（生物化学与分子生物学专业论文）拟南芥alp1互作基因的筛选.pdf

c l a s s i f i c a t i o n ：q 7 8 6 d e g r e eo fs e c r e t s ： u n i tc o d e ：10 3 8 9 s t u d e n t sn u m b e r ：1 0 7 1 6 2 6 t h em a s t e r st h e s i so ff u j i a na g r i c u l t u r ea n df o r e s t r yu n i v e r s i t y s c r e e n i n g f o r p r o t e i ni n t e r a c t i n gw i t ha l p l b r a n c h e so fk n o w l e d g e ：s c i e n c e p r i m a r ys u b j e c t ：b i o l o g y s e c o n d a r ys u b j e c t ：b i o c h e m i s t r ya n d m o l e c u l a rb i o l o g y r e s e a r c hd i r e c t i o n ：p l a n tb i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l a rb i o l o g y c a n d i d a t e ：l i f e n g s u p e r i o r ：d r z o n g h u aw a n g d r a i r o n gw a n g e x e c u t i o nt i m e ：m a y2 010 独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是本人在指导教师的指导下独立完 成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作 了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本 研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯 他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位( 论文储亲笔签名力锋 吼训扩 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或 部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在年后解密可适用本授权书。 不保密，本论文属于不保密。 靴( 论文储亲笔签硼锋 指导教师亲笔签名： v 矿 矿 y 机 伊 期 期 易、 福建农林大学硕士学位论文 目录 摘要1 a b s t r a c t 2 第一部分综述3 l 拟南芥的优势及研究策略3 1 1 模式植物拟南芥3 1 2 拟南芥分子生物学研究策略4 2j 蛋白的研究与进展5 2 1 分子伴侣热休克蛋白5 2 2 j 蛋白的结构与功能6 2 3 拟南芥中j 蛋白的研究7 3 生物信息学方法研究蛋白的相互作用8 3 1 生物信息学的网络资源8 3 2 蛋白互作生物信息学的计算方法概述9 4 基于酵母双杂交系统( y e a s tt w o - h y b r i ds y s t e m ) 的蛋白互作研究1 0 4 1 酵母双杂交系统的原理与应用1 0 4 2 酵母双杂交系统的局限和进展1 2 第二部分实验材料与方法1 4 1 材料1 2 l 1 1 植物材料14 1 2 菌株与载体。1 4 1 3 各种酶及试剂1 4 1 4 培养基15 2 实验方法与步骤16 2 1 拟南芥的培养1 6 2 2 基因引物设计1 6 2 3 t r 亿o l 一步法提取拟南芥总r n a 16 2 4 半定量r t p c r 方法17 2 5 大肠杆菌感受态细胞的制备18 2 6p c r 产物的连接一18 2 7 连接反应物对宿主感受态细胞的转化1 9 2 8 重组克隆的p c r 鉴定l9 2 9 人肠杆菌质粒的提取1 9 2 1 0 质粒的酶切鉴定2 0 2 1 1 酶切质粒的连接2 0 2 1 2 酵母质粒的小量转化2 l 2 1 3 酵母质粒的提取2 l 2 1 4 诱饵蛋白自激活实验2 l 2 1 5 酵母蛋白的提取2 2 2 16s d s p a g e 电泳2 2 2 17w e s t e r nb l o t i n g 2 3 2 18e d n a 文库的构建2 4 2 i9 使用c h r o m as p i n t mt e - 4 0 0c o l u m n 纯化d sc d n a 2 6 2 2 0 酵母感受态的制备2 6 福建农林大学硕士学位论文 2 2 l 酵母文库质粒的大量转化( p g a d t 7 ) 2 7 2 2 2 转化子的收获2 7 2 2 3 接合杂交2 8 第三部分结果与分析2 9 l 数据库分析预测a l p l 互作基因2 9 2p g b k t 7 a l p i 载体的构建和检测3 1 2 1 目的片段的获得及重组质粒酶切鉴定3 l 2 2 重组诱饵质粒p g b k t 7 a l p l 的毒性与自激活检测3 2 2 3s d s p a g e 和w e s t e r nb l o t t i n g 验证a h10 9 p g b k t 7 a l pi 蛋白的表达3 3 3 p g a d t 7 - x 载体的构建。3 4 4 p g b k t 7 a l p l 与p g a d t 7 - x 共转酵母a h l 0 9 检测蛋白互作3 8 5 拟南芥e d n a 文库的构建3 9 5 1 拟南芥r n a 的提取与检测：。3 9 5 2d sc d n a 的合成3 9 5 3 文库的构建及鉴定4 0 5 3 1 文库的转化效率一4 0 5 3 2 文库的保存及滴度的测定4 l 5 3 3 文库多态性及重组比的鉴定4 l 6 酵母y 1 8 7 ( p g a d t 7 - l i b r a r y ) 与a h l 0 9 ( p g b k t 7 - a l p l ) 菌株表达验证4 2 第四部分小结与讨论4 4 下一步工作4 7 参考文献4 8 附录l 本研究中所用的引物5 2 附录2 主要试剂与缓冲液的配制5 3 致 射5 5 i i 福建农林大学硕士学位论文 摘要 蛋白质间相互作用是当前的研究热点之一。了解蛋白质相互作用的方式、程 度、结果，将有助于分析蛋白质的功能、解决生命发育研究中等众多问题。作为 系统生物学的重要工具酵母双杂交技术被广泛应用于筛选和鉴定相互作用 蛋白，以及通过构建蛋白质相互作用网络，来阐明生命的运行规律。 植物中存在大量的j 蛋白，j 蛋白可作为同伴蛋白与h s p 7 0 组成分子伴侣机 器参与对逆境胁迫的应答。a l p i 是一种j 蛋白，a l p l 功能缺失突变体对盐、 a b a 、j a 敏感。而对于a l p l 的研究将有助于我们了解植物的抗逆机制。为了 揭示a l p l 相关的细胞信号转导途径，需要就a l p l 的互作机理进行探讨。 本论文在前期研究工作基础上，首先通过生物信息学的预测，获得了拟南芥 j 蛋白a l p l 可能的互作基因，然后采用了m a t c h m a k e rg a l 4t w o h y b r i d s y s t e m3 双杂交系统，对候选基因进行了初步筛选，结果表明a l p i 不与这些候 选基因互作。同时，构建了酵母诱饵表达载体p g b k t 7 a l p l 以及拟南芥c d n a 文库。其文库的转化效率为1 2 1 0 7 t r a n s f o r m a n t s 3 l a gp g a d t 7 - r e c ，文库的滴度 为2 4 6 1 0 9 p f u m l ，多态性及重组比符合酵母双杂交文库的构建要求。为后续 利用酵母双杂交技术筛选出a l p l 的互作蛋白及构建互作图谱奠定了基础。 关键词：a l p l ；酵母双杂交；c d n a 文库；诱饵载体 福建农林大学硕士学位论文 a b s t r a c t s t u d y o f p r o t e i n - p r o t e i n i n t e r a c t i o n si so n eo fc u r r e n tr e s e a r c hf o c u s u n d e r s t a n d i n gt h ei n t e r a c t i o nm e c h a n i s m sa m o n gp r o t e i n sw i l lh e l pt oa n a l y z e p r o t e i nf u n c t i o na n ds o l v em a n yp r o b l e m sr e l a t e dt ol i f e t h ey e a s tt w o - h y b r i d t e c h n o l o g yi sw i d e l yu s e di ns c r e e n i n gf o ra n di d e n t i f i c a t i o no fi n t e r a c tp r o t e i n s ，a s w e l la sc o n s t r u c t i n gp r o t e i ni n t e r a c t i o nn e t w o r k st oi l l u s t r a t et h el a wo fl i f e i ti sa n i m p o r t a n tt o o lf o rs y s t e mb i o l o g y t h e r ea r eal o to fd n a - j p r o t e i n si nt h ep l a n t ，jp r o t e i na n dh s p 7 0c o u l df o r ma m o l e c u l a rc h a p e r o n ei n v o l v e di nt h er e s p o n s et os t r e s s a l p1i sajp r o t e i n , i tw a s c o n f i r m e dt h a ta l p1l o s s - o f - f u n c t i o nm u t a n ti ss e n s i t i v et os a l t ，a b aa n dj ai n s e e d l i n g t h er e s e a r c ha b o u ta l p 1w i l lh e l pu su n d e r s t a n dt h em e c h a n i s mo fp l a n t s t r e s sr e s i s t a n c e i no r d e rt of u r t h e rr e v e a lt h ea l p1c e l ls i g n a lt r a n s d u c t i o np a t h w a y s ， i ti sf i r s tt oe x p l o r et h ei n t e r a c t i o nm e c h a n i s mo f a l p 1 t h e w o r ko ft h i st h e s i si sb a s e do nt h ep r i o rr e s e a r c hw o r ki no u rl a b o r a t o r y f i r s t ， t h ep o t e n t i a li n t e r a c t i n gp r o t e i n so ft h ejp r o t e i na l p1i na r a b i d o p s i st h a l i a n aw e r e p r e d i c t e db yb i o i n f o r m a t i c sm e t h o d t h e np a r t so ft h e s ep o t e n t i a lp r o t e i n sw e r e s c r e e n e db ym a t c h m a k e rg a l a t w o h y b r i ds y s t e m3 t h er e s u l t ss h o wt h a ta l l o ft h et e s t e dp r o t e i nd i dn o ti n t e r a c tw i t ha l p1 a tt h es a m et i m e ，ay e a s tb a i t e x p r e s s i o n v e c t o rp g b k t 7 - a l pla n dt h ee d n al i b r a r yo f a r a b i d o p s i sw e r e s u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e d t h el i b r a r yt r a n s f o r m a t i o ne f f i c i e n c yw a s1 2 10 7 t r a n s f o r m a n t s 3 1 x g p g a d t 7 r e c ，l i b r a r y t i t e rw a s2 4 6 l 0 9 p f u m l p o l y m o r p h i s ma n dr e c o m b i n a t i o nr a t em e tt h e y e a s tt w o - h y b r i dl i b r a r y r e q u i r e m e n t s t h i sw i l lb eu s e dt os c r e e nf o rt h ei n t e r a c t i n gp r o t e i no fa l p ia n d c o n s t r u c tt h ei n t e r a c t i o nm a pi nt h ef u t u r e k e yw o r d s ：a l p1 ；y e a s tt w o h y b r i d ；e d n al i b r a r y ；b a i tv e c t o r 2 福建农林大学硕士学位论文 第一部分综述 1 拟南芥的优势及研究策略 1 1 模式植物拟南芥 拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) 属十字花科拟南芥属，与白菜、油菜、甘蓝 等经济作物同属一科，具有显花植物的全部特征。与其它植物相比，它具有以下 优点【1 】： ( 1 ) 植株很小，成熟个体处在1 5 - - - 3 0 c m 之间，可以大批量地在实验室中培 养，易于控制其生长条件。目前，实验室中培养拟南芥的方法已经比较成熟，且 非常简便，培养基的使用可以较容易的排除由于环境变化给植物形态发育造成的 影响。 ( 2 ) 生长期短，是拟南芥应用于遗传学实验研究的个优势所在。播种后2 3 天开始萌发，2 0 天左右植株就开始开花结果，4 0 天左右种子成熟并且每株能产 生上万粒种子，这为子代性状分析提供了足够的群体，也很容易扩增变异株的种 子库。 ( 3 ) 拟南芥是典型的自交繁殖植物。不但可以很容易的完成人工杂交，而且 可以在子二代中直接筛选变异株的纯合子。从遗传学特性看，拟南芥易通过人工 诱导方式产生遗传变异。通过物理、化学或生物的方法进行处理，可产生十分理 想的拟南芥突变株。 ( 4 ) 拟南芥为二倍体，其染色体数为5 对，大概为1 3 0m b ，可编码近2 5 ，0 0 0 个基因，目前仅有1 0 的基因通过实验的方法获得证实，而剩余9 0 的基因功能 未知，或尚未完全证实。且拟南芥基因组是目前已知高等植物中最小的。基因组 中高、中、低度重复d n a 的比例低，使得基因库的构建和筛选等过程变的简便 快速。 ( 5 ) 由于植物进化过程中的遗传保守性，拟南芥与其它高等植物的基因组问 有较高的同源性，在拟南芥中发现的些重要的调节基因都能在其他植物中找到 它的同源基因。因此，利用拟南芥的研究成果，将为拟南芥优良基因向经济作物 转移奠定基础。 拟南芥作为植物分子遗传学研究中最受欢迎的模式植物，具有其独特的生 福建农林大学硕士学位论文 物学、遗传学及分子生物学特性。而2 0 0 0 年1 2 月自然杂志上公布的拟南芥 全基因组测序结果【2 1 ，使得拟南芥基因的研究更加深入，将带动农业、环境、人类 健康等多个领域产生巨大进步。 1 2 拟南芥分子生物学研究策略 目前正向遗传学和反向遗传学是拟南芥的研究主要的两种遗传学策略。正 向遗传学的研究方向是从突变体表型分析到其基因的功能。对正向遗传学来说， 突变体表型是研究的起点。通过化学诱变、物理及生物等各种方法获得突变体， 再以特定的条件筛选，以获得具有表型的突变体。然后通过各种手段，确定该突 变体变异基因的信息。通过分子生物学手段克隆该基因获得该基因序列，最后用 遗传互补实验证明该基因的功能。 但是，在拟南芥中的许多基因存在很大的冗余性，譬如一个基因的功能缺 失，具有相当同源性基因就会替代该基因的功能。我们通称这一类为同一基因家 族。据统计，拟南芥中可划入某个家族的基因高达6 5 1 3 1 。这将可能导致在正向 遗传筛选的过程中，因为一个基因的突变不会产生明显表型，而无法分辨出这种 突变体。 反向遗传学则是在获得生物体基因组全部序列的基础上，通过对靶基因进行 必要的加工和修饰，去探讨该基因的功能。它基于基因的测序工作，分离到基因 后，登陆g e n e b a n k 把目的基因与数据库中已知功能的基因进行同源比对。接 着将功能基因整合到质粒上转化植物，最后将野生型、转化子及特征相似的突变 体通过比较分析来推测基因的功能。总的来说，拟南芥的分子生物学研究路线如 下图所示 4 福建农林大学硕士学位论文 反 向 遗 传 学 植物基因缀 一， 舅出全揶基因序列 建立麓镥突变体库 ( 基凶组计捌) l 构建功能基因失话戚过t 表达转化质粒 转化正常( 野生) l i t # i 野生垂、转化子和兵有相 垤特亚的突变体进行比较 基因功眈的帮明 图1拟南芥分子生物学研究策略 f i g 1s t r a t e g yi na m b i d o p s i ss t u d y 2j 蛋白的研究与进展 正 向 遗 传 学 2 1 分子伴侣熟休克蛋白 热休克反应( h e a ts h o c kr e s p o n s e ，h s r ) 是一切有生命细胞遇短暂高温、缺氧、 亚砷酸盐及h 2 0 2 等应激原刺激时，所发生的一种以基因表达和调控变化为特征 的细胞应激反应。h s r 启动热休克基因表达，产生一组高度保守的热休克蛋白 ( h e a ts h o c kp r o t e i n s ，h s p s ) 。热休克蛋i 兰i ( h s p s ) 广泛存在所有原核和真核细胞内， 具有高度保守性的蛋白家族。许多环境胁迫( 如病毒感染，热，n a c ，a b a 等) 都能引起细胞合成热休克蛋白( h e a ts h o c kp r o t e i nh s p ) ，它能保护细胞免受有害 环境损伤。 热休克蛋白属于分子伴侣的一大类，作为特殊的蛋白质，分子伴侣其主要功 能是：协助新生肽链的折叠；协助新生肽链转运至其发挥功能的细胞内场所； 析 析 酣惭 分 分 嫩盼 盼 千医 鲫激 鸵 分羹 哪眦 功 和夔 勘咧 - 一。 t 一一 一，一一 攀 絮 i ；| ，。 福建农林大学硕士学位论文 协助变性蛋白的再折叠；防止多肽链表面疏水基团的不正常聚集；引导严 重受损的蛋白质进入蛋白水解系统。它们还参与染色体的复制、抗原的加工与提 呈，并作用于一些信息转导分子以调节生长和发育【4 。5 6 】。分子伴侣蛋白按分子量 大小可分为h s p 2 5 ，4 0 ，6 0 ，7 0 ，9 0 ，1 0 0 等。在原核与真核生物之间有相互对 应的分子伴侣蛋白，如细菌的d n a k 相当于真核生物的h s p7 0 ，g r o e l 相当于 h s p6 0 ，d n a j 相当于h s p4 0 等。 2 2j 蛋白的结构与功能 d n a 1 蛋白主要由4 个功能域组成：一个由7 0 个氨基酸残基组成的n 一端保 守的j 功能域( jd o m a i n ) 、一个约3 0 个氨基酸残基组成的富含甘氨酸( 9 1 y c i n e p h e n y l a l a n i n er i c h ) 区域( g pd o m a i n ) 、一个含有4 个c x x c x g x g 基序( m o t i f ) 重复的中央富含c y s 区域( c y s t e i n e - r i c hr e g i o n ，c r rd o m a i n ) 和一个由1 2 0 1 7 0 氨基酸残基组成的c 端低同源区域i _ 7 1 。基于序列的组成结构不同可将d n a j 分为 i 、i i 和3 种类型【8 1 ，( 1 ) m 时含有j 、g p 和c r r 等3 个保守区域( 2 ) 含有 j 和g p 两个保守区域，而缺少c r r 区( 3 ) 仅含有保守的j 功能域：尽管d n a j 蛋自家族成员的结构不同，但均含有一个j 功能域。j 功能域能调节h s p 7 0 的 a t p a s e 活性，不保守的c 端区域能调节与多肽的关系。 d n a j 蛋白是h s p 7 0 的辅助伴侣蛋白( c o c h a p e r o n e ) ，h s p 7 0 参与细胞内新生 蛋白的折叠、装配和跨膜运输等过程，并能在逆境条件下防止未折叠的蛋白变性 和介导逆境消退后聚集蛋白的溶解复性。 d n a k 帮助蛋白的折叠或运输过程中，d n a j 首先作为分子伴侣与蛋白底物结合 形成d n a j 一底物复合物，并暴露出h s p 7 0 结台位点，然后d n a j 通过j 功能域与 h s p 7 0 相互作用促进其结合a t p 水解，使蛋白底物与h s p 7 0 a t p 的c 端区域结 台，形成稳定的d n a j 底物h s p 7 0 a t p 三元复合物；最后，g r p e 与d n a k 作用 促进核苷酸分子的交换和底物的释放，加速h s p 7 0 的再生和循环周期0 1 。 g r p e 能增强】或降低d n a k 与靶蛋白的亲和力；d n a j 也能结合新生肽链以 保持其松散构象【1 2 】；h s p 4 0 家族的成员可以作为h s p 7 0 家族成员的耦合因子 ( c o u p l i n gf a c t o r s ) 来促使a t p 水解，以调节其活性，如含有病毒的分子伴侣j 结 构域( jd o m a i n ) 的融合蛋白系统中，j 结构域可以稳定的结合在组成性表达 h s p 7 3 蛋白上，并能够引发细胞内源性的抗原h s p 7 3 复合物的积累【l6 1 。体外蛋 6 福建农林大学硕士学位论文 白互作实验中，h s p l 0 4 协助h s p 4 0 和h s p 7 0 发挥功能。h s p l 0 4 执行解离蛋白 聚集体第一步，然后h s p 4 0 和h s p 7 0 识别变性底物，完成重折叠的过程3 1 。细 菌h s p 4 0 和h s p 7 0 同源物也有同样的能力【1 4 】；d n a j 也可能单独行使分子伴侣的 功能，从酵母到老鼠乃至人类，越来越多的d n a j 蛋白陆续被鉴定出来【l5 i 。d n a j 蛋白基因的表达有组织特异性，并受生物发育阶段的调节，同时也能应答热、盐 和氧化胁迫 i o a 7 】表明d n a j 蛋白与植物的抗逆性有关。 2 3 拟南芥中j 蛋白的研究 拟南芥基因组序列分析表明，拟南芥中已有大约9 4 个j 蛋白基因，是一个 多基因家族i l8 1 。但是并非所有的j 蛋白成员都受热激调控。大多数j 蛋白定位于 细胞器中( 如细胞核、叶绿体、线粒体、细胞质) ，其中在细胞质和细胞核中各 有2 5 种j 蛋白分布【1 8 1 。目前，这些d n a j 蛋白目前的研究多数还集中在基因的 克隆、鉴定和表达的组织特异性阶段，但也有一些关于功能研究的报道。 周人纲实验室先后从拟南芥中克隆了j 蛋白基因a t j l ( a t o j b l ) 、a t j 2 ( a t d j a 2 ) 和a t j 3 ( a t d j a 3 ) 并进行了关于分子伴侣功能的研究。其结果发现，a t j l ( a t d j b l ) 是定位在线粒体中的一个j 蛋白，n 端有线粒体定位序列，其氨基酸序列中包含 j 结构域和锌指结构域，但没有g f 结构域。重组a t j lz 日- , 匕e , 刺激大肠杆菌d n a k 和玉米胚乳细胞质h s c 7 0 的a t p 酶活性【19 1 。a t j 2 ( a t d j a 2 ) 与a t j 3 ( a t d j a 3 ) 均为a 类j 蛋白，且都位于拟南芥的细胞质中，a t j 2 的重组蛋白能刺激玉米h s p 7 0 的a t p 酶活性提高l o 倍，3 7 热激、2 冷胁迫以及水分胁迫都能引起a t j 2 和 a t j 3 基因的表达变化，但在表达程度上有所不同。这表明了a t j 2 和a t j 3 基因可 能广泛参与了多种环境胁迫的响应【2 0 】。s e k im 等的基因芯片研究发现水分及冷 胁迫都可以特异诱导拟南芥j 蛋白a t d j b l 9 基因的表达【2 。柴团耀等分离到了一 受环境诱导的j 蛋白基因，重金属( h g ，c d ，a s ，z n 和c u ) 能强烈地诱导该 基因在叶片的表达，推测该蛋白质在保护细胞膜和酶蛋白的结构和功能及提高植 物的抗逆性方面起作用【2 2 】。a r g l ( a t o j b l 5 ) 其基因的突变能改变根的向地性， 因而参与重力信号传导过程【2 3 1 。拟南芥a r c 6 蛋白是一个j 蛋白，也是一个质体 分裂蛋白，根据a r c 6 突变体和a r c 6 过表达植株f t s z 微丝形态学的表型，可推 测a r c 6 对质体分裂蛋白( f t s z ) 环的组装和稳定起作用【2 4 1 。k u s h n i r 等【l o 】在筛 选拟南芥c d n a 文库时获得一个j 蛋白( a t d j b l 3 ) 的编码基因，该基因在酵母中的 福建农林大学硕士学位论文 过表达可使酵母对巯基氧化剂二酰胺产生耐受性。基因芯片分析发现a t d j b l 9 的 基因是受水分和冷胁迫诱导的基因。 z h a o 等【2 5 1 通过r n a 和免疫印迹分析发现拟南芥的d n a j 基因研f ? 9 2 2 3 6 d ) 在叶 片中大量表达，而在根部表达量低。同时发现在1 2 0 r a mn a c l 胁迫下，拟南芥d n a j 转基因植株比野生型拟南芥更耐盐，说明d n a j 在盐胁迫下起重要的作用。 关于j 蛋白作为同伴蛋白与h s p 7 0 组成分子伴侣发挥作用的研究正在逐步深 入，大量的研究报道表明j 蛋白参与细胞信号转导过程。j 蛋白在植物的生长发育 以及植物的抗逆反应中可能具有重要功能，但是关于这方面的研究报道还不是很 多。借助更多相关突变体的研究将有助于我们探讨j 蛋白在植物的生长发育过程 福建农林大学硕士学位论文 或结构测定结果的重要媒介1 2 6 1 。 3 2 蛋白互作生物信息学的计算方法概述 基于基因序列比对的方法 该方法的基础足同源蛋白理论。即在同一直系同源族中，某一基因或蛋白质 的功能已知，那么其他基因或蛋白质的功能可根据已知的基因或蛋白质的功能进 行预测。直系同源是生物信息学中对新发现的基因进行功能注释的重要手段。通 常使用序列比对软件b l a s t 2 7 】来衡量蛋白质序列之间的相似度。通过这样的方 法，可使许多未知序列被赋予一定的功能提示。其中比较常见的方法有：基因邻 居法【2 引、系统发育谱系法等。该方法主要从生物的角度来考虑蛋白与蛋白的 相互作用的预测，没有或者是没有充分地利用已有的蛋白与蛋白相互作用数据， 舍弃了很多有用的信息，因此应用范围也因此受到限制。 从已知数据归纳相互作用规律的方法 随着质谱技术、酵母双杂交技术、蛋白质芯片技术产生了大量的两两相互作 用数据，同时蛋白质发生相互作用只须局部模块就能实现，从二级结构来看，蛋 白质有折叠，螺旋等结构；从功能部件来看，大部分相互作用的蛋白质都含有各 自不同的d o m i a n ；从功能层次上看，可以有d o m a i n ，蛋白质，蛋白质家族，超 家族，复合体结构等。人们将积累的大量蛋白质相互作用的结构数据从不同层面 进行分类及归纳其相互作用的规律，在此基础上就可以预测新的蛋白质相互作 用，甚至推导出其可能的网络拓扑结构3 0 】 基于数据挖掘的方法 搜索生物信息关键词澍3 13 2 3 3 3 4 1 。生物方面的文献量十分庞大，数据库并不 能及时准确地记录所有结果到，难免有诸多遗漏，因此通过数据挖掘的方法处理 这些文本数据足非常必要的。该算法在原文献中对代表蛋白质的词汇的出现情况 利用统计学方法进行统计，如果有显著相关性存在，则可以认为对应的蛋白与蛋 白之间具有某种联系。蛋白质的代表词汇是利用索引表的方法建立的。j e s s e n 等 人【3 4 】对m e d l i n e 中的记录进行了基因与基因相互作用的研究，结果表明，通过这 种方法发现了没有在已有数据库中报道的基因与基因相互作用，而且经过人工随 机抽样调查，验证其中大部分结果都是正确的。 基于蛋白质表达的方法 9 福建农林大学硕士学位论文 只有蛋白质具有时间和空间的同一性，才能保证蛋白质之间能发生相互作 用，而且互作蛋白质的量要达到一定的量。因此，考察蛋白的亚细胞定位、表达 量、表达时相间的关系也可以预测蛋白质相互作用。一般有两种做法：第一，实 验获得蛋白质的亚细胞定位、表达水平的数据，分析2 个蛋白质的亚细胞定位是 否相同，表达水平是否存在明显的相关性，由此推断它们之间是否存在相互作用； 第二，预测2 个蛋白的亚细胞定位、表达，然后再预测相互作用。 决定蛋白质相互作用的因素多种多样，同样蛋白互作生物信息学的计算方法 也是多种多样。系统地多层面地使用生物信息学分析可以很大程度上弥补了原有 数据的缺陷。尽管如此，生物信息学仍存在不足之处，应用范围有限，仍然需要 进一步的研究加以完善。 4 基于酵母双杂交系统( y e a s tt w o h y b r i ds y s t e m ) 的蛋白互作研究 4 1 酵母双杂交系统的原理与应用 生命的运作离不开蛋白质问的相互作用，从基因的复制、转录到蛋白质翻译、 修饰和定位及信息传导等均涉及到蛋白质复合体的作用。功能基因组时代的来 临，要求我们阐明基因组中未知基因所表达蛋白的生物学功能和从细胞水平上确 定细胞机制。双杂交系统作为一种新兴的、有效的遗传学方法则是采用体内实验， 不易受外界环境的影响，而且所有操作均在核酸水平上进行，不需要蛋白质的大 量纯化就可以检测到蛋白问微弱的相互作用。 真核细胞转录启动因子的结构特点是酵母双杂交系统的理论基础。如酵母的 g a l a 蛋白包括两个彼此分离但功能上必需的结构域【3 6 】：一个是d n a 结合域 ( d n a - b i n d i n gd o m a i n ，b d ) ，位于n 端l - l7 4 位氨基酸；另一个是转录激活域 ( t r a n s c r i p t i o na c t i v a t i o nd o m a i n ，a d ) 位于c 端7 6 8 8 8 1 位氨基酸残基区段 d n a b d 能够识别g a l 4 效应基因的上游激活序列( u p s t r e a ma c t i v a t i n g s e q u e n c e ，u a s ) ，并与之结合。而a d 则通过与转录机器( t r a n s c r i p t i o nm a c h i n e r y l 中的其他成分之间的作用，启动u a s 下游的基因进行转录。当这两个区域单独 存在时均没有转录激活功能，但当它们在空间上彼此联系时，则能够激活报道基 因的转录。是将2 个目的蛋白分别与a d 和b d 融合产生新的融合蛋白，如果这 2 个目的蛋白能够互相作用，则该相互作用会促使a d 和b d 互相靠近而产生有 活性的转录因子，进而激活事先构建到酵母基因组中的报告基因的转录。 1 0 福建农林大学硕士学位论文 目前酵母双杂交系统根据b d 来源主要分为g a l 4 系统和l e x a 系统，真核 细胞中的是g a l 4 系统；原核细胞中的是l e x a 系统。后者因其b d 来源于原核 生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。 氏d n a 哺帅出嗍l u l f i a n 璺巳圆盈硝 ( u a s ) n & a c 哺偿t l o n 由m b hf u s i o n d r a m o t t ( u a s ) n c a 踟妇蹦站心蜘l , a c l o r 图2 酵母双杂交原理示意图 f i g 2t h ep r i n c i p l eo fy e a s tt w o h y b i r d a ：d n a 结合结构域与x 蛋白组成融合蛋白，d n a 结合结构域能与上游激活序列( u p s t r e a ma c t i v a t i n g s e q u e n c e ，u a s ) 结合，但缺少激活结构域，所以不能激活报告基因的转录； b ：激活结构域与y 蛋白组成融合蛋白，但缺少d n a 结合域时也不能激活报告基因的转录； c ：x 蛋白和y 蛋白之间的互作导致d n a 结合结构域与激活结构域的重组而形成有功能的转录因子，最终 激活报道基因的表达 酵母双杂交作为分析蛋白质之问相互作用的有效的研究体系，已被广泛应用 于分子生物学的各个领域中。主要应用在以下几个方面： 对其他方法发现的蛋白质之间可能存在的相互作用加以验证；在确定两蛋白 存在相互作用后，再对所研究的蛋白做一系列缺失突变处理，通过缺失掉不 同片段以精确的定位蛋白中起关键作用的功能域。 筛选文库以得到与已知蛋白质存在特异相互作用的候选蛋白质。发现蛋白质 的新功能。从c d n a 文库中寻找与己知蛋白相互作用的未知蛋白就是双杂交 系统最为重要的用途。 在蛋白质组学研究中的应用，还可利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图谱 ( g e n o m ep r o t e i nl i n k a g em a p ) 。该系统在蛋白质组研究上的应用才刚起步， 尝试较多。但具有很大的分析鉴定细胞内复杂的蛋白质相互作用方面的潜力。 研究细胞信号转导，酵母双杂交系统在信号转导研究中能较全面真实地反映 细胞内信号蛋白的网络性联系与调节，故有重要的应用价值。选择不同的细 胞代谢或信号转导途径为出发点，通过类似的双杂交实验也有可能建立酵母 福建农林大学硕士学位论文 细胞完整的蛋白质联系图谱【3 7 】。 4 2 酵母双杂交系统的局限和进展 尽管酵母双杂交系统是研究蛋白间互作的有力工具，但在实际应用方面仍存 在一些局限【3 8 3 94 0 4 1 】： 首先，可能存在互作的蛋白质必须定位于核内才能激活报告基因的表达。但 是有些蛋白不能被转运到细胞核内( 如细胞浆蛋白、细胞膜蛋白) 。使用该系统 受到限制。此外，由于酵母的翻译后加工系统与其它物种相比不尽相同，某些物 种细胞的蛋白需经过翻译后加工才能互作，对这类蛋白质该系统也不适用。其次 是“假阳性”和“假阴性”。 可以引起“假阳性”的原因很多： ( 1 ) 某些靶蛋白或诱饵蛋白本身具有激活转录功能，激活报道基因的表达。 ( 2 ) 某些蛋白的表面结合其它蛋白的低亲和力区也可能产生“假阳性 。 ( 3 ) 不在细胞同一时空表达的蛋白质，相互之间也可能发生作用，但这种互 作是不具生理意义上的互作。 ( 4 ) 甚至有一些假阳性结果产生的途径尚不能解释m 2 朋】。 造成“假阴性”的原因主要是：融合蛋白的表达对细胞有毒性，导致细胞死 亡或者蛋白间的互作较弱等等。 随着酵母双杂交系统的广泛应用，近些年来又发展出了一些先进技术。对该 系统做了重要的补充和发展。v i d a l 等【删在1 9 9 6 年建立了反向酵母双杂交系统， 掺入一种报告基因，它的表达产物对细胞生长有毒。可用于监测蛋白间的相互作 用，提供了简便的鉴定阻断蛋白间相互作用的方法；s e n g u p t a 等【4 5 1 在1 9 9 6 年为 了研究蛋白质与r n a 的相互作用设计了三杂交系统；a r o n h e i m 等【删在1 9 9 7 年 建立的s o s 富集系统克服了双杂交系统仅能研究核内蛋白的缺点；k a r i m o v a 等 【4 7 】在1 9 9 8 年设计了细菌双杂交系统。酵母双杂交及其衍生系统已经成功地运用 于蛋白质之间，蛋白质与d n a 、r n a 、配体之间相互作用的研究，为深入研究 与蛋白质分子相关的分子间互作提供了一条行之有效的途径。 蛋白质间相互作用是当前生命科学研究的一个热点。在所有生命活动中，蛋 白质之间的相互作用是细胞进行代谢活动的基础。酵母双杂交系统是建立在细胞 内从基因水平研究蛋白质间相互作用的遗传学方法。近年来，酵母双杂交技术被 1 2 福建农林大学硕士学位论文 广泛应用于筛选蛋白质之间的相瓦作用，以及通过构建蛋白质相互作用网络，来 阐明生命的运行规律，是系统生物学的重要工具。 我们的前期研究【3 5 1 是以拟南芥为研究材料，在获得一a l p lt - d n a 激活标 签突变体叫勿j 的基础上，发现a l p l 基因似u x l i nl i k ep r o t e 矾a t l 9 3 0 2 8 0 ) 具有 抗核盘菌的功能，同时该基因的过表达突变体对盐、a b a 和j a 敏感。经生物 信息学分析