（测试计量技术及仪器专业论文）全自动酶免分析系统关键技术的研究.pdf

学位论文版权使用授权书 l i i ii ii iii iii ii i ii iii ii y 18 17 4 8 9 本人完全了解北京机械工业学院关于收集、保存、使用学位论文 的规定，同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和 电子版本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、 缩印、扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以 及提供本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向 国家有关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目 的的前提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活 动。 学位论文作者签名：彰字字 加韶年1 月知日 硅j 陬密论文无需签字广一 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在芝年解密后适用 本授权书。 精狮签名：耙酰学位论文作者签名：锡乡 似踔月f 口日粼年月少日 本 研究工 的研究 作品的 体，均 由本人 摘要 摘要 酶联免疫吸附试验( 简称酶免分析) 是一项临床免疫指标检测的主导技术， 具有操作简便、性能可靠等优点。进入2 1 世纪以后，在全实验室自动化进程的 推动下，检验医学向着自动化、规模化、标准化的方向发展，半自动的酶免分 析仪器已经不能适应发展的要求。 目前，对全自动酶免分析仪器的研制只局限于国外几家大型的医疗器械生 产商，且都价格昂贵，因此，研制我们自己的全自动酶免分析仪器具有很重要 的科学和实用价值。酶免试验全过程的自动化，不仅可以实现批量处理、降低 劳动强度、减少人为误差，还可以普遍地提高酶免试验的特异性，显著地提高 国产试剂的灵敏度。 本文分析了国内外发展现状和市场需求，归纳总结了国内各种半自动产品 的优点，借鉴了国外全自动产品的经验，在此基础上提出了全自动酶免分析系 统的设计思路。系统整体上采用模块式设计，由加样、洗板、读板、传送、孵 育等主要模块构成。其中，加样模块的位置精度和液面检测、洗板模块的残余 量精度控制、读板模块的光路设计和吸光度的测量、9 阵育模块的温度控制是整 个系统的关键技术，论文主要针对这几项关键技术进行了设计和实验分析。 论文所取得的成果主要体现在以下几个方面： 1 、依据模块式的设计思想对系统的硬件结构和软件结构进行了整体方案的 设计。 2 、完成了加样模块的设计。采用步进电机的闭环控制保证了加样系统的运 动精度；实现了液面检测功能，并对其进行了实验测试。 3 、洗板模块中设计了双排1 6 针的清洗头和蠕动泵构成的负压排水系统，并 对模块进行了整体实验测试，结果达到了每孔残余量小于2u1 。 4 、对读板模块的光路和硬件进行了设计，并利用标准板对整个模块进行了 测试，吸光度测量的各项指标都达到了预期要求。 5 、利用p i d 控制原理实现了对孵育模块的恒温控制，利用磁力控制实现了 对酶标板的可控频率振荡。 关键字：酶免检测；全自动；模块化；液面检测；吸光光度法。 a b s t r a c t e n z y m e _ l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ( e l i s a ) i sal e a d i n gt e c h n i q u ef o r i m m u n o l o g i c a lt e s t i n g ，f e a t u r i n ge a s eo fu s ea n dh i g hc r e d i t a b i l i t y , e t c b e c a u s eo f t h et o t a ll a b o r a t o r ya u t o m a t i o n ，t h el a b o r a t o r ym e d i c i n ei s b e c o m i n ga u t o m a t i c ， s w e e p i n ga n ds t a n d a r d i z e di nt h e21s tc e n t u r y ，t h u ss e m i a u t o m a t i ce l i s a a n a l y z e r f a i l st om e e tm a r k e tr e q u i r e m e n t s a tp r e s e n t ，t h em a n u f a c t u r e r so ff u l l ya u t o m a t i ce l i s a a n a l y z e ra r el i m i t e dt oa f e wf o r e i g nf i r m sa n dt h ea n a l y z e r sa r et o oe x p e n s i v e s oi ti so fm u c hs c i e n t i f i ca n d p r a c t i c a lv a l u et od e v e l o pt h ef u l l ya u t o m a t i ce l i s aa n a l y z e rf o rd o m e s t i cm a r k e t t h ef u l la u t o m a t i o no fe l i s ac a nn o to n l yr e a l i z eb a t c hp r o c e s s i n g ，r e d u c el a b o r i n t e n s i t ya n dd e c r e a s e sh u m a ne r r o r s ，b u ta l s oe n h a n c eg r e a t l yt h es p e c i a l i t yo ft h e e l i s aa n d i m p r o v es i g n i f i c a n t l yt h es e n s i b i l i t yo ft h ed o m e s t i cr e a g e n t t h i st h e s i s p r e s e n t sf i r s t l yt h eg e n e r a ld e s i g no faf u l l ya u t o m a t i ce l i s a a n a l y z e rs y s t e mb a s e do nt h ea n a l y s i st od o m e s t i ca n di n t e r n a t i o n a ld e v e l o p m e n t s t a t u sa n dm a r k e t d e m a n d ，c o n c l u s i o no nt h em e r i t so fv a r i o u sd o m e s t i c s e m i a u t o m a t i c p r o d u c t sa n dt h ef o r e i g ne x p e r i e n c ei n f u l l ya u t o m a t i ce l i s a a n a l y z e r t h es y s t e mi sc o m p o s e do fp i p e t t i n gs t a t i o nm o d u l e ，w a s h e rm o d u l e ，r e a d e r m o d u l ea n dt h ei n c u b a t o rm o d u l ea c c o r d i n gt om o d u l a rd e s i g n ，w h e r e i nt h ep o s i t i o n p r e c i s i o na n dl i q u i dl e v e ld e t e c t i o ni nt h ep i p e t t i n gs t a t i o nm o d u l e ，t h ea b s o r b e n c y m e a s u r e m e n ti nt h er e a d e rm o d u l e ，t h eg u a r a n t e eo fr e m n a n tw a t e ri nt h ew a s h e r m o d u l ea n dt h ec o n t r o lo nt h et e m p e r a t u r ei n t h ei n c u b a t o rm o d u l ea r ec r i t i c a l t e c h n i q u ei nt h es y s t e m ，a n dt h e ya r ed e s i g n e da n dt e s t e di nt h et h e s i s t h em a i na c h i e v e m e n t sd u r i n gt h i sw o r k c o m p r i s e ： 1 t h eo v e r a l ls c h e m eo ft h es y s t e mi sf o r m e d a c c o r d i n gt ot h em o d u l a rd e s i g n ， i n c l u d i n gt h eh a r d w a r ea n dt h es o f t w a r e 2 t h ed e s i g no f p i p e t t o rs t a t i o nm o d u l ei sp r o v i d e d t h ec l o s e d 1 0 0 pc o n t r o lo n t h es t e pm o t o ri sa d o p t e di no r d e rt og u a r a n t e ep r e c i s i o n t h ef u n c t i o no f d e t e c t i n gt h el i q u i dl e v e li sf i n i s h e da n dt e s t e d a b s t r a c t 3 4 5 t h ew a s h i n gh e a dh a v i n g16p i n sa n dd r a i n i n gs y s t e mc o n s i s t e do fp e r i s t a l t i c p u m pa r ed e s i g n e di n t h ew a s h e rm o d u l e t h ee x p e r i m e n ti sd o n ea n d r e m n a n tw a t e ri sl e s st h a n2 t a l t h e o p t i cs y s t e ma n d h a r d w a r ea r ei m p l e m e n t e di nt h er e a d e rm o d u l ea n dt h e t e s to ft h em o d u l ei sc a r r i e do u tu s i n gt h ev e r i f i c a t i o np l a t e t h et e m p e r a t u r ec o n t r o lu s i n gp i dp r i n c i p l ei sf i n i s h e da n dt h ev i b r a t i o n so f t h em i c r o p l a t ea r ed e v e l o p e di nt h ei n c u b a t o rm o d u l e k e yw o r d s ：e l i s a ；f u l l y a u t o m a t i c ；m o d u l a r ；l i q u i dl e v e ld e t e c t ；s p e c t r o p h o t o m e t r y 目录 目录 第1 章引言1 1 1 课题的提出及研究意义1 1 1 1 检验医学发展的要求1 1 1 2 全实验室自动化的推动1 1 1 3 课题研究意义2 1 2 国内外发展现状3 1 3 课题主要研究内容及论文结构5 1 4 本章小结5 第2 章工作原理及总体方案6 2 1 酶联免疫吸附试验6 2 2 系统总体方案1 0 2 2 1 系统概述1 0 2 2 2 系统的硬件结构1 2 2 2 3 系统的软件结构一1 4 2 3 本章小结1 5 第3 章加样模块的设计1 6 3 1 模块功能1 6 3 2 模块结构设计16 3 2 1 二维运动控制系统1 6 3 2 2 加样针控制部件一17 3 2 3 加样头脱针机构18 3 3 关键技术及解决方案19 3 3 1 运动精度的控制19 3 3 2 液面检测的设计及实验分析一2 1 3 4 本章小结2 5 i v 目录 第4 章洗板模块的设计2 6 4 1 模块功能2 6 4 2 模块设计2 6 4 2 1 清洗头结构2 7 4 2 2 注水排水系统及残余量的控制一2 8 4 2 3 模块的控制系统3 0 4 2 4 模块的控制程序3 3 4 3 实验及结果分析3 4 4 4 本章小结3 5 第5 章读板模块的设计3 6 5 1 模块功能3 6 5 2 模块工作原理3 6 5 2 1 吸光光度法3 6 5 2 2 朗伯一比耳定律3 7 5 3 模块设计3 8 5 3 1 光电转换系统3 8 5 3 2 数据处理系统一4 1 5 3 3 通信及控制系统4 2 5 3 4 模块的控制程序4 3 5 4 实验及结果分析4 4 5 5 本章小结4 6 第6 章孵育模块的设计4 7 6 1 模块功能4 7 6 2p i d 控制简介4 7 6 2 1 控制原理一4 7 6 2 2p i d 控制器的参数整定4 9 6 3 模块设计4 9 v 目录 6 3 1 温度控制系统4 9 6 3 2 振动功能的实现51 6 4 实验及结果分析5 1 6 5 本章小结5 3 第7 章结论5 4 7 1 课题总结5 4 7 2 进一步工作的方向5 4 致谢5 6 参考文献5 7 个人简历在读期间发表的学术论文与研究成果6 0 v i 免疫学、内分泌学等领域，其基本原理是酶联免疫吸附试验法( e n z y m el i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y ，e l i s a ) 。全自动酶免分析系统将酶免测试过程中读板、 洗板、加样、传送、孵育等功能模块以及后期的数据处理、保存、显示、打印 等所有的环节集合到一起，从而实现了酶免测试的全自动化，具有速度快、操 作简单、便于质控等优点，特别适用于快速、批量测试。 本课题得到了北京市高新技术新产品创新基金的资金支持。 1 1 1 检验医学发展的要求 进入2 1 世纪，自然科学的发展，促进了医学的发展。医学检验从形式上而言， 由原始的手工操作发展成更多的计算机控制的自动化操作；从内容上而言，以 分子生物学技术、免疫标记技术等新技术、新方法的出现为代表，为医学检验 赋予了新的内容和新的发展空间【2 】。国内检验医学发展出现了巨大变化，主要体 现在以下几个方面【3 】： 检测技术操作的自动化。 检测试剂商品化。 检测方法标准化。 检测标本微量化。 检测技术现代化。 实验室管理有序化。 质量控制规范化。 检验医学f 向着规模化、自动化、标准化的方向发展，这就对医学检验设备 提出了同样的要求。 1 1 2 全实验室自动化的推动 第1 章引言 全实验室自动化( t o t a ll a b o r a t o r ya u t o m a t i o n ，t l a ) 又称全程自动化( f r o n t t oe n da u t o m a t i o n ) 是指将临床实验室相互有关或互不相关的自动化仪器串联起 来，构成流水线作业的组合，形成大规模的全检验过程的自动化【4 j 。全实验室自 动化的两个关键概念是“统一化”( c o n s o l i d a t i o n ) 及“集成化”( i n t e g r a t i o n ) 。 “统一化”是指在一台仪器或相互有关的一组仪器上结合不同的分析技术或策 略；“集成化”是指将各种分析仪器与分析日仃处理设备及分析后处理设备相连接。 “全面实验室自动化”( t l a ) 运动，对酶免分析系统提出了更高的要求i 川。 酶免分析仪主要是代替人去完成酶免疫的测定技术。而酶免疫测定的全过程有 非常高的精度、重复性和无污染的高要求。以前整个测定过程大部分是人工来 完成，但这样测定出的效果常常不是很理想。据报道( 美国临床病理学院的调查 报告) ，实验室误差产生原因7 9 的因素是因为实验过程中标本处理不当以及人 为的因素而造成的【6 j 。而酶免分析仪由于减少了人工操作的环节，实现了全自动 化的操作。所以酶免试验全过程的意义不仅仅在于降低了实验者的劳动强度使 人们从“机械”的实验中解放出来，更重要的在于保证整个实验或检测过程的 高质量。在9 0 年代初期，手工酶免试验操作是t l a 的主要障碍。随着实验室从化 验、检验、医学检验到检验医学的发展，酶免检验已成为医学领域中一门重要 的学科，参与临床诊断，治疗及疗效判断等工作【7j 。目前，全面实验室自动化具 有标准化、高效率、高质量自动化和网络化特征，正成为临床实验室发展的新 趋势。为了提高实验室检验质量，更好的为病人服务，承担更多的检验项目更 复杂的标本来源与实时工作模式，酶免实验室的自动化与标准化已成为全面实 验室自动化发展的需求，同时也给实验室带来了新的优势峭j 。酶免试验自动化与 网络化的时代已经到来，全面实验室自动化不再是一种模型。这些技术的进步 将有助于高效临床实验室的建设与发展。 1 1 3 课题研究意义 本课题以酶联免疫吸附试验法为基本原理，旨在设计光机电一体化的现代 化全自动酶免分析系统。该系统实现了从加样、孵育、洗板、读板到报表打印 的全自动无人处理，而且具有多通道、多任务平行处理的能力，从而实现了真 正意义上的酶免分析的全自动化。 酶免试验全过程自动化的意义，并非仅仅限于降低劳动强度、减少人为的 第1 章引言 误差。全自动酶标分析系统还可以普遍地、显著地提高酶免试验的特异性，显 著地提高国产试剂的灵敏度。系统对多项目的批量处理，缩短了整体试验的时 间，提高了试验的效率。 全自动酶免分析系统的自主研制，首先打破了国外大企业对此项技术的垄 断，大大降低了检测费用，为人民医疗水平的提高做出了贡献。其次开拓了我 们在分析化学领域的光电检测技术、自动化技术和计算机技术的应用，进一步 加强了各个领域之间的联系，为我们继续发展本土的全实验室自动化奠定了基 础。第三，要跟上国际的发展，就要发展我国的科技创新能力，拥有我们自己 的专利技术，这也是国家“十一五”计划的重点工作。因此研制国内第一台全 自动酶免分析系统无论在光电检测的技术应用领域内还是在医疗仪器设备的发 展上都具有重大意义。 1 2 国内外发展现状 国外对全自动酶免分析系统的研究，可以回溯到上个世纪9 0 年代初期一j 。 第一代全自动酶免分析系统基本特征是单双针加样系统与酶标板处理系 统一体化，多数孵育位置少于4 块板。由于加标本将占用较长时间( 单针每板1 5 分钟，三块板通常需4 5 分钟完成加标本工作) ，因此，第一代全自动酶免分析系 统，被认为是“节约劳动力而不提高效率”。 第二代全自动酶免分析系统的基本技术特征为非常任务和单一轨道。由于 不能同时地处理二种过程( 如洗板的同时，不能加试剂等) ，因此，其工作任务表 ( 或时间管理器t m s ) “堵车”现象仍无法避免，而造成处理过程不能严格执行， 试验完成时间延长，或单纯执行试验时间表完成实验动作而不论试验效率。不 含标本加样装置全自动酶免分析系统，通常也称“后处理系统”。 第三代全自动酶免分析系统的基本特征是采用多任务、多通道，完全实现 平行过程处理。典型产品为瑞士哈美顿公司的f a m e ( 费米) 全自动酶免分析系统。 费米系统的优点表现在：广泛采用液体水平检测( l l d ) 技术、体积与重量传感、 光学位置传感等，基本实现了全过程控锖i j ( t p c ) ，特别是专利的洗板液体传感器， 确保了最佳洗板效果，是保障试验特异性的关键。在软件与功能上，采用全面 的系统跟踪记录( t r a c e a b i l i t y ) 与系统追溯( t r a c k a b i l i t y ) ，标本试剂加样校验 ( s a m p l ev e r i f i c a t i o n ) 及“自由任务管理”， 实现随时增加检测板训。 第1 章引言 当前，全自动酶免f 向着处理系统一体化，分析系统网络化的方向发展。 对比生化分析仪的试验反应过程，酶联免疫试验是十分复杂的。这就要求全自 动酶免分析仪具备多任务平行处理能力，特别是要具备自由任务资源管理 系统，以保证随时增加任务菜单和急诊插入，并且要求酶免实验过程不受加样 处理的影响【1 1 】【1 2 】【1 3 】。也就是说“后处理设备必须相对独立于前处理”，以实 现最优反应过程和最大化分析生产力【1 4 】，保持原来的前处理设备和后处理设备 的优秀品质同时，使用一台微机、一套操作系统实现了一人操作，实现由自标 本加样、稀释到酶标孵育、洗板、加试剂、读数和结果打印全自动。区别于血 站酶免实验室，临床酶免实验室将承担更多的检验项目，更复杂的实验方法学 ( 如定量检测) 和更复杂的标本来源与实时工作模式【15 | 。临床酶免实验室局域 网络化是实现“全面实验室自动化”重要环节之一。酶免实验室的自动化与标 准化，是全面实验室自动化系统( l a s ) 的一部分。实现酶免试验自动化网络化， 是涉及酶免加样( 前处理) 设备、酶免分析( 后处理) 设备与医学信息技术、 实验室管理科学综合的崭新系统集成高技术，是迈向全面实验室自动化的重要 基石。 而国内的全自动化酶标仪的发展则不容乐观。 首先是由于受到技术的限制，目前国内主要生产的酶标仪不具备整体工作 站的性质，只是在某个过程或功能上实现自动化处理并制造出小型酶标仪，也 就是半自动的产品。例如，北京普朗新技术有限公司的d n m - - 9 6 0 2 a 型酶标分 析仪、伯乐科技发展公司的紫外可见全自动酶标仪矛 i c o d a 自动酶免分析系统， 都是只具有酶免分析检测功能、洗板功能或者其它部分功能。将半自动化产品 发展成为全自动产品是酶免分析技术的发展需要。 其次，医疗条件发展不平衡。主要原因是引进国外的先进设备需要大量的 资金，所以国内各级别的医疗机构内还存在大量的酶免试验是通过手工完成的 现象。在没有全自动化酶标仪的情况下，通常需要人工使用注射器对样品进行 加样，充分反应后再人工送到酶免检测仪中进行分析。有时实验板的清洗工作 也要通过人工来完成，这些都会给样品的酶免试验结果带来很大的误差，在执 行低效的操作的同时也降低了试验质量。 目前，国内对全自动酶免分析系统的需求为1 5 0 2 0 0 台年，全部为进口产品。 1 0 0 万台以下的全部为第一代或是第二代的酶免分析系统。乙肝五项的分析时间 至少2 5 个小时，无法满足大医院的要求。能够满足医院需要的多通道多任务的 第1 章引言 第三代全自动酶免分析系统产品价格超过1 3 0 万台，很多医院无法接受。 1 3 课题主要研究内容及论文结构 本文主要对全自动酶免系统中几个关键技术进行了设计和实验分析： ( 1 ) 加样模块的设计。加样模块是一个三维运动部件，各部分最大运动误差 不超过o 5 m m ，位置精度的保证是本模块的一个关键技术。加样头具有 四个加样针且针间距可以调节，每个针都具有液面检测功能，液面检测 的实现是本模块的另一个关键技术。 ( 2 ) 洗板模块的设计。洗板残余量对检测结果有着重要的影响，其精度的控 制是整个模块设计的关键技术。课题通过设计出一种特殊的清洗头并配 以多点清洗的方法既要保证了洗板的速度，又确保了残余量对测量结果 不产生影响。 ( 3 ) 读板模块的设计。读板部分吸光度的测量直接关系到整个分析系统的性 能，是整个系统设计中最关键的部分。课题首先设计了其光路，并需通 过大量反复的实验找出影响其准确性的因素并加以改进，最终保证单波 长读板时间不大于1 5 秒，4 0 5 n m 时的检测精度为1 ； ( 4 ) 孵育单元温度的控制。利用p i d 调节对8 个独立的温控单元进行控制， 控制精度为0 5 。实现对酶标板的震荡混匀，振动频率5 2 0 h z 可调。 论文在接下来主要从以下几个方面对课题进行了详细介绍：第2 章从整体 上对仪器进行介绍，首先介绍仪器的医学检验基础酶联免疫吸附试验，然 后介绍了系统预期功能指标及相应的整体设计方案；第3 、4 、5 、6 章分别介绍 了加样模块、洗板模块、读板模块、孵育模块的设计，并对各模块的主要功能 进行了调试与试验测试；第7 章对课题进行了总结，介绍了本课题取得的成果 与存在的不足以及将来的努力方向。 1 4 本章小结 本章首先从检验医学和全实验室自动化的角度论述了本课题的必要性和研 究意义，然后介绍了当前国内外对全自动酶免分析系统的研制状况，最后对课 题的主要研究内容和论文结构进行了简单介绍。 第2 章工作原理及总体方案 第2 章工作原理及总体方案 2 1 酶联免疫吸附试验 由于酶的高效生物催化作用，一个酶分子在数分钟内可以催化几十、几百 个底物分子发生反应，产生了放大作用，使得原来极其微乎其微的抗原或抗体 在数分钟后就可被识别出来，这种技术被称为酶联免疫吸附试验法 ( e n z y m e - - l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ， e l i s a ) 【1 1 。 e l i s a 法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所 引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗 原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为e l i s a 法具有灵敏、特 异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点【1 6 】。不仅适用于临床标本的检 查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本，因此，也适合于血清流 行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗 原，所以也是一种早期诊断的良好方法。因i 上l e l i s a 法在生物医学各领域的应用 范围日益扩大。 e l i s a 的基本原理有三条： ( 1 ) 抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙 烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性； ( 2 ) 抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍 能保持其免疫学和酶学活性： ( 3 ) 酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判 定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的 量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。 由于e l i s a 法一方面是建立在抗原与抗体免疫学反应的基础上，因而，具有 特异性。而另一方面又由于酶标记抗原或抗体是酶分子与抗原或抗体分子的结 合物，它可以催化底物分子发生反应，产生放大作用，正因为此种放大作用而 使本法具有很高的敏感性。因此，e l i s a 法是一种既敏感又特异的方法。常用的 e l i s a 有以下两个方面【l7 l 。 6 第2 章一t ：作原理及总体方案 ( 一) 测定抗原的，主要有四种方法。 1 、竞争法( c o m p e t i t i o nm e t h o d ) ：方法的基本原理可见图2 1 ，本法首先将 特异性抗体吸附于固相载体表面，我们把抗原和抗体吸附到固相载体表面的这 个过程，称为包被( c o a t e d ) ，也可叫做致敏。经洗涤后分成两组：一组加酶标 记抗原和被测抗原的混合液，而另一组只加酶标记抗原，再经孵育洗涤后加底 物显色，这两组底物降解量之差，即为我们所要测定的未知抗原的量。 这种方法所测定的抗原只要有一个结合部位即可，因此，对小分子抗原如 激素和药物之类的测定常用此法。该法的优点是快，因为只有一个保温洗涤过 程。需用较多量的酶标记抗原为其缺点。 2 a3 a ，l j 1 也披特 摊抗体 ；奠：涤 j ! = l l 放删执 _ _ ；i 澎会：泐 2 b3 b 勰晰 q ：池执啄 图2 1 竞争法测抗原示意图 2 、双抗体夹心法 方法的基本原理可用图2 2 来表示： 孵爵 一、“一 洗涤 魉蔽4 芎：”嘲允“扼暾翻鹣杯i 已 够 i 抗f 率。乞i j 菩l i 行；i ： 专”争 j 抗体 图2 2 双抗体夹心法测抗原示意图 本法首先也是用特异性抗体包被于固相载体，经洗涤后加入含有抗原的待 测样品，如待检样品中有相应抗原存在，即可与包被于固相载体上的特异性抗 第2 章工作原理及总体方案 体结合，经保温孵育洗涤后，即可加入酶标记特异性抗体，再经孵育洗涤后， 加底物显色进行测定，底物降解的量即为欲测抗原的量【1 8 】。 这种方法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结合的部位，因为其一端要包 被于固相载体上的抗体作用，而另一端则要与酶标记特异性抗体作用。因此， 不能用于分子量小于5 0 0 0 的半抗原之类的抗原测定。我们用在霍乱肠毒素的测 定，h b s a g 及h b s 的测定。 3 、改良双抗体夹心法：本法是双抗体夹心法的一种改良形式，也是用于测 定抗原的，其原理可用图2 3 来表示： 孵自 洗涤 笾竣特芹拗岔九抗昧_ 隅+ 婷绺船 辩振汜翔城物器 每 屯体a ，三筢翘l f ；： j i ， 书b抗b 抗体 图2 3 改良双抗体夹心法测抗原示意图 本法首先是将特异性抗体a 包被于固相载体，经洗涤加入含有欲测抗原之待 检样品。经孵育洗涤后再加一次未标记的特异性抗体b ，而这次加入的抗体b 于 第一次包被于固相载体上的特异性抗体a 对被测抗原来说都是特异性的，但不是 用同种动物免疫制备的，否则可出现非特异性反应。经9 呼育洗涤后，再加酶标 记抗b 抗体，再经孵育洗涤后加底物显色进行测定。这种方法与双抗体夹心法不 同之处是多加了一层抗体。因此，放大的倍数更高，故比双抗体夹心法更加灵 敏。同时避免标记特异性抗体，而另一优点是只要标记一种抗抗体，即可达到 多种应用。 用于测定抗原的尚有第4 种叫做抑制性测定法( 见图2 4 ) ，它是先用抗原包 被固相载体，然后分为二组，一组加入用参考抗体和被检标本混合孵育后的混 合溶液，假如标本中不含抗原，则参考抗体未被结合。因此它可以和包被于固 相载体上的抗原结合。如标本中含有抗原，则抗原先与参考抗体结合，故参考 抗体不再与包被于固相载体上的抗原结合。对加入酶结合物( 抗球蛋白) 和底 物仅显示剩余结合的抗体量。再与另一组不加待检标本的参考系统比较，被检 标本对底物显色的抑制程度与标本中所含抗原量成比例，二者之差，即为欲测 抗原的量。 第2 章一卜作原理及总体方案 ，艄9 芦k 国愕k 慧避，厂监国j 丽盘蔼避 1 f 。 咎誓 屯i 氐 j 艘k ，；趣j 。!栩i 八毫；艺 气体趣ij 皮4 匀：i # f 。 濉。门“j 漩f | 0 黼 矗! 渤 监j 耐， 包被执| i 、l 7 、1 i 。吲 b 参镰k 器僦慧雠b 参毒蠹堙澍? n 蓉l 鲎霄簋；洗涤睦黼 被检标本对底物显色的抑制程度与标本中所含抗原的量成比例，二者之差 即为欲测抗原的量。 ( 二) 测定抗体方面：所用的方法称为间接法，也是目前最常用的方法，其 原理可用图2 5 来表示： l 一、藤0 t l 逸羧巍原魏i 岔抗体 之 0 ：洌l 车f 。l 窿0uo 0 0 躲i 辩标 t，! i | l 氐黝瀑纽 执 i l 诲 图2 5 间接法测抗体示意图 间接法首先用抗原包被于固相载体，这些包被的抗原必须是可溶性的，或 者至少是极微小的颗粒，经洗涤，加入含有被测抗体之标本，再经孵育洗涤后， 加入酶标记抗体，( 对人的标本来说即加酶标抗球蛋白i g g 、i g m ) ，再经孵育沈涤 后，加底物显色，底物降解的量，即为欲测抗体的量，其结果可用目测或用分 光光度计定量测定，本法用不同种抗原包被固相载体后，只要用一种酶标记抗 人球蛋白，即可作多种人的传染病、寄生虫病以及其他疾病的血清学诊断。如 用酶标记抗人i g m ，则可用于早期诊断【l 9 | 。 9 第2 章：j ：作原理及总体方案 2 2 系统总体方案 2 2 1 系统概述 系统采用模块式的结构，将酶免试验过程中的加样、洗板、孵育、读板等 过程划分为不同的模块，再配之于传送等必要的辅助性环节，实现酶免分析的 全自动操作，用户可以根据测试对象的不同来安排测试过程，保证了仪器能适 应不同测试的灵活性。 仪器的外观效果如图2 6 所示，仪器具有可视化的操作，使操作者对仪器的 工作过程一目了然，便于对突发意外事件的应对于处理。仪器采用具有压力感 应的全自动升降门，既增加了仪器的可操作性，同时保证了操作人员的安全。 图2 6 全自动酶免整体结构 1 0 第2 章1 ：作原理及总体方案 仪器的原理框图如图2 7 所示，操作人员根据测试种类的不同和被测对象数 量的多少来安排测试过程，测试过程安排好后启动测试，仪器便会根据测试人 员的安排全自动完成测试过程。首先加样模块将指定的待测对象进行稀释后送 到指定的测试板，并添加特定的试剂，为避免交叉干扰加样模块每完成一次加 样过程便会退掉微量液体吸头( t i p 头) 重新拾取。接下来传送模块将稀释后的 待测物送到孵育单元进行保温反应，从而保证反映的充分性。然后传送单元将 反应完的待测物送到洗板单元清洗掉没有反应的物质，然后加入催化剂使酶显 色再洗掉多余的物质，最后送到读板模块测量其吸光度，读板模块将测量数据 传送到中央控制单元，中央控制单元会将这些数据进行存储，然后进行分析处 理、显示或是打印1 2 0 1 。 它的主要功能要求如下： 1 具有8 个测量通道和1 个参比通道，采用数值孔径0 6 ，光损耗 3 0 - 彳+ 3 0 f = 6 6 d自 2 4 第3 章加样模块的设计 由以上数据可以看到，数据具有足够的稳定性，并且接触液面前后具有足 够大的差距，单片机能够准确的识别判断。 3 4 本章小结 本章首先介绍了加样模块的功能及其在整个系统中的作用，然后对加样头 和脱针机构的结构进行了简单的介绍。论文重点介绍了步进电机移动精度的控 制和液面检测的实现。步进电机的控制采用了核步法闭环控制的方法，结构方 面采用双端承重，程序中进行必要的补偿来保证步进电机的移动精度；采用基 于电容的频率传感器来进行液面检测，并对其进行了实验分析，结果表明传感器 能够准确探测液面。 2 5 第4 章洗板模块的设计 4 1 模块功能 第4 章洗板模块的设计 在酶联免疫吸附试验过程中有两步需要清洗，一步是酶标记过的抗体与特 异性抗原结合后需要将没有结合的反应物清洗掉，另一步是加入催化剂后使酶 显色，需要把过量的催化剂清洗掉，这两步清洗是整个试验过程中非常重要的 两个步骤，如果清洗不够彻底的话，将直接影p l a n 最后的测试结果。本课题设 计的全自动酶免分析系统采用的是模块化的设计，将洗板机作为整个仪器的一 个模块( 如图4 1 所示) ，可以独立的完成洗板功能。洗板模块具有独立的中央处 理单元，可以接收上位机传下来的命令，根据命令完成测试过程中需要的洗板 步骤。 图4 1 洗板模块 4 2 模块设计 洗板机模块主要由三个部分组成：机械传动部分、注水排水部分和系统控 2 6 第4 章洗板模块的设计 制部分。洗板机的清洗对象是8 木1 2 的酶标板，酶标板在驱动电机的带动下逐行 移动，在酶标板移动过程中清洗头抬起，等到酶标板移动到位后，清洗头下降 一定的高度进行注水清洗，清洗完毕后通过清洗头将废液排出。为了适应不同 被测物的清洗，洗板机配有四种不同的清洗液，根据需要选择合适的清洗液 进行清洗，其原理框图如图4 2 所示。 4 2 1 清洗头结构 图4 2 洗板模块原理框图 e c h o l 机械传动部分是运动指令的最终执行者，它的运动精度直接影响着最终的 精度。其中清洗头的设计是整个机械传动部分的关键部分，它是洗板模块与被 清洗的酶标板的直接接触部分，它设计的恰当与否直接关系着最后的清洗效果 【2 9 】。本课题所设计的清洗头如图4 3 所示，采用双排1 6 针的结构，这样酶标板一 次移进就可以清洗一行试剂空，增加了洗板的速度，提高了整个模块工作的效 率。 洗板残余量是洗板模块最重要的指标，为了不影响测试结果的准确性，要 保证残余量不大于2ul 。在清洗头的设计中采取的措施为将每孔的清洗头设计为 如图4 3 所示的具有长度差的双孔结构，a 层为进水口层，b 口为排水口层。在酶 标板移动到位后清洗头下降到排水针接触到酶标板的底部，这样进水口距离酶 标板底部具有一定的距离，在压力进水的过程中，水流就具有一定的冲击力， 增加了冲洗面积和清洗力度，提高了清洗效果。在排水的过程中，排水针可以 第4 章洗板模块的设计 下降到酶标板的最底部，保证了排水效果。另外为了减低洗板的残余量，采用 多点排水的排水方法，可以将清洗头分别移动到试剂孔的中点或者前后左右点 进行清洗【3 ，具体清洗点的选择由操作者在开始选择的清洗方式决定。 由于清洗针的直径比较小，在长期的使用过程中容易产生堵孔而造成清洗 不彻底的现象。为了避免产生堵孔现象，在酶标板移动架的一端设计了清洗池， 可以定期使用蒸馏水对清洗针进行清洗，预防堵孔现象的发生i j l | 。 i 镰i ：霉霉j 嚣霹 罐藉陵墓攀篝肇薄箩 a 88l鲤ii醛l 图4 3 清洗头结构示意图 图4 4 进液部分结构图 4 2 2 注水排水系统及残余量的控制 第4 章洗板模块的设计 注水排水系统对模块残余量的控制有着很重要的影响。进液部分结构如图 4 4 所示，四路清洗液通过电磁阀选择其中- - f o g 进入到清洗头进行清洗。图中a 为连接清洗液储存瓶与电磁阀之间的进液管，b 为连接电磁阀和清洗头之间的进 液管。当用户根据清洗对象选择- f , 清洗液后，程序便会根据选择打开其中的 一路电磁阀，这一路清洗液便会从a 管流入到b 管从而进入清洗头进行清洗。 图4 5 排水部分结构图 排水部分采用负压排水的方法【32 1 ，其结构如图4 5 所示。其中1 为废液瓶，2 为真空瓶，3 为连接清洗头和废液瓶之间的朔料管，4 连接蠕动泵，负责将废液 瓶的废液排出，5 n 液位传感器，7