（化学工程与技术专业论文）咪唑类离子液体色谱填料的合成与表征.pdf

摘要 咪唑类离子液体色谱填料的制备与表征 摘要 高效液相色谱技术是目前分离、分析最常用的手段之一，液相色 谱填料是整个液相色谱系统工作的核心，因此具有重要的研究意义。 本文主要研究以活化硅胶为基质，分别键合2 一乙基咪唑和卜乙烯基 咪唑两种离子液体液相色谱填料，并对填料的色谱性能进行了考察。 得到了如下结果： 1 以活化硅胶为基质，3 一氯丙基三甲氧基硅烷为偶联剂，2 一乙基 咪唑为官能团，制备了2 一乙基咪唑色谱填料，以三甲基氯硅烷作为 封端试剂对填料进行封端处理。填料装柱后，在反相条件下，以n a n o 。 为测试物质检测了色谱柱死时间，以苯为测试物质进行了理论塔板数 的计算。并进行了芳香族化合物和黄酮类化合物的分离实验，达到了 基线分离，取得了较好的分离效果。 2 利用硅胶表面硅羟基与k h - 5 7 0 ( y 一甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧 基硅烷) 反应，以b p o ( 过氧化苯甲酰) 为引发剂，发生k h 一5 7 0 的双键 同卜乙烯基咪唑的双键聚合反应，三甲基氯硅烷为封端试剂，制备 了卜乙烯基咪唑液相色谱填料。在反相条件下，以n a n o 。为测试物质 检测了色谱柱死时间，以苯为测试物质进行了理论塔板数的计算， k h 一5 7 0 的侧链结构有效的掩蔽了未反应的硅羟基，在分析芳香族化 北京化工大学硕士学位论文 合物以及黄酮类化合物时，卜乙烯基咪唑色谱填料表现出色。并首次 尝试了离子液体色谱填料对蛋白质的分离。 关键词：色谱填料，离子液体，黄酮类化合物，高效液相色谱 i l a b s t r a c t s y n t h e s i sa n d c h a r a c t e r i z a t i o no fi m i d a z o l i u mi o n i cl i q u i d c h r o m a t o g r a p h i cs t a t i o n a r yp h a s e a b s t r a c t h i 曲p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) i so n eo ft h em o s t c o m m o nm e a n sf o rs e p a r a t i o na n da n a l y s i s s t m i o n a r yp h a s ei st h ec o r e o ft h ew h o l eh p l cs y s t e m ，s or e s e a r c ho ns t a t i o n a r yp h a s ei sv e r y i m p o r t a n t i nt h i sp a p e r , t w ok i n d so fl i q u i dc h r o m a t o g r a p h i cs t a t i o n a r y p h a s e2 e t h y l - i m i d a z o l ea n d1 v i n y l i m i d a z o l ei o n i cl i q u i d sw e r e b o n d e dw i t ha c t i v a t e ds i l i c a g e l ，a n d t h e nt h e i rc h r o m a t o g r a p h i c p e r f o r m a n c e sw e r es t u d i e d t h er e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 2 - e t h y l - i m i d a z o l ec h r o m a t o g r a p h i cs t a t i o n a r yp h a s ew a s p r e p a r e du s i n ga c t i v a t e ds i l i c am a t r i x ，3 一c h l o r o p r o p y lt r i m e t h o x y s i l a n e a s ac o u p l i n ga g e n t ，2 - e t h y li m i d a z o l ea s af u n c t i o n a lg r o u p ，a n d t r i m e t h y l c h l o r o s i l a n ea sa ne n d c a p p i n gr e a g e n t a f t e rc o l u m np a c k e d ， c o l u m nd e a dt i m ew a st e s t e d b yn a n 0 3 ，a n dt h et h e o r e t i c a lp l a t e n u m b e rw a sc a l c u l a t e db yb e n z e n e t h es e p a r a t i o ne x p e r i m e n t sf o r a r o m a t i cc o m p o u n d sa n df l a v o n o i d sw e r em a d e w eo b t a i n e dag o o d s e p a r a t i o ne f f i c i e n c ya n da c h i e v e db a s e l i n es e p a r a t i o n 2 u s i n gt h er e a c t i o nb e t w e e na c t i v es i l i c ag e ls i o ha n dk h 一5 7 0 ，1 v i n y l i m i d a z o l ew a sb o n d e do nt h es u r f a c eo ft h em o d i f i e ds i l i c ag e lv i a 北京化工大学硕士学位论文 t h ed o u b l eb o n do f k h 一5 7 0 ，w i t h b p oa sa l l i n i t i a t o ra n d t r i m e t h y l c h l o r o s i l a n ea s ae n d c a p p i n gr e a g e n t f i n a l l yw eg o t 1 一 v i n y l i m i d a z o l el i q u i dc h r o m a t o g r a p h ys t a t i o n a r yp h a s e a f t e rc o l u m n p a c k e d ，c o l u m nd e a dt i m ew a st e s t e db yn a n 0 3 ，a n d t h et h e o r e t i c a lp l a t e n u m b e rw a sc a l c u l a t e db yb e n z e n e k h 一5 7 0s i d ec h a i ns t r u c t u r e e f f e c t i v e l y m a s kt h eu n r e a c t e ds i l a n o l s t h e 1 一v i n y l i m i d a z o l e c h r o m a t o g r a p h i cp a c k i n gs h o w e do u t s t a n d i n gp e r f o r m a n c ei nt h ea n a l y s i s o fa r o m a t i cc o m p o u n d sa n df l a v o n o i d s a n di tw a st h ef i r s tt i m et h a tw e a t t e m p tt os e p a r a t e p r o t e i nb yi o n i cl i q u i dc h r o m a t o g r a p h i cp a c k i n g k e y w o r d s ：c h r o m a t o g r a p h i cp a c k i n g ，i o n i cl i q u i d ，f l a v o n o i d s ，h i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y h 北京化丁人学硕i ：学位论文 北京化工大学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 作者签名：生兰交叁 日期：兰型呈：塑 关于论文使用授权的说明 学位论文作者完全了解北京化工大学有关保留和使用学位论 文的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单 位属北京化工大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交 论文的复印件和磁盘，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公 布学位论文的全部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它 复制手段保存、汇编学位论文。 保密论文注释：本学位论文属于保密范围，在上年解密后适用 本授权书。非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授 权书。 作者签名：彭遮么 日期：型生：茎! 兰! 导师签名：星篷至 日期： 兰空虚，茎! 兰2 正文 前言 第一章绪论 色谱作为一种分离技术与方法，自二十世纪初发表第一篇论文算起，已有一 百多年的历史，虽然这种方法在前3 0 多年间并末受到应有的重视，但自4 0 年代 以后，逐渐得到发展，并且其势头越来越猛，从技术到理论，从各种分离模式到 在各个科学领域内的应用，得到了突飞猛进的发展，现在已经成为分析化学学科 中的一个重要分支【l 】。色谱技术为许多重要学科的发展做出了权大的贡献。在人 类进入2 1 世纪之后，人们面临着在信息科学、生命科学、材料科学、环境科学 等领域的快速发展的挑战，在这些领域人才的需求成为国家高度发展的至关重要 的因素。而色谱技术是生命科学、材料科学、环境科学必不可少的手段和工具。 2 1 世纪对各类分析仪器的需求量也以液相色谱仪最多。因此可以毫不夸张地说， 如果没有色谱技术的应用，自然科学和生命科学能发展到今天的这个样子是很难 想象的。 高效液相色谱( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，以下简称即h p l c ) 是二十世纪七十年代以后分析化学发展最快的分支之一，经过几十年的发展和完 善，现在已成为医学、生化、药物临床、食品、化学化工、卫生、环保检测和商 品检验等领域不可缺少的手段。而作为整个h p l c 系统核心的的色谱柱，在过去 的三十年中，高效液相色谱的发展主要体现在色谱仪器和色谱柱技术两个方面， 一方面是不同流量范围的高精度低脉动h p l c 泵、高灵敏度检测器等仪器为 h p l c 方法的建立提供了基本硬件设备，而另一方面各种不同性质固定相的研究 与开发则是h p l c 方法得到广泛应用的基础。所以说固定相的研究与开发是液相 色谱领域中最活跃和最热门的研究课题。 1 1 高效液相色谱色谱柱技术 发生在色谱柱中的分离过程，同时受热力学因素和动力学因素的控制。为了 得到满意的分离效果，首先需要考虑固定相的性质及其与溶质相互作用的强弱， 这主要体现在色谱柱填料的设计、合成及选择上。为使分离的谱带展宽尽可能地 小，就需要对柱子进行优化设计并将填料填充成性能优良的柱子。同时由于流动 北京化_ t 大学硕士学位论文 相的种类和使用条件同时影响动力学因素和热力学因素，故必须正确地选择并优 化色谱条件。当色谱柱确定后，主要是对流动相、淋洗及各种参数的选择。上述 这些问题，都涉及到色谱的基本理论。 色谱技术的理论基础可以大致归纳为色谱动力学和色谱热力学两大部分。色 谱热力学的问题，将在各具体色谱模式中加以探讨。这里，拟主要讨论色谱动力 学的几个问题。在色谱理论发展的早期，主要是借用了化工原理上的塔板概念， 形成了平衡分配的塔板理论。尔后，又针对塔板理论的不足，逐步建立并完善了 速率理论。目前，这两种理论模型仍然为广大色谱工作者所接受和使用，且具有 某种互补性。 1 1 1 塔板理论 假设有两个溶质a 和b ，将它们注入色谱柱后，便会在流动相的携带下通 过色谱柱并获得分离。在柱子出口处设置一个检测器，便能记录下流经出口的溶 质浓度的变化。这种浓度一时间曲线便是该物质的色谱图。如图1 1 图1 - 1 色谱峰及参数 f i g1 - 1p e a k sa n dt h ep a r a m e t e r s 从图1 - 1 上，可以见到溶质的色谱峰，如a 峰、b 峰。同时，也有不保留物 质和杂质形成的峰。没有峰时的信号轨迹形成基线。从色谱图上，可以直接得到 或通过计算的到一系列色谱参数，如保留时间、峰高、峰宽以及色谱柱的理论塔 2 正文 板数等。 色谱过程的塔板理论是m a r t i n 和s y n g e 于1 9 4 1 年首先提出的昭1 。尽管最初 的理论并不完备，但毕竟是对色谱过程进行描述的初次尝试。在m a r i t i n 和s y n g e 之后，s a i d 等学者也对这一理论作了完善和补充，使塔板理论为色谱界所接受。 稍后的一些时间v a nd e e m t e r 和g i d d i n g s 等从色谱动力学的观点出发，提出并 发展了色谱过程的速率理论，深入论述了影响与控制分离过程的各种因素，从而 奠定了色谱柱和色谱分离的另一个重要的理论基础。 1 1 2 色谱柱速率理论 大多数色谱工作者基本上已经接受塔板理论所提出和建立起来的描述色谱 分离过程的参数和概念。但是，严格的说，这以理论仍有着根本性的弱点和不足。 首先，在讨论塔板理论的概念时，需要引入了一个前提，即在每一个塔板中溶质 在两相间的分配达到了平衡状态。实际上，这仅是一种理想状态，正如g i d d i n g s e 3 】 所指出的那样，只当谱峰处于最高点处，两相间才接近平衡。因此，在实际运用 踏板理论是便会带来偏离和误差。其次踏板理论主要考虑的是溶质在色谱柱中的 静态分配过程而没有涉及动力学过程。它可以给出在给定色谱柱上针对给定溶质 的理论塔板数，但却不能回答引起柱效变化的复杂的动力学因素以及谱带展宽发 生的位置及特点。这方面的参数，柱系统的集合形状与参数，如填料的形状与性 质，流动相的种类和流速等，均会影响到谱带展宽与变化，并且与色谱柱的实际 操作和实际应用密切相关。v a nd e e m t e r 于1 9 5 6 年在前人工作的基础上归纳总结 并提出了描述色谱峰展宽的速率理论【4 】，用于理解和控制峰展宽的各种参数和因 素，以便进行柱子及其色谱条件的优化。在v a nd e e m t e r 之后，有不少人对这 一理论进行了补充与修正，使其更加完善与合理，同时也证明了v a nd e e m t e r 方 程确实可以比较精确地描述和计算发生在色谱分离过程中的谱带展宽的原因及 其相互关系。使其成为色谱技术中的一个最基本的理论支柱。 范式方程： h ：2 彩。+ 丝+ 丛竺! 三“ ”d， q厶 其中：厶= 之三了 万( 1 + 七) 在推导这一公式时，他认为在气相色谱中，流动相的传质阻力可以忽略不计。 但是在实际的液相色谱使用过程中，这是必须考虑的。p u r e n l l 5 】于1 9 6 0 年推导 北京化工大学硕士学位论文 出了较完整的流动相阻力项的表达式，从_ 向便得v a nd e e m t e r 万程有j 史元墨的 表达形式 ；t d p + 2 y o - ( 喇+ 警“+ 警“ 热z = 篇等 或以简式表达为：h ：么+ 一b + c “ 式中a = 2 2 d ， b = 2 2 d ( 1 + 参) ( 1 + 6 k + 1 l k 2 ) d ；8 嬲； 乙= = 一十：一 2 4 ( 1 + 七) 2 d m 万2 ( 1 + 七) 2d j 根据这一表达式，可以比较精确的预测给定的色谱柱在优化的流动相速度下 的柱效率，以及各种因素对总理论塔板高度的影响。这对于色谱柱的优化设计是 十分重要的。 1 1 3 色谱柱的类型与结构 一、色谱柱类型 高效液相色谱柱按其分离模式来分，大致可分为正相、反相、离子交换、疏 水作用、亲和以及手性等类型。表1 1 给出了这种分离模式及其所依据的分类原 理和适用范围。 4 正文 表中所列举的各种色谱模式，还可以再细分为不同的类别。例如反相色谱柱 有不同的反相配基( c 1 8 ，c 8 ，c 4 ，c l 以及苯基等) 的差异；正相色谱柱又可细分为硅 北京化工大学硕士学位论文 胶柱及各种键合正相柱；离子交换色谱柱有强阴、强阳、弱阴、弱阳之分；体积 排除色谱柱中，用子有机相的称为凝胶渗透色谱柱，而用子水相体系的称为凝胶 过滤色谱柱，总称为体积排除，又称为尺寸排阻或凝胶色谱柱。疏水作用色谱柱 虽然种类不多，但也有不同配基之分，如丁基、苯基和聚乙二醇基等。亲和色谱 柱也是一大类，可依据配基的类别或亲和作用专一性的程度而进一步细分。由子 制药工业的需求日增，手性柱近年有了很大的发展，其配基种类也急剧增加。总 之，色谱柱的种类也正不断扩大，以适应于日益开拓的领域。 二、色谱柱结构 现代的高效液相色谱柱几乎都是管状的，并多采用的直行管。这是因为在高 效液相色谱中，由于使用了高效的填料，实际并不需要很长的柱长。直型柱即利 于加工，又利于填充，是最适宜的柱型。 在高效液相色谱发展的早期，色谱工作者发现，细径柱子容易引起柱效的降 低，因此，对“无限直径效应 和管壁效应曾进行过深入的讨论【6 】。所谓无限直 径效应，系指当在一根色谱住校头中心以点进样的方式进样后，伴随着样品中溶 质谱带向柱尾的移动，必然会存在径向扩散。因此，当溶质谱带到达柱尾时就不 会仍然保持原有的“点状”，而必然扩展成“盘状”，如果柱径足够大，使得盘状 的溶质谱带到出口时还没有与柱壁接触，则可称此柱为“无限直径柱”。k n o x 认 为，当点迸样时，“无限直径”反可以用下式表示： 厂了百一 d 。6 0 d p + 4 i f d p ( 二= + o 0 6 ) y l ， 式中，d d 为填料的粒径；l 为柱长；v 为流动相折合流速，即 y ：“生 d 。 式中，u 为流动相线速度，d m 为流动相中溶质的扩散系数。 从比的公式可知，巩与填料粒径密切相关。粒径越大则达到无限直径所需 要的柱径亦越大。对于2 5 c m 长，以51 tm 填料装的柱子。反大约为3 9 m m 。 高效液相色谱柱的使用压力，以及装柱机装填时的压力都很高，因此色谱柱 需能承受5 0 m p a 以上的压力，所以柱子必须有良好的密封性能。色谱柱通常使 用带锥套的线密封连接方式。当旋紧柱头的螺帽或连接螺丝时，锥套在压力的作 用下向下方移动时，其锥套会接触柱管的锥度，而柱管锥度角度大于锥套的角度， 并且由于锥套的前端边缘很薄，这样它在挤压下受到锥面向内的压力而变形并抱 紧内管，同时与锥面的接触处会形成一圈环状的密封面，形成了线密封，这种有 金属在高的压力下变形而形成的线密封十分紧密而可靠，在耐受很高压力的同 6 正文 时，能够造成很牢靠的机械连接，达到密封效果，并使其牢牢抱紧所箍套的柱管 或连接管而不致脱落。 色谱柱的另一种不可缺少的部件是筛板或称滤网，即阻挡填料从柱中流失的 多孔网，它一般系用具有特定粒度的不锈钢粉末或镍粉在模型中烧结而成，颗粒 的间隙即为筛板的孔，控制颗粒的大小即可得到不同的筛孔。筛孔应小于填料的 直径，例如，对于粒径5 | im 的填料，使用孔径li jm 或2 1 tm 的筛板已够应用。 1 1 4 色谱柱填料常用基质 色谱技术对于填料在物理性质方面的基本要求是：1 ，具备合适的颗粒大小 和较窄的粒度分布范围，当然最好能实现颗粒单分散；2 ，具备一定的颗粒强度， 特别对于高效填料来说，应能满足在高速高压操作条件下使用的颗粒刚性；3 ， 若为多孔结构的填料，则应达到一定的孔径大小和孔径分布要求，并且应尽可能 避免形态复杂的微孔结构；4 ，在使用的条件下，填料的溶胀或收缩现象不能超 出所允许的限制范围。 一、无机基质 ( 一) 氧化铝 铝原子序数1 3 ，属周期表第主族元素，原子量2 6 9 8 1 5 ，具有3 s 2 3 p 4 外围 电子结构。氧化铝虽然是稳定的氧化物，但具有两性特性，既可呈酸性又可呈碱 性。铝在自然中含量甚丰，仅次于氧化硅，居第三位。天然的晶体氧化铝，即刚 玉，属三方晶系，比重3 9 5 4 1 0 ，硬度达9 。含微量c r 的刚玉为红宝石，含 t i 的为蓝宝石。工业上大量制备的刚玉可作为高温耐火材料或研磨材料而人工 制造的晶体则用于激光器和仪器、仪表的轴承材料。如在高效液相色谱仪中，往 复式输液泵的柱塞和止逆阀座即是以人造红宝石或蓝宝石制造的。至于用作液相 色谱填料的氧化铝，则全部是人工会成的。它们实际上是氧化铝的水合物，其分 子式为人a 1 2 0 3 n h 2 0 ，这里的n = 0 3 【7 】 a 1 2 0 3 具有独特的分子结构和表面性质，以及优是的机械强度和化学稳定性， 使得它在正相色谱和离子交换色谱模式中得到比较广泛的应用。氧化铝的修饰可 以采用两种途径。一个是利用铝羟基的反应，另一条途径是利用涂覆技术。因此 其在正相和离子交换色谱应用外，在反相高效液相色谱分离分析中也具有很好的 应用前景。 ( 二) 氧化锆 氧化锆是另一种新型而又极有希望的无机基质材料，过去几年里人们对它表 现了极大兴趔8 。9 1 。氧化锆作为常规离子交换材料，已经用于核工业中溶液再处 7 北京化工大学硕士学位论文 理、裂变产品的回收、高温离子交换分离等过程。氧化锆从1 9 7 9 年开始研究作 为h p l c 的填料。在低比表面积的氧化锆上吸附季铵盐以形成反相结构，并对其 在h p l c 中应用的可能性进行初步探讨。然而在随后几年里很少有关于这方面的 研究报道，这可能与锆在凝胶上很难得到与在后期常用的硅胶上类似的表面键合 相有一定的关系。近年来，氧化锆作为色谱填料方面的研究发展很快。并在正相、 反相、离子交换填料等方面获得了初步成效。 氧化锆有着优异的物理化学性质。氧化锆的晶体结构决定了其拥有高机械强 度与耐高温特性，晶体氧化锆熔点高达2 7 0 0 ，在5 0 m p a 的高压下，氧化锆微 球没有破裂的现象i t 0 。氧化锆具有极好的耐酸碱稳定性，p h 值使用范围达1 1 4 ， 这种特性是由于其表面结构所决定的。并且粒径、孔径可控，适合于生物工程产 品的分离，在正相色谱中，由于氧化锆对氨基等碱性集团无吸附，具有较好的峰 对称性，在用作离子交换色谱填料时不需键合就可直接使用。这些优点使它极有 可能成为将来最为通用的色谱填料基质之一。 ( 三) 可控孔径玻璃( c p gc o n 仃o l l e x tp o r o u sf l a s s ) 某些玻璃，如含硼的n a 2 0 - - - b 2 0 3 一s i 0 2 系玻璃，在热处理过程中会发生分 离现象，生成可溶于酸的n a 2 0 - - b 2 0 3 相及不溶于酸的高硅相。其中的酸可溶部 分，能以酸处理令其浸析出来，而剩余的高硅相则存留下来。在这一过程中， n a 2 0 - - - b 2 0 3 相所占的体积成为孔隙，剩余的高硅相实质上是二氧化硅。于是， 使得到了可控孔径玻璃n 1 ，。 可控孔径玻璃表面具有可以进行修饰与衍生的游离硅羟基，所以它可以通过 各种化学修饰方法而得到具有不同官能团的表面，可以用作几乎所有色谱模式的 色谱填料基质。此外，它的机械强度高，可耐受非常剧烈的、反复的处理和操作， 可以耐受数十兆帕( m p a ) 的高压而不破坏。此外，它的孔系由相分离过程形成， 因而，其孔径分布非常窄而均匀。这样的特性，使得它可以应用于酶的固定化、 色谱填料、催化剂载体和化工分离等众多的领域。 ( 四) 羟基磷灰石 羟基磷灰石也是一种可用于液相色谱填料的基质材料，主成分为羟基磷酸 钙，c 。1 0 ( p 0 4 ) 6 ( o h h 。天然的羟基磷灰石属六方晶体，由于有很好的生物相容性， 故可以用作生物医学材料，特别是牙科材料。近年来，用作人工骨髓的研究也取 得了很大进展。用作蛋白质的分离材料始自1 9 5 6 年【l 2 1 。 1 9 8 3 年，b i o r e x t 公司开始生产并销售有无定形羟基磷灰石填充的高效液相 色谱柱。实际上，这种羟基磷灰石系由很小的片状结晶所组成，因而柱效、柱子 的通透性以及柱床的稳定性均不是很好。1 9 8 6 年，5um 的球形羟基磷灰石填料 问世，随后，羟基磷灰石填料的应用有了长足的进展。 正文 羟基磷灰石有着独特的化学组成和晶体结构，使得它具有独特的分离机理。 羟基磷灰石晶体上有两种不同的晶面，形成了两种具有不同吸附特性的吸附位 点，即位于c e + 上的吸附阴离子的位点和位于( p 0 4 ) 3 。上的吸附阳离子的位点， 而o h 。不参与吸附过程。这种吸附作用机理，使得它具有很高的吸附容量。羟基 磷灰石一般不经表面化学修饰而直接用作液相色谱填料。它具有较高的机械强 度，球形的羟基磷灰石可在1 5 m p a 压力下工作。若经高温进行陶瓷化处理，可 耐受更高的操作压力。羟基磷灰石的化学稳定性较好，特别是可耐受碱性环境， 但是，它对酸性耐受性不佳。目前，羟基磷灰石填料主要用于生物分子的分离与 分析，特别是多肽、蛋白质及糖类的分离与纯化。在蛋白质分离纯化方面的应用 中，酶、抗体的分离中应用最多。 二、有机基质 ( 一) 多糖型基质材料 常见的多糖型基质材料有葡聚糖系凝胶和琼脂糖系凝胶，这类凝胶是典型的 亲水性树脂，对于水溶性生化物质有很好的相容性，所以无需改性也可以直接用 于凝胶过滤色谱。经典柱层析所用的多糖型凝胶是颗粒分布范围大部分较宽，颗 粒强度低的软胶，只能在常压和低流速下使用。后来通过制各技术的改进，相继 出现了颗粒强度较高、颗粒度较小、粒度分布范围较窄，适合于快速高效液相色 谱使用的半硬质凝胶。各种多糖型凝胶及其改性产物极为广泛地应用于生化物质 的分离纯化。 ( - - ) 聚合物基质填料 高聚合物微球作为色谱填料的基质树脂，因其可以广泛选择各种单体与交联 剂为原料，并可采用不同聚合方法来制备，所以聚合产物的结构类型是很多的。 与多糖型凝胶相比较，颗粒骨架结构具有更高的机械强度和化学稳定性是交联共 聚物微球的优势，所以更适合于经受高流速高压力操作的高效液相色谱使用。常 见的合成树脂按其结构形态与性能，有多孔与非多孔之分，有疏水性与亲水性之 分；部分树脂也可以不经改性而直接用于色谱分离分析。 三，全多孔硅胶 硅胶( s i l i c ag e l ) 的化学成分是二氧化硅。硅属元素周期表第族元素，原子 量为2 8 0 8 5 ，外层电子结构为3 s 2 3 p 2 ，它可以与氧、碳、氮、氢及卤素等形成 稳定的共价键。硅胶是应用最广泛的色谱填料，已有多种粒度和孔径( 5 4 0 0n m ) 的产品【1 3 04 1 。最常用的硅胶颗粒是由硅酸缩合后经热处理而制得。孔径在1 0 0 0 n m 以上的大孔硅胶通过增大间隙孔氧化硅的孔径，并在有机盐存在的条件下进 行煅烧而制得【l 引。近来，已合成出平均孔径大约为2 0 0 0n m 的连续硅胶柱。尽 9 北京化工大学硕士学位论文 1 1 5 色谱柱的装填 在前面章节有关色谱基本理论的讨论中可以得知，发生在色谱柱中总的谱带 1 0 正文 展宽效应与溶质在流动相中的扩散系数、溶质在固定相中的扩散系数以及流动相 的线速度、粒径等密切相关。而对于给定粒径的填料来说，能否填充成均匀而紧 密的柱床是得到高效能柱子的关键。 对于粒径较大的填料( 多用于制备色谱) ，如粒径2 0 pm 的填料，可以用干 法装填，其基本方法与填装气相色谱柱类似。但需注意的一点是，在干法填装制 各液相色谱柱时，不宜过分剧烈的振动和敲打。振动和敲打会使填料因自身粒径 的不均匀性而产生柱子整体上的不均一性，会出现较大的填料粒子靠近柱壁，而 较细粒径者则倾向集中于柱中心。这种柱内颗粒分布的不均匀性，会导致色谱柱 柱效的降低。比较好的方法是采用少量多次的方法向柱内加人填料，例如每次加 入相当于3 5 m m 柱床的填料，装一点即在实验台或桌面上垂直地轻轻磕几十 下，续加一些填料后，重复上述操作，直至填装完成。 对于现在流行的以3 1 0l am 粒径填料装填的高效分析柱，则必须使用湿法 装柱，即匀浆法装柱。因为，随着粒径的缩小，因静电作用和表面能的加大，粒 子间倾向于聚集和“黏结 ，若以干法填装，它们会黏附在连接管及柱壁上，同 时也会因强烈的静电作用被此排斥，因而难以填装出均匀而紧密的柱床。这样， 必须改以湿法装填，即将填料悬浮于适宜的液体中消除上述不良作用。但是，在 固液系统中仍然存在因重力而引起的沉降现象。粒子沉降的速度v 为： g ( c m s 1 ：2 9 a ( p - p o )。 3 6 0 0 r 式中，g 为重力加速度( c m s 2 ) ；d 为粒子直径( c m ) ；p 为粒子密度( g c r n 3 ) ； t oo 为液体密度( e g c r n 3 ) ；r l 为液体的粘度( m p a s ) 。 从上述公式可知，粒子在液体中的沉降速度，与粒径直径的平方以及液一固 密度之差成正比，而与液体黏度成反比。据此，湿法填装可以依阻止沉降的思路 分成三种：一条思路是设法寻找与硅胶密度相近的溶液，以使( p po ) 减小而降 低沉降速度。第二种方法是增加液体的黏度以阻止粒子的下沉。第三种方法是综 合利用前两种方法，尽力减小沉降并尽快地在发生较显著的沉降之前完成装柱操 作。本文采用的为第三种方法。 第三种方法填装色谱柱的过程中需要配置匀浆液，使填料颗粒悬浮于适当溶 剂中。颗粒在匀浆液中的悬浮是一种不稳定的状态，由于颗粒密度和匀浆液密度 间的差异必然引起颗粒的沉降。颗粒沉降导致颗粒随粒度大小分离，使色谱柱床 层不均匀载液流速不均匀，容易造成色谱峰展宽，柱效的下降。颗粒与匀浆液密 度之间差异越大，介质粘度越小，颗粒的沉降速度越大，因此可以根据填料的密 度、粒径等因素选择合适密度和粘度的匀浆液。 在装柱之前，先确定所用的柱型，以确定选用多大的匀浆罐体积。例如，常 北京化工大学硕士学位论文 用的“标准”h p l c 色谱柱柱管为4 6 m m x 2 5 0 m m ，其内腔体积约为4 2 m l ，约需 3 5 8 9 填料。般情况下，为保证填充的成功，需适当过量1 5 2 0 为宜。如使 用4 9 填料充填它，选择固液比约为l ：1 0 ，则匀浆罐体积以4 0 m l 为宜。若罐 体积过大，则可在匀浆罐内装入一个以惰性材料( 如聚四氟乙烯或不锈钢) 制的衬 套将其调整至所需体积。将选用的柱子以乙醇或丙酮清洗干净，并以干净的热风 吹干。 提高装柱速度主要是选择合适的装柱机，一般使用气动式注射泵能在高压情 况下提供大的流量，减少装柱时间，从而使匀浆液能够在严重沉降发生之前装柱 完毕。从装柱过程流体动力学角度分析，经气动泵加压的液体在匀浆管和色谱柱 连接的变径部分会产生湍流，对填充柱床的均匀性造成影响，安装一段预柱可以 减小这种影响，此外在填装之前最好将色谱柱和预柱中都填充匀浆溶剂，这样既 可以减少湍流，又避免包藏进去空气造成色谱填料出现空穴。 顶替液中溶有的少量气体，在装柱完成减压后会在色谱柱中生成少量气泡， 造成差的填充效果，对色谱柱效有影响。因此顶替液、匀浆液在使用前都需要进 行超声脱气处理。 1 2 离子液体介绍 室温离子液体( r o o m t e m p e r a t u r ei o m cl i q u i d s ) 是在室温( 或稍高于室温的 温度) 下呈液态的离子体系，或者说，是仅由离子所组成的液体，人们习惯叫其 为离子液体。离子液体的最早报道可以追溯到2 0 世纪初，1 9 2 9 年，s u g d e n 1 8 】 就将乙胺与2 0 的硝酸反应后，减压出去水分，之后得到油状液体，熔点为8 ， 通过元素分析表明它是一种液体盐，离子液体作为绿色化学的一个组成部分是经 过长时间的发展，逐渐收到了国内外化学工作者的重视，目前已经成为当前化学 研究的热点和前沿，有关离子液体的介绍与应用的报道大量出现，可以说，离子 液体已经成为2 l 世纪化学发展的重要方向之一l l 川。 1 2 1 离子液体种类 根据离子液体发现的先后顺序和年代可以将室温离子液体划分为第一、二代 和第三代离子液体。 1 9 4 8 年美国专利报道了主要用于电镀领域的三氯化铝和卤化乙基吡啶离子 液体，可称之为第一代室温离子液体。后来相继开发出了烷基咪唑和烷基吡啶的 其他金属氯化物盐如z n c l 2 、f e c l 3 、a u c l 3 【2 0 】等离子液体。这类离子液体的酸碱 正文 性随加入的三氯化铝的摩尔分数不同可以任意调节。例如 b m t r n o a i c l 3 离子液 体，当a 1 c 1 3 的摩尔分数x = 0 5 时为中性，x 0 5 时为酸。然 而此类离子液体有一缺点，就是在空气中很不稳定，遇水极易分解变质。由于此 类离子液体可拥有超强酸性核可调控酸碱，构成的阴离子部分价格比价低廉，此 类离子液体依然被研究和应用。到了2 0 世纪9 0 年代，稳定性更好的由二烷基咪 唑阳离子和四氟硼酸、六氟磷酸阴离子构成室温离子液体产生了1 2 ，由于二烷 基咪唑阳离子结构和化学性质特别适合作为离子液体的阳离子，相继出现了以双 三氟甲烷磺酰亚胺( t f 2 n 。) 、三氟甲磺酸( c f 3 s 0 3 - ) 等一系列阴离子的二烷基 咪唑类离子液体。同四氟硼酸( b e ) 、六氟磷酸( p f 6 - ) 阴离子相比，由上述阴 离子组成的离子液体具有黏度更小，电化学窗口更宽，化学性能更稳定的特点 1 2 2 - 2 6 1 ，所以二烷基咪唑类离子液体已经成为研究最为广泛、最深入，并且知道现 在仍被研究和应用的一类离子液体，也可称之为第二类室温离子液体。2 0 0 0 年 来，二烷基咪唑类离子液体的种类和功能被进一步的丰富，主要是思路和做法， 其中之一是将二烷基咪唑侧链引入官能团制备出功能化离子液体，从而赋予离子 液体特殊性质、用途或功能。如为了完成离子液体中手性物质的拆分、对映选择 性、立体选择性和化学选择性等反应以及分离分析等专一性任务【2 7 】，又设计合 成了各种手性离子液体，使其成为“任务专一性离子液体”( t a s ks p e c i f i ci o n i c l i q u i d ) ，可称之为第三代室温离子液体。 1 2 2 离子液体的性质 离子液体有如下特性：( 1 ) 几乎无蒸汽压，在使用、储藏中不会蒸发散失， 可以循环使用，而不污染环境；( 2 ) 有高的热稳定性和化学稳定性，在宽广的温 度范围内处于液体状态，许多例子液体的液体状态温度范围超过3 0 0 ，相比之 下水只有1 0 0 c ；( 3 ) 无可燃性，无着火点；( 4 ) 例子电导率高，分解电压( 电 化学窗口) 大，达3 5 v 多，也与电极种类等有关；( 5 ) 热容量大【2 8 1 。离子液体 所具备的这些其他液体无法比拟的性质，给大部分传统化工反应提供了改造的新 空问，使其在当今化工工程的绿色化进程中显示了巨大的潜力和应用前景【2 9 1 。 随着人们对离子液体性质的深入了解，它们在催化、有机合成、电化掣3 0 等领 域的应用研究越来越受到人们重视。 有取代基咪唑为多数离子液体的阳离子，眯唑五元杂环化合物，其结构如图 1 - 3 所示 北京化工大学硕士学位论文 h 图1 - 3 咪唑环结构 f i gl 3t h es t r u c t u r eo fi m i d a z o l er i n g 咪唑环上有一个大键：，因环上的电子数符合h u c k e l 规贝j j ( 4 n + 2 规则) ， 具有芳香性。咪唑环上的2 个n 原子应不相同，1 位上的n 原子与相邻的两个c 原子和一个h 原子形成3 个6 键，剩余l 对孤对电子提供给大键，3 位上的n 原子与相邻的两个c 原子形成2 个6 键，1 个电子提供给大键，剩余1 对孤对 电子，因此具有碱性。但由于共振作用，l 位上的h 原子也可以在3 位上，两个 n 原子成为等价的。 1 3 离子液体高效液相色谱柱填料 离子液体的优良性质，引起了科研工作者极大的兴趣，其产品数量在各个领 域呈指数级增长，在分析化学领域的气相色谱( g c ) 3 1 - 3 2 】、毛细管电泳仪( c e ) 和高效液相色谱( h p l c ) 有众多的应用。 早期的科研工作者对离子液体在高效液相色谱的应用主要集中在使用离子 液体作为流动相添加剂上【3 3 0 5 1 ，使用离子液体作为液相色谱流动相添加剂，为液 相色谱开拓了一个新的“绿色分离”领域。 h c 3 6 】等庠j r m i m + 类例子液体作为h p l c 流动相添加剂，对麻黄碱类化合物 进行分离。他们研究了不同烷基的咪唑阳离子和不同阴离子的离子液体对核苷 酸、生物碱分离的影响。发现离子液体的加入对分离效果产生很大的影响，改善 了峰型拖尾，降低了谱带展宽，并提高了分离效率，并得出结论：被分析物随着 离子的液体浓度的增大先增大后减小的规律，这主要是咪唑阳离子同硅胶表面硅 羟基竞争作用的结果p 。 在考虑到离子液体作为h p l c 流动相添加剂的作用，人们很快想到了将其应 用到h p l c 固定相上，j i a n g 3 8 】等将烯丙基烷基离子液体键合到改性的硅胶表面， 并利用反相系统对其色谱分离性能进行了检测，分离麻黄碱混合物，发现其分离 效果不如离子液体作为流动相添加剂的效果好，之后他们将甲基咪唑键合到硅胶 表面合成出一种离子交换填料，能够一次性分离1 1 种不同种类的阴离子【3 9 制j 。 经过研究发现离子液体固定相的分离机理主要是疏水作用和离子交换作用。并且 在分离芳香化合物的时候表现出同反相条件下的苯基固定相相似分离机理。 1 4 正文 1 4 本文研究内容 研究制备离子液体高效液相色谱填料的制备及表征方法，考察两种离子液体 键合硅胶填料的性能，实现了对芳香族及黄酮类化合物的分离。建立离子液体高 效液相填料对绿原酸、芦丁、金丝桃苷、槲皮素和山奈酚等化合物的分析方法。 ( 1 ) 、采用活化硅胶，分别采用乙烯基氯硅烷和k h 5 7 0 作为硅烷偶联剂， 乙烯基咪唑键合官能团，三甲基氯硅烷作为封端试剂，合成了两种离子液体高效 液相色谱填料。 ( 2 ) 、制备适合芳香族化合物及黄酮类化合物，p h 适应范围宽，耐高压、 高流速，分离效率高的离子液体固定相。 ( 3 ) 、对合成的填料分析表征、计算死时间，理论塔板数，进行色谱分析。 1 5 北京化工大学硕士学位论文 第二章3 一氯丙基三甲氧基硅烷键合2 一乙基眯唑填料的制备 2 1 前言硅胶性质 与表征 目前，高效液相色谱填料应用最广泛的固定相为硅胶及其键合相，根据统 计，以硅胶为基质的填料占整个填料组成的8 0 左右。硅胶除了具有良好的机械 强度以及容易控制的孔结构和比表面积之外，一个突出的优点就是在其表面还有 丰富的硅羟基，这是硅胶可以进行表面改性及表面化学键合的基础，因此得到了 大多数色谱工作者的青睐。 2 2 硅胶预处理及结果讨论( 用仪器及试剂) 2 2 1 主要实验仪器及试剂 加热回流装置，抽滤系统，鼓风干燥箱，真空干燥箱，2 0 的盐酸，去离子 水，5 微米硅胶。 2 2 2 预处理方法 采用酸性加热条件对硅胶进行活化。在9 0 ( 2 条件下，称取一定量的5 微米 硅胶，按照浓盐酸和去离子水1 5 。2 0 的比例配制溶液，搅拌反应4 小时，得 到活化硅胶。之后用去离子水清洗，直至去离子水呈中性。每次用去离子水清洗 后硅胶均为自然沉降。最后用0 4 5 u r n 的滤膜过滤得到活化硅胶，在1 0 0 下鼓 风干燥5 h ，之后再在真空干燥箱中8 0 下真空干燥5 h ，得到无水的活化硅胶， 储存备用。 1 6 正文 2 2 3 结果与讨论 硅胶酸化处理活化了硅胶表面的硅羟基，以便进行硅胶的表面改性。并除去 了硅胶表面的痕量金属杂质，优化了硅胶性能，减少了分析过程中不可以吸附因 素；同时还除去了在制备、运输和保存过程中的污染物。 2 3 合成反应( 仪器及试剂) 利用硅胶表面的硅羟基同硅烷偶联剂的s i o c h 3 键反应，生成稳定的 s i o s i 化学键，得到改性硅胶，之后利用硅烷偶联剂的氯丙基基团同2 乙基咪 唑的反应，即制得离子液体改性填料。 2 3 1 主要仪器及试剂 真空干燥系统，回流加热系统，3 氯丙基三甲氧基硅烷，无水甲苯，2 乙基 咪唑，三甲基氯硅烷，高纯氮气。 2 3 2 硅烷偶联剂同硅胶反应 瞄“c h 3 c o 代t 一譬趴a 1 7 北京化工大学硕上学位论文 2 3 3 功能化硅胶同2 一乙基咪唑反应 取已干燥的功能化硅胶加入到已干燥过的四口烧瓶中，量筒量取3 0 m l 无水 甲苯，加热至1 1 5 水冷凝回流。之后取2 乙基咪唑5 m l 、2 0 m l 无水甲苯的混合 物用恒压滴液漏斗缓慢滴加到上述四口瓶中，液面下n 2 气鼓入，1 1 5 。c 回流反应 2 4 h ，得3 。氯丙基三甲氧基硅烷键合2 乙基咪唑离子液体填料。采用布氏砂芯漏 斗抽滤，分别用丙酮、甲醇各洗涤三次，每次3 0