（水生生物学专业论文）鲻鱼雌雄基因组dna差异分析及性腺发育相关功能基因的克隆.pdf

中山大学硕士学位论文郝丽红 鲻鱼雌雄基因组d n a 差异分析及性腺发育相关功熊基因的 克隆 专业：水生生物学 硕士生：郝丽红 导师：张为民副教授 摘要 鲻鱼是我国东南沿海常见的经济鱼类，尤其卵巢营养丰富，可作为鱼子酱 的原料的来源，因此实现全雌鲻鱼的培育具有较为重要的实际意义和经济意义。 而鲻鱼性别的早期鉴定，对于实现全雌鲻鱼遗传育种的工作有重要的指导意义。 本研究利用r a p d 和a f l p 分子标记技术，对雌雄鲻鱼基因组d n a 的差 异性进行了探讨和分析，寻找其性别特异性d n a 分子标记。同时利用p c r 方 法从性腺中克隆了两个与性腺发育相关的功能基因一p 4 5 0 芳香化酶基因和p i w i 相关基因的c d n a 片段，为探讨其性腺分化发育的机制打下基础。 首先利用4 0 0 条r a p d 随机引物对雌雄鲻鱼的基因组d n a 进行初步筛选， 得到了雌性特异序列s 2 2 6 和雄性性别特异序列$ 6 0 。对这两条性别相关的差异 序列进行验证后，认为它们不是与性别相关的具有稳定性和可遗传性的性别特 异性探针。 利用6 4 对a f l p 引物对雌雄鲻鱼的基因组d n a 进行了差异性分析，得到 了三条性别相关的序列：m 5 ，m 4 7 ，m 4 7 。但是经过进一步的验证后，排除了 其为性别特异性探针的可能性。 以鲻鱼卵巢c d n a 为模板，用p c r 的方法克隆得到了p 4 5 0 a r o m a 的1 5 4 3 b p 的c d n a 序列，同时也克隆到了p i w i 相关基因的1 2 3 7 b p 的c d n a 序列。 将p 4 5 0 a r o m a 的c d n a 序列进行翻译，可推导出4 3 4 个氨基酸，并且c d n a 序列含有2 3 6 b p 的3 非编码区，在p o t y ( a ) 前1 8 b p 处存在a g t a a a 加尾信号。经 s m a r t ( s i m p l em o d u l a ra r c h i t e c t u r er e s e a r c ht 0 0 1 ) 分析，该氨基酸序列具有芳 香化酶的四个功能区：i - 螺旋区、o z o l s 肽区、芳香化区和亚铁血红素结合区。 利用d n a s t a r 将四个功能区的氨基酸序列与其它脊椎动物进行同源性分析，发 现与斜带石斑鱼、青鲻和黄鳝的同源性都较高，分别是8 8 o ，8 5 o 和8 3 6 ； 中山大学硕士学位论文郝丽红 进化树分析也表明鲻鱼的p 4 5 0 a r o m a 与斜带石斑鱼、黄鳝和青鲻的p 4 5 0 a r o m a 在进化上亲缘关系较近。 鲻鱼p i w i 相关基因的c d n a 序列可推导出4 1 2 个氨基酸，利用d n a s t a r 与人、小鼠、果蝇、线虫和斑马鱼的p i w i 的氨基酸序列进行同源性分析，发现 鲻鱼p i w i 与斑马鱼的p i w i 的同源性最高，为7 5 5 ；与人、小鼠、果蝇和线 虫的同源性较低，在3 0 5 5 8 8 之间。进化树分析也表明鲻鱼的p i w i 相关基 因与斑马鱼的z i w i 在进化上最相近。 对于鲻鱼p 4 5 0 a r o m a 和p i w i 相关基因在鲻鱼性腺发育过程的作用还有待进 一步的研究和探讨。 关键词：鲻鱼；基因组d n a 差异；分子标记；功能基因；p 4 5 0 芳香化酶 基因；p i w i 相关基因 - i v 中山大学硕士学位论文郝丽红 m a l ea n df e m a l eg e n o m i cd n ad i f f e r e n t i a la n a l y s i sa n dc d n a c l o n i n go ff u n c t i o n a lg e n e sf o ro v a r yd e v e l o p i n go fg r e ym u l l e t ( m u g i lc e p h a l u s ) h a ol i h o n g a b s t r a c t t h eg r e ym u l l e t ，m u g i lc e p h a l u s ，h a sb e c o m ea r li m p o r t a n tc u l t u r e df o o df i s hi n s o u t hc h i n a f e m a l eg r e ym u l l e t sa r ec o n s i d e r e dt ob em o r ev a l u a b l eb e c a u s ef e m a l e s c o u l ds e r v ea sas o u r c eo fr o ef o rf o o dp r o c e s s i n g h e n c e ，t h ec o n t r o lo ff e m a l e si n f a r m e dg r e ym u l l e t si so fi n t e r e s ta n da l s oo fc o m m e r c i a l s e xd i a g n o s i si ne a r l y s t a g e so fd e v e l o p m e n tc a np r o v i d eu s e f u li n f o r m a t i o nf o rg e n e t i cb r e e d i n ga n dw h o l e f e m a l e sc u l t u r i n g w eu s e dr a p da n da f l pt e c h n i q u e st oi d e n t i f ym o l e c u l a rm a r k e r sa s s o c i a t e d w i t ht h es e xo rs e xc h r o m o s o m e si ng r e ym u l l e t t h em a l ea n df e m a l eg e n o m i cd n a w a ss c r e e n e da n da n a l y z e du s i n gr a p da n da f l pa s s a y 。w ea l s ou s e dp c rm e t h o d t od oc d n ac l o n i n go ft w of u n c t i o n a lg e n e s - p 4 5 0a r o m a t a s eg e n ea n dp i w i l i k eg e n e w h i c hw e r ee s s e n t i a lf o rg o n a d a ld e v e l o p i n g s c r e e n i n go ft h em a l e sa n df e m a l e sd n a o ft h eg r e ym u l l e tw i t h4 0 0r a p d p r i m e r si d e n t i f i e dt w op o t e n t i a lm a r k e r st h a tp r o d u c e dp o l y m o r p h i s m sb e t w e e nm a l e a n df e m a l ed n a t h e $ 2 2 6s e q u e n c ew a sf e m a l es p e c i f i cm a r k e ra n d $ 6 0w a sm a l e s p e c i f i cm a r k e r h o w e v e r ，a f t e r f u r t h e ra n a l y z i n g ，t h e s et w os e q u e n c e sw e r e i d e n t i f i e dn o tt ob es e xs p e c i f i cm a r k e r s u s i n gt h ea f 廿a s s a ya n db u l k e ds e g r e g a n ta n a l y s i s ，t h r e em a r k e r sm 5 ， m 4 7 a n d m 4 9w e r ei d e n t i f i e dt h a tg e n e r a t e dp o l y m o r p h i cb a n d s h o w e v e r , t h e yw e r e i d e n t i f i e dn o tt ob es e xs p e c i f i cp r o b eb yf u r t h e ra n a l y z i n g t h ee d n as e q u e n c e so fp 4 5 0 a r o m aa n dp i w iw e l ei s o l a t e df r o mo v a r i a ne d n a l i b r a r y t h ee d n as e q u e n c eo fp 4 5 0 a r o m aw a s1 5 4 3 b pi nl e n g t ha n de n c o d e d4 3 4 a m i n oa c i dr e s i d u e s t h es e q u e n c et e r m i n a t e da taa g t a a as t o pc o d o na n d v 主些查兰塑主兰堡丝苎型塑竺 c o n t a i n e da2 3 6 b p3 - u h f f a n s l a t e dr e g i o na n dt e r m i n a t e di n ap o l y a d e n y l a t i o n s e q u e n c e a s m a r t ( s i m p l em o d u l a ra r c h i t e c t u r er e s e a r c ht 0 0 1 ) a n a l y s i s i n d i c a t e dt h a t t h et r a n s l a t e dp r o t e i no fp 4 5 0 a r o m ac d n ac o n s i s t e do fai - h e l i xr e g i o n ，ao z o l s p e p t i d er e g i o n ，aa r o m a t i cr e g i o na n dah e i n eb i n d i n gr e g i o n w ec o m p a r e dt h em u l l e tc y p l 9a m i n oa c i ds e q u e n c ew i t ho t h e rv e r t e b r a t e c y p l 9s e q u e n c e s ，i n c l u d i n gr a i n b o wt r o u t ，m e d a k a ，h u m a n ，c h i c k e n ，f r o g ，n i l e t i l a p i a ，r i c ef i e l de e l ，o r a n g e s p o t t e dg r o u p e r ，z e b r af i s h ，g o l d f i s ha n dj a p a n e s ee e l t h ep 4 5 0 a r o m ao ft h em u l l e ts h o w e dt h eh i g h e s td e g r e eo fs e q u e n c ei d e n t i t yt o p 4 5 0 a r o m ao fo r a n g e s p o t t e dg r o u p e r ，m e d a k aa n dr i c ef i e l de e l ，8 8 0 ，8 5 o a n d 8 3 6 r e s p e c t i v e l ya tt h ea m i n oa c i dl e v e l t h ee d n a s e q u e n c eo fp i w i l i k eg e n ew a s1 2 3 7 b pi nl e n g t ha n de n c o d e d4 1 2 a m i n oa c i d r e s i d u e s c o m p a r i s o no fg r e ym u l l e tp i w ia m i n oa c i dw i t ho t h e r v e r t e b r a t e s ，i n c l u d i n gh u m a n ，h o u s em o u s e ，d r o s o p h i l a ，e l e g a n sa n dz e b r a f i s h ， i n d i c a t e dt h a tm u l l e tp i w ia m i n oa c i dw a sh i g h l yi d e n t i c a lt oz e b r a f i s h ( 7 5 5 i d e n t i c a l ) ，w h i l et h ea m i n oa c i ds i m i l a r i t yb e t w e e nm u l l e ta n do t h e rv e r t e b r a t ew a s 3 0 5 5 8 8 f u r t h e rs t u d yw i l lb ep e r f o r m e do nt h er o l eo fp 4 5 0 a r o m aa n dp i w ii ng o n a d a l d e v e l o p i n go fg r e ym u l l e t k e yw o r d s ：g r e ym u l l e t ( m u g i lc e p h a l u s ) ；g e n o m i cd n ad i f f e r e n t i a l d i s p l a y ； m o l e c u l a rm a r k e r ；f u n c t i o n a lg e n e ；p 4 5 6 a r o m a ；p i w i l i k eg e n e v 1 - 主生查兰堕主兰垡笙壅堑堡塾 r a p d a f l p r 肿 a m p b p c d n a d d h 2 0 d e p c d n t p e b e c o l i e 1 d t a i p t g 勋 k d a m r n a o d 0 r f p c r r p m s d s p a g e v n i s t e 缩略词表 随即扩增多态性d n a ( r a n d o ma m p l i f i e d p o l y m o r p h i s md n a ) 扩增片段长度多态性( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) 限制性片断长度多态性( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) 氮苄青霉素( a m p i c i l l i n ) 碱基对( b a s ep a i r ) 互补d n a ( c o m p l e m e n t a r yd n a ) 双蒸水( d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r ) 焦碳酸二乙酗( d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e ) 脱氧核糖核苷三磷酸( d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e ) 溴化乙锭( e t h i d i u mb r o m i d e ) 大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) 乙二胺四乙酸( t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d ) 异丙基硫代一1 3 - d - 半乳糖苷( i s o p r o p y l t h i o - b d g t i l a c t o s i d e ) 千碱基对( k i l o b a s e ) 千遒尔顿( k i l o d a l t o n ) 信使r n a ( m e s s e n g e rr n a ) 光密度( o p t i c a ld e n s i t y ) 开放阅读框( o p e nr e a d i n gf r a m e ) 聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) 每分钟转速( r e v o l u n t i o n sp e rm i n u t e ) 十二烷基硫酸钠( s o d i u md o d e c y l s u l f a t e ) 聚丙烯酰胺凝胶电泳( p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t m p h o r e s i s ) 电压( v o l t a g e ) 三( 羟甲基) 氨基甲烷( t r i s ( d r o x y m e t h y l ) - a m i n o m e t h a n e ) t r i s e d l a 缓冲液( t r i s - e d t ab u f f e r ) - 8 4 中山大学硕士学位论文郝| j | i 红 1 l l 日i j舌 由于鱼类种类繁多，生活环境复杂多样，而且某些外部环境因素【m 】能在不 同程度上影响鱼类的性别分化，从而使鱼类性别决定及性腺的发育和分化机制 极其复杂。虽然受到外部环境因子的影响，但是遗传物质及一些功能基因在鱼类 性别决定和性腺发育中仍起了关键性的作用，与高等脊椎动物一样，鱼类性别决 定的基础仍然是来自内部的遗传基因【钔。 1 、鱼类性别决定的遗传基础一性染色体 地球上现存的生物种类，在个体性别方面大致可分为两类：一类是个体无性 别差异，这类生物一般比较原始、低等；另一类是个体有性别差异，雌雄异体， 多见于高等动物和部分高等植物。高等脊椎动物的性别决定系统一般较为简单， 如哺乳动物的x x x y ，鸟类的z w z z 等。几十年的细胞遗传学研究表明，鱼 类性别决定几乎包括了动物的所有性染色体类型。但是在1 9 8 5 年前已研究过染 色体组型的1 6 0 0 多种真骨鱼类中，只有7 2 种被认为有性染色体，而能从细胞遗 传学中鉴别出性染色体的不超过3 0 种。1 9 8 9 年前我国学者认为1 0 种鱼类中有性 染色体，它们是鲫fc a r e s s e sa e r a t e s ) ，胡子鲶fc l a r i e s f u s c o u s ) ，革胡子鲶fc l e a t h e r ) ，斑点胡子鲶f c - m a c r o c e p h a l u s ) ，蟾胡子鲶f c b a t r a c h u sj ，白缘 ( l e i o b a g r u sm a r g i n a t u sj ，黑缘f 三n i g r i c a u d aj ，拟缘f 己m a r g i n a o i d e s ) ，刺 鳅rm a s t a c e m b e l u ss i n e n s i sj 和短鲚fo f ? f 口b r a c h y g n a t h u sj ，后来又发现大鳞副 泥鳅fp a r a m i s g u r n u s d a b r y a n u s ) 有性染色体分化，加上国际上近年来发现的近 2 0 种有性染色体的种类，据不完全统计，可能有近1 0 0 种鱼类被认为有性染色 体， 但是在细胞遗传上能分辨出来的、具有较好性染色体形态分化的鱼类可能 只有4 0 种左右吼 作为性别决定的遗传物质，鱼类的染色体类型也是最为多样的。目前一般认 为鱼类性别的染色体决定类型主要有5 类：1 5 】 x x x y 型，即雌性同配、雄性异配型，为大多数鱼类的性染色体类型i 6 】； z w z z 型，即雌性异配、雄性同配型，在数目上z w z z 型少于x x x y 型 1 7 - 8 1 ： 中山大学硕十学位论文郝丽红 z o z z 与x x x o 型，即其中一个性别少1 个性染色体，前者为雌性配子异配， 后者为雄性配子异型1 9 】； x 1 x 1 x 2 x 2 x 1 x 2 y 型，即复性染色体型，该类型仅发现于鱼类1 1 0 】： 常染色体型。很多鱼类的性染色体之间以及性染色体与常染色体之间的差异不 是很明显，所以很难从形态上加以区分，如斑马鱼【1 1 】。 鉴别鱼类异型性染色体般用染色体显带方法( 如g 一和c 带等) 1 1 2 】和比 较基因组杂交 j - 2 f ( c o m p a r a t i v eg e n o m eh y b r i d i z a t i o n ，c g h ) 等方法【1 3 14 1 。荧光原位 杂交法( f l u o r e s c e n c e ns i t uh y b r i d i z a t i o n ，f i s h ) 也是可靠的鉴定方法【1 5 _ 1 6 1 ，但前 提条件是必须预先克隆出性别或性染色体特异的探针。 2 、分子标记技术与基因组差异显示 由于基因组水平上的差异可能较小，在没有异型性染色体分化或异型染色体 分化不明显的鱼类中寻找性别特异片段的难度较大。而能够检测基因组多态性的 d n a 分子标记技术在分离和克隆性别特异片段这方面可能有一定潜力。 2 1 d n a 分子标记技术的发展、原理及应用 2 1 1d n a 分子标记的发展 d n a 分子标记( d n am o l e c u l a rm a r k e r ) 其本质是指能反映生物个体或种群 间基因组中某种差异特征的d n a 片段。由于d n a 分子中碱基的缺失、插入、 易位、倒位、重排或由于长短与排列不的重复序列等丽产生多态性，它以个体 间遗传物质核苷酸序列变异为基础，是可遗传并可检测的，d n a 分子标记便是 检测这种多态性的技术【1 8 】。从1 9 7 4 年c o n o d z i c b e r 仓1 立限制性片断长度多态性 ( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) r f l p 技术以来，经过几十年的发展， 分子标记技术不断得到改进和完善，茹在许多研究领域得到了广泛的应用。出现 的分子标记主要分为3 类【1 7 】： 2 1 1 1 以电泳技术和分子杂交技术为核心的分子标记技术 其中代表技术有：r f l p 矛- 1 d n a 指纹技术，染色体原位杂交f c l l r o m o s o m ei n s i t uh y b r i d i z a t i o n ) 1 9 1 。r f l 卫主要是以低拷贝序列为探针进行分子杂交，d n a 指 纹技术主要是以重复序列，包括串连重复序列f 如卫星、小卫星d n a 和微卫星 中山大学硕士学位论文郝丽红 d n a ) 和散布重复序列( 如转座子、逆转座子) 为探针进行分子杂交。染色体原位 杂交是一种基于s o u t h e r n 杂交的分子标记技术。它利用特异性核酸片段作探针， 直接同染色体d n a 片段杂交，在染色体上显示特异d n a 。 2 1 1 2 以电泳技术和p c r 技术为核心的分子标记技术 其代表技术为：r a p d ( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i s md n a ) ，s s r ( s i m p l e s e q u e n c er e p e a t ) 和a f i j ( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) 2 1 1 3 第三类是基于d n a 芯片技术的分子标记，b p s n p t 2 0 1 。 其中应用最广泛的是r a p d ，a r l p 和a f l p 技术，被称为新一代分子标记。 本文主要采用了r a p d 和a f l p 分子标记技术对鲻鱼雌雄基因组d n a 进行了差异 性分析。 2 2r a p d 分子标记技术的原理，特点及应用 自从1 9 9 0 年d rw i l l i a m s 创立r a p d 技术1 2 1 以来由于其快速、准确、灵敏度 高等特点，迅速得到了广泛的应用。 2 2 ，1 基本原理 r a p d 是在p c r 的基础上，利用人工合成的一系列的寡核苷酸引物( 通常为 1 0 个碱基) 对基因组d n a 进行扩增1 2 “。 由于整个基因组内存在众多反向重复序列。单一的随机引物较低温度条件下 退火，结合在反向重复序列上。在其之间的区域内，若遗传特性发生变化，经p c r 扩增后，则导致一系列p c r 产物表现其差异性，经聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳 分离后，通过e b 染色或放射自显影，可以检测出被扩增的d n a 多态性( 见图1 ) 。 2 2 2r a p d 技术的特点 r a p d 自创立以来，以其自身的优点得到了广泛的应用，其优点主要有【冽： a 、r a p d 分子标记具有极大的丰富性，能反应整个基因组的变化。由于r a p d 是 对整个基因组d n 赴荭行分析，从理论上说可以检测到由于碱基的插入、缺失或 倒位而引起的多态性。 b 、具有高效性与灵活性，可在短期内获得大量的多态性d n a 片段，只要遗传特 中山大学硕i j 学位论文郝丽红 异性发生变化，即使亲缘关系非常近的个体也能识别。 c 、简便、快速、费用低、分子识别率高、对环境污染小等。 但是也有许多不足： a 、稳定性差：由于单链引物随机结合在众多反向重复序列上，因而每次得到的 实验结果不可能一致，r ap d 的高变异性，即使在亲缘关系很近的物种之中，其 合成的谱带也可能有差异，致使在某一杂交组合中找到的r ap d 标记，在另一 杂交组合中不一定适用。 b 、可重复性差：不同的实验室得到的结果有很大的不同 2 4 1 。由于使用退火温度 较低的随机引物，易受到外界条件影响。如：反应体系，m 矿+ 浓度，即使使用同 一引物，其重复性检测结果也会有差异。 c 、反应使用不同引物导致产物信号差异太大，无法进行比较。 a b a s es u b s t i t u t i o n sa tt h ep r i m e rb i n d i n gs i t e s 叵囹匝亟亘回 b i n s e r t i o n ，d e i e t i o nb e t w e e nt w or a p dp r i m e r s 号 砰霄i n s e r t i o nh , 彳仰 u p c r u 9 c r = = = 卫盈亡= = = 髓囫 f i g 1m o l e c u l a rb a s i so fr a p dp o l y m o r p h i s m 1 2 2 图1r a p d 技术的原理 2 3a e l p 分子标记技术的原理、特点 a f l p ( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) 是由荷兰科学家z a b e a u 和 v o s ( 1 9 9 2 ) 创立的一种新型的分子标记。af lp 技术集r ap d 和r f l p 技术 优点于一身，对基因组的多态性检测不需要预知该基因组的序列特征，易于标准 化，所检出的多态位点同r a p d 一样可覆盖整个基因组；但另一方面a f l p 标 中山大学硕十学位论文郝丽红 旧具有与r f l p 标记同样的稳定性和可靠性【2 5 】。 2 3 1 基本原理f 2 6 j ( 见图2 ) a f l p 技术是建立在基因组限制性片段基础上的p c r 扩增，由于不同物种 的基因组d n a 大小不同，基因组d n a 经限制性内切酶酶切后，产生分子量大 小不同的限制性片段，使用特定的双链人工接头与酶切d n a 片段连接作为扩增 反应的模板，接头与接头相邻的酶切片段的几个碱基序列作为引物的结合位点， 用含有选择性碱基的引物对摸板d n a 进行p c r 扩增。扩增产物经放射性同位 素标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后根据凝胶上d n a 指纹的有无来检出多 态性1 2 7 也9 1 。 2 3 2 限制性内切酶的选择 为了使酶切片段大小分布均匀，a f l p 一般采用两个限制性内切酶：一个为 多切点酶，识别位点为四碱基序列，常用的主要有胁e l 、t a q i 等；另一个为寡切 点酶，识别位点为六碱基序列，常用的有p s t l 、e c o r l 和麒n d i 等。 采用双酶切的主要原因有： ( 1 ) 多切点酶产生较小的d n a 片段，而切点数较少的酶能够减少扩增片段的数 目，因为扩增片段主要是多切点酶和切点数较少的酶组合产生的酶切片段，这样 就可以减少选择扩增时所需要的选择碱基数。 ( 2 ) 通过少数引物可产生许多不同的引物组合，从而产生大量的不同的a f lp 指 纹1 2 8 1 。 中山大学硕士学位论文郝丽红 f i g 2 s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no fa m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ( a f l e ) a n a l y s i s 1 2 2 图2a f l p 技术的分子原理 2 3 3 引物的选择 引物由三部分组成：( 1 ) 5 端的核心碱基序列，该序列与人工接头互补；( 2 ) 限制性内切酶识别序列( e n z ) ；( 3 ) 引物3 端的带有选择碱基的粘性末端( e x t ) 。 选择性碱基的种类、数目和顺序决定了扩增片段的特殊性，只有那些限制性位点 侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可被扩增。 中山大学硕士学位论文郝酣红 以目前常用的髓d 尺i 引物：和o m s ei 引物为例说明各部分的组成，图中n 代 表某个核苷酸 2 9 】。 核心顺序如f e ) e n ze x t e c o ri 引物5 二g a c t c c g t a c c a at t cn n n 3 ms ei 引物5 二g a t g a g t c c t g a gt a an n n 一3 2 3 4a f l p 技术的特点 a f l p 是在r a p d 和r f l p 的基础上发展起来的，克服了二者的缺点，结合了 其优点： ( 1 ) 方便快速，只需要极少量d n a 材料，不需要s o u t h e m 杂交，不需要预先知 道d n a 的顺序。检测信息量大，处理样品数量多，灵敏度高，易于操作，而且可 产生丰富而稳定的遗传标记f 3 0 】： ( 2 ) a f l p 分析的大多数扩增片段与基因组的单一位置相对应，因此a f lp 标记 可用于作为遗传图谱和物理图谱的定位【2 引。 灿也p 也有不足之处： ( 1 ) 不是共显性标记，扩增片段少数是共显性条带，多数是扩增片段有无显性 条带，条带统计分析难度较大。 ( 2 ) 对模板d n a 的质量要求较高，且需模板d n a 量多于2p 一引。 ( 3 ) a f l p 技术操作要求严格，扩增时有假阳性和假阴性结果以及凝胶背景杂乱 【2 7 】。 虽然有不足，但a f l p 技术以其准确性、灵敏度高，以及快速高效的特点而 得到了广泛的应用，已经成为构建高密度连锁图谱、基因定位、分子育种、基因 组多样性检测等领域的主要分子标记。 2 4r a p d 和a f l p 技术的应用 2 4 1 遗传连锁图谱的构建 由于r a p d 和a f l p 能对整个基因组进行多态性检测，因而也可以直接利用 r a p d 和舢进行基因组作图。 通过r a p d 和a f l p 分析，可以快速寻找出同某一区域连锁的d n a 标记，用 来为r f l p 连锁间隔区提供新的d n a 标记，增加r f l j 连锁图中某一特定区域 中山大学硕士学位论文郝丽红 d n a 标记的密度【3 2 。利用r a p d 和a f l p 构建遗传图谱在陆生动物 3 3 - 3 4 】、植物 基因组图谱方面已取得了大的成果i ”- 3 6 1 。近年来在水生生物的遗传图谱的构建 中也得到了广泛的应用。利用r a p d 和a f l p 分别构建了鲤科鱼类c y p r i n u s c a r p i ol ，鲶鱼c k 一口5m a c r o c e p h a l u s ，虾l f f 叩蹦口蹦s 等的遗传图谱【3 7 4 2 1 。 2 4 2r a p d 与遗传多样性研究 基因型不同的品种或不同亲缘关系的物种，基因组内核苷酸序列存在差异。 当使用同一随机引物对不同基因组体外扩增时，基因组上与引物互补的d n a 片 段( 模板) 的数目、位点是不同的，因而其扩增产物( d n a 片段1 的大小、数目也 不同，亦即扩增产物表现出多态性。当使用一系列不同的随机引物扩增时，这种 多态性更加丰富。这种扩增产物的多态性反映了被测材料的遗传多样性。因 r a p d 能反映整个基因组的d n a 多态性，所v 以r a p d 技术已广泛应用于多种动 植物的遗传多样性研究。 2 4 3r a p d 和a f l p 与标记辅助育种 通过i l a p d 和a f 凹分析可以筛选出与目标基因( 性状) 连锁d n a 片段，作 为辅助育种的分子标记。很多动植物的目标基因( 性状) 已经找到与其连锁的 r a p d 分子标记，这些标记在动植物育种中发挥了重要作用【4 3 埘】。 2 4 4r a p d 和a f l p 在分类研究、品种鉴定、突变体检测、疾病诊断、基因定 位等方面也得到广泛的应用【4 5 1 。 2 5 分子标记技术与性别或性染色体特异的探针的克隆 由于r a p d 和a f l p 技术可以产生丰富的d n a 指纹，并且操作简便、易于检 测等，在动植物基因组d n a 的差异分析方面渐渐得到应用。 j i a n g 等 4 6 】利用r a p d 对银杏雌雄植株的基因组进行分析，从产生的8 3 7 2 条 带中找到了一条6 8 2 b p 的雄性檀株特异的阳性带。 对于布鲁格丝虫阶h 舒4m a g i 是否存在y 染色体有许多争议，a n t h o n y 等利 用r a p d 技术从雄性中得到了一条2 3 3 8 b p 的片断，并进行杂交分析，从而确定了 b r u g i am a 如州为x x x y 雄性异配的染色体，并为y 染色体的作用的研究奠定了基 中山大学硕士学位论文郝甜红 础【4 7 j 。 g r i f f i t h s 等【4 8 】认为a f l p 技术是一种有效的分离性别特异性分子标记的方 法，并利用a f l p 从鸵鸟o s t r i c h 中分离出3 个与w 染色体连锁的d n a 分子标 记，从s h a g 中分离出两个性别特异的分子标记。 王艺磊等用a f l p 筛选锯缘青蟹性别差异d n a 片段，从4 3 1 2 条带中共筛选出 候选差异d n a 片段7 4 8 条【4 9 】。 鱼类的研究中，d n a 指纹技术成功地分离到了虹鳟的性染色体特异的探针。 在最初的研究中，认为虹鳟是x x x y 性别决定类型，但是y 染色体和x 染色体 在形态上十分相似，因此不能十分确定。i t u r r a 等【5 0 】利用9 0 0 多条随机引物分别 对虹鳟r a i n b o wt r o u t ( o n c o r h y n c h u sm y m s s ) 的雌雄鱼的基因组d n a 进行p c r 扩增、对比分析，o p - a i i6 5 0b p 和o p p 93 9 0b p 的多态性条带被鉴定为雄性特 异性分子标记，用其中的一个雄性特异的分子标记构建探针进行荧光原位杂交 ( f l u o r e s c e n t ns i t uh y b r i d i z a t i o n ) ，在“假定”的y 染色体上有明显的信号，从 而进一步证明了虹鳟的性染色体为x x x y 型。 a l i c i af c l i p 也利用a f l p 指纹技术从虹鳟中分离出了与y 染色体连锁的雄性 特异的分子标记o m v 一1 6 31 3 1 l 。 同样是在虹鳟中，利用r a p d 从其y 染色体上得到了一段特异序列o m y p 9 用限制性酶切o m y p 9 得到的的r s i 酶切片段可作为鉴别虹鳟雌雄性别的特异 性分子标记【5 2 】。 b a l a z sk o v a c s 等分析了非洲鲶鱼a f r i c a nc a t f i s h 的雌雄基因组，得到了两条 雄性特异的r a p d 分子标记, c g a y l f l l c g a y 2 1 5 3 1 。 m t a r i q e z a z 等在具有x x x y 性别决定型的尼罗罗非鱼o r e o c h r o m i s n i l o t i c u sz - 中，利用a f l p 分子标记技术分析，得到了三个与y 染色体相关的a f l p 分子标记：o n i y 4 2 5 ，o n i y 3 8 2 和o n i y 2 2 7 ，及个与x 染色体相关的o n i x 4 2 0 a f l p 分子标记1 5 4 1 。 2 6 性别特异性d n a 探针在鱼类性别决定研究中的应用 在鱼类中性别决定方式多种多样，高度分化的性染色体在鱼类中很少见【5 5 。 很多鱼类的性染色体之间以及性染色体与常染色体之间的差异细微，可能需要特 殊染色和经验判断，以至有些种类中是否有性染色体还存在争议，如银鲫 5 6 - 5 ”。 中山大学硕士学位论文郝瞄红 利用性别或性染色体特异的d n a 探针，可以进行性染色体的定位和鉴定，及鱼 类遗传性别的鉴定，并且对鱼类的性别决定方式的研究提供有力证据【5 ”。 利用雄性特异性的d n a 探针构建荧光原位杂交的探针p 9 a l l ，ei t u r r a 对 虹鳟的性染色体进行了鉴定，从而为虹鳟是x x x y 性别决定型的说法提供了新 的依据【5 0 】。 d e v l i n 等在具有初步性染色体分化的大鳞大麻哈鱼ro n c o r h y n c h u s t s h a w y t s c h a ) 中，发现雄性基因组比雌性基因组多了一个生长激素基因的假基因 g h p s i l 5 9 ，依据此性别特异的g h p s i 片段，h e w 等在鲑鳟鱼类中实现了遗 传性别鉴定【删。 s t e i n 等利用从大鳞大麻哈鱼中得到的段雄性性别特异的重复序列作为探 针进行荧光原位杂交( f i s h ) 对y 染色体进行了鉴定【6 1 i 。 利用性别特异i 拘d n a 分子标记作为探针进行荧光原位杂交不仅能够对性染 色体进行鉴定和定位，而且也可用来在种间进行染色体的对比研究。 i t u r r a 等【6 2 l 用从虹鳟( ( o n c o r h y n c h u s 删女船) 和大鳞大马哈鱼( o k i s “t c h ) r 扣 得到的分子标记o m y p 9 ，5 s d n a ，和g h 2 d 作为探针进行原位杂交，对虹鳟和 大鳞大马哈鱼的染色体进行了对比研究。 通过对y 染色体上的g h 假基因在四种大麻哈鱼o n c o r h y n c h u sk e t a ，d g o r b u s c h a ，0 k i s u t c h ，和o t s h a w y t s c h a 中的演化进行对比研究，d e v l i n 等认 为性染色体是在种属分化过程中的早期就开始演变的【6 3 】。 b a l a z $ k o v a c s 也利用鲶鱼性别特异性的分子标记进行了杂交分析【删。 鱼类的性别决定机制的复杂多样使得对其进行研究的思路更为开阔。性别特 异性的分子探针为鱼类性染色体的鉴定、定位、遗传性别的鉴定及其性别决定机 制的研究奠定了基础，是一种可以利用和发展的新型的方法和思路。 3 、 性腺发育相关功能基因的研究 3 1p 4 5 0 芳香化酶( p 4 5 0 a r o m ) 基因在性腺发育和分化中的作用 3 1 1i 4 5 0 芳香化酶的主要功能及特点： 鱼类性别分化中一个最显著的特点是：性腺的分化具有很大的可塑性，在性 腺分化的早期，外源类固醇处理能够改变其性别，而产生完全的性逆转陋】。 一般来说，雌