（控制理论与控制工程专业论文）转基因微细作业系统中超微量注射控制器的研制.pdf

摘要 转基因是近年来在生命科学领域广泛应用的新兴技术，目前8 0 以上的转 基因动物模型是利用显微注射法构建完成的。外源基因的注射关系到细胞的容 受量及其成活率。本文围绕着转基因微注射系统中的超微量注射控制技术进行 了以下几方面的研究工作： 根据转基因超微量注射操作作业的特殊要求，设计出气压电控式超微量注 射控制器。就微注射的气路设计中涉及的流体理论进行了阐述，并对微管道中 各种影响流量控制的因素做了研究。此外，就微针端内径、出流量的测量进行 了理论讨论和方法阐述。对出流量与诸影响因素间的关系进行了理论推导和试 验测试。设计出的系统经实际试用表明，宜人性强，可控性好，重复精度高， 能够满足转基因注射精细操作的需要。 关键词：转基因超微量注射气压电控 a b s t r a c t g e n et r a n s f e ri san e wa n dw i d e l yu s e dt e c h n o l o g yi nb i o s c i e n c ef i e l d a tp r e s e n to v e r8 0p e r c e n to ft r a n s g e n i ca n i m a lm o d e l sa r ec o n s t r u c t e db y m e a n so f m i c r o i n j e c t i o n t h ed e s i r e dv o l u m e o f e j e c t e df o r e i g ng e n e i s d e t e r m i n e db yt h eh o l d i n g c a p a b i l i t y o ft h er e c i p i e n tc e l l sa n dt h ea c t u a l e j e c t e dv o l u m eo ff o r e i g ng e n ew i l lg r e a t l y i n f l u e n c et h es u r v i v a lr a t ea n d e x p r e s s i o nr e s u l t t h em a i nr e s e a r c hw o r k sc a r r i e do u ti nt h i sp a p e ra r ea s f o i l o w s ： m a n y l i t e r a t u r e si nt h ef i e l d so f t r a n s g e n i ct e c h n o l o g y , t r a n s g e n i c e q u i p m e n ta n dm i c r of l o wc o n t r o lt e c h n o l o g ya r ec o n s u l t e da n da n a l y z e d a c c o r d i n gt ot h er e q u i r e m e n t so fa c c u r a c y ，r e p e a t i n gc a p a b i l i t y ，a g r e e a b i l i t y ， c o m p a t i b i l i t yw i t h e n v i r o n m e n ta n db i o l o g ys u b s t a n c e ，ak i n do fe l e c t r i c a l c o n t r o lm i c r o i n j e c t i o ns y s t e mw i t hg a sn i t r o g e na si n j e c t i o np r e s s u r em e d i u m w a sc h o s e na sd e s i r e d a c c o r d i n gt ot h ef l o wc h a r a c t e r i s t i c sa n dt h et i ps h a p eo ft h ei n j e c t i o n p i p e t t e m e a s u r e m e n to fe j e c t i o nv o l u m ea n dt i p s i z eo ft h ep i p e t t ew e r e e x p l o r e dt h e o r e t i c a l l ya n dd e s c r i b e dm e t h o d i c a l l y k e y w o r d s ：t r a n s g e n i c ，m i c r o i n j e c t i o n ，e l e c t r i c a lc o n t r o l ，g a sm e d i u m 第一章绪论 1 1 转基因动物的定义与发展历史 转基因动物( t r a n s g e n i c a n i m a l ) 是指在基因组内稳定地整合以实验方法 导入的外源基因，并且外源基因可以稳定地遗传给后代地遗传工程动物。1 9 7 4 年，贾因利斯( j a e n i s h ) 和明茨( m i n t z ) 应用显微注射法闭，在世界上首次成 功地获得了卢 ，4 0 d n a 转基因小鼠制备，制各过程如图1 1 闭。1 9 8 0 年，戈登 ( g o r d o n ) 等人首先育出带有人胸苷激基因的转基因小鼠。尤其是帕尔米特 ( p a l m i t e r ) 等人于1 9 8 2 年将大鼠的生长激素基因导入小鼠受精卵的雄原核中， 获得了比普通对照小鼠生长速度快2 4 倍、体形大一倍的转基因“硕鼠”，从 此转基因动物技术轰动了整个生命科学界。它使人们看到了利用此技术在建立 人类疾病动物模型、加速动物育种、研究真核生物基因表达调控机制，以及在 哺乳动物特异组织系统内生产人的药用蛋白等方面令人鼓舞的前景。在随后的 十几年里，转基因动物技术飞速发展。转基因兔、转基因绵羊、转基因猪、转 基因牛和转基因山羊陆续育成。除哺乳动物外，科学家还分别育成了转基因鱼 和转基因鸡。这些开创性的工作使人们可以从分子、细胞和个体多水平层次， 从发育时间和组织生理空间多角度、立体地研究基因的功能，使人类按照自己 的意愿修正和改造物种。 1 2 转基因动物的制备 基于基因工程的基本原理与技术方法，生产转基因动物的关键技术包括： 外源目的基因的制备；外源目的基因有效地导入生殖细胞或胚胎干细胞；选择 获得携有目的基因的细胞，选择合适的体外培养系统和宿主动物：转基因细胞 胚胎发育及鉴定；筛选所得的转基因动物品系。 转基因动物研究的核心技术是如何成功地把目的基因转入动物早期胚胎细 胞中。目前，制各转基因动物的主要方法有基因显微注射法、转录病毒感染法、 胎干细胞转移法和精子载体导入法等。下面分别对其原理与方法做一简要介绍： 广东工业大学工学硕士学位论文 融国 臻谯4 谶 1 撇触 蟪备黼循乖蘸 图1 1 转基因小鼠的制各过程 f i g u r e1 - 1t h ep r e p a r a t i o np r o c e d u r e o ft r a n s g e n i cr a t 1 2 1 原核期胚胎显微注射法 基因显微注射法是由美国人戈登( g o r d o n ) 发明的，也是一种比较经典、 应用比较广泛、效果比较稳定的转基因导入方法。首例表达人胸苷激酶基因、 生长激素基因的转基因小鼠都是利用这种方法获得成功的。采用这种方法已成 功培育出转基因小鼠、绵羊、兔和牛。目前8 0 以上的转基因动物模型都是利 用显微注射构建完成的嘲。 基本原理是；通过显微操作系统将外源基因直接用注射器注入受精卵( 雄 原核内) ，利用受精卵繁殖中d n a 的复制过程，将外源基因整合到d n a 中， 再发育成转基因动物。具体而言，基因显微注射法主要包括以下几个步骤： 1 ) d n a 的制备与纯化； 2 ) 动物的挑选、超排卵与取卵； 3 ) d n a 的显微注射； 2 ： 移一一 密寸 寓 j l ： n 一 勤辞 4 ) 卵的转移； 5 ) 转基因动物的获得。 1 _ 2 2 反转录病毒感染法 4 1 反转录病毒的核酸为一条单链r n a 分子。病毒进入细胞后，r n a 首先编 码出反转录酶，在酶作用下，病毒r n a 反转录为双链分子，d n a 通过种尚 未明确的机制整合到宿主细胞d n a 中。因此，如果将目的基因重组到反转录病 毒载体上，人为感染着床前或者床后的胚胎，或直接将胚胎与能释放反转录病 毒的单层培养细胞共孵育以达到感染的目的，就可通过病毒将外源目的基因插 入整合到宿主基因组d n a 中。由于反转录病毒的高效率感染和在宿主细胞d n a 的高度整合特性，借此可以大大提高基因转移的效率。应用该方法已成功培育 出转基因鸡和转基因牛。 1 2 3 胚胎干细胞方法 目前，胚胎干细胞方法在转基因小鼠制备上应用比较成熟。胚胎干细胞( e s ) 是从早期胚胎内细胞团( i c m ) 中分离出来的，能在体外培养的种高度未分 化的多能细胞。在某种意义上也可以说，它是一种含正常二倍染色体的具有发 育全能性的细胞，能分化为成体细胞的所有组织( 包括生殖细胞) 。胚胎干细胞 方法是将基因导入胚胎干细胞：然后将转基因的胚胎干细胞注射于动物囊胚后 可参与宿主的胚胎构成，形成嵌合体，直至达到种系嵌合。因此，可以将其作 为一种载体，导入外源基因，获得转基因动物。 1 2 4 精子载体法 精子载体法是一种直接用精子作为外源d n a 载体的转移方法。基本原理和 方法是：精子直接与外源d n a 混合培养，外源基因可以直接进入精子头部，受 精后就可发育成转基因动物。后来罗特曼( r o t t m a n ) 对此方法进行了改进， 将外源d n a 在与精子共孵育之前用脂质体包埋，使脂质体与d n a 相互作用形 成脂质体一d n a 复合物。这种复合体比较容易和精子细胞融合，从而进入细胞 内。 3 广东工业大学工学硕士学位论文 1 3 转基因动物技术研究的意义 转基因动物技术是在2 0 世纪8 0 年代初发展起来的。从这项技术诞生的那 天起，它就在改良畜禽生产性状、提高畜禽抗病力以及利用转基因畜禽生产非 常规畜牧产品( 如人类药用蛋白) 等方面显示了广阔的应用前景1 5 。随着基因工 程技术的不断发展，转基因动物技术将会不断得到完善，从而在未来畜牧业、 基因药物生产中大显身手嘲。目前，转基因动物技术的应用主要有以下几个方面： 1 3 1 转基因动物模型与基因治疗 由于外源基因可在转基因动物细胞中整合表达，并接受受体基因组遗传背 景的调控，因此可以把转基因作为一个理想的功能标记建立相应的动物模型。 目前所取得的一些成就都得益于转基因动物模型的建立，如：基因协同表达、 复合型启动子，增强子、外源基因的反馈调节以及染色体重组等。迄今，利用转 基因动物模型的研究己深入到生物学基础理论研究的各个方面，如遗传学、发 育生物学、胚胎学、组织学、免疫学、药理学、生理学、生物进化学等。目前， 可以通过精确地失活某些基因或增强某些基因的表达来制作各种研究人类疾病 的动物模型。通过这些模型的建立，将有助于预防和治疗这些疾病。 1 3 2 优良动物育种 采用转基因动物育种技术具有常规育种技术无可比拟的优势：周期短、成 本低、选择效率高、不受有性繁殖的限制等。因此这方面的应用也是转基因动 物最具经济开发前景的应用领域之一。目前，转基因技术已被用于提高生产速 度、动物抗病育种、提高绵羊等的产毛性能及抗冻品种培育等领域。 1 3 3 在医药领域的应用 利用转基因动物生产人力药用蛋白等非常规畜牧产品，是目前世界上转基 因动物研究的热点之一。其中，通过动物乳腺生物反应器生产人类药用蛋白的 研究已取得了初步成功。此时的转基因动物不在于动物本身，而是它们身上产 出的乳汁可以提取一系列活性物质，它们中的每一只都可称为一座天然基因药 物制造厂。 4 1 3 4 在异种器官移植中的应用 生产可用于人体器官移植的异种器官可能是解决世界范围内普遍存在的器 官短缺的有效途径，目前对器官供体动物研究较多的是猪。任何器官的移植， 包括脑在内，在外科手术上都已经不成问题。移植的主要障碍在于免疫排斥， 使器官失去功能。这可以通过转基因技术得到解决，即建立免疫排斥相关基因 转基因猪。当然受体的排斥反应是多样和复杂的，对此科学家正在积极寻找解 决此类反应的办法。 1 4 转基因微细作业系统的组成 微操作系统是多学科理论成果相结合的高科技产物，它融微流体动力学、 自动化控制理论与应用、计算机科学与应用以及精密机械加工、显微生物操作 技术为一体，对系统整体的安装精度、运动精度和定位精度均有很高的要求口l 转基因微细作业系统由显微镜子系统、作业台子系统和微操作子系统三部分组 成。显微镜子系统用以监视注射的操作过程。作业台子系统用以移动对象物， 使操作对象进入视场。微操作器子系统用以在视场内固定细胞并进行基因注射 作业。 1 。5 显微注射技术现状 微注射方法有包被针尖、被动注射和直接压力方法。 在包被针尖法中，将针尖( 密闭针) 浸到即将导入到细胞的物质溶液中。 微注射针刺入细胞，样品在细胞质中溶解。这种方法既快又简单，但对实际上 导入细胞中样品的量难以控制。 在被动注射法中，针中充满注射溶液。溶液的填充是依赖虹吸作用，即将 针管末端插入溶液中使其针头充满溶液，也可将针头置于一定体积样品，使针 的开放端由于虹吸作用而充满。将针刺入细胞中，样品被动地流入细胞中。这 种方法避免了包被针尖方法所遇到的许多问题，包括由于针尖干燥使样品变性 问题。另一个优点是导入到细胞中的物质浓度是已知的，但控制注射的量极为 困难。这是由于时间、位置以及导入样品进入细胞的速度无法精确控制。 在直接压力法中，直接加压显微注射目的是在特定时间和位置，将一精确 5 广东工业大学工学硕士学位论文 体积的已知浓度的物质，精确地导入到细胞中。通过谨慎的操作，可以通过滴 定确定细胞对特定物质成分的反应。直接压力法中，空气一水银微注射方法和 液压，往复注射方法( h i r a m o t o19 7 4 ) 是最广泛使用于导入已知体积的方法( 如 皮升或更小) 。这些方法也可以用于从细胞特定区域及细胞质转移中抽吸回收物 质( b a r k e r1 9 1 1 ，1 9 1 4 ；b r i g g s 和k i n g1 9 5 2 ；g u r d o n1 9 6 2 ；g u r d o n 和 w o o d l a n d1 9 6 9 ；g r a e s s m a n n1 9 7 0 ，1 9 8 3 ：s i l v e r1 9 8 9 ) 。 空气一水银微注射方法的原理简单明了：水银具有较大的表面张力，水银 滴可作为一种很好的压力传导器，因此当将其灌入狭管中时，只需小小用力就 可以传导很大的压力。这种方法在许多研究中都证明是有效的。具体操作步骤 如下l ： 1 ) 用一小滴水银从后面加载于注射针中； 2 ) 一旦水银滴达到注射针的细颈部，让其靠近针尖： 3 ) 将注射针安装到一个长塑料管上，其内径应比针的外径略小； 4 ) 将管子的另一端安装到产生压力的装置上，一般是微型注射器或相似 的装置； 5 ) 用注射器增加系统压力，将水银滴驱至注射针口处； 6 ) 将待注射样品从针尖处加载于注射针，方法是将针尖插入溶液中，用 微注射器降低压力产生部分真空； 7 ) 从样品中撤出注射针。刺入靶细胞中，用微注射器增加压力，将样品 注射于细胞中。 第二种直接压力注射方法是液压，往复注射方法。这种方法能在一定程度上 控制注射体积和速度。它依赖于注射液体进入靶细胞的机械特性。操作步骤如 下： 1 ) 将薄壁硼硅玻璃拉成细长注射针： 2 ) 将注射针安装到合适的操作臂上，用铂丝绕成1 5 m m 的圈，将注射针 穿入； 3 ) 针穿过绕圈约2 0 0 p m ，针的中心处于圈中； 4 ) 用光学显微镜观察圈和注射针时，对铂丝圈通以低电流；电流强度应 可以熔化玻璃，但不要太高，以免针尖落下来或接触到线圈； 5 ) 从线圈中撤出修正的注射针，安装于操作臂上用于显微注射： 6 ) 安装持针器，其内径应与针主干的外径相匹配； 6 7 ) 安装注射针以前，用液压液充满注射器、管和持针器； 8 ) 将针安装到持针器上，深深地推动注射器活塞使液体反向填充注射针， 直到针尖流出几皮升液体为止。 由于生物工程技术的研究对象是具有生命活性的动植物或其细胞，每一个 实验环节的失败都会导致生命的死亡，前功尽弃，造成人力、物力、时间上的 巨大浪费。就目前来说，实验动物的净化技术，细胞的培养、洗涤、消毒技术， 基因表达水平的检测技术等自动化程度都已经很高，所以显微操作技术和手段 的提高是关系着实验成败的关键。 图1 2b r i n k m a n n 公司的e p p e n d o f f 显微注射操作系统 f i g u r e1 - 2e p p e n d o f fm i c r o in j e c t i o no p e b t i o ns y s t e m o fb r i n k m a n nc o m p a n y 现在生物工程界普遍使用的显微注射系统基本已被美国的m d i 例及德国的 b r i n k m a n n 公司 1 0 1 、日本的n a r i s h i g e 1 1 1 等公司所垄断。图1 2 ”“为b r i n k m a n n 公司的e p p e n d o d 显微注射操作系统。这些显微注射系统一般都由三大部分组 成： ( 1 ) 显微镜子系统； ( 2 ) 作业台子系统： ( 3 ) 微操作子系统。 其中微操作子系统包括左右微动操作手和注射量控制器。操作手上装有执行器 一固定针和微注射针。微动操作手各有三个自由度，通过球铰型操作杆控制a 注射量控制器，由它来控制外源d n a 液体的注射量及汲取量，多为气压控制式， 7 广东工业大学工学硕士学位论文 即以气体为压力介质。上述控制器在精度上均可达到皮升级的要求，其原因是 由于它们采用了可精确到l p s i 的气压控制阀，能够精确地控制推动注射液的气 体的压力。 如今，国际上大都利用上述微操作系统进行细胞操作。我国一些重点实验 室在国家重点投资的情况下，其仪器配备已达国际水平。如内蒙古大学实验动 物研究中心和中国科学院动物发育所使用的是德国l e i c a 公司生产的微操作系 统，价值5 0 万人民币；北京农业大学国家生物技术重点实验室使用的是日本 o l y m p u s 公司生产的微操作系统，价值4 0 万人民币；医科院基础技术研究所 医学分子生物国家重点实验室使用的是日本n i k o n 牌微操作系统，价值5 万美 金：农科院畜牧所购买的是德国o i p t o n 牌微操作系统，价值为8 万德国马克。 但是这些仪器价格昂贵而且都是手动操作，科研人员普遍希望能够以机械代替 人工，以自动代替手动，使这项显微操作技术能够简单化、自动化，进而实现 工程化，真正实现基因工程。 1 6 选题意义和来源 目前，国内外的生物工程操作人员大都是手工进行转基因注射作业的，即 使他们配备了价格昂贵的现代化设备。这是由微注射操作系统在性能和宜人性 上存在着诸多弊端所决定的。转基因的特性对注射作业提出了相当苛刻的要求。 正常细胞的外源基因容受量为皮升级。外源基因注入的太少，达不到表达效果； 太多，又容易将细胞涨破旧。注射剂量不一致会导致胚胎注射后发育不同步。 为了跟进基因工程的发展，我们设想着力解决基因注射量的精确控制的问 题，使注射量可控化、定量化，解决注射剂量不一致导致胚胎发育不同步的矛 盾。 本项目得到国家8 6 3 高技术计划“超微量注射控制技术的研究”( 项目编 号：9 9 1 4 1 0 ) 、广东省重点学科“微细作业系统的研究”( 项目编号：省 9 7 0 0 0 4 ) 的共同资助。 1 7 本论文的组织结构 本论文的组织结构如下： 1 )第一章介绍了转基因技术现状及本课题研究意义。 8 第一章绪论 2 ) 3 ) 4 ) 5 ) 第二章阐述转基因超微量注射控制器的工作原理。 第三章论述了气路设计中涉及的流体理论、气路设计及气路中可能 影响注射控制的因素。 第四章介绍了转基因超微量注射控制器的电路部分设计。 第五章介绍了对控制器的控制效果进行的实验检验及结果分析。 9 第二章气压电控式超微量注射控制器的工作原理 2 1 转基因微细作业系统 图2 1 所示是我们实验中所用到的微细作业系统。它也是由显微镜子系 统、作业台子系统和微操作子系统三部分组成的。在该系统中，显微镜子系统 是一台高分辨率的光学显微镜。作业台子系统是由2 台p a r k e r 微型步进电机 驱动的，可以在x 、y 轴两个方向上运动的载物台。微操作子系统是由固定针、 注射针以及微量注射控制器组成。固定针和注射针是由拉针仪拉出的直径为微 米级的玻璃针。研制用于微细作业系统中进行注射量控制的微量注射控制器是 本课题的目的。 图2 1 转基因微细作业系统 f i g u r e2 - 1t r a n s g e n i cm i c r o o p e r a t i o ns y s t e m d n a 超微量注射具有超微量性与个体性的特点，是转基因操作的关键之 处。基因液注射的量过少，达不到目的；过多，又容易超过细胞的容受量而使 其胀破。同时，为减小注射过程对生物质造成的机械性损伤，应尽可能缩短注 射针在细胞内的停留时间。因此，基因液超微量注射控制技术是转基因微操作 1 0 第二章气压电控式超微量注射控制器的设计原理 系统必须解决的问题。 现有的基于微注射的各种基因导入技术都在操作流程、流量控制和环境、 生物质相容性等方面存在着这样那样的缺陷，以下我们构建气压电控式超微量 注射控制器( 图2 2 ) ，用可调气压来固定细胞和向细胞中注射外源基因，以 期在保证环境、生物质相容性的同时，通过简单操作精确定量控制基因出流量， 将操作人员从烦琐的重复劳动中解放出来，为生命科学的相关研究提供可靠的 量性依据，减少人为因素引入的误差干扰。 图2 2 气压电控式超微量注射控制器 f i g u r e2 - 2 e l e c t r i c a lc o n t r o lm i c r o i n j e c t i o nc o n t r o l l e rw i t hg a sa s i n j e c t i o nm e d i u m 2 2 控制器的气路工作原理 在进行气路设计前，针对流体在微管道中的运动特性尤其是其不同于宏观 世界中的运动特点进行研究是很必要的，我们在下面将先介绍微流体的研究现 状，以使我们的设计有理论的依据，从而使控制器中气路工作按照我们既定目 的进行。 在宏观流动中，由于其特征尺寸远大于流体分子的平均自由程，所以将流 体假设为连续介质。随着特征尺寸的减小，流体分子的平均自由程与流动特征 尺寸的比值相对增大，流体的流动规律可能与宏观流动不同。目前一般将大于 1 m m 的尺度称为宏观尺度，1 u m 1 m m 的尺度称为微尺度。微流体研究的特征 尺度目前一般在微尺度( 微米) 量级。 早在1 9 0 9 年k n u d s e n 就完成了稀薄气体动力学的先期实验工作，并将气 体分子平均自由程与流动特征尺寸的比值称为k n u d s e n 数( k n 数) 。根据k n 数 的大小将气体在管道内的流动分区如下【1 3 1 ： k n 一0 ( r e 一一) ：e u l e r i 1 方程( 忽略分子扩散) ； k 。10 ：具有无滑移条件的n - s 1 4 u 1 5 1 方程； 1 0 - 3 k n 1 0 。：具有滑移条件的n - s 方程； 1 0 _ 1 k n 1 0 ：过渡区； k n 1 0 ：自由分子流。 有关微尺度气体流动的研究，早在2 0 世纪7 0 年代就已开始，到目前为止， 已有不少国内外研究者作出研究报告，其主要研究结果如表2 一 目。 研究者管道尺寸，u m流体介结果原因 质 w u ，p i t t l e 1 n13 0 - 2 0 0 ( 宽) 3 0 - 6 0 ( 深) 气体 ，r 6 4 达1 1 8 较大的相对 粗糙度 ( 2 0 p m ) 使 流动阻力增 大 p f a h l e r 1 b ”l 0 5 5 0气体 ，与r e 有关，在小 气体稀薄效 r 。时，随r 。减 应 小而减小，比不 可压缩流动小1 5 c h o i t 2 0 i3 0 - 8 1 2 圆管氮气 管径1 0 p m 、 r e 4 0 0 时，r 。 为5 0 2 - 5 3 9 h a r l e y i ”l 截面为( 3 4 ，4 - 8 0 0 ) x气体与不可压缩理论 1 i 4 、长为1 0 1 8 蚰的梯分析结果相差 形 3 邬小波嘲理论计算气体加速压降，壁面处 由于摩擦力 无量纲速度梯度引起压力梯 变化；速度剖面分度和气流加 布沿管长变化，不速：由于可 可能达到充分发压缩性的影 展状态响 秦丰华 1 7 6 - - 1 7 9、长为 氦气、m a 为0 ，0 0 3 0 0 3微尺度效应 1 0 - 7 0 m m 的圆管氦气 时，可压缩性仍十 分明显 杜东兴0 4 1管径管长为氨气层流状态下，大 由于可压缩 巾8 4 7 u m 1 3 5 6 m于不可压缩、充分性导致速度 由1 4 4 4 p m x 2 2 3 m 发剖面偏离抛 巾5 3 4 0 p m 2 2 8 5 m m 展流动物线分布 表2 1 气体在微小管道中流动的部分研究结果 t a b 2 - 1r e s u l to fg a sf l o wi nm i c r o c h a n n e l s 1 2 第二苹气压电控式超微量注射控制器的设计原理 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 。 由表2 1 可见，对于微尺度气体流动，因特征尺寸的缩小，表现出了与宏 观流动不同的特性，由于不同研究者的实验条件不同，其结果也各不相同，摩 擦系数，与雷诺数r 。的乘积或大于常规值或小于常规值或与常规值基本相等。 对于微尺度液体流动，虽也有一些研究报告，但由于液体在常温、常压下 其分子靠得更近，分子间以及与固体之间的吸引力和粘着势在微流动中起主要 作用，所以其微流体力学问题要复杂一些。由于液体分子的结构比气体复杂， 研究者 管道尺寸 流体介研究结果原因 质 牧原光宏 直径：4 5 - 5 0 5 p r o 硅油 流量与压力成比例关 运动粘度：2 6 系，与n - - s 方程吻合 1 0 一一4 3x1 0 一m 2 s p f a h l e r u 5 1 5 3 p m 1 3 5 p m ，1 0 0 p m异丙醇 截面尺寸较大时，与n x1 7 p m ，l o o p m s 方程吻台：槽道深 0 8 p m 的矩形槽度小到0 8 p m 时，偏 离n _ _ s 方程 王补宣当量直径为0 2 m ，顶角甲醇、水流速对压降有影响流 为3 0 、4 5 。、6 0 的v 形速越大，压降越大；当 槽 量直径与压降成反比， 与n s 方程吻合 李勇2 “ 直径为：4 2 、2 7 、1 7 p r o ， 去离子在较低压力下，流量与 长度为：6 4 - 1 0 5 m m 、 水 压力成线性关系，与n 5 7 5 - 9 2 5 m m、s 方程十分吻合 5 1 5 m m 江小宁 直径为：8 - 4 2 p m 实验结果与理论计算吻 管长为：l l o c m合，流动符合宏观流动 规律 李战华 直径为2 5 p m 的石英圆管 去离子在定常层流条件下，其液体为非极 水、四氯压力、流量关系符合经 性小分子结 化碳、乙典连续假设流动构 基苯、环 己烷 姜明健2 1宽为0 5 0 - 0 5 5 2 深为水临界雷诺数：矩形槽为流动均匀性 0 5 0 0 5 5 2 、 长为9 0 0 - 1 0 0 0 左右，三角槽对流动也有 l o o m m 的矩形槽及边长为 为5 0 0 左右，阻力系数 影响，流动 0 7 m 、长为1 0 0 n 的等明显低于常规尺度槽均匀使阻力 边三角形槽系数减小 表2 2 液体在微小管道中流动的部分研究结果 t a b 2 2r e s u l to ff l u i df l o wi nm i c r o c h a n n e l s 1 3 广东工业大学工学硕士学位论文 粘度也比气体大，所以液体微流动研究的难度更大。有关微尺度液体流动的部 分研究结果如表2 2 1 1 b 】。 由表2 - 2 可见，由于液体分子平均自由程比气体小得多，而微管道的尺寸 与液体分子平均自由程相比较大，且所研究的液体又多为小分子液体，所以有 关微尺度液体流动的研究结果大多与宏观流动规律相吻合。 综上所述，目前有关微流动的研究发现，随着几何尺寸的缩小，并非是传 统理论和宏观尺度下的研究结果在尺度上的缩小，而是产生了许多不同于宏观 尺度的现象和问题。 因此我们在进行气路设计的时候一方面利用流体力学的理论，但重要的还 是进行实验验证并进行调整。设计的控制器注射针通道内部气路结构如图2 - - 3 所示。 注射针压力状态分为四种：负压、保压、注射和冲阻。 负压，用以将外源基因吸入注射针内；阀2 下开，阀8 开，阀5 关；通路 为3 2 1 9 8 7 。 保压，防止毛细作用和扩散产生的回吸；阀2 上开，阀8 、5 关；通路为3 2 1 0 6 7 。 注射，注射外源基因：阀2 上开。阀5 开，阀8 关：通路为3 2 1 0 一6 7 和3 4 5 7 。 1 , 4 7 一电磁阀2 - 单向阀3 - - 注射器5 一真空发生器 6 一过滤减压阀8 , 1 0 一精密减压阀9 - - 气源 图2 3 超微量注射控制气路图 f i g u r e2 - 3g a sr o u t eo fm i c r o i n j e c t i o nc o n t r o l l e r 第二章气压电控式超微量注射控制器的设计原理 冲阻，用以注射针阻塞时将微管通道导通；通路为3 2 - - 1 0 - - 6 - - 7 和3 - - 4 5 7 。 固定针压力状态分为两种：负压和大气压。 负压，用以吸附固定细胞。 大气压，为节省气源，注射间隙将负压通道关闭而与大气导通。 2 3 控制器的电路工作原理 整个控制器是由8 9 c 5 1 单片机控制，内有精密压力传感、放大电路。控制 电路如附录2 所示。 注射时间、注射压力、保持压力和吸附压力通过面板独立进行设定。时间 设定精度为微妙，设定范围为o 到9 9 毫秒，并在l e d 上显示以便我们进行操 作。注射针内的压力由控制电磁阀的精密定时电路在注射压力和保持压力间进 行切换。 注射流程如下： 1 通过面板上的按钮和螺钮设定时间和压力参数，单片机将注射时间设置 值在l e d 上显示，同时由精密压力传感器将气路中的压力值经过处理后也送到 l e d 显示 2 单片机通过控制电磁阀将注射针的状态置于负压状态，将目的基因吸入 注射针； 3 接着，单片机通过控制相应的电磁阀使注射针处于保压状态； 4 控制作业台移动将受体细胞移入视野内； 5 用固定针固定受体细胞： 6 将注射针刺入受体细胞； 7 单片机控制气路使注射针处于注射状态，外源基因注入受体细胞； 8 注射针保压； 9 。移走受体细胞。 注射时间、注射压力、保持压力和吸附压力等参数设定后，可重复步骤4 至9 进行受体细胞的批注射。 2 4 本章小结 本章首先对超微量注射控制器设计中用到的微细作业系统进行了简要描 述，然后对设计的控制器的气路和电路工作原理做了介绍。 1 6 第三章气压电控式超微量注射控制器的气路设计 第三章气压电控式超微量注射控制器的气路设计 3 1 气压传动概述 气动( p n e u m a t l c ) 是“气动技术”或“气压传动与控制”的简称 2 9 1 。气 动技术是以空气压缩机为动力源，以压缩空气为工作介质，进行能量传递或信 号传递的工程技术，是实现各种生产控制、自动控制的重要手段之一。气路部 分是超微量注射控制器直接执行注射作业的部分，其应用知识和设计思想将在 下面介绍。 进入到2 0 世纪6 0 年代尤其是7 0 年代初，随着工业机械化和自动化的发 展，气动技术广泛应用在生产自动化的各个领域，形成现代气动技术。由于气 动装置具有成本低、可靠性高以及相对于液压设备动作速度快等优点，近几十 年来气动技术得到广泛应用。目前，气动元件的生产由美洲( 以美国为中心) 、欧洲( 欧洲各工业发达国家) 和亚太地区( 以日本为中心) 三分天下，气动 行业的知名企业有e l 本的s m c m l 、德国的f e s t o i ”l ，英国的n o r g r e n 吲和 美国的p a r k e r c 3 3 1 等。 气压传动系统一般由四部分组成 3 4 1 ，它们是： 1 气源装置提供压缩空气的装置。一般是空气压缩机或者气瓶； 2 控制元件是用来控制压缩空气的压力，流量和流动方向的，以便使执 行机构完成预定的工组循环。它包括各种压力控制阀、流量控制阀和方向控制 阀等； 3 执行元件是将气体的压力能转换成机械能的一种能量转换装置。它包 括实现直线往复运动的气缸和实现连续回转运动或摆动气马达或摆动气缸等； 4 辅助元件是保证压缩空气的净化、元件的润滑、元件间的连接及消声 等所必须的，它包括过滤器，油雾头、管接器及消声器等。 而超微量注射控制器中气动部分是用气压控制基因的注射，控制对象是液 体，因此不需要执行元件。我们进行气路设计时，运用了流体力学的许多知识， 1 7 广东工业大学工学硕士学位论文 下面简要介绍本课题涉及的流体力学知识。 3 2 流体力学的基本知识m e t 为了便于研究气体的流动，按流动的特征作各种分类，按流动中流体密度 是否变化来分类，可分成不可压缩流动和可压缩流动。气体流动速度小于7 0 m s 时，其密度的相对变化小于2 。工程上，常将流动时流体密度的变化可以忽 略不计的流动称为不可压缩流动。即认为不可压缩流动的流体密度p 是不变值。 不能忽略密度变化的流动称为可压缩流动。通常认为，气体流速大于( 7 0 - 1 0 0 ) m s 的流动，就必须考虑密度的变化。 3 2 _ 1 空气的热力学性质 完全气体( p e r f e c tg a s ) 是一种假想的气体，它的分子是一些弹性的、不 占有体积的质点，分子间除相互碰撞外，没有相互作用力 3 7 1 。应当注意，完全 气体在热力学书中常译成理想气体，但它与没有粘性的理想气体是完全不同的 两个概念。对于完全气体，三个基本状态参数之间保持着一个简单的关系，称 为完全气体的状态方程 p m = 尺7 - ( 3 一1 ) 式中p 压力 毋质量体积，m 3 ，k g r 气体常数，对空气，r = 2 8 7 n - m ( k g k ) ； 7 _ 热力学温度，k 。 完全气体的状态方程也可写成 p = p r 7 = 罟尺t ( 3 - 2 ) 式中p 密度，k g ，m 3 ； m 质量，k g ； v 体积，m 3 。 对一定质量的气体，状态方程可以写成 1 8 弟三苹气压电控式超微量注射控制器的气路设计 尝：丛( 3 - 3 ) 互t 2 它表达了系统的两个状态的状态参数之间的关系。 实际气体只要不处于很高的压力或很低的温度，都可当作完全气体。按完 全气体状态方程计算，带来的误差不会太大。 对封闭容器中的气体和流动中的气体，气体状态方程都可使用。对流体中 的气体，p 、p 和丁届于懑顿敞b 于不同位置时的三个基本状态参数。 利用气体状态方程，可将有压状态下的气体体积折算成标准状态下的气体 体积。设标准状态下气体的压力为p 。，温度为l ，体积为圪，将该状态下一定 质量的气体压缩成压力为p 、温度为r 的有压状态，则有压状态下气体的体积 肛圪一t 丝 ( 3 4 ) lp 3 _ 2 2 不可压缩流动方程 1 流量和连续性方程单位时间内通过某截面的流体量称为流量。如流 体量以体积度量，以q v 表示。q 。的常用单位是m 3 s 或l r a m 。如流体量以质量 度量，就称为质量流量，用表示。锄的常用单位是k g s 。 体积流量q ，= u o a( 3 5 ) 质量流量q 。= p e 3 u 3 a( 3 - 6 ) 式中q ，体积流量，m 3 ，s ； q 疗，质量流量，k g s ； a 管道的截面积，m 2 ； “管内截面上的平均流速，m s p 流体的密度，k g m 3 。 不可压缩流动通常使用体积流量。可压缩流动必须使用质量流量。质量流 量通常转化成标准状态下空气的体积流量口a ，有 = 劬p a ( 3 7 ) 式中 q 。标准状态下的体积流量，m 3 s ( a n r ) ； q 。质量流量，k g s ； p 。标准状态下空气的密度。 1 9 广东工业大学工学硕士学位论文 令p q = p aq a 及p 口_ p ar 乃，p = pr ，可将有压状态下( 即在一定压力 状态下) 的流量q 转化为标准状态下的流量口a ，即 q a 2 q 詈争 ( 3 _ s ) 式中p t 有压状态下空气的绝对压力和热力学温度，p 的单位为m p a ， 丁的单位为k ： p 。死标准状态下空气的绝对压力和热力学温度。p 。- - 0 1 m p a ，乃 = 2 9 3 k 。 一元不可压定常流动，体积流量保持不变。管内两缓变交流截面1 和2 之 间的连续性方程为q v l 一- - - q v 2 ，即 u a = u 2 a 2( 3 - 9 ) 一元可压缩定常流动，质量流量保持不变，管内两缓变流截面l 和2 之间 的连续性方程为q 1 = q 。2 ，即 p l u j a = p 2 “4 2 ( 3 - 1 0 ) 2 伯努利方程一元不可压缩理想气体定常流动的能量方程，即伯努利 方程为 p + 妻t u 2 = p o ( 3 1 1 ) 或p ，+ 告肿；= p 一告肿；( 3 - t 2 ) 式中p 。速度为零处的压力，称为总压力。是流动流体被等熵滞止( 无能 量损失) 时的压力，是静压力p 与动压力去肼2 之和； p 静压力。与流线平行的面上感受的压力。 式( 3 - 1 2 ) 表明，流速高处压力低，流速低处压力高。它表明单位体积气体的 压力能和动能之和保持不变。 由于流体有粘性，流体在管内流动存在压力损失。根据能量守恒，实际不 可压缩定常管流的伯努利方程可表述为：流入能量应等于流出能量加上从进口 至出口的损失能量。即 第三苹气压电控式超微量注射控制器的气路设计 p f 十i 1 肿2 i = 见+ j 1 p u22+apf(3-13) 式中a p f 管流中两缓变流截面1 至2 之间的压力损失； “j 和截面1 和截面2 上的平均速度。 3 压力损失压力损失可分成沿程压力损失和局部压力损失。缓变流引 起的损失为沿程压力损失，急交流引起的损失为局部压力损失。 沿程压力损失按下式计算 a p t = g i d _ 2 1 pu2(3-14) 式中p 广沿程压力损失，p a ； z 管长，m ： d 管内径，m ； k 沿程压力损失因数； p 密度，k g m 3 ； “流速，m s 。 空气在等截面直管道内作不可压缩流动，通过管内的实际体积流量应等于 管截面积d 2 4 乘以管内实际的平均流速。若不考虑粘性作用产生的沿程压力 损失，在等截面积直管道两端压力差的作用下，可求得管内的理想流速。实际 的体积流量被理想流速除之，所得的面积称为不可压缩流动条件下直管道的有 效截面积，记为a e ，则有 ! d 2 a e ：垒( 3 1 5 ) a 吉 局部压力损失按下式计4 算 a p 。= = 1p u 2 ( 3 1 6 ) 式中，是局部压力损失因数。通常值都是由实验测定。不同的急变流的局部 压力损失因数可查有关手册。 般情况下，局部压力损失因数只取决于急变流的几何形状，与雷诺数 无关。但在雷诺数较低时( 几千至几万之间) ，与雷诺数有关，且成不稳定值。 2 1 厂东工业大学工学硕士学位论文 故空气过滤器之类的气动元件，其内部流动虽然属于局部压力损失，但通过元 件的流量( 或流速) 与压力降之间的关系都不使用式( 3 1 6 ) 来表达。 实际管道若是由m 段沿程压力损失和n 个局部压力损失串连组成，作为估 算，则总压力损失a p f 就是这些压力损失的叠加，即 p l 2 善 号圭? + j = l 旬寺； ( 3 一1 7 ) 3 2 3 可压缩流动方程 空气作高速流动时，空气得密度和温度都会发生较明显的变化。对一元定 常可压缩流动，除速度，绝对压力p 为变量外，还增加了密度p 和温度，两 个变量。故求解高速流动的问题，必须列出四个基本方程。 1 连续性方程一元定常可压缩流动，质量流量保持不变，即 = p u a = c 对上式作如下演算 d i n ( p u a ) 】= d ( 1 n c ) = 0 则得微分形式的连续性方程 塑+ 鱼+ 丝：o( 3 1 8 ) 口“a 2 动量方程在一元定常可压缩直管道中，取出一微段d x 的气体微团， 如图3 1 所示。在d t 时间内，该气体徽团由l 一2 移至1 2 。由于是定常流动， 在d