（微生物学专业论文）植物内生菌cpcc480435生物活性物质的初步研究.pdf

上海师范大学硕士学位论文中文摘要 植物内生菌c p c c 4 8 0 4 3 5 生物活性物质的初 步研究 摘要 植物内生菌作为一类生活在植物体内部的微生物，具有丰富的生物多样 性，代谢产物也是多种多样，是目前人们寻找新型抗菌、抗肿瘤天然药物的重 要资源。本研究利用上海来益生物药物研发中心的植物内生菌资源，通过特定 抗肿瘤细胞a 5 4 9 、l o v o 模型和抗菌模型的筛选，获得多株活性功能菌株，对 其中一株c p c c 4 8 0 4 3 5 进行了菌种鉴定，并对其次级代谢产物进行分离纯化和 结构鉴定研究。主要研究工作包括以下几个方面： 利用3 9 5 株植物内生真菌进行发酵，制备了7 8 0 份水相样品和7 8 0 份酯相 样品，经抗肿瘤细胞a 5 4 9 、l o v o 模型和抗菌模型初筛，初步确定活性菌株。 对初筛具有较强抗肿瘤活性的4 9 份酯相样品，进行复筛，选取1 株抗肿瘤 活性稳定且形态特殊的菌株c p c c 4 8 0 4 3 5 进行进一步研究。根据菌株的形态、 培养特征、1 8 sr d n a 以及i t s 序列分析结果，对c p c c 4 8 0 4 3 5 进行分类鉴定， 归属为茎点霉属( p h o m as p ) 。 对菌株c p c c 4 8 0 4 3 5 的代谢产物进行研究，分离纯化得到3 个次级代谢产物， 分别为c p c c 4 8 0 4 3 5 z l 3 。利用质谱和核磁共振波谱对这些产物进行结构鉴定， 确定c p c c 4 8 0 4 3 5 z l 为6 ，8 二甲基四氮萘2 ，4 ( 3 h ，1 0 h ) 二酮，分子量2 4 2 ，对a 5 4 9 、 l o v o 细胞均具有一定的抑制作用；c p c c 4 8 0 4 3 5 2 2 为2 ，4 ( 1 h ，3 h ) 嘧啶二酮，分 子量1 1 2 ；c p c c 4 8 0 4 3 5 2 3 为腺苷，分子量2 6 7 ，医学上已广泛应用，主要用于治 疗阵发性室上性心动过速( p s v t ) 类心律失常，并且根据文献调研，目前为止 还没有关于茎点霉属( p h o m as p ) 产出该化合物的报道。 关键词：植物内生菌，筛选，分离，纯化，次级代谢产物，高速逆流色谱，抗 肿瘤活性 英文摘要上海师范大学硕士学位论文 t 皿s t u d yo nb i o a c t n 7 r es u b s t a n c e so f t 皿e n d o p 丑瞪1 ： ec p c c 4 8 0 4 3 5 a b s t r a c t e n d o p h y t ei sas p e c i a lg r o u po fm i c r o o r g a n i s m s 、析t l lt a x o n o m i cd i v e r s i t y , w h i c hc a np r o d u c ev a r i o u sb i o a c t i v es u b s t a n c e s i ti sa ni m p o r t a n tr e s o u r c et of i n d a n t i m i c r o b i a la n da n t i t u m o rd r u g se t c i nt h i sr e s e a r c hw o r k , al a r g ea m o u n to f e n d o p h y t e sc o n s e r v e di ns h a n g h a ih e a l t hc r e a t i o nc e n t r ef o rb i o p h a r m a c e u t i c a lr & d ，h a db e e ns c r e e n e db a s e do nt h es p e c i a la n t i t u m o rm o d e l sl i k ea 5 4 9a n dl o v 0 c e l ll i n e s ，a n da n t i b i o t i cm o d e l s ，a n dd o z e n so fs t r a i n ss h o w e da c t i v i t i e s a m o n g t h e s es t r a i n s ，s t r a i nc p c c 4 8 0 4 3 5w a st a x o n o m i c a l l yi d e n t i f i e d ，a n di t ss e c o n d a r y m e t a b o l i t e sw e r es t u d i e d 15 6 0f e r m e n t a t i o ns a m p l e sw e r ep r e p a r e df r o m3 9 5s t r a i n so fe n d o p h y t e s a f t e r p r i m a r ys c r e e n i n go nt w om o d e l s ，w eh a dao v e r a l lk n o w n l e d g ea b o u tt h ea c t i v i t yo f t h es t r a i n s 1 1 1 e4 9s a m p l e sw i t l la n t i t u m o ra c t i v i t yi nt h e p r i m a r ys c r e e n i n gw e r e i m p l e m e n t e ds e c o n d a r ys c r e e n i n g t h es t r a i n sc p c c 4 8 0 4 3 5w a ss e l e c t e df o rf b r t h e r s t u d y a c c o r d i n gt ot h e i rm o r p h o l o g y , c u l t u r a lc h a r a c t e r i s t i c s ，18 sr d n aa n di t s s e q u e n c e s ，t h es t r a i nc p c c 4 8 0 4 3 5w a si n d e n t i f i e da sp h o m as p t h r e ec o m p o u n d sf r o mt h em e t a b o l i t e s ，n a m e da sc p c c 4 8 0 4 3 5 z l 3 r e s p e c t i v e l y , w e r ep u r i f i e db ym e a l l so fs o l v e n te x t r a c t i o n ，s i l i c ag e lc h r o m a t o g r a p h y , h s c c c ，a n dh p l cp r e p a r a t i o n m sa n dn m ra n a l y s e ss h o w e dt h a tt h em o l e c u l a r w e i g h t so ft h e s ec o m p o u n d sa r e2 4 2 ，112 ，2 6 7r e s p e c t i v e l y , a n dt h e i rm o l e c u l a r s t r u c t u r e sw e r ei d e n t i f i e da sc p c c 4 8 0 4 3 5 z l ：6 ，8 ，1 0 - t r i m e t h y l b e n z o p t e r i d i n e 2 ，4 ( 3 h ，1 0 h ) 一d i o n e ；c p c c 4 8 0 4 3 5 2 2 ：2 , 4 ( 1 h ，3 1 4 ) - p y r i m i d i n e d i o n e ，c p c c 4 8 0 4 3 5 2 3 ： a d e n o s i n e c o m p o u n dc p c c 4 8 0 4 3 5 z ls h o w e dc y t o t o x y t i e sa g a i n s ta 5 4 9a n dl o v o c e l ll i n e s c o m p o u n dc p c c 4 8 0 4 3 5 2 3 ( a d e n o s i n e ) h a sb e e nu s e dt ot r e a tp a r o x y s m a l s u p r a v e n t r i c u l a rt a c h y c a r d i a ( p s v t ) ，a n da c c o r d i n gt ot h el i t e r a t u r e ss of a r , i ti sn o t r e p o r t e dt h a ta d e n o s i n ec o u l db eb i o s y n t h e s i z e db yp h o m as p k e yw o r d s ：e n d o p h y t e ；s c e e n i n g ；i s o l a t i o n ；p u r i f i c a t i o n ；s e c o n d a r ym e t a b o l i t e s ；h s c c c ； a n t i - t u m o ra c t i v i t y i l 附录 上海师范大学硕十学位论文 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究 成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中做了明确的声明并表 示了谢意。 作者签名 论文使用授权声明 本人完全了解上海师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其它手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 7 0 储躲肋导师虢俸式荃。啉 ，f 毛。 j ：海师范大学硕f j 学位论文第一帝文献综述 曼曼曼曼曼曼曼曼曼! ! 曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼i- 一一 一一一m m 一一i 曼曼量曼曼 植物内生菌概况 第一章文献综述 1 1 植物内生菌的定义及多样性 早在1 0 0 多年前人们就己经发现在健康植物组织内部也有微生物存在，这类 微生物后来在文献中被称为植物内生菌( e n d o p h y t e ) ，但基于内生菌分离和随后的 检测方法，关于植物内生菌的定义，不同的科学家提出各自不同的观点【1 捌。 目前较常用的内生菌概念是由s t o n ej k 等提出的，是指那些在其生活史的 一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌或细菌，被感 染的宿主植物( 至少暂时) 不表现出外在病症，可通过组织学方法或从严格表面 消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接扩增出微生物d n a 的方法来注明其 内生。 内生菌不但具有种类的多样性，在植物体内的分布也具有多样性，其中以叶 鞘和种子的菌丝含量最多【3 】。 1 2 植物内生菌的起源和演化 有证据表明，植物内生菌是从病原菌演化而来的。在与宿主植物长期的共进 化过程中，一方面，病原菌可能发生影响其毒力的基因突变，这类基因的突变使 病原菌失去原有的毒力，生活在植物体内，但不再引起宿主表现出病症。某些内 生菌的回复突变，而引起宿主病变的现象也支持了这一说法。 另一方面，当侵入的病原菌毒力与宿主的防卫能力处于平衡时，病原菌也就 以内生菌的方式存在于植物体内。病原菌虽然毒力依旧，但宿主对这些病原菌的 抵抗力足以使其不表现出病症，两者能够长期共处。由于宿主本身抵抗力的减弱 而使其内生菌转变为病原菌，引起宿主病变的现象支持了这一学说。 第一章文献综述 上海师范大学硕二 ：学位论文 2 植物内生菌的作用 植物内生菌长期生活在宿主植物体内，并与宿主植物协同进化，在演化过程 中形成了密切的互惠共生关系，一方面内生菌从宿主中摄取营养供自己生长需 要，另一方面内生菌在宿主的生长发育和系统演化过程中有着十分有益的作用： 2 1 固氮作用 根瘤菌在豆科植物体内的联合固氮作用是众所周知的，但1 9 7 5 年d o b e r e i n e r 与d a y 在甘蔗体内分离到固氮螺菌( a z o s p i r i l l u m ) ，非豆科植物中的固氮菌这才 引起了世人关注。目前内生茵在非豆科植物体内的固氮作用已成为内生菌研究中 最令人感兴趣的课题之一： 2 2 促进植物生长、发育 内生菌能产生植物生长素、赤霉素以及细胞激动素等，直接促进植物生长。 也能通过增强植物吸收氮、磷等营养元素，或与病原菌竞争营养和空间或直接产 生拈抗物质而抑制病原菌，从而问接促进植物生长【4 】【5 】【6 】。有些真菌的侵染可以 破坏宿主的繁殖能力，甚至造成不育，同时又促进植物的营养生长【刀。 2 3 增强宿主植物的抗逆性 2 3 1 提高宿主植物对生物胁迫的抗性 内生真菌在提高宿主植物对生物胁迫抗性方面主要表现在阻抑昆虫和食草 动物的采食、抵抗病虫害等。 研究发现带有内生真菌的植物对害虫的拒食性和其他抗性缘于内生真菌可 在寄主体内产生毒素，主要是生物碱类、吲哚双萜生物碱、双吡咯烷类生物碱和 麦角碱等。每一种生物碱都能够阻碍或改变某些昆虫的取食行为，一些生物碱还 具有抗虫的作用。 2 f ：海师范大学硕l j 学位论文 第一章艾献综述 内生真菌还能提高感染植物的抗病性。g w i i l l l 和b e t h a r d 在对高羊茅幼苗研 究发现，内生真菌提高了高羊茅对玉蜀黍丝核病( r h i z o c t o n i az e a e ) 和褐斑病 ( r s o l a n i ) 的抵抗，但对夏斑病( m a g n a p o r t h e p o a e ) 无作用。 内生菌通过影响宿主植物的物质代谢并产生生理活性物质、与病原菌竞争生 态位和营养物质或者诱导植物产生的酚类、醌类物质在细胞间隙积累构成病原菌 进入植物体内或在植物体内运转的机械、化学屏障等方式提高宿主抵抗病原菌的 能力。 ， 2 3 2 增强宿主对非生物胁迫的抗性 在非生物胁迫方面，感染内生真菌的植株对干旱、高温等的抗性和持久性更 强。对于植物内生真菌共生体的抗旱性研究已开展较多，较普遍的看法是，内 生真菌的侵染有助于提高植物对干旱胁迫的抵抗能力【引。w h i t e 等的高羊茅内生 真菌共生体抗旱性实验表明，与未感染植株相比，感染植株叶片更厚更窄、叶卷 曲现象更普遍、根系生物量更大且分布更涮9 1 。m a r k 和c l a y 对高羊茅的光合特 性进行了研究，发现当叶温超过3 5 时，感染植株的c 0 2 交换速率比未感染植 株高2 0 - 2 5 ，这说明在高温条件下，感染植株光合作用固定碳的能力较强【i o l 。 陈世萍等证明，在正常条件下，感染内生真菌的黑麦草体内保护酶系统如 p o d 、s o d 的活性明显高于未感染内生真菌的植株，并认为内生真菌很可能增 强了植物的s o d 活性调节能力，从而对植物的抗旱性产生有益影响【1 。 2 4 产生或促进宿主产生一些抗人类疾病的药物 内生茵可产生一些重要的抗人类疾病的药物，如从紫杉中分离得到的一种内 生真菌t a x o m y c e sa n d r e a n a es t r o b e l ，该菌可产生与宿主相同的抗癌代谢产物紫 杉醇【1 2 1 ( 结构见图1 1 ) 。 有的内生菌不但可以自身合成药物活性成分，还具有促进宿主植物合成活性 成分的能力。例如，w a n g 等从中国红豆杉( t a x u sc h i n e n s 括) 中分离到的一株内 生真菌，可使红豆杉悬浮培养细胞紫杉醇的产量提高两倍f 1 3 l 。江等在研究内生菌 与龙血树d r a c a e n aa n g u s t i f o l i ar o x b 血竭形成的关系中发现，内生真菌对龙血树 3 第一章文献综述上海师范人学硕上学位论文 血竭形成具有很强的促进作用，可使血竭的形成量提高6 6 1 2 0 ；接种于死态 龙血树，同样可促进血竭树脂的形成和积累。 可见将植物内生菌接种于一些与之关系密切的药用植物，能够提高药用植物 活性成分的含量和产量，并为之提供新的途径。陈等将4 种纯培养的内生真菌分 别与金线莲无菌苗进行共培养，发现内生真菌对金线莲的生长及体内多糖合成均 具有明显的促进作用，并使金线莲的干质量最高增加了4 9 5 ，多糖量增加了1 倍左右。戴等将大戟内生菌( 镰刀菌) 的菌丝提取液添加到悬浮细胞的培养过程 中，结果大戟中皂昔类成分表现为代谢产物与生物量的双增长。目前，虽然以内 生菌为诱导子提高药用植物有效成分量的研究还不够广泛，但已预示出植物内生 菌是促进药用植物产生活性成分的最佳刺激源。 3 内生菌宿主植物的选择 研究植物内生菌首先要将其从植物中分离，自然界植物种类数目非常庞大， 选取何种植物材料来分离内生菌并进行相应的研究是一个非常重要的问题，这需 要发挥研究人员的创造性和想象力来缩小寻找有用内生菌的范围。o o c y d i n a 就 是人们从水生植物r h y n c h o l a c i sp e n i c i l l a t e a 中分离出的内生菌s e r r a t i a m a r c e s c e n s 产生的一种抗感染物质，它的结构特征是有一个含氯的大环内酯【1 4 】， 如图1 1 。 s t r o b e l 等人在选择植物进行内生菌分离及发现其天然产物中提出了以下几 个基本原则： ( 1 ) 特殊环境中的特殊植物，特别是那些具有独特生物特征及生存方式的 植物应被重点研究。红树林是生长于热带和亚热带陆海交界带上的稀有木本植 物，是由陆地向海洋过渡的特殊生态系统，因而其内生菌次生代谢产物也成为天 然产物研究的一个热点【1 5 】。 ( 2 ) 具有人类记载历史的植物，这些植物一般是通过当地居民直接接触经 验而记载下来的，他们的功能很可能是由内生菌产生的。比如有种用来治疗割伤、 伤疤和感染的蛇草k e n n e d i an i g r i s c a n s ，研究人员发现这种植物含有一种链霉菌 n r r l 3 0 5 6 2 t 1 6 1 ，从该链霉菌中分离得到了广谱的新肽类抗生素m u n u m b i c i n s 。 ( 3 ) 一些地域性植物，它们有与众不同的存活方式或只在个别地方才能存 4 一i ：海师范大学硕 j 学位论史第一章文献综述 活，这也许是我们分离得到新型植物内生菌以及新的次级代谢产物的重要来源。 ( 4 ) 生存于具有丰富生物多样性地区的植物，例如热带雨林植物，因为这 些植物的内生菌也往往具有很高的生物多样性。 图1 - 1 内生真菌中发现的紫杉醇与o o c y d i n a 4 植物内生菌中获得的抗肿瘤活性物质 药用植物次生代谢产物中含有多种抗肿瘤活性化学成分，有些活性成分已 开发成药物在临床上应用。 4 1 萜类抗肿瘤化合物 1 9 9 3 年s t r o b c l 小组首次从紫杉属植物t a x u sb r e v i f o l i a 中分离出一株内生真 菌t a x o m y c e sa n d r e a n a e ，该内生菌在培养中能产生紫杉醇( t a x 0 1 ) 和其他紫杉烷类 抗肿瘤化合物，证明了与植物长期共生的内生菌具有合成与宿主相同或相似的活 性成分的功能【1 刀。 4 2 生物碱类抗肿瘤化合物 2 0 0 0 年，张等首次报道了从长春花茎皮中分离到一株经培养可以产生长春 新碱的内生真菌9 7 c g 3 t 1 引。w a g e n a a r 等从传统药用植物雷公藤( t r i p t e r y g i u m w i l f o r d i i ) 中分离了一种内生真菌( r h i n o c l a d i e l l as p ) ，发现其能产生3 个新的 细胞松弛素( 见图1 2 中a 、b 、c ) 和一个已知的c y t o c h a l a s i ne ( 见图1 2 ) 这 第一章文献综述上海师范大学硕十学位论文 些细胞松弛素都有一定的细胞毒活性，而c y t o c h a l a s i ne 活性最耐1 9 1 。 c 图1 2 部分来自雷公藤内生真菌的松胞菌素类物质 c y t o c h a l a s i ne 球毛壳甲素a ( c h a e t o g l o b o s i n a ，结构见图1 3 ) 是一种细胞分裂抑制剂， 通过影响细胞内的收缩蛋白而抑制细胞质的分裂。张玲琪等从生长于西双版纳的 美登木( m a y t e n us h o o k e r i ) 的老叶中分离、筛选出一株内生真菌球毛壳菌 ( c h a e t o m i u m g l o b o s u m ) ，并从该内生菌的发酵产物中分离得到了球毛壳甲素a ， 由于美登木自身合成的抗癌活性成分是美登素( m a y t e n s i n e ) ，从这一研究中可 发现，植物内生真菌不仅能产生与宿主成分相同或相似的活性物质，有的还能产 生与宿主成分结构不同而作用相似的活性物质【2 0 】【2 1 1 。 尹 6 c h a e t o g l o b o s i na 鬼臼毒素 图1 - 3 球毛壳甲素a 和鬼臼毒素 o i c h 3 9 j ：海师范人学硕l ：学位论文第一帝文献综述 4 3 苯丙素类抗肿瘤化合物 1 9 9 9 年李等首次报道了从桃儿七茎中分离到一株曲霉属的内生真菌，其培养 物中含有鬼臼毒素( 结构见图1 3 ) ；2 0 0 4 年，曾等又分别从南方山荷叶和川八 角莲中分离到了能够产生鬼臼毒素类似物的内生真菌，这些内生菌分布在不同属 的植物中。 4 4 甾体类抗肿瘤化合物 z h o u 等从滇重楼中分离得到了5 0 株内生真菌，其中3 2 株内生真菌的发酵培 养物中含甾体化合物，不同菌株发酵培养物中甾体化合物的产率不同，最高的可 达2 0 8 6 2 m g l 。 5 抗肿瘤药物筛选模型的研究进展 化学药物治疗依然是人们对付肿瘤的一种重要的手段，而抗肿瘤药物大都来 源于动物、植物或微生物所产生的天然产物，那么要进行抗肿瘤药物的开发，我 们首先要建立一套高效、稳定的抗肿瘤药物筛选模型。目前为止，研究人员已经 分别从分子水平、细胞水平以及动物整体水平建立了不少的筛选方法，简单介绍 如下： 5 1 分子水平的抗肿瘤药物筛选模型 5 1 1 肿瘤血管生成抑制剂( t a i ) 高通量筛选 肿瘤的生长和转移与肿瘤区域的新生血管密切相关，肿瘤区域的新生毛细血 管是肿瘤赖以生长和生存的物质基础，肿瘤细胞需要新生血管为迅速生长的肿瘤 提供营养物质和排出废物【2 2 1 。如果对肿瘤新生血管网进行干扰、阻断和破坏，那 么肿瘤及其转移的癌细胞将失去营养和无法进行代谢而萎缩坏死。抑制肿瘤血管 形成作为一种肿瘤治疗的途径，就是抑制肿瘤新生血管的形成以达到有效抑制肿 瘤细胞的生长和转移。这种以肿瘤血管为靶标的治疗策略肿瘤血管靶向治疗 7 第一章文献综述 上海师范大学硕十学位论文 逐步发展成为当今肿瘤领域研究的主攻方向之一。 基质金属蛋白酶( m m p ) 是一类含锌的蛋白水解酶。在肿瘤血管生成过程中， m m p 参与细胞间和基底膜结缔组织的更新和重组，因此，m m p 抑制剂是一类 重要的t a i l 2 3 1 。可根据人的m m p ，建立大肠杆菌、酵母菌或昆虫细胞的表达系 统，分离纯化重组蛋白，并用这些重组酶建立适用于t a i 的高通量筛选( h t s ) 的模型。 重组受体是近年来发展起来的一项技术，可使用重组受体技术制备与肿瘤血 管生成密切相关的生长因子受体如血管内皮生长因子( v a s c u l a re n d o t h e l i a l g r o w t hf a c t o r ，v e g f ) 、碱性成纤维细胞生长因子( b a s i cf i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r ， b f g f ) 受体及其亚型等建立t a i 的h t s 模型【2 4 1 。 5 1 2 端粒酶抑制剂的筛选模型 端粒酶是一种将端粒区的重复序列加到染色体末端的逆转录酶。端粒酶核 蛋白复合物包含了两个基本组分：一个催化蛋白亚单位( h t e i 玎) 和一个模板 r n a ( h 1 r ) ，端粒酶在绝大多数肿瘤细胞中都有表达，而大部分正常的体细胞 中无端粒酶的活性。早期的研究讨论了端粒酶及其抑制剂与癌症的关系，h a r l e y 等人断言端粒酶活化是细胞无限增殖所必须的，而无限增殖是肿瘤恶变的病因， 因此抑制端粒酶活性是发现特效肿瘤药物的有效途径之一，有可能成为癌症治疗 的新靶剧2 5 】。目前人们筛选到的端粒酶抑制剂主要有以下几种： 反义寡核苷酸，硫代反义核苷酸，作用于h t e r t ( 人端粒酶催化亚单位) 的抑制剂，富含g 的单链d n a 形成的分子内g 四联体螺旋体结构g 4 作用试剂， 以及组蛋白脱乙酰酶( h d a c ) 抑制剂【2 6 1 。 以端粒酶及其抑制剂开发的新药物一般具有副作用小，特异性强，疗效好等 优点，因此广为一些专家和学者看好，但是端粒酶及其抑制剂的研发就其现状而 言，仍有许多问题有待解决，如在正常体细胞，包括有些微生物细胞中也存在端 粒酶的活性，端粒酶在抑制肿瘤细胞的同时，是否也对这些细胞产生有害作用： 端粒酶的抑制看上去似乎只在端粒较短的癌细胞起作用，而在端粒较长的癌细胞 中则需要较长时间才能起作用，且往往伴随着有毒副作用。在部分的肿瘤中现己 发现端粒延长的旁路途径，抑制端粒酶活性可能会激活这些旁路途径，还有如何 一卜海师范人学硕f ：学位论文第一帝文献综述 霉皇曼皇曼曼曼曼曼曼曼曼! ! 曼曼曼曼曼曼! 曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼 mmmmmm _m = 曼鼍量曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼! 曼皇曼量 增加端粒酶抑制剂细胞内的浓度和减少降解也是一个较难解决的问题。 5 1 3 微管蛋白为靶点的抗肿瘤药物筛选 微管是真核细胞骨架的重要组成部分，参与细胞形态、细胞内运输、鞭毛和 纤毛运动、染色体运动和细胞分裂等细胞功能。无限制的快速增殖是肿瘤细胞的 重要特点，而微管的动态聚合与解聚过程是细胞分裂中的重要环节，任何干扰这 一过程的药物都可能影响肿瘤细胞生长。多数抑制微管活性的化合物都对肿瘤细 胞生长有不同程度的抑制作用。孙婉等成功建立了以微管蛋白为靶点的高通量筛 选模型，用于抗肿瘤药物的筛趔2 7 】。 5 2 细胞水平的抗肿瘤药物筛选模型 5 2 1m t t 法检测细胞增殖的抗肿瘤药物筛选 四甲基偶氮唑盐化学名为3 ( 4 ，5 二甲基噻唑) 2 ，5 二苯基四氮唑溴盐( 3 ( 4 ，5 - d i m e t h y l - 2 t h i a z o l y ) - 2 ，5 - d i p h e n y l - 2 h t e t r a z o l i u mb r o m i d e ，m t t ) ，为一种 能接受氢离子的黄色染料，在活细胞线粒体的呼吸链中，琥珀酸脱氢酶和细胞色 素c 可使m t t 的四氮哗环开裂，生成蓝紫色的f o r m a z a n ( 甲簪) 结晶。将生成的 f o r m a z a n 结晶溶解于d m s o 后，可通过测定5 7 0 n m 处溶液的吸收值来检测 f o r m a z a n 的生产量，由于f o r m a z a n 结晶的生产量与活细胞数成正比，故可以检测 药物对细胞增殖的影响。此方法操作方便，稳定性较好，适合对大量的样品进行 高通量筛选。 5 2 2 差异性d n a 修复模型 有研究利用d n a 修复缺陷的大肠埃希菌3 4 3 5 9 1 和正常的大肠埃希菌 3 4 3 6 3 6 的差异性d n a 修复特性，建立了液体悬浮法和琼脂固体筛选方法，用 于抗肿瘤药物的筛选【2 8 】。从抗肿瘤药物的作用机理来看，多数抗肿瘤药物的作用 机制主要是作用于d n a ，而多数对d n a 有损伤的物质虽有一定毒性但也具有 抗肿瘤作用，其中毒性等副作用小的可作为抗肿瘤药物在临床上使用。不同的遗 9 第一章文献综述 上海师范人学硕上学位论文 传毒性试验靶位不同，e c o l i 差异性d n a 修复试验的靶位是d n a ，差异性d n a 修复模型利用e c o f i 差异性d n a 修复测定方法，以两个菌株经受试物处理后在 培养基上生存率的差异来判断受试物对d n a 损伤的影响，从而判断其抗肿瘤活 性，在此基础上建立了液体悬浮大肠埃希菌差异性d n a 修复方法来筛选抗肿瘤 药物，此方法简单快速，适合于需要大量处理样品的微生物发酵液的筛选；尤其是 在其基础上建立起来的琼脂固体筛选方法，与抗生素的杯碟法生物检定操作一样 简单。 5 2 3 血管内皮细胞模型以及内皮细胞和肿瘤细胞共培养模型 抑制肿瘤新血管生成的靶点，除上述的干扰血管生成因子的合成和释放以及 拮抗血管生成因子的作用外，还有抑制内皮细胞增殖及阻止内皮细胞向肿瘤组织 浸润。通过检测血管内皮细胞的d n a 合成、增殖、迁移能力以及t u b e 形成能 力进行抗血管生成药物的筛选。 血管内皮细胞是进行抗血管生成药物筛选的主要细胞，常用的血管内皮细胞 株有人脐静脉血管内皮细胞e c v 3 0 4 和牛主动脉内皮细胞b a e c 等【2 9 1 。模型的 主要检测内容如下：( 1 ) d n a 合成：血管内皮细胞的d n a 合成可以反映细胞的 增殖，d n a 合成的检测通常采用的方法为 3 h 胸腺嘧啶掺入法。( 2 ) 细胞增殖： 血管内皮细胞增殖是血管生成的重要步骤，因而能抑制内皮细胞增殖的物质就有 可能抑制血管生成。( 3 ) 细胞迁移：细胞迁移的检测有两种模型：细胞损伤模 型，用刀片在血管内皮细胞的培养皿上划出撑形损伤区，经p b s 洗涤后再用含 0 1 明胶的a m e m 培养2 0 h ；细胞用甲醇固定，g i e m s a 染色，在光镜下计数从 损伤边缘迁移出的细胞数；b o y d e n 室模型，b o y d e n 室由两层组成，两层之间 为用胶原包被的多孔( 8 l m ) 的多聚碳酸盐滤层；血管内皮细胞放置于上层，被检 测的物质于下层，共同培养6 h 后，除去上层的细胞，下层细胞用乙醇固定，h e 染色，光镜下计数进入下层的血管内皮细胞数【3 0 1 。( 4 ) t u b e 或c o r d 形成：血管 生成过程中内皮细胞会形成细胞条索，然后形成管状，体外培养的血管内皮细胞 在特定条件下也可以形成细胞条索状。血管内皮细胞在胶原凝胶中培养，3 d 后 用光镜检查血管内皮细胞t u b e 或c o r d 形成的数目。 k e b c r s 等在血管内皮细胞模型的基础上建立了内皮细胞和肿瘤细胞共培养 1 0 一卜海师范人学硕f ：学位论文 第一帚文献综述 模型，此模型可以在体外较好的模拟体内内皮细胞和肿瘤细胞的相互作用【3 l 】。肿 瘤细胞旁分泌和自分泌血管生成促进因子，可刺激内皮细胞发生迁移、t u b e 形 成。常用的有肿瘤细胞作用下的内皮细胞迁移、t u b e 或n e t w o r k 形成实验。利 用这些模型，通过检测药物对血管内皮细胞d n a 合成、增殖、迁移能力以及管 腔形成能力等的作用效果进行筛选。 5 3 器官及个体水平的抗肿瘤药物筛选模型 5 3 1 自发、诱发小鼠肿瘤模型的建立 由于小鼠与人类在遗传学、病理学、生物学许多特性方面的相似性，使它成 为人们建立抗肿瘤模型的首先动物。诱发性小鼠肿瘤模型是指利用化学致癌物诱 发实验性肿瘤的小鼠模型，目前使用较多的化学致癌物有多环芳烃类、亚硝胺和 偶氮染料等，方法有皮肤涂抹、灌注法、穿线法等【3 2 1 。自发性小鼠肿瘤模型的产 生与饲料和所处环境等有明显关系，很多肿瘤的潜伏期较长，因此实际应用较少， 时洪凯等2 0 0 7 年成功建立了小鼠结直肠自发肿瘤模型，对于我国人群中常出现 的结直肠癌药物的筛选具有非常重要的现实意义 3 3 】。 5 3 2 移植小鼠肿瘤模型的建立 同种移植是将可移植的肿瘤移植于同系或同种受体小鼠。异种移植的小鼠肿 瘤模型是指将人类肿瘤移植在小鼠身上使其生长发育。目前有以下几种移植方法： 组织块移植法；细胞种植法；肾包膜下移植法。 以往主要是将肿瘤组织移植n d , 鼠的免疫抑制部位，但该法难度高，成功几 率小，裸鼠由于先天无胸腺而免疫功能缺陷，使人类肿瘤获得较高的移植成功率， 并基本保存原有结构、功能等一系列特点，且生长稳定，从而成为肿瘤实验性研 究的理想模型。但裸鼠仍具有体液免疫功能，不是研究免疫治疗方法的最理想模 型。1 9 8 3 年，b o s m a 等首次报道了细胞和体液严重联合免疫缺陷的近交系小鼠 s c i d 小刚3 4 1 。因s c i d 鼠同时缺乏t 细胞和b 细胞，与裸鼠仅缺乏t 细 胞有极大不同，因而其应用价值远高于裸鼠。在s c i d 鼠体内进行人免疫功能重 第一章文献综述卜海师范大学硕j ：学位论文 建的成功，解决了长期以来动物模型不能确切反映人体免疫系统的特点以及研究 人体免疫应答仅限于体外实验的难题。陈鹏等也曾成功地将s h z 2 8 8 大鼠乳腺癌 细胞株接种雌性s d 乳鼠，成瘤后植入去胸腺s d 大鼠腰椎内，制成大鼠脊柱种 植性肿瘤的动物模型，用于肿瘤机理的研究和抗肿瘤药物的筛选【3 5 】。 高苒等将表达红色荧光蛋白b 1 6 细胞接种到绿色荧光转基因小鼠皮下，建立 双荧光小鼠肿瘤模型，采用活体荧光成像仪和荧光显微镜可在整体和细胞水平直 接观察肿瘤的生长以及肿瘤与宿主的相互作用【3 6 1 。 5 3 3 转基因小鼠肿瘤模型的建立 转基因小鼠是指通过不同的方法将外源基因导入小鼠受精卵，然后产生携带 外源基因的小鼠品系，并能通过生殖细胞将外源基因传递给后代的小鼠。转基因 小鼠技术创立后，被迅速用于创建转基因的肿瘤小鼠模型。乳腺癌的转基因小鼠 模型是相对成熟的一种。l i 等利用小鼠乳清酸蛋白w a p 启动子和猴病毒s v 4 0 大t 抗原构建了乳腺癌w 廿t a g 转基因小鼠模型3 7 1 。 5 3 4 体内血管生成模型 体内血管生成模型包括鸡胚绒毛尿囊膜、兔角膜血管生成等异源模型，以及 近年建立的模拟人体内血管内皮细胞受诱导形成新生血管过程的多种人源体内 血管生成模型。 鸡胚绒毛尿囊膜( c a m ) 和卵黄囊膜( y s m ) ，法最初是胚胎学家研究胚胎 组织移植物的发育潜能的方法【3 引。1 9 7 5 年f o l k m a n 研究小组将c a m 法应用到 肿瘤诱发血管生成的研究中。鸡蛋7 2 h 孵育后去除白蛋白以减少壳膜的粘附性。 然后移植物通过壳膜上的开口种植到c a m 上，3 - - 4 d 后移植物周围典型的放射 状排列的血管就是形成的新生血管。进入移植物的血管通过显微镜检测计数。无 菌的玻璃纤维滤纸盘可以用来诱发c a m 的血管生成。a u e r b a c h 建立了另外一 种c a m 法，将无壳的鸡胚胎培养在培养皿中，这样操作和观察更为方便。c a m 法的优点是简单、方便、价格便宜、观察指标明了，适合于大规模的筛选，是目 前较常用的体内模型【3 9 1 。 1 2 j ：海师范火学硕f j 学位论丈第一章文献综述 量曼量曼曼曼曼皇蔓曼曼曼曼菖m = mm = m = m 璺曼曼曼曼皇曼鼍曼曼曼曼曼曼曼曼皇曼曼曼曼曼曼曼曼詈曼量曼曼曼曼! 曼曼曼! 量曼曼皇 角膜评价法被认为是一种最好的定性的方法，应用这种方法对大量的组织、 细胞、细胞提取物、细胞培养基质的促进或抑制血管生成的作用进行了研究 4 0 j 。 现在可用h y d r o n 制成含b f g f 及待测物质的小丸。评价的方法是移植5 7 d 后 处死动物进行评分：( ) 无血管生成，( 4 - ) 可疑阳性，( + ) 出现毛细血管环或 芽。角膜是无血管的，因此只要发现血管进入角膜就可以认为是血管生成，可以 避免其他模型中的原有血管干扰的影响【4 1 1 。与c a m 相比，角膜评价法技术要求 高、费用相对多，不适合进行大规模的筛选，可用于进行深入细致的抗血管生成 药物的评价。 5 3 5 斑马鱼在抗血管生成药物筛选中的应用 近年来，斑马鱼逐渐被用于筛选抗血管生成药物。其胚胎早期发育的过程中， 血管生成的模式比较简单，主要出现在头部和躯干部体节间，体节间的血管最初 由背部的动脉出芽形成于相邻体节之间。可见斑马鱼胚胎是一种理想的抗血管生 成药物的筛选模型4 2 ，4 3 】。p a r n g 等利用此模型筛选药物，在9 6 孔板上用药物处理 胚胎，通过血管内源性碱性磷酸酶染色来显示血管，进而评价药物对血管生成的 作用。c r o s s 等研究发现血管荧光标记的转基因斑马鱼可用来快速筛选抗血管生 成药物，认为其有潜力成为一种高通量筛选模型。一些抗血管生成药物如 s u 5 4 1 6 、s u 6 6 6 8 、t n p 4 7 0 作用于斑马鱼的效果与在哺乳动物中的相近，证实 了利用斑马鱼筛选抗血管生成药物的有效性【删。 分子、细胞水平等体外模型的优点是实验容易控制，操作较简单，实验费用 较低，样品所需量较少，适合用于大规模的高通量初步筛选；体内模型的优点是 实验条件比较接近今后药物使用的环境，但实验比较复杂且费用较高，适合于对 活性较高且稳定的化合物进行进一步的深入研究。 尽管人们在植物内生菌的起源、入侵机理、种类、生态分布和资源开发等 研究方面取得了可喜的成就，但是对很多问题还不是很清楚，缺乏全面系统的 研究，研究过程中仍然存在着许多有待解决的问题，具体的包括以下4 个方面： 第一，即使我们用不同的培养基来培养植物组织，也不能保证所有生活在植物 组织内的真菌全被分离出来，可能有的内生真菌不能在人工培养基上生长；第 二，虽然我们分离到的内生真菌，并在各种培养条件下进行产孢诱导，但有的 1 3 第一章文献综述上海师范大学硕七学位论文 菌株在人工培养基上不产生有性或无性孢子，这些不产孢菌株无法用经典形态 学方法进行鉴定。第三，在内生菌产生活性成分的培养条件方面：一般条件下 内生菌产生活性成分的量较低，而且在多次传代后，内生菌的生物学特性易发生 退化，导致所产生的有价值化合物不稳定；第四，在作用机制研究方面的研究涉 及多个学科范畴，植物药学领域的研究人员不可能全面精通微生物学、药用植物 学及分子生物学方面的知识，因此，对于内生菌产生植物活性成分或促进药用植 物产生活性成分的机制研究还有待于多学科研究人员的共同努力和合作。 6 立题依据 近些年的研究证实了生活在药用植物组织中的植物内生菌不仅能够参与植 物次生成分的合成，或对植物次级代谢产物进行转化，有些还能够独立产生与宿 主相同或类似的活性产物。总之，植物内生菌生活环境的特殊性决定了其既有理 论研究的广度和深度，又有多方面的应用潜力，是个潜力巨大、尚待开发的微生 物新资源。 本课题的研究是利用上海来益生物药物研发中心的植物内生菌资源，通过 m t t 法测定抗肿瘤细胞a 5 4 9 、l o v o 模型的筛选，获得活性菌株，对它们的代 谢产物进行研究，建立植物内生真菌代谢产物的化合物库。对从发酵液分离得到 的化合物，进一步进行体内外模型的活性筛选，为确认其是否能成为候选药物的 研究打下基础。 7 实验方案 利用上海来益生物药物研发中心的植物内生菌资源，根据本课题立题的目 的，对实验方案设计如下： 1 4 ( 植物内生菌的活化) ( 垄壁堂曼塑鱼j c 王e (复筛) 醪鼬 第二章植物内生真菌活性菌株的筛选上海师范大学硕十学位论文 第二章植物内生真菌活性菌株的筛选 1 试验材料 1 1 菌株 植物内生真菌：上海来益生物药物研发中心菌种室保藏。 1 2 主要实验试剂 葡萄糖： 复合氨基酸： 大豆卵磷脂 干酪素： 药媒： 蛋白胨： z n s 0 4 7 h 2 0 ： m t t 1 3 主要实验仪器与设备 1 6 a v a n t i r m j 2 5 高速冷冻离心机： h x - 1 0 5 0 恒温器 h 8 5 全自动湿热灭菌锅： d z f 6 0 2 0 型真空干燥箱： n i k o n e 1 0 0 型显微镜： m k 2 全自动酶标仪 冷冻干燥仪： b l 6 0 0 电子天平： 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 康明威试剂公司 康明威试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 北京中棉紫光生物科技有限公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 a m e r s c o 美国b e c k m a n 北京博医康实验仪器有限公司 日本h i r a y a m a 上海益恒实验仪器有限公司 日本n i k o n t h e r m of i s h e r c h i s t 德国s a r t o r i u s f ：海师范大学硕卜学位论文第二章植物内牛真菌活性菌株的筛选 i 一一一一一一一 - - 一i ni n ee l mo i,- , 曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼皇曼量曼 1 4 主要培养基 1 ) 斜面培养基( ) ： 改良p d a 培养基 土豆汁 2 0 0 生物素 o o l 琼脂粉 2 0 2 ) 种子培养基( ) ： 黄豆粉 2 o 葡萄糖 1 0 p h自然。 3 ) 发酵培养基( ) ：