（应用化学专业论文）蔗糖亚硒酸酯的合成及其生物活性研究.pdf

硕士学位论文 m a s t e r st t e s i s 中文摘要 硒对许多疾病都有防治作用，近年来对各种硒多糖的合成及其生物活性研究已 经较为深入，但将蔗糖与硒有机结合成蔗糖亚硒酸酯方面的研究还未见文献报道。 以蔗糖和硒为原料合成的蔗糖亚硒酸酯，不但把无机硒转化成了有机硒，而且其化 学结构也形成了特殊的硒氧键。同时蔗糖亚硒酸酯不仅可以抑制癌细胞的生长，而 且其生物活性和硒在生物体的吸收和利用也普遍高于无机硒亚硒酸钠。目前，国内 外各种市售的有机硒的营养强化剂和含硒抗癌药物的含硒量最高不超过1 2 ，而本 文设计合成出的蔗糖亚硒酸酯具有极高的含硒量，其含硒量超过2 0 ，又由于硒元 素本身具有良好的生物活性，所以高含硒量的蔗糖亚硒酸酯理应具有非常好的生物 活性。本文对蔗糖酯的合成，以及近年来硒化合物的研究进展和硒的生理代谢进行 了综述。主要研究内容如下： 1 、合成了二糖的有机硒化合物，即蔗糖亚硒酸酯，并用紫外分光光度法对其 进行了含硒量测试，其含硒量高达2 1 3 。 2 、对蔗糖亚硒酸酯的结构进行了红外光谱和紫外光谱的表征和分析，并对其 稳定性进行了研究，初步推断了蔗糖亚硒酸酯硒氧键的连接方式。 3 、用m t t 比色法对蔗糖亚硒酸酯进行了抗肿瘤活性的广谱性研究，发现蔗糖 亚硒酸酯对不同的癌细胞均具有良好的抑制作用。并且用l o g i t 法计算了蔗糖亚 硒酸酯对不同癌细胞的半抑制浓度( i c 5 0 ) ，同时探讨了其作用于癌细胞的时效性和 量效性的关系。 4 、通过m t t 比色法和细胞形态学观察法详细地对蔗糖亚硒酸酯样品进行了人 类宫颈癌细胞( 简称h e l a 细胞) 的生物活性研究。 5 、采用a m e s 试验方法，用t a 9 8 菌株对蔗糖亚硒酸酯进行了抗诱变测试，当 蔗糖亚硒酸酯的浓度达到5 0 0p , g d i s h 时，其抑制率高达9 7 4 。 6 、对蔗糖亚硒酸酯进行了急毒性测试和硒元素的动物吸收实验，发现与无机 硒化合物亚硒酸钠比较，其急性毒性远远小于亚硒酸钠，且其硒元素更易被动物吸 收。 以上研究表明，蔗糖亚硒酸酯作为营养强化剂和含硒抗癌药物具有优良的开发 前景。 关键词：蔗糖亚硒酸酯；抗肿瘤活性；细胞凋亡；抗诱变性；m t t 比色法 a b s t r a c t s e l e n i u mi sp r e v e n t i n ga g e n tf o rm a n yd i s e a s e s 1 1 1 er e s e a r c ha b o u tt h eb i o a c t i v i t i e s o fs e l e n i u mh a sb e e np e r f o r m e dd e e p l y b u ti ts t i l ls t a y sa tt h ep r i m a r ys t a g ei nt h ew o r l d t oc o m b i n et h es u c r o s ea n ds e l e n i u l ni n t os u c r o s es e l e n i t e t h es u c r o s es e l e n i t e t r a n s f o r m si n o r g a n i cs e l e n i u mt oo r g a n o s e l e n i u ma n di t sm o l e c u l es t r u c t u r eh a st h e s e l e n i t eg r o u p 1 1 1 es p e c i f i cc o n f i g u r a t i o nc a nr e s t r a i nt h eg r o w t ho fc a n c e rc e l l t h e b i o l o g i ca c t i o no fs u c r o s es e l e n i t ei sh y p e rt h a nt h es o d i u ms e l e n i t e a n dt h es e l e n i u mo f s u c r o s es e l e n i t ec a nb ee a s ya b s o r b e da n du s e db yo r g a n i s m n o w a d a y s ，t h eh i g h e s t s e l e n i u mc o n t e n to ft h eo r g a n o s e l e n i u ma sr i c hs e l e n i u mn u t r i m e n ta n da n t i c a n c e rd r u g s w h i c ha r es o l di nt h ew o r l di s1 2 i nt h i sa r t i c l e ，t h es e l e n i u mc o n t e n to fs u c r o s e s e l e n i t ei sm o r et h a n2 0 a n dg o o db i o l o g i ca c t i v i t yo fs e l e n i u ms h o w si nm a n y r e s p e c t s t h e r e f o r es u c r o s es e l e n i t eo ft h eh i g hs e l e n i u mc o n t e n ti se x c e l l e n ti nb i o l o g i c a c t i v i t y t h i sa r t i c l es u m m a r i z e ss e p a r a t i o n , p u r i f i c a t i o n , i d e n t i f i c a t i o na n db i o l o g i c a c t i v i t yo fs e l e n i u mp o l y s a c c h a r i d e 乃em a i nr e s e a r c hc o n t e n t sa n dc o n c l u s i o n sa r ea s f o l l o w s ： 1 w es y n t h e s i z e ds u c r o s es e l e n i ta n dd e t e r m i n e di t ss e l e n i u mc o n t e n ta c c u r a t e l yb y u v s p e c t r o p h o t o m e t r y a n dt h es e l e n i u mc o n t e n ti s2 1 3 2 t h es t r u c t u r eo fs u c r o s es e l e n i t ew a sc h a r a c t e r i z e da n da n a l y z e db yf o u r i e r i n f r a r e ds p e c t r o p h o t o m e t r ya n du vs p e c t r u m a n dw em a d et h es t a b i l i t ys t u d yo f s u c r o s es e l e n i t e p r e l i m i n a r yd e m o n s t r a t i o ns h o w e di t sm o l e c u l e s t r u c t u r eh a dt h e s e l e n i t eg r o u p 3 w es t u d i e dt h ea n t i t u m o rb i o a c t i v i t yo fs u c r o s es e l e n i t eo nm a n yk i n d so fc a n c e r c e l l s s u c r o s es e l e n i t es h o w e dav a l u a b l eb r o a ds p e c t r u mo fa n t i t u m o rb i o a c t i v i t yi n h u m a n s i c 5 0w a sc a l c u l a t e db yl o g i tm e t h o da n dt h ee f f e c to ft i m e l i n e s sa n dd o s eo f s u c r o s es e l e n i t ew a sd i s c u s s e do nv a r i o u sk i n d so fc a n c e rc e l l s 4 t h ea n t i t u m o rb i o a c t i v i t yo fs u c r o s es e l e n i t ew a ss t u d i e do nh e l ac e l l sb yu s i n g m t ta n dc e l lm o r p h o l o g y 5 t h es u c r o s es e l e n i t ee x h i b i t e de x c e l l e n ta n t i m u t a g e n i cb i o a c t i v i t yb ya m e s t e s t s a n di t si n h i b i t i o nr a t ew a s9 7 4 w h e ni t sc o n c e n t r a t i o nw a s5 0 0 腭d i s h 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 6 i na d d i t i o n , w eh a daf e wl i v i n ga n i m a le x p e r i m e n t st os u c r o s es e l e n i t e ，s u c ha s a n i m a ln u t r i t i o nt e s t sa n da c u t e t o x i c i t yt e s t s a n dt h er e s u l t ss h o w e dt h a ts u c r o s e s e l e n i t eh a dt h el o w e ra c u t e t o x i c i t yt h a ns o d i u ms e l e n i t ea n dt h es e l e n i u mo fs u c r o s e s e l e n i t ec o u l db ee a s i e ra b s o r b e da n du s e db yo r g a n i s mt h a ns o d i u ms e l e n i t e t h e r e f o r e ，t h er e s u l t ss h o ws u c r o s es e l e n i t eh a sag o o df u t u r ep r o s p e c ta sak i n do f r i c hs e l e n i u mn u t r i m e n to ra n t i c a n c e rd r u g s k e yw o r d s ：s u c r o s es e l e n i t e ；a n t i t u m o r ；a p o p t o s i s ；a n t i m u t a g e n i c ；m t t 华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所瞿交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作所取得的研 究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过 的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法 律结果由本人承担。 作者签名：自晶帆硼月眵日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权华中师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同意华中 师范大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 作者签名：自占日 慨p 州月甲日 导师签名： 鸯酋f ) 日期：y d 厂年厂月甲日 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的学位论文 日 可按“章程”中的规定享受相关权益。 导师戥御 日期功f “尹日 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 第一章文献综述 1 1 蔗糖的来源及其研究现状 蔗糖是光合作用的主要产物，广泛分布于植物体内，是自然界中广泛存在的糖 类，它是一种可循环可再生的绿色资源，也是世界上产量最大的有机化合物产品之 一，其年产量在天然有机制品中居首位l lj ，并且蔗糖工业也是世界上规模最大的天 然有机化学工业之_ _ 1 2 1 。同时，由于世界上蔗糖产量逐年递增，且各种高甜度的甜 味剂迅猛发展，国际蔗糖市场早已饱和并有大量剩余，这为蔗糖衍生物的研究打下 了坚实的基础p j 。 蔗糖分子中有8 个羟基，化学性质活泼，能与多种化合物发生各种不同类型的 反应，对于同一种取代基，其衍生物的分子结构就有2 5 5 种理论可能性 4 1 ，因此以 蔗糖为原料，通过各种不同的化学反应可以制备出大量的中问体和最终产品，创造 出良好的经济价值【5 】。 美国砂糖研究基金会主席、化学革新家h a s s 博士于1 9 5 2 年首先提出“蔗糖化 学”( s u c r o c h e m i s t r y ) 这一概念，简略地说就是研究蔗糖的相关产品、相关反应、 相关反应规律及相关的制备途径和方法的科学称为蔗糖化学【6 j 。近几十年来，由于 蔗糖来源广泛、纯度高、廉价易得、生物降解安全、可再生和对环境无污染等诸多 优点，国内外深入研究并开发了大量的蔗糖相关产品，其产品被广泛用于表面活性 剂【7 1 、聚合物8 1 和医药【9 】等领域。 1 2 蔗糖的性质与结构及蔗糖酯的合成方法 1 2 1 蔗糖的性质与结构 纯净的蔗糖是无色或白色晶体，熔点为1 8 2 1 8 3 ，易溶于水。蔗糖不溶于无 水乙醇、苯、二氯甲烷和甲苯等有机溶剂，能溶于n ，n 二甲基甲酰胺、吡啶和二 甲基亚砜，这三种有机溶剂是制备蔗糖衍生物时常用的溶剂。 蔗糖水解后得到一分子d 一葡萄糖和一分子d 一果糖，所以，它是由一分子葡萄 糖和一分子果糖分子问失水后，通过分子内糖苷键形成的一种非还原性二糖。蔗糖 分子中无游离醛基、羰基和苷羟基，没有变旋现象，因而不能还原t o l l e n s 或f e h l i n g 试剂。蔗糖的分子结构式如图1 1 所示： 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s h 图1 1 蔗糖的分子结构式 o h 1 2 2 蔗糖上羟基的活性研究 从2 0 世纪7 0 年代至2 0 世纪9 0 年代，英国科学家l e s l i eh o u g h 及其课题组成 员经过对蔗糖化学反应的大量实验和研究，于1 9 9 1 年提出蔗糖上八个羟基的活性 顺序大致为6 、6 4 l 2 、3 、3 、4 【1 们。 1 2 3 蔗糖酯的合成方法 自从1 8 8 0 年h e x z f i e l d 在实验室成功地合成蔗糖八醋酸酯以来，蔗糖酯的合成 路线随着人们对蔗糖酯要求的提高而不断改进。蔗糖酯的合成方法有多种分类法， 按反应方式分类，可分为：酰氯法、酯交换法和直接脱水法等。 1 2 3 1 酰氯酯化法 酰氯酯化法是指在催化剂存在的条件下，蔗糖和酰氯发生反应生成蔗糖酯，反 应方程式如下： h o h h o h h 目前，酰氯酯化法主要是使蔗糖和酰氯在含氮的有机溶剂中，如d m f 、氮杂 苯、喹啉或吡啶中，发生酯化反应生成蔗糖酯【m 1 2 1 。 2 硕士学位论丈 m a s t e r st h e s i s 1 2 3 2 酯交换法 酯交换法是指蔗糖和脂肪酸酯在催化剂存在的条件下，发生酯交换反应生成 蔗糖酯，反应程式如下： h + r c o o c h 3j ! 生一 o h o h + c h a o h 1 2 3 3 直接脱水法 直接脱水法是使蔗糖与羧酸直接反应，以强酸( 对甲苯磺酸) 为催化剂，极性 非质子有机溶剂d m f 为溶剂，脱水生成蔗糖酯，反应方程式如下： h + r c o o h o h 1 3 硒的研究与应用进展 o h + h z o 硒是动物和人体所必需的微量元素之一【1 4 。1 5 1 。瑞典化学家b e r z e l i u s 于1817 年 首先发现硒元素，并将其命名为硒( s e l e n i u m ) ，但在之后的1 0 0 多年时间里，由于 硒有剧毒，使得硒的研究进展一直十分缓慢【l6 1 。直到1 9 7 1 年才由r o f r u e k 的研究证 明了硒是g s h p x 的组成物质和维持酶活性的重要成分，这也是生物化学和生物医 学史上的一个重要里程碑。从此，各国对硒的研究力度加大，随着对硒的深入研究， 发现缺硒会导致人的多种疾病发生，并且大量的研究表明，硒元素具有清除自由基、 提高人体免疫功能、拮抗金属中毒、抗癌和防衰老等多种作用【l 。 硒在自然界中的存在形式分为无机硒与有机硒两种，与无机硒化合物相比，有 机硒化合物具有毒性低、生物吸收性好、生物利用率高和抗肿瘤活性强等特点【1 3 。2 0 】， 能更好的发挥硒的作用。美国科学家k a r a m 等研究发现，人工合成的有机硒化合 物要比无机硒化合物及天然硒化合物抗肿瘤活性更强和毒性更低【2 。 3 硕士学位论丈 m a s t e r st h e s i s 1 3 1 硒与抗氧化作用 由m r n a 上的三联密码子u g a 编码硒半胱氨酸掺入的蛋白质，称为“硒蛋白 ， 且人们已经发现的硒蛋白中，大多数硒蛋白都是生物体内重要的功能酶 2 2 彩】，同时 硒还是许多抗氧化酶的重要组分，特别是谷胱甘肽过氧化物酶( g s h p x ) 的必需组 分和催化中心。 谷胱甘肽过氧化物酶的主要生理作用是作为体内一种重要的抗氧化剂，清除生 物体内的自由基，清洁和净化生物体内环境污染，其有还原型和氧化型两种形式， 硒与其结合，能极大的加强谷胱甘肽过氧化物酶的抗氧化作用，保护细胞和组织不 受过氧化物的危害，充分的发挥它们各自的生理功能【2 4 】。研究表明，在一定的范围 内g s h p x 的活性与硒摄入量呈正相关，因此，补硒可增加g s h p x 的活力和提高 其抗氧化能力【2 5 】。 另外，维生素c 也是一种重要的抗氧化剂，在生物体内，可与硒协同。正常机 体中硒的吸收量、体内维生素e 的含量以及它们的代谢之问的作用相互影响、相互 协调，以维护机体内两者的相对平衡。许多研究表明，硒可与维生素e 在抗氧化作 用过程中相互补充，相互加强，增强了体内的整体抗氧化能力【2 砚7 1 。 1 3 2 硒与抗肿瘤作用 硒是一种可增强生物体内免疫功能和抑制肿瘤细胞的微量元素，在肿瘤防治方 面的作用已经被广泛研究幽- 2 9 1 。国内外大量研究已表明，硒对许多癌症有非常好的 抑制作用，特别是对肺癌、肝癌、前列腺癌和乳腺癌等的疗效已经被实验所证实。 1 3 3 硒与抗金属中毒的作用 工业上铅和汞的大量使用使环境汞污染日趋加重，人们对铅和汞中毒的研究也 日益增多，大量试验已证实硒具有拮抗铅和汞的作用。梁英【3 0 】通过给大鼠补硒前后 铅、汞含量的变化，证明了补硒可降低大鼠各组织中的铅、汞的含量以及减少它们 在体内的蓄积，并且实验数据表明有机硒的抗金属中毒的效果明显好于无机硒化合 物亚硒酸钠。 1 3 4 人体硒需要量的补充 1 9 8 0 年美国国家研究委员会膳食供给委员会制订了第一个膳食硒标准。中国膳 食硒调查，提出每天最小的膳食硒需要量，即中国男性和女性每天分别需要9l a g 和1 3l a g 的硒就能预防克山病的发生，而最大安全膳食硒摄入量为4 0 0l a g d a y l 3 1 1 。 4 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 1 3 5 有机硒化合物中硒含量的测定 常用的硒含量的测定方法有：原子吸收分光光度法【3 2 1 、电感耦合等离子体原子 发射光谱法【3 3 1 、荧光法0 4 1 、极谱法阅和紫外分光光度法【3 6 1 等。 1 3 6 富硒食品的开发现状 硒是人体生理中所必需的微量元素之一，缺硒会导致多种疾病，因此为满足硒 营养的需要，国内外在富硒食品的开发中做了大量卓有成效的工作。目前，国内外 已开发使用的有机硒营养剂有：硒蛋氨酸、富硒酵母 3 7 1 、富硒茶【3 羽、富硒大米【3 9 】、 富硒麦芽 4 0 1 、富硒藻类【4 1 1 和富硒蛋 4 2 1 。 1 3 7 硒化合物的毒性 硒在生物体内的生理功能之一是作为体内自由基的清除剂并防止体内氧化损 伤 4 3 1 ，但在不同的浓度和条件下，硒化合物一方面能清除自由基，另一方面能产生 自由基。在硒浓度较低时，主要倾向可能以清除自由基为主，有益于健康；而在硒 浓度较高时，则以产生自由基为主，导致毒性作用，有害于健康。在毒性方面，有 机硒化合物与无机硒化合物相比，毒性大大降低，甚至部分有机硒化合物无急性毒 性 4 4 1 。 1 3 8 硒多糖的来源 天然的硒多糖一般存在于微生物和高等植物中，含量较低，同时硒在硒多糖中 的存在形式可能有r l s e 0 2 r e 和一s e l l 两种，其中前者同时含有硒氧单键和硒氧双键。 1 3 8 1 天然植物硒多糖 在富硒的环境下，植物可以通过特殊的代谢途径利用环境中的无机硒合成天然 有机硒，例如我国最大的高硒区湖北恩施地区的一些常见多糖类植物中的硒多糖含 量明显高于其它地区的同种植物【4 5 1 。 1 3 8 2 微生物富集硒多糖 通过微生物的生长代谢，在含有无机硒的真菌、藻类或细菌等的培养基中，对 硒进行富集和生物转化，从而获得硒多糖。 1 3 8 3 人工合成硒多糖 人工合成硒多糖主要有以下3 种方式：一是对多糖用单体硒或亚硒酸等进行修 饰 4 6 1 ；二是利用化学性质活泼和具有酰氯结构的硒化试剂和各种不同的多糖来合 成；三是将含硒的功能基团接枝到不同种类的多糖分子上【4 7 1 。 5 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 1 4 硒的生理代谢 目前，许多学者对硒的抗癌机理进行了广泛的研究，并提出了各种理论和假设， 主要有以下几种机n - 提高机体免疫力、改变致癌物质的代谢、基因调节机制、蛋 白激酶c 途径、诱导癌细胞分化、诱发细胞凋亡和降低致癌物质的诱变性等等。 研究表明，小分子硒化合物( 如n a e s e 0 3 ) 进入人体后，代谢中由m r n a 上的 三联密码子u g a 编码成第2 1 个氨基酸硒代半胱氨酸掺入蛋白质【4 8 】而发挥其生 物功能 4 9 1 。大量的实验室研究、流行病学调查和人群干预实验显示，硒具有防癌抑 癌作用5 0 1 ，并且诱导癌细胞凋亡是硒发挥防癌抑癌作用的重要途径之一【5 1 1 。 1 4 1 硒阻断癌细胞分裂增殖的信息传递p k c 途径 蛋白激酶c ( p k c ) 是蛋白质磷酸化关键酶，它在膜信息传导变异，细胞调节 和肿瘤发生中起重要作用，并且肿瘤组织中的p k c 活性显著高于相应的正常组织。 国内外的研究表明，硒化合物如亚硒酸钠、二氧化硒和硒酸盐可抑制p k c 催化的 内源性蛋白质的磷酸化作用。硒通过影响p k c 活性而影响到蛋白质的磷酸化和膜 的功能，由此抑制肿瘤的生长繁殖【5 2 】。 1 4 2 硒化合物与细胞凋亡 细胞凋亡与人体疾病的发生和预防关系密切。肿瘤在组织中发生时，细胞增殖 的速度超过了细胞由凋亡导致的消亡的速度，从而破坏了正常组织的平衡。硒能抑 制致癌物的作用，是由于硒化合物能降低细胞增殖的速度或增加细胞凋亡的速度或 两者兼而有之，因此筛选低毒高效的硒化合物是学者们致力探索的课题。1 9 9 8 年 i p 5 3 。5 4 1 综述了多种含硒化合物，发现它们既能抑制细胞增殖同时又能诱导细胞凋亡。 目前，由于有机硒化合物疗效显著，且毒性较无机硒要低得多，而一直备受关 注。崔侨【5 5 】通过生物转化将硒富集到灵芝菌丝体中，分离纯化得到灵芝硒多糖， 并通过m t t 比色法、凋亡的形态学观察、细胞形态学观察和流式细胞仪等多种方 法对细胞凋亡进行了充分的研究，研究结果表明，灵芝硒多糖s e g l p 一2 b 和 s e g l p 3 b 可以诱导k 5 6 2 细胞凋亡。 1 4 3 细胞凋亡简介及其检测 细胞凋亡是一种主动的由基因决定的细胞自我破坏的过程。细胞凋亡过程中， 细胞膜反折，包裹断裂的染色质片段或细胞器，然后逐渐分离，形成众多的凋亡小 体。 6 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 细胞凋亡的发生过程，在形态学上可分为三个阶段：第一阶段，凋亡的起始。 此阶段形态学变化表现为细胞表面的特化结构，如微绒毛的消失等。但细胞膜依然 完整，未失去选择透性。细胞质中，线粒体大体完整，但核糖体逐渐从内质网上脱 落。染色质固缩，形成新月形帽状结构等形态，沿着核膜分布。这一阶段经历数分 钟，然后进入第二阶段。第二阶段，凋亡小体的形成。首先，核染色质断裂为大小 不等的片段，与某些细胞器和线粒体一起聚集，为反折的细胞膜所包围。从外观上 看，细胞表面产生了许多泡状或芽状突起。之后，逐渐分隔，形成单个的凋亡小体。 第三阶段，凋亡小体逐渐为邻近的细胞所吞噬并消化【5 6 。 细胞凋亡的检测是基于凋亡细胞所形成的形态学和生物化学特征而进行的，譬 如形态学观测、d n a 电泳和流式细胞分析等。 1 5 课题的提出 本文研究的主旨是在确定蔗糖亚硒酸酯的最优化的合成工艺条件的基础上，将 其进一步分离纯化，通过各种分析手段判断了硒和蔗糖的结合方式，并对蔗糖亚硒 酸酯的生物活性进行研究，为蔗糖亚硒酸酯的开发利用提供科学依据。 从初步的研究检测情况来看，本论文的研究意义在于以下三个方面： 一是理论研究方面，利用平行对照实验确定硒多糖合适的合成工艺，利用经典 方法分离纯化得到蔗糖亚硒酸酯，利用现代理论分析技术研究了蔗糖亚硒酸酯的结 构和特性，并且该工艺简单，成本低廉。二是本文设计合成出的蔗糖亚硒酸酯具有 极高的含硒量，其含硒量超过2 0 ，又由于硒元素本身具有良好的生物活性，所以 高含硒量的蔗糖亚硒酸酯理应具有非常好的生物活性。三是实际应用方面，充分对 蔗糖亚硒酸酯的抗肿瘤活性的广谱性进行了研究，并研究了蔗糖亚硒酸酯抗诱变 性、急性毒性和硒元素的动物吸收性。在科学研究的基础上为开发蔗糖硒酸酯类药 品和保健品提供科学依据，使我国蔗糖和硒的原料转化为产品，从而使资源优势转 化为经济优势。因此，蔗糖亚硒酸酯作为营养强化剂和含硒抗癌药物具有非常优良 的开发前景。 本文的创新点：一、选用的原料是低聚糖中价格低廉和纯度高的蔗糖，且其生 物相容性好、具有生物可降解性和无毒等优势。二、首次对蔗糖亚硒酸酯进行了合 成、分离纯化和生物活性研究，填补了国内外低聚糖亚硒酸酯抗肿瘤和抗诱变研究 的空白。三、对蔗糖亚硒酸酯进行了急性毒性和动物营养吸收性做了研究，为其进 一步成为营养强化剂或抗癌药物打下了坚实的基础。 7 硕士学位论丈 m a s t e r st h e s i s 第二章蔗糖亚硒酸酯的合成及结构表征 2 1 试剂与仪器 2 1 1 实验仪器 d f 一1 0 1 s 集热式恒温加热磁力搅拌器( 巩义市予华仪器有限责任公司) 予华牌循环水真空泵s h z d ( ) ( 巩义市予华仪器有限责任公司) 1 0 1 a b 型电热鼓风干燥箱( 天津市泰斯特仪器有限公司) 超声波清洗机s b 5 2 0 0 d t ( 宁波心意生物科技有限公司) 冷冻干燥机f d 一1 d 一8 0 ( 北京博弈康实验仪器有限公司) 2 x z 一4 型旋片式真空泵( 4 升秒) ( 浙江黄岩天龙真空泵厂制造) 管式电阻炉s k 2 3 4 1 0 a ( 湖北英山县建立电炉制造有限公司) e y e l a 旋转蒸发仪n 。1 0 0 1 型系列( 上海爱朗仪器有限公司) 傅立叶红外光谱仪( p e r k i n - e l m e rs p e c t r u m 一2 0 0 0 ，k b r 压片) d z f 一6 0 5 0 型真空干燥箱( 上海一恒科技有限公司) 电子分析天平( 赛多利斯科学仪器有限公司) 紫外可见分光光度仪光谱仪( u v _ 31 0 0 型) 玻璃仪器气流烘干器( 长城科工贸有限公司) i k a c m a gh s 7 磁力搅拌器( 德国) 高速离心机t g l 一1 6 c 恒温摇床z h w y - 1 0 3 b s c o u ts e 系列电子天平 2 1 2 实验试剂 蔗糖，高氯酸，硝酸，亚硒酸钠，邻苯二胺，无水吡啶( 分析纯，国药集团) 甲醇，乙醇，甲苯，盐酸( 分析纯，上海振兴化工一厂) 硒化试剂( 自制) 8 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 2 2 蔗糖亚硒酸酯的合成及其分离纯化 2 2 1 蔗糖亚硒酸酯的合成 将蔗糖在吡啶中分散得到蔗糖吡啶混合物。同时将自制的硒化试剂在吡啶中分 散，分散完毕后，倒入蔗糖吡啶的混合物中反应1 2 2 4h ，得蔗糖亚硒酸酯粗产品【5 7 1 。 2 2 2 蔗糖亚硒酸酯的分离纯化 将粗产品离心，得沉淀，用甲苯洗涤沉淀，然后离心，重复操作两次，产品用 少量水溶解，加入氢氧化钠水溶液调节p h 值，调好后旋蒸至一定体积，4 倍量的 乙醇沉淀，离心，得沉淀，水洗醇沉该沉淀两次，冻干，得蔗糖亚硒酸酯的最终产 品【5 8 1 。 2 3 紫外分光光度法测定蔗糖亚硒酸酯中硒的含量 2 3 1 实验方法 在酸性条件下，硒与邻苯二胺形成黄色络合物【5 9 。6 1 1 。 婶。+ q ：芝一味： e 。 准确移取lm g l 的硒标准溶液0 5m l 置于1 0 0m l 容量瓶中，加入三次蒸馏 水5 0m l ，用1m o l l 盐酸调节p h 值到2 ，再加入2m l1 的邻苯二胺溶液，摇匀， 避光静置5 0m i n ，加三次蒸馏水定容至1 0 0m l 。将上述溶液加入到盛有2 0m l 甲 苯的2 5 0m l 分液漏斗中，充分振荡，静置分液，取上层溶液，加甲苯定容于2 5m l 的容量瓶中。用石英比色皿，以甲苯为参比，在2 0 0 8 0 0n n l 波长范围内做紫外光谱 扫描，在九= 3 3 2n l n 处有最大吸收波长。 2 3 2 校准曲线的绘制 分别准确移取1m g l 硒标准溶液0 0 、1 0 、2 0 、3 0 、4 0 、5 0m l 于6 个1 0 0m l 容量瓶中，分别依次加入三次蒸馏水5 0m l ，用1m o l l 盐酸调节p h 值到2 ，再加 入2m l1 的邻苯二胺溶液，摇匀，避光静置5 0m i n ，加三次蒸馏水定容至1 0 0m l 。 将上述溶液加入到盛有2 0m l 甲苯的2 5 0m l 分液漏斗中，充分振荡，静置分液， 取上层溶液，加甲苯定容于2 5m l 的容量瓶中。用石英比色皿，以未加硒标准溶液 9 硕士学位论丈 m a s t e r st h e s i s 的甲苯萃取液为参比，在九= 3 3 2n n l 处，测得相应吸光度a 值，并作s e 浓度与吸 光度a 的标准曲线如下图2 1 所示，标准曲线方程为： y = 0 1 3 7 7 x 一0 0 0 1 7 ( r 2 = 0 9 9 9 ) ， 式( 2 - 1 ) 0 0 00 5 01 0 01 5 02 0 02 5 0 图2 1 硒标准曲线 2 3 3 样品分析 准确称量0 0 2 3 3g 蔗糖亚硒酸酯样品，于1 0 0m l 容量瓶中，加三次蒸馏水定 容至刻度，再从中移取1m l 蔗糖亚硒酸酯样品于1 0 0m l 容量瓶中，加入三次蒸馏 水5 0m l ，用lm o l l 盐酸调节p h 值到2 ，再加入2m ll 的邻苯二胺溶液，摇匀， 避光静置5 0m i n ，加三次蒸馏水定容至1 0 0m l 。将上述溶液加入到盛有2 0m l 甲 苯的2 5 0m l 分液漏斗中，并充分振荡，静置分液，取上层溶液，加甲苯定容于2 5m l 容量瓶中。用石英比色皿，以未加硒标准溶液的甲苯萃取液为参比，在九= 3 3 2n l l l 处，测得相应吸光度a 值，根据已校正的标准曲线对比求出蔗糖亚硒酸酯的含硒量。 2 3 4 紫外分光光度法测定硒含量的结果分析 蔗糖亚硒酸酯样品硒含量按式2 2 计算： 样品中的硒含量( m g g ) = c v w 1 0 0 ， 式( 2 2 ) 式中：c ，标准曲线上查得的样品浓度( m g l ) v ，蔗糖亚硒酸酯样品定容后的体积( l ) 1 0 0 5 o 5 o 5 o 3 2 2 1 1 o o o o 0 o o o 0 一o一皿 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s w ，称取的样品质量( g ) 以未加样品的甲苯萃取液为空白，在九= 3 3 2n l t l 处测得蔗糖亚硒酸酯的紫外吸 光度a = 0 2 8 0 ，算出含硒量为2 1 3m g g ，即为2 1 3 。 2 4 蔗糖亚硒酸酯的结构表征与分析 2 4 1 紫外光谱的测定 配制1 的蔗糖亚硒酸酯、蔗糖、及亚硒酸钠水溶液，均呈透明液体状。以蒸 馏水为空白，在1 9 0 1 1 0 01 1 l l l 范围内扫描测定旧- 6 3 ，如图2 1 所示： 2 。5 赢犯鬟d 毒5 镬n7 鹱鬟玎 l 1 w a v e l e n g t h 细旧 图2 1 蔗糖、蔗糖亚硒酸酯和亚硒酸钠的紫外光谱图 在图2 一l 中，我们把1 水溶液的蔗糖、蔗糖亚硒酸酯和亚硒酸钠的三张紫外 光谱图( 原始谱图见附录) 放在一起对比，发现亚硒酸钠中的s e 0 3 2 - 在2 0 7 2n l n 处 有一个强度为2 5 5 8 的特征吸收峰。从图2 1 中，发现蔗糖无特征峰，而蔗糖亚硒 酸酯却在1 9 7 6n l n 处有一个吸光度为2 4 8 6 的很明显的吸收峰，这说明蔗糖经硒化 后结构上发生了变化，且在蔗糖亚硒酸酯的结构中存在亚硒酸酯基团。 o 5 o 5 2 1 1 o ssm譬俘霉口*qv 硕士学位论丈 m a s t e r st h e s i s 2 4 2 红外光谱的测定 将蔗糖、亚硒酸钠、蔗糖亚硒酸酯3 种样品烘干，与k b r 研磨压片后在4 0 0 0 2 0 0 c m - 1 范围内扫描测定 6 4 1 ，如下图2 2 所示： 3 0 0 02 0 0 0 1 0 0 0 w a v e n t m b e 瑙( c m - 1 ) 图2 2 蔗糖、蔗糖亚硒酸酯和亚硒酸钠的红外光谱图 在图2 2 中，我们把蔗糖、蔗糖亚硒酸酯和亚硒酸钠的三张红外光谱图( 原始 谱图见附录) 放在一起对比，从亚硒酸钠样品的红外光谱我们可以看到，它的s e 0 3 2 离子在7 8 9c m 1 和7 3 4 c m d 处有两个特征吸收峰( 在图2 2 中以a 加箭头标出) 。以 此来对比蔗糖亚硒酸酯样品，发现蔗糖经过硒化后，在8 1 0c m 。1 和7 4 4c m - 1 附近新 出现了的两个亚硒酸酯特征吸收峰( 在图2 2 中以b 加箭头标出) 。这说明硒化后蔗 糖样品中确实存在亚硒酸酯基团，进一步证实了紫外光谱的判断。同时发现蔗糖和 蔗糖亚硒酸酯除了8 1 0c m - 1 和7 4 4c m 1 附近新出现的两个亚硒酸酯特征吸收峰以 外，它们的红外光谱图上的其它吸收峰基本一致，证明了蔗糖硒化后，其糖环的结 构没有大的改变，基本上还是保持着蔗糖的基本构型，只是其中部分羟基被硒化试 剂所取代，生成了蔗糖亚硒酸酯。 1 2 硕士学位论丈 m a s t e r st h e s i s 2 5 蔗糖亚硒酸酯的稳定性 -呻joa 01 i 僵1 w 砷z = 【w 1 ) 图2 3 蔗糖亚硒酸酯和8 个月后该蔗糖亚硒酸酯的红外光谱图 将已制备的蔗糖亚硒酸酯冷冻干燥，观察其物理性质为白色固体，易溶于水， 溶于水后成无色透明状水溶液，测其硒含量为2 1 3 ，并作红外光谱图( 原始谱图 见附图7 ) ，在8 1 0c m 1 和7 4 4c m 1 附近新出现了的两个亚硒酸酯特征吸收峰( 在图 2 3 中以b 加箭头标出) ，避光真空保存8 个月。将8 个月时的蔗糖亚硒酸酯与新制 时的蔗糖亚硒酸酯对比，观察其颜色状态仍为白色固体，易溶于水，溶于水后仍为 为无色透明状水溶液，用相同方法测其含硒量，其含硒量也没有发生大的变化，其 含硒量仍为2 1 0 ，然后作其红外光谱图( 原始谱图见附图9 ) ，对比两次谱图，见 图2 3 所示( 原始谱图见附录) ，发现其所有的吸收峰都存在且没有发生明显的位移， 而且在8 0 7c m 。1 和7 4 1c m 1 处仍然有s e 0 3 2 - 的两个特征吸收峰( 在图2 3 中以a 加 箭头标出) ，证明我们所制备合成的样品其稳定性很高，其高含硒量也非常的稳定， 并没有出现样品分解或者含硒量降低的情况。 硕士学位论丈 m a s t e r st he s i s 2 6 本章小结 一、以蔗糖和硒化试剂为原料制备蔗糖亚硒酸酯，并且通过紫外光谱和红外光 谱对其结构进行了初步的表征和分析，推测出蔗糖亚硒酸酯中含有活性基团亚硒酸 酯的结构。 二、通过紫外分光光度法准确测定了蔗糖亚硒酸酯中硒的含量，并且其硒含量 极高，可以稳定在2 1 左右，并且具有很好的重现性。 三、制备出的蔗糖亚硒酸酯，放置8 个月后，再次通过红外光谱的分析和含硒 量的测定，证实了其结构本身以及其含硒量均无明显的变化，说明了蔗糖亚硒酸酯 具有很好的稳定性，为其进一步开发成抗癌药品和保健品提供了理论基础和科学依 据。 1 4 硕士学位论文 m a s t e r st i e s i s 第三章蔗糖亚硒酸酯的生物活性研究 3 1 试剂与仪器 3 1 1 实验试剂 改良型r p m i 一1 6 4 0 培养基( 赛默飞世尔生物化学制品有限公司) 无支原体胎牛血清( g t 州四季青生物工程材料有限公司) 四甲基偶氮唑蓝( d i p h e n y lt e t r a z o l i u mb r o m i d e ，m t t ) ( s i g m a 公司) 吖啶橙( a o ) ( a m r e s c o ) 溴化乙锭( e b ) ( s i g m a 公司) 胰蛋白酶( c s e u w ) 蔗糖亚硒酸酯( 自制) 二甲基亚砜( d m s o ) ，亚硒酸钠( 分析纯，国药集团化学试剂有限公司) 氯化钠，氯化钾，磷酸一氢钠，磷酸二氢钾( 国药集团化学试剂有限公司) 3 1 2 细胞株 宫颈癌细胞系( 以下简称h e l a 细胞) 华中师范大学生科院实验室提供 3 1 3 试剂配置 3 1 3 1 蔗糖 称取蔗糖样品0 0 1 5g ，用p b s 定容于5 0m l ，用1m o l l 的h c l 溶液调节p h 为7 2 ，4 。c 保存。超净台内用注射滤器( o 2 2 岬微孔滤膜) 过滤除菌，使用前用 r p m i 1 6 4 0 液对其稀释。 3 132 蔗糖亚硒酸酯 称取含硒量为2 1 3m g g 的蔗糖亚硒酸酯样品0 0 1 5g ，用p b s 定容于5 0m l ， 用lm o l l 的h c i 溶液调节p h 为7 2 ，4 。c 保存。超净台内用注射滤器( o 2 2b t m 微 孔滤膜) 过滤除菌，使用前用r p m i 1 6 4 0 液对其稀释。 3 133 亚硒酸钠 称取亚硒酸钠0 0 1 5g ，用p b s 定容于5 0m l ，用lm o l l 的h c i 溶液调节p h 为7 2 ，4 c 保存。超净台内用注射滤器( 0 2 2 岬微孔滤膜) 过滤除菌，使用前用 r p m i 一1 6 4 0 液对其稀释。 1 5 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 3 134m t t 溶液( 5m g ，ml ) 配制 称取m t t0 5g ，溶于1 0 0m lp b s 中，o 2 2l a i n 滤膜过滤除菌，分装，_ 2 0 。c 避 光保存( 配制和保存过程中，均要用锡箔纸包住以避光) 。 3 135 胰蛋白酶( o 2 5 。) 配制 称取胰蛋白酶粉末2 5 0m g ，用p b s 定容于1 0 0m l ，搅拌混匀，置于4 。c 过夜。 超净台内用注射滤器( o 2 2 岬微孔滤膜) 过滤除菌，分装，- 2 0 保存。 3 136 磷酸盐缓冲液( 以下简称p b s )