（应用化学专业论文）苹果渣混合秸秆发酵生产牛饲料的研究.pdf

摘要 本文从固体农业废弃物综合利用角度出发，将苹果渣混合秸秆共同发酵 使农业废弃物转化为高质量的牛饲料，其目的在于解决当前长期困扰苹果汁 生产厂无法处理苹果渣的难题，同时满足畜牧业对蛋白质饲料的需求。 实验中分别以粗蛋白含量、真蛋白含量、氨基酸总量为测定指标，通过 正交实验，确定了较优培养基配方：通过单因素实验，研究了苹果渣混合秸 秆共发酵生产饲料蛋白初步放大实验所需的较优反应器、培养基的填充物及 填充物的预处理方法：在遵循逐级放大、逐步摸索、逐步优化的原则下，研 究了填料量、菌种的接种量、料水比分别在盆式反应器、厚层通风反应器中 发酵时对粗蛋白含量的影响，从而确定了放大发酵工艺条件并对其进行了稳 定性研究；研究了分别在盆式反应器和厚层通风反应器中进行固态发酵和液 固态发酵时，比较两种发酵形式的优缺点，选择出更适合苹果渣混合秸秆共 发酵的发酵形式；对部分苹果渣混合秸秆共发酵饲料进行饲料卫生安全检测， 同时进行了小鼠急性经口毒性实验。 结镕 表明：以苹果渣为主要原料，采用放大实验所选择的反应器，经选育菌 种固态和液固态发酵后，产物主要成分发生明显变化，其中粗蛋白、真蛋白、 粗脂肪、灰分含量显著提高，而还原糖和粗纤维则有明显的降低。经1 7 种必 要的氨基酸测定分析，其含量急剧提高且丰富、齐全，营养价值显著增加， 特别是对畜禽生长重要的蛋氨酸，酪氨酸和赖氨酸增加显著。苹果渣发酵饲 料中氟、氰化物、亚硝酸盐、黄曲霉毒素b 。、游离棉酚、重金属含量远远小 于国家标准要求的最低含量，沙门氏菌未检出，苹果渣发酵饲料急性经口毒 性属实际无毒级。因此，苹果渣发酵饲料是一种优质安全的蛋白质饲料。 关键词：苹果渣饲料蛋白发酵反应器工艺条件 a b s t r a c t t h i sd i s s e r t a t i o nw a ss t u d i e dh o w a p p l ep o m a c ea n dc o r ns t a l kw e r et u r n e di n t o h i g hq u a l i t yc a t t l ef e e d s t u f f sw h i c hw a sb a s e do nt h et e c h n o l o g yo ff e r m e n t a t i o n t h ea i mo ft h er e s e a r c hs e t t l e dt h ep r o b l e mt h a tt h ep l a n to fp r o d u c i n gc i d e rc l o u d n o td e a lw i t h a p p l ep o m a c ea n d s u f f i c es t o c k b r e e d i n gt ot h en e e do f p r o t e i n f e e d s t u f f t h ec o n t e n to fc r u d ep r o t e i n ，r e a lp r o t e i na n dt h ea m o u n to fa m i n oa c i dw e r e s e l e c t e da sd e t e r m i n a t i o ns t a n d a r dr ；s p e c t i v e l y , a n dt h es o l i ds t a t ef e r m e n t a t i o n s u b s t r a t eo ff e e d s t u f fp r o t e i np r o d u c t i o nf r o ma p p l ep o m a c ew a ss t u d i e dt h r o e l g ht h e s c i e n c ee x p e r i m e n to fl 母( 3 4 ) a n dt h eo p t i m a ls u b s t r a t ec o m p o s i t i o n t h ee f f e c t so f r e a c t o r , m a t e r i a l sd i s t r i b u t i o na n dd i f f e r e n tp r o c e s s i n gm o d e so nc o r ns t a l kw e r e s t u d i e dd u r i n g p r i m a r ym a g n i f i e de x p e r i m e n t s ；t h ee f f e c t s o fp r o d u c t s c r u d e p r o t e i nc o n t e n to fd i f f e r e n tm e d i u m ，i n o c u l u m sc o n c e n t r a t i o na n dr a t i oo fm a t e r i a l t ow a t e ri nd i f f e r e n tr e a c t o rw e r es t u d i e do np r i n c i p l em a g n i f i c a t i o n g r o p ea n d o p t i m i z a t i o ns t e pb ys t e p ；t h ee f f e c t so fp r o d u c t s c r u d ep r o t e i nc o n t e n to fd i f f e r e n t f e r m e n t a t i o nm e t h o d si nd i f f e r e n tr e a c t o rw e r es t u d i e d ；t h ef e e d i n gs a n i t a t i o n e x p e r i m e n t sa n dt h eu r g e n tt o x i c o l o g i c a le x p e r i m e n t so nm i c e ，w h i c hp r o v i d e dt h e f o u n d a t i o nf o rf u r t h e rs c a l e u pa n da p p l i c a t i o no fa p p l ep o m a c es y n t h e t i c a l l y , w e r e c o n f i r m e du s i n gs o m ep a r to fa p p l ep o m a c ef e r m e n t a t i o nf e e d i n g r e s u l t ss h o wt h a tt h ec o n t e n to fc r u d ep r o t e i n ，r e a lp r o t e i n ，t h ea m o u n to f a m i n oa c i d ，c r u d ef a t ，a n da s hh a di n c r e a s e do b v i o u s l yi nb a s i n t y p er e a c t o ra n d t h i c k - b e d d e da i r i n gr e a c t o rb ym i x e ds t a i ns o l i da n ds o l i d - l i q u i ds t a t ef e r m e n t a t i o n t h ed e g r a d a t i o nr a t i o so fr e d u c t i v es u g a ra n dc r u d ef i b e rw e r eo b v i o u s t h ec o n t e n t o ff l u o r i n e ，g l y c o s i d i ch y d r o c y a n i ca c i d ，n i t r i t e ，a f l a t o x i nb 1 ，f r e eg o s s y p o la n d h e a v ym e t a li nf e e d s t u f fw e r ef a rl e s st h a nn a t i o n a lc r i t e r i o na n ds a l m o n e l l aw a sn o t f o u n di nf e e d s t u f f r e s u l t so fu r g e n te x p e r i m e n t so nm i c eu s i n ga p p l ep o m a c e f e r m e n t a t i o nf e e d s t u f fw e r ei m a o c u o u s c o n s e q u e n t l y ，a p p l ep o m a c ef e r m e n t a t i o n f e e d s t u f fw a sak i n do fs a f ep r o t e i nf e e d s t u f fa n dh a da b u n d a n tt h ec o n t e n to fa m i n o a c i d ，e s p e c i a l l ym e t , t y ra n dl y s w a n g y o n g ( a p p l i e dc h e m i s t r y ) d i r e c t e db yp r o f e s s o rs o n gj i m n g k e y w o r d s - a p p l ep o m a c e ，f e e d s t u f fp r o t e i n ，f e r m e n t a t i o n ，r e a c t o r ，t e c h n o l o g y c o n d i t i o n 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解学校有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻读学位期间 论文工作的知识产权单位属于西北大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构 送交论文的复印件和电子版。本人允许论文被查阅和借阅。学校可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存和汇编本学位论文。同时，本人保证，毕业后结合学位论文研究课题 再撰写的文章一律注明作者单位为西北大学。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名：至重指导教师签名： 2 口吖年占月2 日年月日 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，本论文不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西北大学或其它教育机构的 学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：王勇 j o 口f 年6 月】日 第一章概述 1 1 我国饲料资源的现状 改革开放以来，我国畜牧业持续高速发展，特别是乳业，已经成为我国食 品工业中发展最快、成长最好的产业。从1 9 7 8 1 9 9 8 年的2 0 年间，全国奶类 总产量增长了7 7 倍，年平均递增率为1 1 6 。但与世界发达国家相比，我国的 乳业产值占农业总产值的比重尚不到1 ，乳业发展的空间非常广阔，这将会促 进饲料需求量的不断增加。 据预测，到2 1 世纪3 0 年代我国人口将增长到1 6 亿，届时受土地资源、水 资源、农产品中的饲料资源的限制，人畜对生存环境资源的争夺还将进一步加 剧1 1 j 。饲料正日益成为影响我国农业的重大问题，其中饲料中的蛋白质资源短 缺是全世界面临的重大课题，特别在发展中国家日趋严重。根据世界联合国粮 农组织估计，本世纪初的十几年内人类对蛋白质的需求量每年相差2 亿多吨【2 1 。 为此，各国都在重视加强蛋白质资源的研究。 饲料蛋白又称单细胞蛋白或菌体蛋白，是食品工业和饲料工业的重要蛋白 质来源，对于解决世界蛋白质资源不足方面问题将会发挥重要作用。与传统动、 植物蛋白相比较，饲料蛋白除了蛋白质含量高，营养丰富外，还含有一定量的 活性和非活性有益微生物，在动物体内能起到净化肠道的作用1 3 1 。在国内，随 着养殖业的快速发展，对蛋白饲料的需求越来越大，植物蛋白饲料如饲料粮、 糠麸、豆饼以及饲料草等常规饲料已远不能满足养殖发展的需要。在这种蛋白 饲料资源普遍贫乏的情况下，开发和利用新型饲料资源对国民经济发展具有深 远的现实意义。近几年来，在养殖业发达的西欧，如英国、丹麦、瑞士、法国 等国，由于大量地使用动物蛋白饲料( 肉骨粉) ，疯牛病、“口蹄疫”等动物遗 传型疾病已经危害到养殖业的发展，许多牲畜被屠宰、焚烧，人们对食品安全 问题充满了巨大的恐惧和不安 4 1 。这也再次吸引更多的科研工作者转向新型蛋 白饲料的研究开发，饲料蛋白因为它的种种优势首当其冲。 1 2 我国苹果渣类农业固体废弃物来源 农业固废体弃物是指农业生产、禽畜饲养、农副产品加工以及农村居民生 活活动排出的废物，如植物秸秆、人和禽畜的粪便等。我国是农业大国，随着 农业的发展，各种农业废物不仅种类繁多而且数量巨大。比如，我国年产秸秆 达5 亿吨之多；在我国某些产棉区，当棉花采摘丰收后，大量棉秸就成了无用 之物；而每年被抛弃和做燃料的1 4 0 万吨花生壳资源也有待充分利用。此外还 有木材加工中的术屑约占木材加工量的1 0 ，数量也极为可观【5 _ 6 】。 就陕西省而言，由于我省苹果业的迅猛发展，近年来建成了二十多冬浓缩 果汁生产线，年产苹果浓缩汁超过2 0 万吨，对我省调整农业产业结构，实现农 业现代化，提高农民收入具有重要现实意义。但伴随着苹果汁的生产，苹果渣 成了困扰当地政府和科技工作者的一个环境难题。每到榨汁旺季，苹果渣堆积 如山，严重污染环境。目前普遍采用的方法是将其当作垃圾倾倒，资源浪费严 重。 随着科学技术的进步，人们越来越认识到资源和环境对人类的重要性。农 业固体废弃物潜在的利用价值被人们所认识，这不仅在于其蕴涵着大量的能源 物质，也在于其拥有丰富的农作物所需的营养物质。因此，农业固体废弃物已 不再作为废物为人们所抛弃，更多的是将其作为资源化研究和利用的对象。 1 3 苹果渣的成分1 7 】 苹果渣中果皮和果肉占9 6 2 ，果籽占3 1 ，果梗占0 7 ：其总能值比小 麦麸高，热能也不低；粗蛋白含量比甘薯干高；c a 、p 、微量元素和氨基酸含量 与甘薯干较为接近；粗纤维与啤酒糟、酒糟类接近。粗纤维中除了少量的果壳、 果梗为木质素成分外，果肉、果皮多为半纤维素和纤维素；苹果渣还含有丰富 的维生素和果酸，有利于微生物的直接吸收和利用。根据生产工艺的不同，设 备挤压强度的不同，苹果渣皮的质量也有所不同。但苹果渣常规营养成分分析 的结果及氨基酸、维生素和微量元素的含量可以得知，苹果渣含较为丰富的营 养成分，是一种质量好的饲料资源，有很好的开发利用价值。经过专家分析与 测定，苹果渣中微量元素、氨基酸及总糖含量比果干和鲜果干物质中的含量低。 2 这表明在压榨过程中，营养成分中的可溶部分随汁液流走。一次压榨苹果渣的 营养成分如表1 - 1 所示。若为二次压榨，其粗纤维、粗脂肪含量明显提高。 表1 - 1 苹果湿渣成分含量 t a b 1 - 1t h ec o n t e n to fa p p l ep o m a c e 1 4 饲料蛋白的定义和特点 通常所言的饲料蛋白即单细胞蛋白( s i n g i ec e l lp r o t e i n ，简称s c p ) ，又称 微生物蛋白或菌体蛋白，是利用工业废水、废气、天然气、石油烷烃类农副加 工产品以及有机垃圾等作为培养基，培养酵母、非病源性细菌、微型菌、真菌 等单细胞生物体，然后经过净化干燥处理后制成，是食品工业和饲料工业重要 蛋白质来源。饲料蛋白营养丰富，除蛋白质外，还含有脂肪、碳水化合物、核 酸和无机盐等，维生素含量也十分丰富，而且含有动物机体所必须的各种氨基 酸，特别是植物饲料中缺乏的赖氨酸，蛋氨酸和酪氨酸含量较多，可作为畜禽 的优质蛋白质饲料，是一种具有较高经济价值的饲料资源【8 。 概括起来，饲料蛋白有以下特点：生长速度快，蛋白质含量高；原料来源 丰富，石油、天然气、淀粉、废糖蜜、废酒糟水等均可作原料；生产过程易控 制，可工业化生产，不受气候、土壤和自然灾害的影响，可连续生产，成功率 高：营养功能多，除蛋白质外，还含有丰富的维生素【1 0 。 1 5 苹果渣饲用价值的研究进展 苹果榨汁后的果渣是果汁厂的副产品，主要由果皮、果核和残余的果肉组 成，约占鲜果重的2 5 。我国年产苹果约2 0 0 0 万t ，加工苹果每年排出的苹果 渣达1 0 0 多万t 。目前，除少量苹果渣用于深加工外，绝大部分都未被有效地利 用。由于鲜苹果渣含有较高水分( 约8 0 以上) ，并且含有丰富的单糖、还原糖、 果胶和半纤维素等物质，很容易被微生物利用进而发霉、变质，造成环境的极 大污染和资源的浪费。为了有效利用和开发苹果渣饲料资源，许多科研工作者 进行一些尝试，但往往由于方法不当而达不到合理使用的目的。 虽然苹果渣可开发利用的途径很多，但迄今最有效的途径还是发酵生产高 蛋白饲料，能使苹果渣完全转化而不存在二次排渣再污染环境问题，同时也是 解决饲料短缺问题的重要措施之一。目前，苹果渣作饲料主要有以下几个方向： 鲜饲、苹果渣干粉饲料、苹果渣青贮饲料和苹果渣发酵饲料【1 1 。 鲜饲：鲜苹果渣酸度较大，p h 值3 5 4 8 之间，饲喂前最好用食碱进行碱 中和处理，食碱用量为鲜果渣的0 5 1 o ，以降低酸度，避免酸中毒。鲜苹 果渣含水量较大，能量相对较低，因此，饲用量不宜过大，占日粮的1 ：3 为宜， 主要用于奶牛、奶山羊和肥育猪。由于牲畜对鲜渣拒食，通常是与混合精料拌 在一起饲喂1 1 2 】。在利用鲜苹果渣直接喂猪或在渣内加碱后喂牛和羊时，由于鲜 苹果渣本身营养的不平衡，和榨汁后发生的一系列物理和化学变化，鲜饲并不 能达不到合理使用的目的【1 3 】。 苹果渣干粉饲料：鲜苹果渣加工成苹果渣干粉，可以用作配制全价料或颗 粒料，还可进一步进行膨化处理。其加工工艺流程如下：鲜苹果渣一品质检验 一碱中和处理一机械破碎一千燥处理一粉碎过筛一成品包装。加工所用的湿果 渣，必须新鲜纯净，如果堆放时间过久，便会自然发酵，产生大量有机酸，会 降低其营养价值和适口性，气温高时，还会腐烂变质。加工前对原料进行品质 检验，弃去异物和腐烂变质原料。利用苹果渣于粉配制配( 混) 合饲料或颗粒 饲料，可取代部分玉米和麸皮，适当补充饼粕类蛋白质饲料。根据我国畜禽饲 养水平及其饲料情况，建议苹果渣干粉在配( 混) 合饲料中的配合比例为：仔 猪日粮占3 7 、育肥猪1 0 2 5 、雏鸡日粮占2 4 、育成鸡5 1 0 、 蛋鸡3 5 、牛羊精料补充料中占1 0 2 5 。另外，在牛羊的饲草中还可 再添加部分苹果渣干粉。实验结果表明：用苹果渣千粉取代部分浓缩料喂育肥 猪，结果平均日增重达0 5 5 k g ，每千克增重消耗的饲料比对照组减少o 6 k g ；雏 鸡日粮中添加1 5 3 0 的苹果渣干粉，可提高其增重2 5 2 7 。苹果渣干 粉具有特殊的果香气味，饲喂畜禽时要逐渐提高搭配比例，经过5 7 d 则可习 惯采食。苹果渣原料中如果含籽实较多，则苹果渣干粉在日粮中的配合比例应 适当降低。否则，由于耔实含的单宁较多，影响其适口性和饲喂效果1 1 。 4 苹果渣青贮饲料：青贮方法简单、快捷。鲜苹果渣在青贮时需进行碱中和 处理，通常添加3 5 ( 以干物质计) 石灰，既可中和酸性，又可补钙且降 低成本。如果水分过大可添加1 0 2 0 的草粉和麸皮。通常最好同禾本科草 类、青玉米秸、红薯蔓等混合青贮，鲜苹果渣可占3 0 5 0 。用苹果渣与禽 粪混合青贮也取得了较满意的效果。 将新鲜的苹果渣与2 3 c m 的玉米秸秆混合填八青贮窖内，经过厌氧发酵， 乳酸菌大量繁殖，抑制了霉菌、大肠杆菌等有害菌的繁殖，使青贮饲料具有酸 甜芳香气味，营养丰富，适口性好。青贮饲料内含有有机酸，当喂量适合时， 能促进牛的消化腺分泌，对提高饲料消化率有良好作用，但喂量过多对奶牛也 会产生不利 1 4 l 。此外，青贮需要建造青贮窖且青贮含水量高、干物质少，远距 离运输费用高，作为商品流通受到区域限制【1 5 j 。 苹果渣发酵饲料【“。1 9 】：苹果渣通过微生物发酵生产饲料蛋白是解决蛋白质 来源的重要途径之一。随着畜牧业生产的发展，饲喂牲畜所需的蛋白饲料越来 越缺乏。如何解决饲料蛋白严重缺乏的矛盾已引起人们的高度重视。我国是一 个饲料蛋白严重短缺的大国，每年需从国外进口大量的鱼粉蛋白来缓解供小于 需的矛盾。利用苹果渣发酵生产蛋白饲料不但减少环境污染，而且极大的利用 了宝贵的饲料资源。 苹果渣的无氮浸出物含量较高，其主要成分是可溶性的碳水化合物、果胶、 除脂肪酸以外的有机酸和半纤维素。以苹果渣为主要原料，通过添加合适的氮 源和微量的无机盐类，将适宜混合菌株接种其中，调节菌株所需营养、温度、 湿度、p h 值及其他条件，通过好氧发酵可消除或减少其中的抗营养因子，提高 酸性和中性洗涤纤维的消化率，提高蛋白质、脂肪、氨基酸、肽、维生素、酶 类、核苷酸、有机酸、香味剂及未知生长因子等生物活性物质，从而生产出高 质量的苹果渣发酵饲料。刁其玉等人将有益微生物接种到以苹果渣为主的培养 基中进行有氧和无氧发酵，制成颗粒状苹果渣发酵饲料。由高产奶牛实验表明， 用苹果渣发酵饲料代替等量的甜菜粕或苹果发酵饲料和甜菜粕同时使用，奶牛 分别增产鲜奶1 8 9 k g ；：天头和1 9 0 k g 天头，同时乳脂、乳蛋白质、乳固体 物都有上升的趋势，奶牛发病率明显下降。苹果渣发酵饲料是一种新型的反刍 动物饲料添加物【3 1 。梁建光等人选择4 5 头荷斯坦奶牛，按年龄、胎次、泌乳月、 日产奶量基本一致的原则进行分组逐头配对，分为试验1 组、试验2 组和对照 组，每组1 5 头。经有益微生物发酵和营养强化处理的苹果渣作为实验产品。试 验1 组用苹果渣发酵饲料替代l o 的精料成分饲喂奶牛，试验2 组固定用1 5 k g 颗粒苹果渣发酵饲料替代1 5 k g 精料( 1 k g 麦麸+ 0 5 k g 豆饼) 饲喂奶牛，对照 组用常规配合饲料饲喂，其它饲料和饲养条件一致。总实验天数为5 0 d 。实验结 果表明：试验1 组和试验2 组奶牛丑平均产奶量比对照组高1 6 6 k g 和0 3 4 k g ， 增奶效果显著，乳成分变化不显著。两个试验组牛奶的体细胞数显著低于对照 组。说明经发酵和营养强化处理的苹果渣有提高奶牛产奶量和改善奶牛健康的 作用【1 3 】。 苹果渣发酵饲料是目前开发利用苹果渣的研究热点，当前研究主要集中在 菌种的筛选和发酵工艺条件的选择；通过诱变或基因工程选育出适宜在苹果渣 中生长并且能生产出高质量饲料蛋白工业化所需的混合菌种；发酵培养基的优 化和放大发酵反应器的选择及其放大工艺的确定，在这些方面的研究为今后工 业化生产提供必要的实验数据。 1 6 利用苹果渣混合秸秆制备牛饲料的重要意义 我国是世界上的最大苹果产地，1 9 9 9 年总产量已达2 2 0 1 万吨，比世界总产 量的1 3 还多【2 0 】。由于榨汁等深加工每年排放苹果废渣几百万吨，加上其它果 渣上千万吨，除少量直接利用外，绝大部分因为水分含量高( 8 0 左右) ，蛋白 含量低( 在干基中约6 ) ，没有营养价值，不易保存而被遗弃。特别是水果加 工旺季，渣皮堆积如山，经微生物分解，酸臭难闻，严重污染环境，同时又是 巨大纤维素资源的浪费。 利用生物发酵技术，选育出更适合混合菌种发酵苹果渣，从而得到高质量 的饲料蛋白，发酵后的苹果渣可以代替一部分精饲料如麸皮、玉米粉等，再与 作物秸秆混合即为良好的牛饲料。因此，发酵后的苹果渣营养价值增加，达到 了充分利用资源，减轻环境污染，变废为宝的目的。所生产的饲料蛋白也将部 分地弥补了国内蛋白资源不足的现状，具有良好的社会效益和经济效益【1 。经 生物处理的苹果渣不仅含有动物可利用的粗蛋白、脂肪等，并且含有微生态凋 节剂，这些活性因子进入到反刍动物瘤胃后和瘤胃固有微生物发生协同作用， 调整整个瘤胃微生物的区系达到和谐的程度，提高微生物对饲料的利用，同时 提高了瘤胃微生物蛋白的产量。苹果渣发酵饲料除含活性物质外，还含有大量 有机酸，比如乙酸，丙酸等挥发性脂肪酸，这些物质对于提高奶牛的生产力和 免疫机能有很好的作用【1 3 】。 培养微生物菌体作为蛋白食物来源始于第一次世界大战的德国，但近三十 年来，饲料蛋白的研究和开发才受到各国科技界和工业界的广泛关注。继1 9 6 7 年在美国麻省理工学院举行第一次国际饲料蛋白学术会议以来，迄今为止已召 开过六届国际学术会议，上百家大公司、高校和科研所参与科技开发，极大地 加速了这一领域的发展。同时以食品工业废料和农副产品下脚料及农作物纤维 为主要发酵原料，不仅来源广泛、成本低廉，而且对要求日益严格的环保问题， 也体现出不可估量的价值【2 1 1 。因此，利用现代生物技术，将苹果渣转化为蛋白 饲料，既能解决水果榨汁企业面l j 岛的现实问题，减少环境污染，又充分利用了 资源，为缓解蛋白饲料短缺开辟了一条新途径【2 2 。2 6 】。 1 7 苹果渣发酵饲料的发展趋势 苹果渣作为果汁业的副产品，成本低，营养成分含量丰富，有毒有害物质 含量低，经过深加工可生产出良好的苹果渣发酵饲料，同时又减轻环境污染， 提高养殖业经济效益，具有很大的发展潜力。苹果渣发酵技术集当今国内外饲 料工业领域里高新科技的精华，将果品加工的下脚残渣进行生物工程处理，运 用一套适宜的工艺，制成颗粒饲料产品。苹果渣发酵饲料属节粮、安全饲料， 对我国发展畜牧业、农副产品深加工业和实现农业及科技现代化起到推进作用， 产生显著的社会效益，经济效益和生态效益。今后应集中力量进行以下几个方 面的研究根据季节的不同苹果渣采用不同加工方法的配合使用；发酵法生 产苹果渣发酵饲料所用优良菌种的选择和培育及稳定性研究；工业化生产的 工艺和设备的可行性研究，深加工产品的认证和舰范化；不同动物的适宜添 加量和饲喂效果；扩大和完善苹果渣发酵饲料的生产及推广应用，进一步开 发系列产品和相关产品。 第二章苹果渣混合秸秆共发酵生产饲料蛋白实验步骤 应用发酵技术生产饲料蛋白不仅可以提供大量优质的饲料蛋白源，而且还 能开发出具特殊功能的饲料添加剂，如活性酵母、活性制剂、益生素等微生物 制品。随着畜牧业的发展，饲料的需求量越来越大。而饲料生产量，尤其是蛋 白饲料的不足已经成为全球性问题。面对饲料资源严重短缺的局面，迫切需要 开发颓的蛋白饲料资源。在蛋白饲料开发利用中，国内外都很重视饲料蛋白的 研究，积极利用作物废弃物如苹果渣、秸秆等生产饲料蛋白，满足饲料业、养 殖业的需求，缓解饲料供需矛盾，同时也能解决秸秆焚烧引起的环境污染问题。 随着农业生物技术的发展，利用生物技术特别是微生物发酵手段来处理苹 果渣和秸秆等固体废弃物，使其成为家畜饲料来源，不仅能促进我国畜牧业的 发展，而且也会改善农业生态环境，实现资源的充分利用，变废为宝【2 7 】。 2 1 苹果的预处理 苹果的破碎：由于果实破碎，果组织破裂，其中所含果汁便加速流出，苹 果压碎的程度与压榨机的类型，果实的成熟度和各个品种的果肉特性有关。 碎果肉的压榨：破碎后的碎果肉立即装于压榨机上压榨，压榨筐装料后， 最初让其自然流出，以后慢慢开动压榨机，使果肉处于低压力下，只有在大部 分果汁流出后才加强压力，直到果汁流尽，苹果湿渣作为废料由出料皮带传出。 苹果湿渣的烘干：刚由苹果榨汁线送出的果渣含水约6 0 以上，并且含有 一定还原糖，为保证其不腐败，必须将其水分烘干，烘干温度不得超过9 0 。c ， 否则果渣易焦化。烘干时要注意保持鼓风，以使之受热均匀。烘干后的果渣可 长期保存。 干果渣的粉碎：干果渣颗粒较大，发酵和酶解时不易反应完全，因此需要 用粉碎机粉碎。粉碎后的果渣过4 0 目筛。 工艺流程如图2 - 1 所示。 苹果汁 翻2 - 1 苹果的预处理工艺流程图 f i g 2 - 1t h ef l o wc h a r to fa p p l e sp r e t r e a t m e n t 2 2 苹果渣固态发酵生产饲料蛋白的特点和工艺 2 2 1 固态发酵定义及特点 固态发酵是指利用自然底物做碳源及能源，或利用惰性底物做固体支持物， 其体系无水或接近于无水的任何发酵过程，微生物的生长及所形成的产物均在 基质的表面。其主要特点是发酵体系没有游离水存在，微生物是在其有足够湿 度的固态底物上进行反应，底物则既不溶于水，也不悬浮于水中。它不仅起到 一个提供碳源、氮源、水分、无机物和其它营养物的作用，同时也为微生物的 生长提供了一个固定的位置，因此该过程很类似于在自然环境中所发生的微生 物反应。它是解决能源危机、治理环境污染的重要手段之一，是绿色生产的主 要工具。 固态发酵所用原料一般为经济易得、富含营养物质的工农业生产的副、废 产品。根据需要，有时还对原料进行粉碎、蒸煮等预加工，以促进营养物吸收， 改善发酵生产条件，有时需要加入尿素等营养物质。 固态发酵所需设备简单，操作容易，并可因陋就简、园地制宜地利用一些 来源丰富的工农业副产品。该法的缺点是劳动强度大，不便于机械化操作，微 生物品种少，生长慢，产品有限等【2 8 _ 3 0 1 。 2 2 2 苹果渣固态好氧发酵生产饲料蛋白的工艺 苹果渣固态发酵生产饲料蛋白的主要工艺过程有；菌种扩大培养、原料预 处理( 苹果渣和秸秆的预处理) 、接种发酵、干燥灭活、分析测定。整个生产线 工艺流程如图2 2 表示【1 6 】。 9 湿苹果渣 图2 2 苹果渣固态发酵工艺流程图 f i g 2 - 2t h ef l a wc h a r to fa p p l er e s i d u es o l i ds t a t ef e r m e n t a t i o n 2 3 苹果渣固态发酵生产饲料蛋白培养基优化研究 正交实验设计：发酵选取对提高饲料蛋白含量影响较大的4 个主要因素a ( 麸皮) 、b ( 尿素) 、c ( 硫酸铵) 、d ( 磷酸二氢钾 进行b ( 3 4 ) 正交实验。 实验因素水平如表2 1 所示。 表2 - 1 培养基正交实验因素水平表 t a b 2 1t h ef a c t o r sa n dl e v e ro fm e d i u mo r t h o g o n a lt e s t s 2 4 苹果渣混合秸秆共发酵生产饲料蛋白放大研究 通过单因素实验和正交实验，获得了固态发酵生产饲料蛋白的小试最佳工 艺条件。即固态发酵培养基配方为：苹果渣7 9 ，麸皮1 5 ，无机盐的添加量 为尿素2 、硫酸铵2 、磷酸二氢钾2 ，将4 8 h 培养成熟的产朊假丝酵母、绿 色木霉和果酒酵母三菌种按4 5 ：3 ：1 接入固态发酵体系，自然p h 值，在不灭 菌条件下，3 0 3 4 。c 恒湿生化培养箱中培养，发酵结束后发酵样6 5 c 烘干至恒 重测定分析【1 8 】【3 2 】。固态发酵放大实验就是在此工艺条件下，进行放大实验，即 在现有的实验室条件下进行放大。 2 4 1 固态发酵培养基填充物配料的选择 在固态发酵中，原料粉碎得细，可提高原料的利用率和产量；但原料过细， 又影响氧在基质内的传递，对发酵不利。因而在发酵过程中，还需在发酵培养 基中加入适量的填充物以增加基质间的空隙，从而有利于发酵【2 。选取麸皮、 小麦秸、玉米秸秆和玉米芯四种农作物纤维素，按一定质量比与苹果渣以及其 他添加物配成发酵培养基。培养基配料为：苹果渣6 4 ，麸皮1 5 ，其他辅料 1 5 ，其中玉米秸秆为氨化处理过的【” ；尿素、硫酸铵和磷酸二氢钾分别按原 料质量的2 、2 和2 添加，料水比1 ：1 7 5 ，自然p h 值【3 2 j 。以此进行固态 发酵实验，并测定发酵产物中粗蛋白的百分含量。 2 4 2 培养基填充物预处理实验 在苹果渣与秸秆混合固态发酵生产牛饲料的预实验中发现，直接使用秸秆 而不做任何的处理会使发酵样霉变，蛋白含量下降，影响产品质量。实验设计 选用两种方法对玉米秸秆进行预处理。其一采用氮化秸秆：把玉米秸秆切成3 5 厘米，每1 0 0 千克加4 千克尿素、6 0 千克水，放入氨化池内逐层压实密闭1 4 d 放去余氨后与苹果渣混合发酵。在实验室阶段的放大实验时，秸秆用量少，也 可用塑料袋贮1 3 3 】。其二采用高压蒸汽1 2 1 下3 0 r a i n 灭菌。 2 4 3 苹果渣混合秸秆共发酵放大实验反应器选择 实验选择四种基本的简易固态发酵反应器进行放大实验研究，它们除了装 置上的不同外，其主要区别在于使用不同的促进氧气传递和散热的方式，选用 的发酵反应器如下p 事3 6 】： 厚层通风反应器：由铝合金制成，反应器的高和内径分别为1 7 5 c m 和 2 0 o c m ( 每次可装料2 5 k 曲。固态培养基铺在4 0 目的不锈钢金属筛网上，筛网距 离反应器底部5 c m 。为了解决发酵中氧气传递问题选择了底部强制通风和使用 氨化后的玉米秸秆作为培养基填充物两种方法相结合。底部通风是由鼓风机( 风 速为o 5 m s ) 提供的。反应装置如图2 3 所示。 盆式反应器：由塑料制成，反应器的高和内径分别为1 5 o c m 和2 5 o c m ( 每 次可装料2 5 k g ) 。固态发酵培养基以4 5 度斜角铺于反应器1 2 处，实验通过定 时搅拌加快氧气传递和散热，保持适宜的发酵温度。 1 l 浅盘反应器：这个反应器采用3 0 o c m 4 0 o c m 3 o c m 的塘瓷盘，装料量 为3 5 k g 。解决氧气的传递问题采用每2 4 h 翻样一次。 堆积式反应器：此法将物料堆积成小山状，高为6 0 o c m ，内径为2 0 ，0c t n 。 整个发酵过程为静态发酵，但每2 4 h 将样品翻动一次，促进散热和氧传递。 发酵样品每天取一次，6 5 。c 烘干至恒重测定分析。此实验一共进行两次，并 且同一分析者对同一试样连续进行两次测定，所得结果之间的差值小于1 5 。 恒温恒湿培养箱 。一一 二 ， k 二) | + ：一一一一j 图2 - 3 厚层通风反应器；1 培养基；2 金属筛网 f i g 2 - 3s c h e m a t i cd i a g r a mo ft h et h i c k b e d d e da i r i n gr e a c t o r ； 1 m e d i u m ；2 w i r e sm e s h b a s k e t s 2 4 4 不同反应器进一步放大研究 通过反应器的选择实验发现盆式反应器和厚层通风反应器以其各自的特点 被选为进一步放大实验时的反应器，盆式反应器在发酵过程中，定时搅拌，发 酵产物均匀，发酵的产品粗蛋白含量高，但是发酵时间较长；厚层通风反应器 粗蛋白含量略低于盆式反应器，但发酵时问短，单次发酵产量比盆式反应器大 的多，便于工业化生产且劳动强度小。结合以上原因，分别对两种不同的反应 器进行进一步放大实验，在对苹果渣混合秸秆共发酵生产饲料蛋白的放大生产 条件研究的过程中，遵循逐级放大、逐步摸索、逐步优化的原则。 盆式反应器分别设计出两种不同规模的放大方案，即小型盆式反应器，由 塑料制成，反应器的高和内径分别为1 0 o c m 和2 0 o c m ( 每次可装料o ，5 k g ) ；大 型盆式反应器，由塑料制成，反应器的高和内径分别为1 5 o c m 和2 5 o c m ( 每 卜i+，i+ 次可装料2 5 k g ) 。厚层通风反应器在实验中使用两种不同规模的反应器进行实 验，即小型厚层通风反应器，由塑料制成，反应器的高和内径分别为1 5 0 c m 和 1 3 5 c m ( 每次可装料0 5 k g ) ；大型厚层通风反应器，由铝合金制成，反应器的 高和内径分别为2 0 0 c m 和3 1 0 c m ( 每次可装料3 6 k g ) 。放大所用固态发酵培养 基配方为：苹果渣6 4 ，麸皮1 5 ，玉米秸秆1 5 。无机盐的添加量为尿素2 、 硫酸铵2 、磷酸二氢钾2 ，将4 8 h 培养成熟的产朊假丝酵母、绿色木霉和果 酒酵母三菌种按4 5 ：3 ：1 接入固态发酵体系，自然p h 值，在不灭菌条件下， 3 0 3 4 。c 恒湿生化培养箱中培养，其中盆式反应器培养1 2 0 h ，厚层通风反应器 培养9 6 h 。发酵结束后发酵样6 5 烘干至恒重测定分析。实验选取粗蛋白含量 作为测定指标。在放大实验过程中，影响粗蛋白含量的因素很多，如填料量、 菌种的接种量、料的含水量等，都必须通过实验来找出最佳的发酵放大规律， 同时还要进行了稳产实验研究。 2 5 苹果渣液固态发酵生产饲料蛋白的特点和工艺 当前，利用纤维素资源转化为蛋白饲料或菌体蛋白的研究比较普遍，但研 究多是采用固态发酵法或液态发酵法【”啦! 。因饲料附加值较低，所以对上述两 种发酵方法产生诸多不利，如许多纤维素原料需复杂的预处理，液态法的产量 小且设备投资大；赢接固态法，接种量大且发酵时间较长，劳动强度大，条件 难以控制，产品质量不稳定等弊端，难以适应市场的要求，从经济角度出发， 工业化很难实施，因此绝大部分仍停留在实验室及中试水平。为了克服这些不 足，如果采用新的液固态发酵的方法，可以弥补上述缺憾，明显缩短生产周期， 提高蛋自含量和产量，方便可行。 2 5 1 液固态发酵的特点 1 液固态混合发酵工艺生产苹果渣蛋白饲科，该工艺具有菌种性能稳定、接 种浓度大、发酵快、物料不需灭菌、产品质量稳定等优点，生产易于控制，适 于规模化生产【4 3 】。 2 5 2 苹果渣液固态好氧发酵生产饲料蛋白的工艺 苹果渣液固态好氧发酵工艺如图2 - 4 。 湿苹果渣 图2 _ 4 苹果渣液固态发酵工艺流程 f i g 2 - 4t h ef l o wc h a r to fa p p l er e s i d u es o l i d l i q u i ds t a t ef e r m e n t a t i o n 2 6 苹果渣混合秸秆液固态发酵放大规律的研究 菌种扩大培养：取3 个锥形瓶分别装入2 5 0 m t 、1 5 0 m l 、l o o m l 的土豆培 养基，分别将产朊假丝酵母、绿色木霉和果酒酵母接种于锥形瓶中，于3 0 。c 、 1 4 0 r m i n 振荡培养4 8 h 。 液态培养基的配方：将苹果渣过6 0 目筛装入5 0 0 m l 锥形瓶中，分别加入 5 蔗糖，2 尿素，1 ( n h 4 ) 2 s 0 4 ，1 k h z p 0 4 ，p h 僮自然，加自来水适量， 搅拌，使苹果渣与水混合均匀。采用高压蒸汽灭菌1 2 1 。c ，3 0 r a i n 。 固态发酵培养基的配方：( 1 ) 盆式反应器：干苹果渣( 未过筛) 0 7 8 8 k g ， 麸皮0 1 6 9 k g ，秸秆0 1 6 9 k g ，尿素2 ，( n h 4 ) 2 5 0 42 ，k h 2 p 0 42 。( 2 ) 厚层 通风反应器：干苹果渣( 未过筛) 1 5 7 5 k g ，麸皮o 3 3 8 k g ，秸秆o 3 3 8 k g ，尿素 2 ，m h 4 ) 2 s 0 42 ，k h 2 p 0 4 2 。 接种：将扩大培养的各菌种接种于灭菌后的苹果渣液态培养基中，搅拌均 匀，放入3 0 c 摇床中培养2 4 h ，按3 0 m l 1 0 0 9 底物的量接入固态发酵培养基上， p h 值自然，调节初始料水比1 ：1 7 5 ，在不灭菌条件下，3 0 3 4 c 恒湿生化培 养箱培养，6 5 c 烘干至恒重测定分析。 2 7 苹果渣发酵饲料卫生安全检测 2 7 1 苹果渣发酵饲料中氟含量的测定【4 4 1 原理 1 4 氟离子选择电极的氟化镧单晶膜对氟离子产生选择性的对数响应，氟电极 和饱和甘汞电极在被测试液中，电位差可随溶液中氟离子的活度的变化而变化， 电位变化规律符合能斯特方程式。 一 。2 3 0 豫丁 e = e o 一竺兰竽k c f f e 与i g c f 呈线性关系。2 3 0 3 r t f 为该直线的斜率( 2 5 。c 时为5 9 1 6 ) 。 与氟离子形成络合物的f e “、朋3 + 、及讲等离子会干扰测定结果。其他 常见离子无影响。测量溶液的酸度为p h 值5 6 ，用总离子强度缓冲液消除干 扰离子及酸度的影响。 2 试剂 3 m o l l 乙酸钠溶液、o 7 5 m o l l 柠檬酸钠溶液、l m o l l 盐酸。 总离子强度缓冲液：3 m o l l 乙酸钠溶液与o 7 5 m o l l 柠檬酸钠溶液等量混 合，临用时配制。 氟标准溶液：氟标准贮备液、氟标准溶液、氟标准稀释液。 3 测定步骤 ( 1 ) 氟标准工作液的制备 吸取氟标准稀溶液0 、1 0 、2 5 、5 0 和1 0 0m l ( 相当于0 、1 0 、2 5 、5 0 和 l o o h g 氟) ，再吸取氟标准溶液2 5 、5 o r a l ( 相当于2 5 0 、5 0 0 , u g 氟) ，分别置于 5 0 m l 容量瓶中，于各容量瓶中分别加入l m o l l 盐酸l o m l ，总离子缓冲液2 5 m l ， 加