（林木遗传育种专业论文）est技术分析西伯利亚蓼耐盐机制及耐盐相关基因克隆.pdf

摘要 西伯利亚蓼( p o l y g o n u ms i b i r i c u ml a x m ) 为多年生草本植物，可在盐碱地碱斑上 生长，为盐碱地的优势种，是研究植物耐盐碱胁追的优良材料。在以往对西伯利亚蓼的 研究基础上，本文从以下几个方面进行研究： 1 通过对西伯利亚蓼n a h c 0 3 混合e d n a 文库2 5 7 5 个e s t 的分析，拼接出1 9 7 7 个t u t s ，其中包含2 0 6 个重叠群( e o n t i g ) 和1 7 7 1 个单拷贝e s t ( s i n g l e t o n ) 。确定了 高丰度表达、中丰度表达e s t 和低丰度表达e s t ；高丰度表达基因5 1 个，占所有n ，r 的2 6 ，代表4 5 7 个e s t ，占总e s t 的1 7 7 7 ，其中参与光合作用的e s t 占高事度 表达基因的5 4 9 2 。表明n a h c 0 3 胁迫条件下时部的主要生理功能仍为光合作用；中 丰度表达基因1 5 4 个，占所有n j t 的7 8 ，代表3 4 2 个e s t ，占总e s t 的1 3 3 0 。 低丰度单拷贝的e s t1 7 7 1 个，占总e s t 的6 8 8 6 ，说明文库的复杂性较好。 利用b l a s t x 对1 9 7 7 个1 u t 进行注释，其中7 2 0 个t u t $ 有明确的功能注释，占 总t u t s 的3 6 4 2 ；1 0 9 个为未知蛋白，占总t u t s 的5 5 l ，其余1 2 3 8 个则没有明 显同源性而被鉴定为新基因，占总t u t s 的6 2 6 2 。将7 2 0 个n 玎分成代谢、能量、 光合作用、蛋白合成、转运组件、转录、信号传导、细胞救援与防御和其它等九类，其 中代谢、能量和光合所占的比例最高，分别达到2 2 9 0 、1 2 2 5 和1 1 8 6 ，而细胞救 援与防御类所占比例较低，仅为1 2 4 ，从而确定叶部虽然受到了n a h c 0 3 胁迫，但其 主要功能如光合作用、代谢和能量仍处于主导地位，这也在一定程度上说明了西伯利亚 蓼具有耐胁迫能力。 2 以s m a r t 策略构建了西伯利亚蓼n a h c 0 3 胁迫4 8h 的叶部和茎部正反消减文 库，随机挑取克隆测序，共获得了2 2 8 2 条有效序列，其中茎的正向消减文库中有5 9 8 条，茎的负向消减文库中有4 9 0 条，叶的负向消减文库中有5 6 7 条，叶的正向消减文库 中有6 2 7 条。通过进行m i p s 功能分类并对茎部与叶部正反消减文库比较，在盐胁迫条 件下，发现茎部与叶部的胁迫反应有很大不同，茎部与叶部除细胞救援与防御、转运组 件组中变化趋势相同外，在代谢、能量、光合作用、蛋白合成、转录、信号传导等方面 均表现为相反的趋势，其中茎部表现为胁迫抑制的有转运组件、转录和蛋白质合成，而 在叶部则表现为胁迫诱导。在茎部表现为胁迫诱导的光合作用、信号转导、能量以及代 谢，在叶部则表现为胁迫抑制。说明叶部与茎部在n a h c 0 3 条件下具有两种不同应答机 制和分工，结合以往的研究结果，确定茎部在西伯利亚蓼的个体植株水平耐盐机制中起 到重要作用。 3 利用r a c e 技术克隆了1 7 个与胁迫有关的e d n a ，并进行了生物信息学分析， 确定1 7 个胁迫相关基因为水通道蛋白基因、胚胎晚期富集蛋白基因、乙二醛酶基 因、臭氧反应胁迫相关蛋白基因、谷氧还蛋白基因、超氧化物歧化酶( m n ) 、超氧化物 歧化酶( c u - z a ) 、广泛应激蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、铜伴侣、钙调蛋白、谷胱甘 。： ：。：些型璧兰型兰垒堡- ：一 肽转硫酶、半胱氨酸合成酶、谷氨酰胺合成酶、金属硫蛋白、a c i - 还原酮双加氧酶、泛 素蛋白连接酶锌结合蛋白，通过已有的研究结果表明其中胚胎晚期富集蛋白基因、乙 二醛酶i i 基因、超氧化物歧化酶( h 恤) 、超氧化物歧化酶( c u z n ) 、谷氨酰胺合成酶、 金属硫蛋白等基因具有潜在的耐盐碱功能，为耐盐基因工程育种的潜在基因资源。 关键词西伯利亚蓼；e s t 分析；消减文库；基因克隆 a b s t r a c t p o l y g o n u ms i b i r i c u ml a x m ，ap e r e n n i a lh e r b a g e ，c a l lg r o wi nt h es a l i n e - a l k a l is p o t sa n d i st h ed o m i n a n tp o p u l a t i o ni nt h es a l i n e a l k a l is o i l ，w h i c hi ss u i t a b l em a t e r i a lf o rt h es t u d yo b t h et o l e r a n c em e c h a n i s mo fs a l i n es t r e s s b a s e do nt h ep r e v i o u ss t u d yo nt h ep o l y g o n u m s i b i r i c u m ，t h ef o l l o w i n ga s p e c t sw e r ee n g a g e di nt h i sw o r k ： 1 1 9 7 7t e n t a t i v eu n i q u e t r a n s c r i p t s ( t u t s ) c o n t a i n i n g2 0 6c o m i g sa n d1 7 7 1s i n g l e t o n e s t sw e r eo b t a i n e do nt h ea n a l y s i so f t h e2 5 7 5e s i sf i o mt h em i x e dc d n a i i b r a r yo f p o l y g o n u ms i b i r i c u mu n d e rt h en a h c 0 3s t r e s s 毗e s t se x p r e s s e di nh i 西la b u n d a n c e ， m o d e r a t ea b u n d a n c ea n dl o wa b u n d a n c ew e r ec o n f i r m e dr e s p e c t i v e l y t h e r ea r e5 1g e n e s e x p r e s s e di nh i g l la b u n d a n c e ，w h i c ha m o t t n tt o2 6 i nt h et o t a lt u t sa n dr e p r e s e n t4 5 7e s t s ， a c c o u n t e df o r1 7 7 7 i na l le s t s t l l ep h o t o s y t h e s i se s t sa r e5 4 9 2 i nt h ee s t se x p r e s s e d i nh i g ha b u n d a n c e i ti n d i c a t e dt h a tp h o t o s y n t h e s i si ss t i l lt h em a i np h y s i o l o g i c a lf u n c t i o no f l e a f u n d e rt h en a h c 0 3s n _ c s s t h e r ea r e l 5 4g e n e se x p r e s s e di nm o d e r a t ea b u n d a n c e w h i c h a m o u n t t o7 8 i n t h e t o t a l n 丌墨a n d r e p r e s e n t 3 4 2 e s t s a c c o u n t e d f o r l 3 3 0 i n a l l e s t s t h e r ea l e1 7 7 1s i n g l ec o p ye s t se x p r e s s e di nl o wa b u n d a n c e w h i c ha m o u n tt o6 8 8 6 i nt h e t o t a le s t s i ti n d i c a t e dt h a tt h ec o m p l e x i t yo f t h ee d n al i b r a r yi se n o u # 1 9 7 71 1 玎sw e l ea n n o t a t e db yb l a s t x 7 2 0i nw h i c ha r ea n n o t a t e dw i t hd e f i n i t ef u n c t i o n , a m o u n t i n gt o3 6 4 2 i na l lt u t s 1 0 9t u t 瓷a r ea n n o t a t e dw i t hu n k n o w np r o t e i n , a m o u n t i n g t o5 51 i na l lt u t s 1 1 地o t h e r sa r ec o n s i d e r e da sn o v e lg e n ef o rl i t t l eh o m o l o g ya m o u n t i n gt o 6 2 6 2 i na l l 觚a c c o r d i n gm i p sf u n c t i o n a lc a t a l o g u e t h e7 2 0e s t sa r ei n v o l v e di n m e t a b o l i s m , e n e r g y , p h o t o s y n t h e s i s ，t r a n s p o r tf a c i l i t a t i o n , t r a n s c r i p t i o n ，s i g n a lt r a n s d u e t i o n , c e l lr e s c i l ed e f e n c ea n dt h eo t h e rv i t a lp r o c e s s a m o n gt h ea b o v ec l a s s i f i c a t i o nt h ee s t s i n v o l v i n gm e t a b o l i s m ，e n e r g ya n dp h o t o s y n t h e s i sa r ei nt h eh i g h e s t ，a m o u n t i n gt o2 2 9 0 ， 1 2 2 5 a n d1 1 8 6 i n t h e a l l e s t sr e s p e c t i v e l y , w h i l e t h o s e i n v o l v i n g c e l lr e s c u e d e f e n c ea r e l i t t l ea n da m o u n tt o1 2 4 i na l le s t s t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tu n d e rt h en a h c 0 3s t r e s s ，t h e m a i n a c t i v i t i e s o f l e a f s u c h a s p h o t o s y n t h e s i s ，m e t a b o l i s m a n d e n e r g y t r a n s f o r m a t i o n ，a r es t i l l d o m i n a n t ，w h i c hi l l u s t r a t e dt h et o l e r a n c ea b i l i t yo f p o l y g o n u ms i b i r i c u mt ot h es a l ts t r e s s 2 u s i n gp c 王i - s e l e c t l me d n a s u b t r a c t i o nk i tb a s e do ns 【a r ts t r a t e g y , t h er e v e r s ea n d f o r w a r ds s hl i b r a r yo f t h es t e ma n dl e a f w e r ec o n s t r u c t e dt r e a t e dw i t hn a h c 0 3f o r4 8h o u r , c l o n e ss e l e c t e dr a n d o m l yw e r es e q u e n c e d ，2 2 8 2v a l i ds e q u e n c ew e l eo b t a i n e d ，w h i c hi n c l u d e d 5 9 8e s t si nt h es t e m sf o r w o r ds s hl i b r a r ya n d4 9 0e s t si nt h es t e mr e v e r s es s hl i b r a r y , 6 2 7 e s t s i n t h e l e a f f o r w o r ds s h l i b r a r y a n d5 6 7 i n t h e l e a f r e v e r s es s h l i b r a r y a c c o r d i n g t o t h e f u n c t i o n a lc a t a l o g u eo f m i p sa n dt h ec o m p a r i s o no f t h er a ，e l s ea n df o r w a r ds s hl i b r a r yo f t h e s t e ma n dl e a f t h er e s p o n s e st on a h c 0 3s u e s sa i ed i f f e r e n tb e t w e e nl e a f a n ds t f f l n e x c e p tf o r i 东北林业大学博士学位论文 t h es a m et r e n di ne e l lr e s c u ed e f e n c ea n dt r a n s p o r tf a c i l i t a t i o n , t h et r e n di nt h em e t a b o l i s m ， e n e r g y , p h o t o s y n t h e s i s ，p r o t e i ns y n t h e s i s ，t r a n s c r i p t i o n , a n ds i g n a lt r a n s d u c t i o ni so p p o s i t e n e g e n e si n v o l v i n gt r a n s p o r tf a c i l i t a t i o n ，t r a n s c r i p t i o na n dp r o t e i ns y n t h e s i sa r ed o w n - r e g u l a t e d u n d e rn a h c 0 3s t r e s si ns t e m ，b u tu p - r e g u l a t e di nl e a f t h eg e n e si n v o l v i n gp h o t o s y n t h e s i s ， s i g n a lt r a n s d u c t i o n , e n e r g ya n dm e t a b o l i s ma r eu p - r e g u l a t e du n d e rn a h c 0 3s t r e s si ns t e m ，b u t d o w n - r e g u l a t e di nl e a f t h er e s u l ti n d i c a t et h a tt h e r ea r ed i f f e r e n tm e c h a n i s mi nr e s p o n s et 0s t r e s sb e t w e e ni e a t a n ds t e mi np o l y g o n u ms i b i r i c u m c o m b i n i n gw i t hp r e v i o u ss t u d y , t h ec o n c l u s i o ni st h a tt h e s t e mp l a yn i li m p o r t a n tr o l ei ns a l t - r e s i s t a n e ei np o t y g o n u ms i b i r i c u m 3 1 7c d n a sr e l e v a n tt os t r e s sw e r ec l o n e db yt h er a c e a n dw e r ea n a l y z e db y b i o i n f o r m a t i c s ，t h er e s d ts h o w e dt h a tt h e1 7c d n a se n c o d et h ew a t e rc h a n n e lp r o t e i n ，l a t e e m b r y o g a n e s i sa b u n d a n tp r o t e i n ( l e a ) ，g l y o x a l a s ei i ，o z o n e - r e s p o n s i v es t r e s s - r e l a t e dp r o t e i n , g l u t a r e d o x i n ( o r x ) ，m n s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ( s o d ) ，c u - z ns o d ，u n i v e r s a l s t r e s sp r o t e i n ( u s p ) ，e y s t e i n ep r o t e a s ei n h i b i t o r , c o p p e rc h a p e r o n e ，c a l m o d u l i n , g l u t a t h i o n e s - t r a n s f e r a s e ( g s t ) ，m e t a l l o t h i o n e i n ( m i ) ，c y s t e i n es y n t h a s e ，g l u t a m i n es y n t h e t a s c ，a c i r e d u e t a n e d i o x y g e n a s ea n du b i q u i t i n - p r o t e i nl i g a s e z i n ci o nb i n d i n gr e s p e c t i v e l y b a s e d o i lt h ep r e s e n t s t u d y , l el e a ，g l y o x a l a s e ，m n - s o d ，c u - z ns o d ，g l u t a m i n es y n t h e t a s ea n dm t h a v e p o t e n t i a lf u n c t i o no fs a l t - r e s i s t a n c e ，w h i c ha r el a t e n tg e n er e s o u r c ef o rg e n e t i ce n g i n e e r i n go f s a l ts t r e s s k e y w o r d sp o l y g o n u m s i b i r i c u ml a x m ；e s ta n a l y s i s ；s s hl i b r a r y ；g e n ec l o n e i v 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得壅皇垦盎些盘鲎或其他教育 机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡 献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 靴糍轹矧玖产一飙节月夕 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解盎宴堡盎些态堂 有关保留、：使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查 阅和借阅。本人授权 壅皇堡盐些盘堂 可以将学位论文的全部或部分内容编入有 关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 黜文名：刮袭矽铷虢 签郑飙砷月伊 工作单位：茵。稚够越 通讯地址啪读。午私纷 停 签字嗍：冲月巾 磊 罗 、 g 乙 腾笋 r 勿甜如 话 编 1 绪论 土壤盐渍化对农业生产的影响是一个全球性问题，世界范围内，有1 0 亿h m 2 的盐 渍化土壤，约占陆地总面积的7 r o t ”。在1 5 亿h m 2 耕地中，0 7 7 亿h m 2 受到盐害的影响 吲。我国约有盐荒地2 0 0 0 万h m 2 ，次生盐渍化土壤6 7 0 万h m z ，约占全国耕地总面积的 1 4 。此外，由于灌溉不当、工业污染加剧和化肥使用不当等原因，次生盐渍化土壤面 积还在以每年3 的速度扩展p j 。因此，深入研究植物的耐盐碱机理，提高植物的耐盐 性，是利用生物治理和综合治理盐碱地的一个重要前提。 1 1 盐胁迫对植物的伤害 盐胁迫可使植物的生长受抑制，光合下降，能耗增加，衰老加速，生长量降低，最 终导致植株因饥饿而死亡：e 4 j 。从能量代谢的角度分析，盐分胁迫下植物生长量减少的原 因有三个方面：一是光合作用降低，碳同化减少：二是渗透调节物质的合成和积累是耗 能的过程；三是维持渗透势是一个耗能的过程t 5 1 。而在细胞水平上则表现为造成膜损伤 和细胞膜透性增加 6 1 ；打破了细胞的离子平衡，产生离子毒害，导致一些酶活力下降； 产生氧自由基，破坏细胞结构；使膨压降低，抑制细胞生长等等【”。 1 2 植物耐盐的信号传导 植物对盐胁追的反应是多年来的研究重点，而最初的研究多限于形态学、生理学等 方面，随着分子生物学技术的不断发展，对盐胁迫下的植物反应，更多的集中在盐胁迫 下的分子信号传导、基因表达调控、大分子的相互作用等方面，同时也积累了越来越多 的盐应答资料，并能够描述植物在外界盐胁迫下启动的从分子信号传递、相关代谢途径 调节的一些变化。揭示植物在盐胁迫后形成新的离子和渗透压平衡的应答体系。由于自 然界中植物种类繁多，种间差异很大，因此各种属的盐调控通路也有很大差异。通过研 究许多盐生植物如山菠菜特有的耐盐途径，比较它们与淡水植物盐应答的不同，可以直 接找到植物耐盐的某些方式 s , g l ；然而近十几年的研究表明，甜土植物与盐土植物在耐 盐的分子机制上，有很大的相似之处，如盐离子的区域化、胁迫信号的传递等等u o j 。这 为以模式植物为材料，揭示一些植物盐胁迫下的应答机理，提供了可靠的基础。 在较早的研究中，往往以离子毒害、离子的区域化、渗透胁迫物质的合成、氧自由 基的清除等方面进行分门别类的研究，随着分子生物学的发展，各种突变体的获得、转 基因技术的成熟以及正向遗传学与反向遗传学的相互配合，发现盐胁迫下植物的各种应 答与反应是相互协调、相互关联又各自具有特异的通路。因此，对盐胁迫的某一个方面 的研究，还必须兼顾到其他的影响，这样才有可能更深入的揭示其机理。而这一观点， 在盐胁迫的相关信号感应、传导与传递到诱导相关基因的表达中，有更直接的体现。 盐胁迫信号根据功能可分为三类：离子和渗透胁迫平衡信号( 第一类信号) ，主要 作用是重新建立胁迫条件下的细胞离子和渗透平衡；解除盐胁迫造成的毒害信号( 第二 东北林业大学博士学位论文 类信号) ，主要是控制和修复胁迫所造成的伤害；调整细胞分裂和伸长信号( 第三类信 号) ，使细胞的分裂和伸长与胁迫条件相适应。三者之间有着密切的关系，第一类信号 发挥作用，建立起离子与渗透平衡，减少对细胞的毒害，从而降低了第二类信号分子； 而一旦离子和渗透平衡较差，将增加第二类信号，启动植物保护功能，解除由此带来的 毒害。所以第一类信号和第二类信号是相互协调的。而第一类信号和第二类信号发挥作 用的结果决定着第三类信号的强弱，即对植物生长抑制的程度 1 i l 。 由于盐胁迫下植物应答的复杂性以及目前所获得的资料和数据还不充分，传递的途 径和组成部分也不十分清楚；目前所获得的盐胁迫信号传导多是基于细胞水平上的信号 传导，而对于植物个体水平及植物之间的信号传递，则更是空白。 1 2 1 植物离子平衡与信号传导 对于盐胁迫下保持细胞内的离子平衡，涉及到细胞内外的电化学势及细胞膜上的离 子通道等。n a c i 胁迫所涉及的离子平衡不仅仅是n a + 和c l 。，还涉及到c 和c a 2 + l ”j 。而这 些离子运输的动力是与细胞膜内外的一的电化学势分不开的，膜内外的这种电化学势的 建立依赖于膜上的旷泵( i - r a t p 酶和h + 焦磷酸酶) 【1 2 ，l ”。盐胁迫下，旷的内流会降低 内外的化学势，而c l 。的内流则有利于提高内外的化学势，这种被动的离子流动是由细胞 膜上的一种阴离子通道蛋白参与完成的。而一旦建立起来这种膜内侧负电荷膜外正电荷 的化学势后，c l 。往往与旷进行偶合共转运进入细胞内【l 引。生理学试验数据显示，n a + 和 c 向细胞内运输是相互竞争的，其原因是有些共同的蛋白参与运输n a + 和k + 【”j ，这些蛋 白有高k + 低n a + 亲和力的蛋白、n a + k + 选择性低的蛋白、阳离子通道蛋白等等”。c a ” 的平衡对细胞也非常重要，在盐胁迫下，会引起c a 2 + 的瞬时增高，而c 矿的瞬时增高恰 恰是一种胁迫信号，有研究表o ) j c a 2 + 有助于n a + k * 选择性吸收的提高。而c e + 有自己的 运输系统来保持其在细胞内的平衡l l ”。 植物的离子平衡信号的感知是通过细胞内和细胞外过量的n a + 实现的，由于n a + 的浓 度变化引发细胞内c a 2 + 的信号途径，而信号输出的最终结果则是导致运输n a + 、k 十、旷 蛋白的表达和活性发生变化。而对离子平衡的信号途径研究的较为清楚的是s o s 途径 【1 8 】，s o s 途径是通过一系列拟南芥盐敏感突变体( s a l t t o l e r a n c es e n s i t i v em u t a n t ) 发现 的。其s o s 3 编码了一个可被肉豆蔻酰化的c a 结合蛋白( s o s 3 ) ，s o s 3 具有3 个e f - 臂 的c a 结合蛋白删，与钙调磷酸酶的b 亚基有高度的同源性。该蛋白可以和c a 进行特异 性结合，在被肉豆蔻酰化后可以和目标蛋白相结合。这种结合即可以和s o s 2 蛋白结 合，激活s o s 途径，同时还可以和类s o s 2 蛋白结合，通过参与a b a 的合成而介导渗透 胁迫的调控 2 0 l 。s o s 2 为丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，属于仅在植物中发现的p k s 家族蛋 白，有一个类s n f l 的催化域和一个独一无二的调节功能域，它们都参与了与s o s 3 的结 合f 2 ，2 2 ) ，而这两个功能域的相互作用使s o s 2 的磷酸化激酶活性处于失活状态。s o s 3 与 调节域相结合，使s o s 2 的催化域释放出来，从而表现出催化功能。通过对s o s 2 和s o s 3 突 变体的转s o s 2 基因研究表明，突变体的盐敏感性得到了缓解。证明该基因在植物s o s 途 径中的作用。s o s l 基因编码了一个膜的n d i - f 反向转运蛋白，该蛋白在细胞质一侧有一 个长长的“尾巴”1 2 3 1 ，作为细胞内溶液的感受器。这样，n a + 的感知和运输可以在一个蛋 1 绪论 自上实现。而s o s i 的n a + ，一反向转运蛋白活性是受s o s 2 调节的。 s o s 信号途径的大致如下：在细胞内由盐诱导产生的c a 信号，传递给肉豆蔻酰化 s o s 3 ，s o s 3 进一步将这一信号传递给下游的信号受体，而产生盐刺激反应 x o , 2 4 】。s o s 3 结合到s o s 2 的调节域，激活s o s 2 的激酶活性，s o s 2 和s o s 3 共同调节s o s l 的表达水平 2 3 1 ，另# b s o s l 的活性也需要s o s 2 和s o s 3 的存在【2 5 1 。由于s o s l 为n 删反向转运蛋 白，从而将细胞质中的n a + 排出，保持细胞内的离子平衡。 1 2 2 植物的渗透调节以及渗透信号传导 盐胁迫必然导致植物的失水或者是吸收水分困难，而植物要在胁迫下进行生存，必 须减低植物细胞的水势而吸收水分。植物已经演化出一个渗透调节系统，用于胁迫下调 节细胞的水势，保证水分的吸收和正常的膨压。渗透调节剂有无机离子如n a + 、k + 以及 有机兼容性溶质如甘氨酸甜菜碱、脯氨酸、多元醇以及可溶性糖等。对于盐胁迫下使用 n a + 作为渗透调节剂是最经济的策略，因为将n a + 运入液泡进行区域化，一方面减少了细 胞质中n a ? 的毒害提高细胞的渗透势的同时，也减少了用于合成有机渗透调节刘所需要 的能量和物质，通过对转基因拟南芥的研究发现，a v p l 基因( 该基因产物可促进n a + 进 入液泡) 可提高转基因拟南芥叶片的保持水分的能力】。尽管采用无机离子更经济，但 渗透调节物质的主要部分，仍然是有机可溶物质，只是因物种不同，所采取的渗透调节 物质不同。这些有机可溶性物质除具有调节渗透压的功能，还具有保护剂等功能，因为 有机渗透调节剂具有亲水功能，可以取代水而和蛋白质表面、蛋白复合体、膜表面结合 而起到渗透保护剂的功能1 2 7 】。例如甘氨酸甜菜碱在盐胁迫下，可以保护类囊体和质膜的 完整【2 引。离浓度的兼容性溶质还能抑制离子对酶活性的影响，增加酶的稳定性【2 9 3 0 】。另 外，有些有机渗透调节物质作为渗透保护剂，还具有清除氧自由基的功能j 。 对渗透胁迫的感知可能是由于膨压的变化。信号输出的结果目前还不十分清楚，很 有可能是一些基因的表达以及渗透调节合成酶活性的激活或合成、水的运输以及渗透调 节物质运输系统的激活等等。参与由渗透胁迫所产生的信号转导的有蛋白激酶途径和磷 脂途径，a b a 也参与了渗透胁迫的调节。在高渗透胁迫条件下，已经分离了多个m a p 蛋白激酶，例如在苜蓿中分离了4 6 k d 的m a p 蛋白激酶s i m k ，该酶受高渗胁迫的诱导 d 2 1 ：在烟草中发现了类s i m k 的m a p 激酶s i p k ，该激酶受高渗透胁迫诱导m j ；有一系歹1 j 实验结果表明，双组份的组氨酸激酶、m a p k 、m a p k k 、m a p 张在渗透胁迫下表达 增加【3 4 1 。膨压的变化必然涉及到细胞膜，而细胞膜上的磷脂组成了产生多信号分子的动 态系统，保持在胁迫下的膜结构上。而对于磷脂信号传导的细节还不十分清楚，但有一 点是确定的，信号分子处于较低水平的时候，可以激活下游的适应反应。而磷脂信号分 子较多的时候，则可以诱导胁迫伤害反应。在磷脂信号系统中，磷脂酶c ( p l c ) 途径 较为清楚，尤其在非植物系统中研究的更详细。p l c 催化4 ，5 二磷酸肌醇磷脂( p i p 2 ) 生 成第二信使1 ，4 , 5 三磷酸肌醇( i p 3 ) 和甘油二酯( d a g ) ，i e 3 释放细胞内储存的c a _ ”， 而c a 2 + 的增加可以促进与渗透胁迫有关的基因表达1 3 5 】。另外还有其他的磷酸肌醇如 i p 6 、i ( 1 ，3 4 ) p 3 也可以使p 螈c a 2 + 释放| 3 6 , 3 7 l 。产生的d a g 磷酸化后，直接形成另一个信 号分子磷脂酸( p a ) 【3 8 1 。在多种植物中都发现了渗透胁迫下i p 3 迅速增加1 3 9 “。而i p 3 前 东北林业大学博士学位论文 体p i p 2 合成酶基因磷脂酰肌醇4 一磷酸5 一磷酸激酶( p i p 5 k ) 也受胁迫诱导【4 3 1 。，在拟 南芥中与儿c 同源的a t 比c 也受盐胁迫和干旱胁迫的诱导h 4 l 。而转反义儿c 基因的植物 导致i p 3 的含量降低，同时表现出对渗透胁迫的不敏感1 4 5 1 。另外a b a t g 参与渗透胁迫的 信号传导。 1 。2 3 氧化胁迫的信号传导与氧自由基的清除 高盐能够造成植物伤害，其中一个很重要原因是产生大量活性氧，产生氧化胁迫， 导致细胞组份受到破坏。氧化胁迫信号的传导可能起始于胁迫造成的损伤如活性氧或者 变性蛋白等，而信号输出的结果是产生一些清除氧自由基的蛋白、分子伴侣或者诱导细 胞凋亡的一些基因表达等等。氧化胁迫信号系统的网络极其复杂，目前还不十分清楚。 对拟南芥的研究表明，至少1 5 8 个基因参与t r o s 的产生与清除 4 6 1 ，活性氧自由基可以 作为信号分子，而与信号分子相对应的受体分子有那些，目前还不十分清楚，但至少有 三种机制参与了该信号的传递过程，( 1 ) 未确定的受体蛋白，( 2 ) 氧化还原敏感的转 录因子，如n p r l 或h s f s 等，( 3 ) 直接由r 0 s 引起的磷酸化抑制【4 7 - 5 0 l 。随后，由r o s 会引起细胞内c a 2 + 、c a 结合蛋白类物质的变化，例如：钙调蛋白【5 1 郅】和g 蛋白的激活 1 5 4 、磷脂信号的激活1 5 5 , 5 6 等。 已有大量的实验证明氧化胁迫下，与清除活性氧有关的基因及相关酶的活性显著增 加，例如在拟南芥和柑橘类植物中，磷脂过氧化氢谷胱甘肽过氧化物酶( p h o s p h o l i p i d h y d r o p e r o x i d eg l u t a t l a i o n ep e r o x i d a s e ，p h g p x ) 转录增加t 1 57 ，引。通过转基因植物证明， 转线粒体m n s o d 、f e s o d 以及叶绿体的z n - s o d 、过氧化氢酶、谷胱甘肽s 转移酶 等，可以增加植物对氧化胁追的抗性t 5 9 都l 。 1 3 耐盐相关的转录因子研究 与其他逆境一样，盐胁迫下会有很多功能蛋白表达，包括水通道蛋白、早期胚胎富 集蛋白( l a t ee m b r y o g e n e s i sa b u n d a n t ，l e a ) 和渗透保护剂合成酶等等。另外还包括 调节蛋白如蛋自激酶、磷酸化酶、转录因子以及激素a b a 合成相关酶等等。目前为止， 各种功能蛋白的过量表达可以提高植物的抗逆性，但仅仅能够改善植物抗逆的某一个方 面，而盐胁迫后涉及多方面的内容( 如离子平衡、渗透胁迫、次级氧胁迫等等) 。转录 因子可以控制多个目标基因的表达。因此，对盐胁迫下转录因子的研究是目前的研究热 点。 1 3 1 d r e b 转录因子( d e h y d r a t i o nr e s p o n s i v ed e m e n tb i n d i n gp r o t e i n ， d r e b ) 在研究拟南芥f f j r d 2 9 基因时发现，其启动子区有两个顺式作用元件，与其中之一 d r e c r e p e a t ( t h ed e h y d r a t i o nr e s p o n s i v ee l e m e n t c - r e p e a t ) 与d r e b 结合，该转录因子 属于a p 扼r f ( ( a p e t a l a 2 ，e t h y l e n e r e s p o n s i v ed e m e n tb i n d i n gf a c t o r ) 家族。在拟南 芥中发现了5 种d r e b 结合因子，这种基因在水稻、烟草、玉米以及番茄中也存在。通过 转基因发现，各种d r e b 转录因子所赋予转基因植物的抗性也不尽相同。例如，过量表 j 2 5 _ d r e b i a 的转基因拟南芥，显示出对抗冻、抗旱及耐高盐胁迫的特点1 6 4 - 6 6 1 ，通过芯片 及n o r t h e m 杂交分析表明，有4 0 多个基因受该基因的调控【6 7 - 6 9 1 ，而这4 0 个基因分别是与 抗逆有关的功能蛋白、胁迫相关的信号传导因子和其他转录因子。而转d r e b 2 基因的植 物却没有表现出抗胁迫的特点，或许该基因的产物需要翻译后修饰，才能表现出抗胁迫 功能嘲1 。 1 3 2n a c 转录因子 a i d a 等首先报道了n a c 的结构域，发现在矮牵牛n a m 基因、拟南芥a t a f l 2 和 c u c 2 基因编码的蛋白n 端包含一个保守的氨基酸序列，命名为n a c 7 们。目前已经发现 n a c 类转录因子在植物抗逆和防卫反应中起重要作用。n a c 转录因子的c 端是转录激活 功能区，具有高度的多样性，该末端的共同特点是一些氨基酸如丝氨酸、苏氨酸、脯氨 酸、谷氨酸重复出现的频率高。n a c 转录因子可与m y c - l i k e 元件结合，该元件的核心 序列( c a t g t g ) 在拟南芥e r d l 干旱诱导反应应答过程中起重要作用【7 ”。在拟南芥中 分离了三个e d n a 均属于n a c 转录因子，可以和e r d j ( e a r l yr e s p o n s i v et od e h y d r a t i o n1 ) 基因的启动子序列结合【_ 7 2 1 。在- 9 专n a c 转录因子基因的转基因植物中，过量表j 盘n a c 转 录因子基因，导致一些干旱胁迫的基因上调表达，并且转基因植物表现出强烈的抗胁迫 能力1 7 3 ，7 4 。 3 3 b z i p ( b a s i cl e t t c i n ez i p p e r ) 转录因子 植物碱性亮氨酸拉链( b z m ) 蛋白是一类重要的植物转录因子，b z i p 类转录因子 识别核心序列a c g t 的顺式作用元件为c a c g | t g ( g 盒) 、c a c g t c ( c 盒) 、t a c g 1 a ( a 盒) 等，一些受a b a 诱导的基因的启动子区都含有这些元件【7 1 】。在b z i p 转录因 子中，a b r e 结合蛋白( a r e b ) ，a b r e 结合蛋白( a b f ) 能够结合到a b r e ( a b a - r e s p o n s i v ee l e m e n t s ：a c g t g g t c ) 上，而a b r e 为一个主要的a b a 诱导基因的顺式作用 元件。因此，a r e b 能够激活a b a 依赖的基因表达 7 5 , 7 6 。c h o i 等用酵母单杂交的方法已 经从拟南芥中分离出逆境诱导的4 种b z i p 蛋白，分别称做a b f i 、a b f 2 a r e b i 、a b f 3 和 a b f 4 a r e b 2 1 7 5 j 。a r e b l a b f 2 和a r e b 2 a b f 4 需要a b a 的激活，因为在a b a 缺乏突变 体a b a 2 和a b a 不敏感突变体a b i l 1 中，这些转录因子的活性降低。 过量表达a b f 3 或a r e b 2 a b f 4 的转基因植株对a b a 敏感，同时增加了植物的抗旱 性 7 7 】。而a r e b l a b f 2 是葡萄糖信号的必要组份，该基因的过量表达影响了包括干旱、 盐以及热胁迫等多种胁迫的抗性1 7 。 1 3 4m y b 、m y c 类转录因子 m y b m y c 是一类和a b a 信号相关的转录因子，它们的发现是和拟南芥中一种被外 源a b a 诱导表达的干旱应答基因r d 2 2 密切相关的。但是，许多a b a 诱导基因的启动子区 都含有a b r e 一致序列，而r d 2 2 的启动子区域却不含a b r e 一致序列。这一结果表明，在 东北林业大学博士学位论文 干旱胁迫的应答反应中，除了a b r e ，b z i p 调节系统外还存在另外一个对a b a 应答的调节 系统。研究发g ) e r d 2 2 的启动子区有- - 6 7 b px e 域能调节干旱诱导基因的表达。在这- - 6 7 b p 区域内含有m y b 和m y c 的识别位点，