的氨蒸酸痔列葡邑知的c l o s t r i d i u mt h e r m o c e l l u m 的c e l b 基因编码的蛋白韵氨篡酸侉列院较，= 者仅有一小部分具有稻似 往，毽这- - + 部分胃畿包含有底物结合和域催亿位点。杨智源”4 j 等曾扶 短小芽稳秆菡s - 2 7 种宠隧了蓠聚貉内切酶，对该酶的研究认为萁作雳最 适溢度为5 5 ，最适p h 为s 7 ，在磷9 熬条件下仍关有7 9 o 懿活力。 对予蘩聚糖酶豹应用方覆警有摄遥，隶瓣1 3 ，d 麓糖营的蠹镯1 3 饕聚糖酶 可以作必报告蒸医搜用1 3 2 。 髂必攘物蘧聚糖黪的磺究，曼薅至少邑报遥t9 秘植物款2 6 糖s l ， 3 麓聚糖酶的氨基羧顺序和e d n a ，共从c d n a 或基因组d n a 克隆攘导 出它们的基本结构【 1 2 9 1 。烟擎中灼葡浆糖酶研究的最多，根据其氨基酸 死丁矮簿嚣l 内秘蓉黎藏酸编码壤胤熬克糍& 壤鲑芽缒抒蓝豹擒建 顺序主要分为兰种结构f 1 7 0 7 t 。第类疆g l a 为代袭的至少包括4 个 碱健异构俸，氨基酸序列上存在1 罄拜p l j 蹲 ，第二粪包括6 释霁擒 体，4 种为酸。障的，主袋是p r 一2 ，p r - n ，p r o ，g l l 5 3 ，g l l 6 1 ，s p 4 1 a t l 7 1 辩臻媚，第三类为酸搜蓬鑫f 臻。雕静已有秘当多麴涯撼涯潮第一类 。l ，3 麓聚糖醚在娲孳耪子生橡发芽淤段具骞攫要作爆【6 1 1 【6 2 】 6 0 l 【6 ”。关于 基藩兖隆艿嚣，瑶蘸已在3 耱攘凌上翁彳释1 ，3 - 麓聚糖酶蓬嚣，爨瓣 不鹪骜溺络橡避孬比较势明确蟪码其黪列特殊特征的仪有少数。 l 。3 忍丁震骜窝蘩聚耱懿豹蛰穗效应 大多数瘸原真菌熟细胞戮都食有几丁质蒂h 葡聚糖，当将几丁质酶和 饕聚耱酪莛燕佟矮蹲，霹导致粪蓥骢纲腿突全跛裂，生长受疆蠛考缨缒笼 亡，嫩止瘸骞的发生_ 和发展，阑此：煮也阍的遮种协同作用受剿植物瘸害 生物爨治酪究羔佟者的裹菠重援。s e t a - b u u r l a g e ( 1 9 9 3 ) 扶翅攀中分离癌 i 类和i i 类葡聚糖酶及几丁质酶，用不同类型的酶组分进行抑菌安验，结 累显示，只有l 类葡聚糖酶与几丁矮酶具蠢协网臻用，i i 类甍聚耱酶不其 体外活性，餐滔与i 类几丁质酶结合詹，帮表现出建的撺菌活性。= 者 可童接破坏真麓顶端生长平衡越被广泛嗣子披物抗真麓痍萋醒王穰中，律 外撺蓠实骏已经证鹱，这礴种酶丽时俸用于真菌时，其有徽强的协同效应 f 鲴 6 7 1 9 0 t 。王益& f l s l 通过构建蒸因缀文痒，觚s e r r a t i am a r c e s c e n s 稻 b c i m u l a n s 串分掰宠隧了3 s k b 翦危t 质酶萃珏4 o k b 静$ ，3 - 麓聚耱酶戆 编码綦因，将搿个基因瀚辩与努棱藏粒p r p 2 2 涟按，转椽大瑟榉蘩j m t 0 9 ， 褥戮翦阳犍壳隧予兼纂骞这两释酶静活性，转铯鬟b s u b t i l i s b - 9 0 8 孛，生 物测建，双价蕊因静溅合辩液滋单一跳黪液镬熊蘩丝散果好，浆滚鼹燮之 楚，菌缝一般技毁灭瞧漓解簿，曩露寤弓：二者煞癸露佟焉，不仅撬癍深囊 萤瓣懿錾扩大，露且拨真藿熬能力太大