（生物化学与分子生物学专业论文）拟南芥渗透胁迫应答基因的筛选及功能分析.pdf

摘要 摘要 逆境胁迫因子如高盐、干旱、低温等人人限制了植物的生长发育，是导致粮食作物减产的重 要因素。随着我国人口数量的不断膨胀，耕地面积的不断减少，如何有效利用沙化、盐碱地已成 为我国粮食作物生产所面临的严峻问题。通过植物基因1 1 程技术改良物种，使作物具有较高的抗 渗透胁迫能力，是解决这一问题的有效途径。目前，植物抗渗透胁迫基因工程的研究热点主要集 中在如何提高植物的抗渗透胁迫能力上，而从大量的胁迫相关基因中筛选出抗渗透胁迫的关键基 因是植物抗渗透胁迫基因工程的关键。 本研究以前期通过生物信息学手段预测得到的拟南芥渗透胁迫相关基因为基础，采用 r e a l t i m ep c r 方法，对预测基因进行筛选。将筛选到的渗透胁迫虑答基冈转化烟草，验证基因的 功能。获得了2 个具有抗渗透胁迫功能的新基因。该研究结果为前期的基冈功能预测j f ：作提供了 实验证明，也为植物抗渗透胁迫基冈1 ：稃提供了新的基冈资源。 取得的主要研究结果如下： 1 r e a l t i m ep c r 筛选渗透胁迫麻答基因 通过r e a l t i m ep c r 方法对8 个拟南芥基因在渗透胁迫前后的表达水平进行了检测，得到了4 个渗透胁迫条件下上调表达的基因，分别命名为a t m y b l 2 6 ，a t l m p ，a t d b p l ，a t d b p 2 。 2 植物表达载体的构建 通过r t - p c r 克隆了上述4 个渗透胁迫应答基因，构建了由组成型启动子c a m v 3 5 s 调控的 植物表达载体p b m y b ，p b i m p ，p b p i ，p b p 2 。将其导入到农杆菌b l a 4 4 0 4 ，以用于下一步转化 烟草。 3 烟草的遗传转化 以烟草“龙江9 l l ”为受体材料，利用农杆菌介导法将上述4 个植物表达载体进行遗传转化， 获得抗性植株。 4 转基因植株的筛选及抗逆性检测 抗植株扣叶盘，置于含k m 的分化培养基上进行二次筛选，得到遗传背景完全一样的转基因 烟草。转a t m y b l 2 6 基因的3 0 个株系二次筛选得剑2 5 个分化株系；转a t l m p 基因的3 1 个株系 二次筛选得到2 5 个分化株系：转a t d b p l 基冈的2 4 个株系二次筛选得剑2 1 个分化株系；转a t d b p 2 基因的2 4 个株系二次筛选得到2 0 个分化株系。 对二次筛选得到的幼苗进行抗盐性及抗旱性检测。共获得转a t d b p l 基冈的抗盐植株1 1 个， v 东北农业犬学理学硕十学佗论文 其中既抗盐又抗旱的植株4 个；获得转a t d b p 2 基因的抗盐株系l1 个，其中5 个株系既抗盐有抗 旱；a t m y b l 2 6 、a t l m p 在逆境胁迫下的表现与对照植株并无明显差异。 5 抗逆转基因植株的分子检测 对具有抗逆性的植株进行了p c r 检测及r e a l t i m ep c r 检测。对转a t d b p l 基因的1 2 个耐盐 株系进行p c r 检测，获得阳性植株1 0 个，从中选取5 个抗性较好株系进行r e a l t i m ep c r 检测， 结果表明a t d b p l 基冈在2 个株系中超鹫表达：对转a t d b p 2 基冈的1 1 个耐盐株系进行p c r 检 测，获得阳性植株9 个。选取5 个抗性较好的株系进行r e a l t i m ep c r 检测，结果发现a t d b p 2 基 冈在4 个株系中超量表达。 6 抗性植株的生理指标检测 对r e a l t i m ep c r 检测超量表达的株系进行生理指标的检测。相对电导率测定结果表明，r e a l t i m e p c r 检测超量表达的抗性株系胁迫处理后的相对电导率与对照株系相比保持在相对稳定的水品； 叶绿索含量的测定结果表明，r e a l t i m ep c r 检测超量表达的抗性株系胁迫处理后的叶绿素含量降 低幅度要小于对照株系。 关键词拟南芥：渗透胁迫：功能分析 v i a b s t r a c t t h e s c r e e n i n ga n df u n c t i o n a n a l y s i so fa r a b i d o p s i so s m o t i c s t r e s sr e s p o n s i b l eg e n e s a b s t r a c t a d v e r s ee n v i r o n m e n t a ls t r e s ss u c ha sd r o u g h t ，c o l da n dh i g hs a li n i t yr e s t r i c t e dg r e a t l yp l a n tg r o w t ha n d p r o d u c t i v i t y ，t h e ya r et h ef a t a lf a c t o r si n d u c ep r o d u c t i v i t yo fa li m e n t a r yc r o p w i t ht h ep o p u l a t i o nk e e p i n g i n c r e a s i n ga n dd e c r e a s i n go fc r o p l a n da r e a ，h o wt ou s et h ed e s e r ta n da l i n el a n d si sa nv e r yi m p r o t a n t p r o b l e m u n d o u b t e d l y ，i m p r o v e m e n t i n gs p e c i e st h r o u g hp l a n tg e n e t i ce n g i n e e r i n gt e c h n o l o g ym a k i n gc r o p s t ot a k ep o s s e s s i o no fh i i g h e rr e s i s t a n c et oo s m o t i cs t r e s s ，t h a ti sau t i l i t yw a yw h i c hc a ns o l v et h i sp r o b l e m a t p r e s e n t ，h o wt oi n c r e a s ep l a n t sa b i l i t yo fr e s i s t i n go s m o t i cs t r e s sh a v eb e e nb e c o m ea h o ts p o to fp l a n tg e n e t i c e n g i n e e r i n go no s m o t i cs t r e s s ，n e v e r t h e l e s s ，s c r e e n i n gr i s i s t a n c eo s m o t i ck e yg e n e sf r o mm a s s i v eo s m o t i c s t r e s sg e n e sb e c o m eac r i t i c a l i t ya s p e c to fp l a n tg e n e t i ce n g i n e e r i n go no s m o t i cs t r e s s i nt h i ss t u d y ，w es c r e e n i n gp r e d i c t e dg e n e sb yr e a l t i m ep c rb a s e do nt h ep r e d i c t e do s m o t i cs t r e s sr e l a t e d g e n e sf r o ma r a b i d o p s i s ，w h i c hw e r eo b t a i n e db yb i o i n f o r m a t i c sm e t h o d w et r a n s g e n i co s m o t i cs t r e s s r e s p o n s i b l eg e n e sw h i c hw e r eo b t a i n e db yr e a l t i m ep c ri nt ot o b a c c o ，t ov a l i d a t eg e n ef u n c t i o n 2n e w g e n e sh a v er e s i s t a n c eo s m o t i cs t r e s sf u n c t i o nw e r eg o t o u rs t u d yn o to n l yp r o v i d i n ge x p e r i m e n t a le v i d e n c e f o rp r e v i o u sg e n e sf u n c t i o np r e d i c t i o n ，b u ta l s op r o v i d i n gi m p o r t a n tg e n e sf o rp l a n tg e n e t i ce n g i n e e r i n go n o s m o t i cs t r e s s t h em a i nr e s u l t sw e r es u m m a r i z e da sf o i l o w s ： 1 r e a l - t i m ep c r s c r e e n i n go s m o t i cs t r e s sr e s p o n s i b l eg e n e s t h ee x p r e s s i o no f8a r a b i d o p s i sg e n e sw e r ei d e n t i f i c a t e db yr e a l - t i m ep c r ，w eo b t a i n4u p r e g u l a t i o n e x p r e s sg e n e sa to s m o t i cs t r e s s ，d e s i g n a t i n gt h e ma t m y b l 2 6 , a t l m p , a t d b p l ，a t d b p 2r e s p e c t i v l y 2 c o n s t r u c t i o no fp l a n te x p r e s s i o nv e c t o r w ec o n s t r u c t e df o u rp l a n te x p r e s s i o nv e c t o r s ：p b m y b ，p b i m p , p b p1 ，p b p 2w h i c h r e g u l a t e db y c a m v 3 5 sp r o m o t e r ，a n dt h e nt h ev e c t o r sa r et r a n s l a t e di n t oa g r o b a c t e r i u mb l a 4 4 0 4f o rt o b a c c o t r a n s f o r m a t i o n 3 t r a n s f o r m a t i o nm e d i a t e db ya g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s t h e4g e n ea b o v e w h i c hw e r er e g u l a t e db yp r o m o t e rc a m v 3 5 s ，w e r et r a n s f e r r e di n t ot o b a c c o “l o n g j i a n g9 11 ”a n de a c hc o m b i n a t i o n a l lo b t a i n e ds o m er e s i s t a n ts e e d l i n g s 4 s c r e e n i n go ft r a n s g e n i cp l a n t sa n d i d e n t i f i c a t i o no fr e s i s t e n ts e e d l i n g s v i i 东北农业人学理学硕i 。学位论文 d i s c sf r o mr e s i s t e n ts e e d l i n g ss c r e e n i n go nm sm e d i u mc o n t a i nk m ，t h e nw ec a no b t a i nt h es e e d i n g s u n d e rt h es a m eg e n e t i cb a c k g r o u n d t h e r ew e r e2 1d i f f e r e n t i a t e dl i n e si n2 4l i n e sw i t ha t d b p i ，2 0 d i f f e r e n t i a t e dl i n e si n2 4l i n e sw i t ha t d b p 2 ，2 5d i f f e r e n t i a t e dl i n e s i n3 0l i n e sw i t ha t m y b l 2 6 ，2 5 d i f f e r e n t i a t e dl i n e si n3 0l i n e sw i t ha t l mp s e e d i n g so b t a i n e db ys e c o n d a r ys c r e e n i n gw e r ea c c e p t e dd e t e c t i o no fs a l tr e s i s t e n c ea n dd r o u g h e ：i n 1 1s a l tt o l e r a n c el i n e sw i t ha t d b p l ，t h e r ew e r e8l i n e sh a v ed r o u g h tt o l e r a n c e ；i n1 1s a l tt o l e r a n c el i n e s w i t ha t d b p 2 ，t h e r ew e r e9l i n e sh a v ed r o u g h tt o l e r a n c e u n f o r t u n a t l yt r a n s g e n i cl i n e sw i t ha t m y b l 2 6a n d a t l m pd i dn o td e m o n s t r a t es i g n i f i c a n th i g h e rt o l e r a n c et os t r e s s 5 m o l e r c u l a ri d e n t i f i c a t i o no fr e s i s t a n c ep l a n t s r e s i s t a n c ep l a n t sw e r ed e t e c t e db yp c ra n dr e a l t i m ep c r i n12s a l tr e s i s t a n c el i n e s ，t h e r ew e r e1 0 p c rp o s i t i v ep l a n t s w es e l e c t e d5l i n e sf r o mt h e mr a n d o m l y , a n d2o v e r - e x p r e s s i o na t d b p ll i n e sw e r e o b t a i n e d ；i n11s a l tr e s i s t a n c el i n e s ，t h e r ew e r e8p c rp o s i t i v ep l a n t s w es e l e c t e d5l i n e sf r o mt h e m r a n d o m l y , a n d4o v e r e x p r e s s i o na t d b p il i n e sw e r eo b t a i n e d 6 i d e n t i f i c a t i o no fr e s i s t a n tp l a n t sp h y s i o l o g i c a li n d e x r e s i s t a n tp l a n t sp h y s i o l o g i c a li n d e xw a sd e t e c t e d r e s i s t a n tp l a n t s c o n d u c t a n c eu n d e rs a l t ys t r e s sw a s m o r es t a t i o n a r yt h a nc o n t r o l ；c h l o r o p h y l li nt r a n s g e n i ct o b a c c ou n d e rs a l t ys t r e s sw a s h i g h e rt h a nc o n t r 0 1 k e yw o r d s ：a r a b i d o p s i s ；o s m o t i cs t r e s s ；a n a l y s i so f g e n e s f u n c t i o n c a n d i d a t e ：t i a nj i a s p e c i a l i t y ：b i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l a rb i o l o g y v i i i s u p e r v i s o r ：v i c e p r o f l ij i e 研究生学位论文独创声明和使用授权书 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ( 注；翅逡直墓丝盂蔓签别直塑数：奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证 书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：、刁侈日期：弘移年莎月，7e l 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文 在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：l 司住 导师签轹瓠 同期：泗暑年名月1 7 日 日期：弘缪彩月侗 引占 1 引言 1 1 研究的目的和意义 植物在生活周期中会遇到各种各样不利环境条件的挑战，如盐碱、干旱、低温等，这些逆境 胁迫会限制植物水分的吸收和影响植物细胞中水分的分布，进而制约其生长发育，最终导致农作 物严重减产甚至死亡。全球盐碱地约占陆地面积的1 3 ，在我国1 5 亿亩耕地中约有1 亿亩为盐碱 地，此外还有5 亿多亩为盐碱荒地。世界上还有近l 3 的地区属丁干旱地区，即使在雨水充足的 地方也会经常出现短期缺水的现象，干旱给全球农业和林业带来了严重危害。另外，在低温条件 - 卜植物会产生保护机制，但气温突降会使植物来不及产生应对机制，便己死亡。人口增k 的巨大 压力及全球环境和气候的变化，要求我们迅速扩大农作物的种植面积和区域，培育耐盐、耐早及 耐低温的植物对解决因环境恶化给农业带来的灾害具有重要意义。 传统育种学家已经在提高植物抗逆性方面进行了长期的探索与研究，但常规育种方法存在着 丁作量大、周期氏、耗资多、效率低、可利崩基因资源有限等弊端。近年来，随着分子生物学的 飞速发展和基冈工程技术的日趋成熟，人类可以有目的地改造生物的这种特性，通过基因工程手 段改良作物的抗渗透胁迫能力为提高作物产量、解决人类的生存与环境问题提供了新的途径。研 究表明，植物对渗透胁迫的抗性是受多基因、多因子调控的复杂遗传性状；利用单一功能基囚很 难使植物的抗逆性得到理想的改良。因此如何利用抗逆基因资源，从大量抗渗透胁迫相关基因中 寻找到“关键基因”，是植物抗渗透胁迫基冈t 1 ：程的首要任务。 本研究以前期通过生物信息学手段预测得剑的拟南芥胁迫相关基冈为基础，采用r e a l t i m e p c r 方法，对预测基冈进行筛选。将筛选剑的渗透胁迫应答基冈转入烟草，验证基因的功能，筛 选抗渗透胁迫的新基冈。试图为前期的基冈功能预测i ：作提供实验证明，也为植物抗渗透胁迫基 因工程提供新的基因资源，因此本研究具有重要的理论研究价值和应用前景。 1 2 文献综述 1 2 1 植物渗透胁迫应答机制 渗透胁迫是指由于环境因素的变化使植物不能得到充足水分的一种状况。常见的渗透胁迫因 素有干旱、盐害及冻害等，会导致植物欠水而引发渗透势的变化，严重影响植物的生长发育及产 量。自然环境中，盐胁迫由土壤中高浓度的n a + 和c i 。引发，导致植物生长发育受阻，由此引 起了各种生理生化变化，其中包括：光合作用受抑制，营养物质摄取受阻，质膜的解体，活性氧 的增多和代谢毒物的积累等，严重的还会导致植株夕e 亡( 沈义国2 0 0 1 ) 。植物的耐盐及耐旱特性是 在一系列酶的凋节卜而发挥作川的，这些酶或蛋白分别参与植物的渗透凋节、离子区域化和离子 的选择吸收。通过对渗透涧1 ，剃合成基冈的克隆和转移，可以人人提高植物的抗逆性。同样，低 温也会造成根系对叶片的水分供应减少而使叶片膨压卜降，严重的可造成细胞膨压的完全丧失， 引起渗透胁迫，甚至造成死亡。植物在长期的进化过程中形成了一些保护机制能减轻渗透胁迫造 东北农业大学理学硕 j 学位论文 成的伤害，比如有些植物在形态上演化生成盐腺，能排出体内的过量盐分以逃避盐害。但在渗透 胁迫一f j l , 乎所有的植物都能合成一些无毒性的小分子有机物作为渗透调：1 ，剂来维持细胞内渗透 势的相对稳定，如脯氨酸、甜菜碱等，这些小分子的合成酶是一些耐盐相关基因研究的一个重点。 在分子水平上，在渗透胁迫下植物中一些基因的表达状况发生了改变，有些基因表达增强，有些 基因表达减弱，还有一些基因则由不表达状态变为表达状态。我们将这类基因统称为渗透胁迫应 答基因( 舒卫国2 0 0 0 ) 。植物在感受干旱、高盐及低温后，这些胁迫信号经一系列传递过程，最后 诱导特定功能基冈的表达，在生理生化上作出调：符反应，达到维持植物细胞水分平衡的目的。如 气孔的关闭、植物体内水分吸收的维持或增强、光合作用的保护、离子稳态的维持、新蛋白质的 合成、代谢的转变等等。同时，通过系列的信号传导( t h o m a s h o w ，1 9 9 9 ) ，植物细胞开始合成 一些新的抗逆相关转录l 天l 子，同时增强已有的逆境相关转录网子的表达，调控其他功能基因的表 达，并由这些功能基因去执行各种各样的生理功能，如转变细胞代谢，合成脯氨酸、多胺等抗渗 透物质，调解离子平衡，调1 ，基冈表达等。可见，植物的抗渗透胁迫反应是一个有众多基冈参与 的系统调控过程。人们止在从生理生化、细胞利分子水平米了解这一系列的保护机制。 1 2 2 渗透胁迫应答相关蛋白 在渗透胁迫条件下，植物的许多基因可以被诱导表达。与功能已知的蛋白质的同源序列比较 分析表明，这些基冈的表达产物具有广泛的潜在功能。这些产物一般可分为两大类，即功能蛋白 ( f u n c t i o np r o t e i n s ) 和调节蛋白( r e g u l a t o r yp r o t e i n s ) ( s h i n o z a k ike ta l ，1 9 9 7 ) 。第1 类功能蛋 白是在抗渗透胁迫中直接起作用的蛋白质；第2 类调：j 了蛋白则参与渗透胁迫的信号传导或基因表 达调控，起到间接保护作用，其中转录冈子是调二i 了蛋白的主要成员。 1 2 2 1 膜蛋白 生物膜参与细胞的物质运输、信号转导、代谢调控利能量转换等生命活动。近儿年，对植物 膜蛋白进行蛋白组学的研究报道主要集中于拟南芥上。表1 1 列举了近几年对植物膜蛋白质组学的 研究。在各种逆境中植物受剑伤害最人的结构就是膜结构，冈此逆境条f ，l ：f 植物诱导合成了许多 膜蛋白，以维持细胞膜结构及其功能的稳定性。水孑l 蛋白是与渗透胁迫密切相关的膜蛋白，水孔 蛋a ( a q u a p o r i n ) 属丁跨膜通道m i p ( m e m b r a n ei n t r i n s i cp r o t e i n ) 人家族，是一种能介导水分跨膜运 输的功能性的膜通道蛋白，它j “泛地存在于从微生物剑高等动物和植物的各种生物体中，对水具 有专一性。水孔蛋白在转录、翻译、翻译后修饰等各个水平上均受到凋控。植物中第一个水孔蛋 白丫一t i p 是由m a u r e l 等于1 9 9 3 年从拟南芥液泡膜中分离出来的。水孔蛋白的发现对植物生理学是 一个概念性的发展。液泡是植物细胞所特有的泡状结构，液泡与细胞质有一层液泡膜，液泡膜具 有特殊的选择透性，使液泡具有高渗性质，能调节细胞渗透压和膨压，并能使多种物质在液泡内 贮存和积累( m a e s h i m am2 0 0 1 ) 。s a n t o n i 等利用2 0 d e 分析了拟南芥叶子的质膜蛋白，发现用 n a 2 c 0 3 处理膜蛋白，并且用含c 8 中的裂解液裂解后，人大地提高了疏水性蛋向的溶解性，利用 m a l dl o t o f o m s 鉴定了其中的6 1 个点，发现其中包含有水通道蛋白剃a t p a s e 等膜内蛋白。为 了鉴定质膜中的整合蛋白和外周蛋白，a l e x a n d e r s o n 等利刚6 1 ( w w ) d e x t r a n5 0 0 和6 1 ( w w ) p e g3 3 5 0 两相分配法纯化了拟南芥叶子和叶柄的质膜，通过s d s o p a g e 和l c o m s m s 鉴定了 2 引言 2 3 8 种膜蛋向，发现其中1 7 的蛋白质是通道蛋白，1 6 是信号转导蛋白，9 是膜运输蛋白，9 是应答蛋白。而被鉴定的蛋白中有人约一小的蛋白是未知功能蛋l e l ( a l e x a n d e r s o ne2 0 0 4 ) 。表1 1 列举了植物膜蛋白质组学的研究进展及研究方法( 张江巍2 0 0 7 ) 。 表1 1 植物膜蛋白质组学的研究 t a b 1 - lr e c e ntp r o t e o mi t ss t u di e so fp l a nt m e m b r a n es y s t e m 到目前为止，在拟南芥、烟草、玉米、豌豆、水稻、马铃薯、桃、郁金香等多种植物中都发 现了水孔蛋白，另外从蛋白数据库中发现了人鼙水孑l 蛋白的同源物。与动物水孔蛋白不同，植物 体中会表达大量的水孑l 蛋白同源物，而且数目惊人。例如，拟南芥基冈组中已鉴定出3 5 个水孔蛋 白基因，玉米中有3 6 个表达的水孑l 蛋白基因已被检测剑，水稻基因组中有3 3 个水孔蛋白基因被鉴 定( f r a n c o i s ，2 0 0 5 ) 。水孔蛋白能够使水分子沿着水势差跨膜运输，这一过程不需要生物提供直 接的能量，然而水孔蛋白并不是一个简单的让水分通透的物理性通道，它具有生物调节功能，这 也是水孔蛋白介导的水分跨膜运输的一个重要特点。关于对水孔蛋白调控的研究，目前主要集中 在转录水平的研究，包括蛋白磷酸化在内的翻译后调节则是最近几年的研究热点。转录水平的调 节是对水孔蛋白活性的一个“粗调”过程，而蛋白磷酸化等翻译后调：常则是一个“精调”过程， 通过两者协同作用共同实现对水孔蛋白的表达调控。 1 2 2 2 渗透胁迫相关转录因子 与渗透胁迫相关的转录冈子是凋。1 j 蛋白的重要闪素。转录冈子也称反式作删冈子，是指能够 3 东北农业大学理学硕十学位论文 i 与基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性相互作用的u n f 结合蛋白，通过它们之间以及与其 它相关蛋白之间的相互作用激活或抑制转录( 刘强2 0 0 0 ) 。典型的转录因子含有d n a 结合区 ( d n a b i n d i n gd o m a i n ) 、转录调控区( a c t i v a t i o nd o m a i n ) 、寡聚化位点( o li g o m e r i z a t i o ns i t e ) 以 及核定位信号区( n u c l e a rl o c a l i z a t i o ns i g n a l ) 等功能区域。转录因子通过这些功能区域在特定的 时间进入细胞核内，与特定基因启动子区域中的顺式作用元什相互作用或与其它转录因子的功能 区域相互作用来调控基因的表达。近年来，相继分离了一系列植物转录因子，并证明它们在调节 植物的生长发育及其对外界环境的反应等方面起着重要的作用。不仅如此，还发现一个逆境相关 转录因子可以调控多个逆境相关功能基因的表达，利用转录因子来改良植物抗逆性，能获得较为理 想的综合效果。拟南芥基因组测序的完成，已推断至少有2 7 0 0 0 个编码转录因子的基冈，约占其 估计总基因数的6 5 ，( r i e c h m a n n 2 0 0 0 ) ，拟南芥中转录因子基因数量如此之大、种类如此之多， 表明植物转录调控的复杂性，也表明了植物转录囚予研究的重要性，而现在拟南芥中总体上已描 述其特征的转录因子只约l i 其总数的5 ( r i e c h m a n n2 0 0 0 ) 。 1 ) d r e 类转录因子 脱水u 向戍转录冈子( d e h y d m i o nr e s p o n s i v et r a n s c r i o t i o nf a c t o r s ，d r e b ) 可以调：肖一些对低温 或缺水胁迫响应的基冈。能被低温和水胁迫诱导的d r e b 基冈编码一种转录冈子，可以结合顺式 作用元件( d r e ) 驱动一些与胁迫相关的基冈的转录表达( s m i r n o f f a n db r y a n t ，1 9 9 9 ) 现已有很 多与d r e 相结合的转录冈子被分离出来，分别命名为c b f l d r e b l b 、c b f 2 d r e b c 和 c b f 3 d r e b l a ( s t o c k i n g e re j 甜a l ， 19 9 7 ；g i l m o u r ，s j p f 口，l9 9 8 ；l i uqe ta l ，19 9 8 ；m e d i n a j e ta l ， 1 9 9 9 ；d u b o u z e tj ge ta l ， 2 0 0 3 ) 。转录因子与气动元件结合促使一系列基困的表达，表现 出植物对低温和水胁迫的适应性。将米源于水胁迫诱导基因( r d 2 9 a ) 的d r e 启动子与拟南芥d r e b 基因( d 咫_ 口埘) 融合转入植物，超表达d r e b 的转基因植株对冻害、缺水胁迫、盐胁迫等表现出 很强的抗性。比如，z h a oj 等( 2 0 0 7 ) 为了提高酥油草的抗旱能力将拟南芥中的d r e b l a 基因转入酥 油草中，发现爿加删能够稳定遗传在t 1 代植株中表达，d r e b 1 - 游基因a 嘏觅磁在转基因植物中 也有上调表达。他们发现转基冈酥油草的比咯氨酸的含繁有显著提高，这也说明了彤在诱发植 株抗逆反应中的作川，该研究为提高酥油草耐早性及逆境相关的转录因子利启动子提供了有力证 据。以往的研究证明d r e b c b f 是植物中典型的干旱、盐碱及低温的应答基冈，最近有研究表明 历劂基因是受高温诱导的，它是拟南芥热胁迫的调控闪子，s c h r a m m 等( 2 0 0 8 ) 进一步研究了 s _ r a 躔因分子调控和运作过程，发现在2 1 个拟南芥h s f 家族成员中h s f a 3 是唯一的在热诱导下受 d r e b 2 a 调控的基因，h s f a 3 的突变体植株的耐热性明显下降，这一d r e b 2 a 对h s f a 3 的调控机制对于 植物耐热分子机制的建立具有重要的意义。d r e b 类转录网子也，“泛存在于藓类植物中，土生小 型藓类中的p p d b f l ( p h y s c o m i t r e l l ap a t e n sd r e b i n d i n gf a c t o r l ) 基因已被分离出来，l i un ( 2 0 0 7 ) 将该基冈转入烟草中，结果发现超表达p p d b f l 基冈的烟草对于盐、干早及低温的胁迫具 有很强的耐性，他们的结果表明p p d b f l 可能是d r e b 类的转录因子，这就意味着在苔藓和高等植物 中也有类似的调控机制。 2 ) 蛋白磷酸酶 4 引言 植物中存在为数众多的蛋白激酶和磷酸酶，参与体内庞杂信号网络的各个方面，拟南芥基因 组中编码蛋白磷酸酶的基因就有1 1 2 个( d a v i dk e r k2 0 0 2 ) 。真核生物中的蛋白磷酸酶根据其底物 特异性可分为两大类：丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶类( p r o t e i ns e r i n e t h r e o n i n ep h o s h o a t a s e s ，p s p s ) 和酪氨酸蛋白磷酸酶类( p r o t e i nt y r o s i n ep h o s p h a t a s e s ，p t p s ) 。其中，p t p s 类包括酪氨酸蛋白磷酸 酶和舣特异性蛋白磷酸酶，是一类能使磷酸化的丝苏氨酸和磷酸化的酪氨酸脱磷酸， 在结构上 是与其他相似的一类特殊蛋白磷酸酶。p s p s 根据催化弧基的不同及对特定抑制剂的不同敏感性分 为p p l 和p p 2 两类。p p l 对哺乳动物磷酸化酶激酶亚基的去磷酸化活力较高，受内源蛋白抑制物i - l 和i 2 的抑制。p p 2 对磷酸化激酶亚基的去磷酸化活力较高，且不受i 1 和i 2 的抑制，此酶的催化 亚基可单独存在，无需特定调节亚基的结合， 但其功能的实现需要特定的调：符皿基将其在细胞 内定位或者识别特定的底物。p p 2 按照弧基的结构、活力及对二价阳离子的依赖性又被进一步分 为个3 皿类p p 2 a 、p p 2 b 矛 i p p 2 c ( 图1 1 ) 。p p 2 a 所有的均由一个催化亚基和一个调： 7 亚基组成其 核心，p p 2 a 的活性不依赖于二价阳离子；p p 2 b 是迄今发现的惟一依赖于c a 2 + c a m 的蛋白磷酸酶； p p 2 c 由一个催化亚基和一个调节亚基构成是一种单体蛋白磷酸酶，其活力依赖于m 矿+ 或m n 什。 p p 2 c 是一类具有多种功能的蛋白磷酸酶，它的许多成员已在许多生物体以及生物体的不同组织内 得到检测并进行特性分析。p p 2 c 广泛存在于原核生物和真核生物中，这一家族的很多成员都与信 号传导途径相关，拟南芥数据库分析结果表明，p p 2 c 可能是植物中最庞人的蛋白家族，它的7 6 个成员有着高度的复杂性结构，在其他真核生物中该类蛋白也为数众多( s c h w e i g h o f e r 2 0 0 4 ) 。低 等真核生物的遗传学研究也为研究蛋白磷酸酶在信号通路中的功能提供依据。如在酵母中，p p 2 c 在由外激素诱导的m a p k 信号传递途径中充当负调控因子，对融合酵母的遗传学分析表明p p 2 c 可 能位于s p c l 下游( g a i t s1 9 9 7 ) 。 图1 1 蛋白磷酸酶的分类 f i g 1 1c l a s s i f i c a t i o no fp r o t e i np h o s p h a t a s e 对w i s i s p c lm a p k 介导的逆境信号途径欺负凋控作用( s h i o z a k i3 1 1 r u s s e l l1 9 9 5 ) 已经揭示， 高等真核生物中的是逆境胁迫信号激活的激酶通路中的一种负调控因子。p p 2 c 在高等植物中广泛 参与a b a 调控的各种信号途径， 包括诱导的种子萌发休眠、幼苗根系的伸长、保卫细胞及离子 通道调控和气孔关闭、逆境胁迫等。蛋白磷酸酶磷酸蚩自酶可以通过磷酸化与去磷酸化作来调控 基因的转录，当植物受到外界环境的1 # 生物胁迫时。磷酸蛋白酶会与细胞会迅速作出反应。j o s e a 5 东北农业大学理学硕十学位论文 l c a r r a s c o ( 2 0 0 3 ) 已将烟草中的p p 2 c 类基因d b p l ( d n a 。b i n d i n gp r o t e i np h o s p h a t a s e1 ) 分离出来， 发现它不仅可与d n a 结合并具磷酸蛋白酶的活性，当受到病害刺激后植物体内的蛋白激酶和磷酸 蛋白酶会协调作用选择性的表达一些蛋白来调节信号的传导。最近他们又进行了深入研究，发现 d b p l 是c e v il 表达的开关( j o s el2 0 0 6 ) 。 由于在蛋白激酶和蛋白磷酸酶转录起始的过程中，存在很多蛋白与d n a 及蛋白之间相互作 用的复杂关系，基因的表达受蛋白冈子的催化的蛋白可逆磷酸化是细胞信号传导中的重要组成部 分，这种翻泽后修饰可以改变信号通路中许多关键蛋白质的性质，真核生物的调控蛋白较原核生 物既复杂又灵活。磷酸化去磷酸化作用对很多转录因子的功能起调控作用，目前，蛋白质的可 逆磷酸化在控制细、胞对胞外刺激的反应过程中的重要性已经得到，“泛的认知，而且细胞的生 长、发育、分化及许多其他的受到信号转导调控的生理学反应大多都建立在磷酸化雨l 脱磷酸化的 基础之上，蛋白质的可逆磷酸化反应对丁信号的快速、精确传递起着不可替代的作用。多数蛋 白磷酸酶和蛋白激酶一样受到精确调：青， 许多蛋白磷酸酶位于信号转导途径的下游或末端，是 信号调= 宵的对象，这种对蛋白激酶调节过程的存在说明蛋白磷酸酶的重要性。目前越来越多的 研究发现，蛋白磷酸酶与蛋白激酶一样，在信号转导中尤其是在由环境胁迫所激活的信号通路 中同样起调控作用，在蛋白质的可逆磷酸化反应中，两者缺一不可。 3 ) m y b 类转录因子 m y b 类蛋白在植物生k 和抗胁迫反应中起调控作刚的转录冈子中的一个人家族。它是植物中 数量最多、功能最多样化的转录冈子。m y b 类转录冈子家族是指含有m y b 结构域的一类转录 因子。m y b 结构域是一段约5 1 5 2 个氨基酸的肽段，包含一系列高度保守的氨基酸残基衣l 间隔 序列。植物m y b 转录因子以含有保守的m y b 结构域为共同特征，广泛参与植物发育和代谢的调 节。植物m y b 类转录冈子以含有m y b 结构域为共同特征，根据所含m y b 结构域的数目，植物 中的m y b 类转录因子可简单分成3 个亚类：只含一个m y b 结构的m y b 蛋白亚类成员可能是一 类重要的端粒结合蛋白，在维持染色体结构的完整性和凋节基冈转录上起重要作用( b i l a u d 等 1 9 9 6 ) ；r 2 r 3 亚类成员含有两个m y b 结构域，该弧类在植物中数量最多，这些蛋白具有多重功 能，它们或参与次生代谢的调节，或控制细胞的分化，或应答激素刺激和外界环境胁迫以及抵抗 病原菌的侵害( h a i l i n gj i n l 9 9 9 ) ；r i r 2 r 3 哑类成员含有3 个m y b 结构域，与动物、真菌中 的r 1 r 2 r 3 2m y b 蛋白高度同源，主要参与细胞周梵玎的控制和调1 了细胞的分化( i t o2 0 0 0 ) 。 s t m y b l 是植物中鉴定的第一个只含一个m y b 结构域的m y b 蛋白，随后相继发现i b p l 、 b p f l 、c c a l 和l h y 等只含有一个m y b 结构域的m y b 蛋( ：l ( b i l a u d 等1 9 9 6 ) 。表1 2 列举了模式 植物拟南芥中已知的m y b 类转录【天l 子及其可能的生物学功能( h a i l i n gj i m 9 9 9 ) ，可以看出m y b 转录冈子有着广泛的生理功能，几乎参与植物发育和代谢的各个方面。c h e ny a n h u i l 等鉴定了拟 南芥基因组中的1 9 8 个m y b 类蛋白，其中有1 2 6 个属丁r 2 r 3 一m y b ，1 2 6 为r i r 2 r 3 m y b ，5 个是 m y b 一相关，3 个非典型m y b ，他们分离了其中的1 6 3 个基因，研究发现，m y b 相关蛋白家族较 r 2 r 3 m y b 基冈家族更为古老且进化更为迅速( c h e ny a n h u i l2 0 0 6 ) 。 6 引言 表卜2 拟南芥m y b 类转录因子及其生物学功能( 根据j i n 和m a r t i n1 9 9 9 修改) t a b 。卜2a r a b i d o p s i sp l a n tm y b t r a n s c r i p t i o nf a c t o r sa n dt h e i rb i o l o g