（生物化学与分子生物学专业论文）拟除虫菊酯降解基因的克隆.pdf

摘要 不动杆菌( a c i n e t o b a c t e r 印) j x c c 2 d 菌株是由本实验室筛选所得，对菊酯类等化学农药具 广谱、高效的降解作用。本研究以该菌株为原始材料，以p g e m - 3 z 为载体、e c o l f l m l l 0 为受体 菌，通过同尾内切酶肘。6 i 和b a m h i 酶切，成功构建了 x c c 2 d 菌株的基因组质粒文库。文库的库 容约为l o 、插入片段长度约为2 t k b 。 利用农药- b u r k 培养基和酯酶筛选培养基对所构建的基硐组质粒文库进行筛选，选取在农药平 板中生长、在酯酶筛选平板上形成透明圈的重组菌株。对筛选得到的重组菌株2 4 - 3 8 进行了酯酶 比活力测定和农药降解能力检测，实验结果表明：该重组菌株具酯酶活性，其比活力为0 5 3 5 ， 并为胞外分泌型酶。该重组菌株作用高效氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯、溴氰菊酯1 0 8h 后，降解率 分别为6 6 o 、5 0 5 、9 5 7 ；作用丙溴磷和哒螨灵7 2 h 后，降解率分别为3 2 5 和2 5 9 。 对2 一铲3 8 重组菌株中插入的大小约为3 2i d a 的外源片段进行亚克隆，并对亚克隆片段进行核 苷酸序列测定、拼接，得到长为1 8 5 4 b p ，具完整阅读框架，编码6 1 7 个氨基酸的基因序列。该序 列与假单胞菌m i s 3 8 ( p s e u d o m o n a s s p ) 的l i p a s e j 翼有9 4 的相似性。以原始菌彰i o x c c 2 d 为模板， 根据文库实验中获得的l i p a s e 基因序列设计引物，经p c r 可扩增出完整的h p a 基因序列，整个实 验结果表明本研究已获得来源于不动杆菌( a c i n e t o b a c t e r s p ) j x c c 2 d 、具有农药降解活性的脂 肪酶基因，该基因序列已在c , e n a a n k 注册( 注册号为d q 9 0 6 1 4 3 ) 。 现有文献表明脂肪酶基因功能中未见有降解农药的报道，本实验首次克隆到了具有广谱农药 降解活性的脂肪酶基因。 关键词不动杆菌x c c 2 d ，拟除虫菊酯，基因组文库，重组菌株，脂肪酶，降解 a b s t r a c t t h ea c i n e t o b a c t e rs p j x c c 2 dc a l ld e g r a d es y n t h 荫cp y r e t h r o i dp e s t i c i d ea n do t h e rp e s t i c i d e s e f f i c i e n t l ya n db r o a d l y t h eg a n o m i cl i b r a r yo ft h eb a c t e r i aw a sc o n s t r u c t e ds u c c e s s f u l l y , w i t ht h ee c o l i j m l1 0 t h er e c e p t o rs t r a i n a n dp g e m 一3 z 勰t h ev p t o l b o t hs t l 2 t ma n dt h a tc o n t a i n i n gt h ev e c t o r c o u l dh a r d l yd e g r a d et h ep e s t i c i d e sw h i c hw t e s t e di nt h i sp a p e r p a r t l yd i g e s t e dt h ea c i n e t o b a c t e r s p j x c c 2 dg e n o m i cd n a ，w i t hm o b i ，i n t ot h ef r a 舢t sb e t w e e n3 k ba n d7 k b c o m p l e t e l yd i g e s t e d t h ep g e m - 3 z , a n dp u r i f 似lt h el i n e a ra st h ev e c t o r t h et w or e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s e s i s o c a n d a m e r , a n dh a v et h es a 鹏c o h e r e n tt e r m i n a l w eg o tt h eg e n o m i cl i b r a r yw i t ht h ei n s e r tf r a g m e n t sa m o n g2 - 7 k b a n dt h ec a p a c i t yw a s1 0 4 t h ew h i t es i n g l ec o l o n yw a si n c u b a t e do nt h eb u r ks o l i dm e d i u mc o n t a i n i n gt h ep e s t i c i d e s ，a n dt h e e s t c r a s es c r e e n i n gs o l i dm e d i u m , a t3 7 t h ec o l o n yw h i c hc o n t a i n st h et a r g e tg e n ec a ng r o wi nb o t h p l a t e s 。a n di tc a nm a k et h et r a n s p a r e n tz o n e o n ec o l o n yc o n t a i n i n gt h ed e g r a d i n gg e n ew a si s o l a t e d , n l m l d2 4 3 8 w h o s ee x e e l l a re s t e r a r e l a t i v ea c t i v i t yw a s0 5 3 5 t h e2 - 4 3 8w a si n c u b a t e dw i t ht h e 0 2 9 lp e s t i c i d e sf o r1 0 8h i t sd e g r a d a t i o nr a t i ot ob - c y p e r m e t h f i n ，c y n u 吐l r i na n dd e l t a w t t h r i nw o r e 6 6 o ，5 0 5 a n d9 5 7 。r e s p e c t l y i t sd e g r a d a t i o nr a d i ot op r o f e n o f o sa n dp y r i d a b e nw e r e3 2 5 a n d 2 5 9 r e s p e c t l y , w h e nc u l t u r e df o r7 2 h t h ep 2 4 3 8c o n t a i n sa3 2 k b i n s e r tf r a g m e n t s e q u e n c e da n da n a l y s i s e dt h i sf r a g m e n t i tw a s c o n c l u d e dt h a tt h e r ew a sao r f c o m p o s e db y6 1 7a m i n oa c i d s a n di th a d9 4 i d e n t i t yw i t ht h el i p a s e o f m i s 3 8 ( p s e u d o m o n a ss p ) i t w a s i n f e r r e d t h a t t h ed e g r a d a t i o ng e n e w a sa m e m b e r o f l i p a s e t h e s e q u e n c ew a ss u b m i t m dt ot h eg e n e b a n k ，a n dt h e a c c e s s i o nn u m b e rw a sd q 9 0 m 4 3 t h e r ei sn om p o r tt l l a tt h eh p a c a nd e g r e et h ep e s t i c i d e s s ot h i sp a p e rc l o n e dt h el i p a s cg m w h i c hh a st h ea c t i v i t yo fp e s t i c i d e s - d e g r a d a t i n ga tt h ef i r s tt i m e k e yw o r d s ：a c i n e t o b a c t e r s p j x c c 2 d ，s y n t h e t i cp y r e t h r o i dp e s t i c i d e ，g c n o m i cl i b r a r y ， r e c o m b i n e d c o l o n y 2 4 3 8 ( e c o l ij l v l l l 0 ) ，h p a 辩，d e g r a d a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示了谢意。 魏弓 时间：沙7 年月咖 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科 学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不 同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名：虿掾埒 黜轹歹- 奇 v u 帆如7 年6 月咖 帆刁年多月矽 中国农q e 科学院硕+ 学位论文第一章绪论 1 。1 拟除虫菊酯类农药 第一章绪论 1 1 1 拟除虫菊酯类杀虫剂的发展 拟除虫菊酯类杀虫剂( s y n t h e t i cp y r e t h r o i dp e s t i c i d e ) 是仿效天然除虫菊化学结构的合成农药。 由于其杀虫谱广、药效高，对哺乳类动物毒性一般较低，且在自然环境条件下降解速率较其它农 药快，深受农户的欢迎( 庞国芳等，1 9 9 8 ) 。随着现代农业的发展，农药已经成为现代农业不可或 缺的生产资料之一，在农业增产、增收方面起着重要作用。随着有机氯、有机磷等毒性高、降解 慢的农药的禁用，使得拟除虫菊酯类农药成为现今我国施用面积渐为广泛的农药之一。2 0 0 5 年拟 除虫菊酯类农药的销量上涨2 4 矾( 张晓，2 0 0 5 ) 。 1 4 - 1 5 世纪人们发现天然除虫菊是十分理想的杀虫剂，最早种植于秘鲁和南斯拉夫。1 8 2 8 年英 国j i m t i k o f f 通过将除虫菊花加工成杀虫粉出售，用于防治卫生害虫，这是早期农药发展史上的重 要事件( 粱卫驱，2 0 0 5 ) 。2 0 世纪2 眸代，鉴定出天然除虫菊杀虫剂的有效成分为除虫菊酯i 和。 6 睥代，人们了解到除虫菊酯结构上的两个光不稳定中心，分别位于醇部分和菊酸乙烯侧链的偕 二甲基部分。1 9 7 3 年英国洛桑研究站的m e l l i o t t 成功合成了以苯氧基苄醇取代除虫菊酯的醇部分和 以氯取代偕二甲基光稳定提高了1 0 - 1 0 0 倍的拟除虫菊酯一二氯苯醚菊酯亦称为氯菊酯，这是菊酯 类农药应用于农业的一个里程碑。1 9 7 6 年日本研究人员o h n o n ，f u i i m o t o k 等人发现在醇部分添加 氰基( - c n ) 可以提高菊酯类农药的毒效( 肖红利，2 0 0 4 ) 。据此人们开发了很多光稳定、毒效高 的拟除虫菊酯类农药，如溴氰菊酯、氯氰菊酯、氟氯氰菊酯、氰戊菊酯等。这样使得菊酯类杀虫 剂在卫生和农用方面迅速扩大了施用面积。 传统的羧酸酯类拟除虫菊酯虽然具有高效、广谱、击倒快的特性，但也存在高鱼毒和靶标害 虫抗性日趋严重的缺陷。羧酸酯是拟除虫菊酯具有杀虫话性至关重要的结构部分，随着研究的逐 渐突破，合成了大量的以肟醚、醚，酮、烯烃等取代酯键的化合物，发现许多活性优异。鱼毒低 或具有杀螨活性的化合物，并且这些化合物仍具有拟除虫菊醑农药的活性特点，从而使拟除虫菊 酯的化学结构从羧酸酯型扩大至非羧酸酯型化合物，如醚菊酯、乙氟菊酯等。不但降低了生产成 本，而且还扩大在水田和水产养殖业的使用。 科研人员利用不断完善的结构和活性关系，逐步对其分子结构中醇部分、酸部分和酯部分进 行改造修饰设计各种含酯类或非酯类新化合物。现在研究人员正在不断研究究如何得到单一的光 学异构体，例如同相合成技术的应用以及与之相连的单一分离技术的研究( k u m a re ta l ，2 0 0 2 ) ： 采用生物酶技术合成菊酯醇部分的单一光学异构体( h s h m a n ，1 9 9 8 ) ；利用光化学的重排技术 合成菊酯类产品的酸部分( d i e g oe ta 1 ，1 9 9 5 ) ；手性催化荆的研究和利用( y o s h i n o r ie ta 1 ， 2 0 0 1 ) 等。利用经典方法研究开发拟除虫菊酯的同时，利用生物技术生产天然除虫菊酯的设想也 在进行，例如：用试管培养除虫菊植株组织来生产除虫菊素；美国尤他州a g r i d y n et e c h n o l o g i e si a c 用基因工程将除虫菊素在植物中的初级合成物( p t o c u $ o l m ) 转移到微生物上，按除虫菊素生物合成 步骤，在生物反应器( b i o r c a c t o r ) 中人工控制生产。目前，虽然这两种技术生产成本仍高于人工种 中国农业科学院硕十学位论文第一章绪论 植而被停止，但是开创了研究菊酯的新思路( j o v e , t i c ，1 9 9 4 ) 。除此以外，科研人员还在研究各 种分离技术，以方便、简单的获得高活性的单一光学异构体，并从分子水平和遗传学的角度研究 拟除虫菊酯类产品抗性机制。目前已有拟除虫菊酯类农药工业产品5 0 多种，但是遗憾的是在提高 菊酯稳定性和毒效的同时，该类农药的对人畜的安全性也随之降低，今后该类农药的研究应该向 提高人类，环境安全性的方向发展。 经过对天然除虫菊酯结构的不断修饰和改造，目前拟除虫菊酯类人工合成的农药因其对环境 相对友好，已经在农作物和室内卫生害虫的防治和控制过程中发挥了重要作用，但是在该类农药 的活性与抗性之间总是难以权衡，大部分产品都是高鱼毒性和低杀螨性，所以拟除虫菊酯类农药 的研究将集中于开发新犁的、具有特殊活性的化合物，提高对害虫和螨类的活性，降低害虫抗性 和对鱼类的毒性，目前有研究表明，通过引入吡啶环等各种杂环，可以提高菊酯类农药的杀螨活 性( 马军安等，2 0 0 3 ；n i s h i d a ，2 0 0 2 ；张田林等，2 0 0 3 ) ；在活性分子中引入氟原子，可以在提高 生物活性的同时，降低生物体的抗药性( z u ox 盈，2 0 0 2 ；v j i h a r a ，2 0 0 4 ；邹新琢，2 0 0 3 ) ；菊 酯的烃类和醚类类似物对鱼类低毒( 胡志强，2 0 0 2 ) ，并且硅原子的引入在某种程度上会改变化合 物的作用特性，此类研究都在进行中，加快对低毒性，环境效应好的菊酯类产品开发，将会对我 国农业的可持续发展起促进作用。 1 1 2 菊酯类农药的致毒机理 菊酯类农药同时具有驱避、击倒和毒杀三种不同作用，一般认为驱避作用是菊酯作用于感觉 器官上引起的反应，它在极低浓度时，即有效，因此不会影响到神经系统的其他部分，与击倒及 毒杀机制完全无关。有关击倒和毒杀的作用机制和作用部位存在着争论，一种说法认为击倒致影 响周围神经，而毒杀是破坏了中央神经系统。此说法的根据是，用菊酯处理昆虫时，击倒发生的 时间大约正好是药剂渗入表皮的时问，而毒杀发生的时间则较晚，因此击倒致可能到达周围神经 系统，而毒杀发生时才可能到达中央神经系统。而相反的实验证明，不论用滴加法或者注射法处 理，同样产生击倒，后来同样产生毒杀效应，因此认为击倒与毒杀都是对中央神经系统的影响， 致使中毒程度不同，即击倒时毒杀的初步征象，击倒后不继续中毒即会恢复。 目前菊酯类农药的 毒理机制还没有完全阐明，各类说法还存在许多不明确和有争论的地方( 杨小平，1 9 9 9 ) 拟除虫菊酯在哺乳动物体内吸收、分布、代谢转化均非常快，用杀灭菊酯给鼠类经口染毒( 8 r a g k g ) ，1 4 , 时后血浓度即达高峰，2 4 4 , 时降至4 以下，4 8 b 时难以测出。吸收后在体内经酯酶和 混合功能氧化酶的作用，被水解、氧化和结合，降解代谢主要在肝内进行。含氰基者氰基的排出 比较缓慢，最终以硫氰酸盐排出。致毒机制至今尚未完全阐明，目前的研究认为它影响细胞膜的 功能，干扰钠离子通道，导致钠通道的闸门关闭延迟，形成除极后电位及重复除极，持续地重复 发放神经冲动，将使膜内钠离子梯度衰减，最终引起神经传导阻滞。此外，拟除虫菊酯作为神经 毒物，它尚可抑制神经细胞膜的嘲基丁酸受体。使该介质失去对脑的抑制功能。国内曾报道3 例溴氰菊酯中毒者，脑脊液中卜一氨基丁酸含量明显高于正常水平。动物试验中，尚发现中毒动物 细胞第二信使之一的兴奋性递质环鸟昔酸( c g m p ) 升高。这些研究。对以中枢兴奋抽搐，其后转 入中枢抑制的全身中毒症状，提供了比较合理解释的基础。该类杀虫剂对皮肤、黏膜污染的局部 也有刺激作用除接触性损害外，尚可引起局部迟发过敏反应( 何风生，1 9 8 3 ) 。 2 1 1 3 我国菊酯类农药现状 我国在2 0 世纪早期开始在安徽、上海、浙江等南方地区种植除虫菊，3 0 4 0 9 代赵善欢等开 始对天然除虫菊的组分进行研究，1 9 5 6 年北京农业大学黄瑞纶在杀虫药剂学专著中详细介绍 了除虫菊化学有效成分等。1 9 7 2 t g 在程暄生的指导下，江苏省农药研究所首先在国内开展了拟除 虫菊酯的合成研究。随后很多强有力的科研单位和高校纷纷与专业生产厂结合，迅速将科研成果 转化为生产力，同时也涌现了许多技术雄厚的专业生产厂由于部分地区对害虫和害虫抗性的综 合治理的不合理性，导致害虫对拟除虫菊酯类农药的抗药性迅速发展，严重影响了拟除虫菊酯类 产品的使用寿命，而且导致农民盲目加大施用剂量，增加了环境自身净化污染物的负担，些科 研单位对害虫的抗药性机制进行了大晕研究，研制了各种菊酯类农药与其它农药如有机磷、氨基 甲酯类农药的混配制剂，如乐果一氯氰菊酯乳油、辛硫磷一氰戊菊酯乳油等，同时菊酯类农药的增 效剂如增效醚、八氯二丙醚等。得到了广泛应用。目前我国形成一支相当强大的研究队伍，在系 统研究开发拟除虫菊酯类杀虫剂和各种混配农药剂型，以及各种菊酯农药增效剂和助剂等领域都 有所成就( 王朝晖等，1 9 9 7 ) ，现在已经成为研究和生产菊酯类农药的大国之一( 胡志强，2 0 0 4 ) 。 1 2 农药残留及危害 1 2 1 现状 农药作为目前农业增产的主要依靠，在农业中具有广泛的应用，是人类主动向自然界投放的毒 性化学物质( 王让会，1 9 9 8 ) 。通常，我们把残存在环境中和生物体内的微量农药称作残留农药， 它包括农药原体残留量及其具有比原体毒性更高或相当毒性的降解物的残留量( 张韩杰。2 0 0 4 ) 目前我国农药的施用方法仍以药液喷洒和粉剂喷洒为主。有研究表明( 李本量，1 9 9 5 ) ：施用农药 后，仅有1 2 的药作用于防治对象本体，有1 0 2 0 附着在作物本体上，其他8 0 9 0 的农药 主要散落在农作物的周边环境，如农田、土壤或漂浮于大气。大气中的农药残留主要来自于农药在 防治害虫、杂草等时的喷洒和农药生产过程中的烟尘；土壤中的农药残留则主要由于直接喷洒或 间接落入，利用污染水源灌溉也是导致土壤中农药残留的主要因素之一；水体中的农药残留除水 田或者水产养殖直接施用外，大气和土壤中的农残也会随雨水造成水质污染。随着菊酯类农药使 用的日益广泛，使用时间逐渐增长，以及农民对农药的不合理施用，同时由于靶标害虫抗药性， 使得在农药使用中，不断增加施用量。增加了环境自净负荷，目前在全世界范围内各种有机农药 残留现状非常严重。 拟除虫菊酯类农药在我国已有五十多年施用历史，随着国家对有机磷、有机氯等高毒性、难 降解农药的禁用，促使拟除虫菊酯类农药扩大生产和使用范围，现在拟除虫菊酯类农药占我国杀 虫剂总旅用面积的三分之一以上，主要是施用于棉花、果树、蔬菜以及对家庭害虫的防治。我国 目前的农药残留较为突出的是蔬菜中的农药残留，东北农业大学的李雪飞等人研究吉林省长春市 的2 0 0 3 2 0 0 4 年9 个蔬菜批发市场8 种蔬菜中的农药残留进行调查，结果显示，2 0 0 3 年，蔬菜中残 留的农药主要是有机磷农药，8 种蔬菜中，6 种检出了有机磷农药，3 种蔬菜检出了拟除虫菊酯类农 药；2 0 0 4 年，则主要是拟除虫菊酯类农药，8 种蔬菜中，6 种检出了有机磷农药残留，8 种蔬菜均检 3 中国农业科学院硕十学位论文第一章绪论 出了拟除虫菊酯类农药残留。这说明，农民施药已经从有机磷农药转向了拟除虫菊酯类农药( 李 雪飞，2 0 0 6 ) 。 拟除虫菊酯类农药残留将会引起一系列的严重后果，首先过最的残留农药会抑制庄稼生长， 破坏天然植被，影响整个生态系统；其次，菊酯类农药对某些非靶标生物高毒，如家蚕、蜜蜂、 赤眼蜂、鱼类、沼虾、鸡等，1 9 9 7 年，林小涛等人就发现，甲氰菊酯对罗氏沼虾表现为高毒；1 9 9 9 年，朱鲁生等发现，甲氰菊酯及其混合剂对鸡也表现为高毒；另外，2 0 0 2 年鲁兴萌等研究发现， 即使低浓度的拟除虫菊酯农药也会对一些经济昆虫造成极大的危害，如家蚕；2 0 0 1 年桐乡和海宁 发生的桑园中毒事件就是因拟除虫菊酯农药残留问题引起的，而且菊酯还具有在高等动物体内富 集的能力，潜在危害很突出( 肖红利，2 0 0 4 ) ；再次，害虫抗药性增加，并且会引起害虫转换，导 致防治成本升高；第四，据酯类农药与土壤中有机质结合，增大了土壤对各种重金属的吸附，间 接引起环境重金属，影响人类健康；最后，残留农药使得蜂产品、茶叶、纺织品、蔬果等产品遭 遇“绿色壁垒”，自从我国加入w l x 3 以来，欧洲不断降低从我国进口的蔬果、茶叶、肉类等产品的 拟除虫菊酯类农药的残留标准，严重影响了我国的出口贸易，阻碍了经济发展。1 9 9 9 年出口到德 国的茶叶中氰戊菊酯( f e n v a t e r a t e ) 农药残留超标4 倍甚至到1 0 0 倍，相当数量的茶叶不能出口，同 年中国茶叶所对2 0 0 0 十出口的茶叶样品进行了检测，结果发现：其中氰戊菊酯超标率为3 9 7 8 4 2 ，甲氰菊酯超标为2 2 4 6 6 ；2 0 0 0 年7 月1 日起执行的国际农残留标准，我国的茶叶等 农产品出口将面临更加严峻的形势；2 0 0 2 - 年，欧盟因农残监控体系的建立和运行问题，宣布停止 从我国进口蜂蜜；山东冻鸡、冻兔由于农药残留超标而失去了国际市场影响贸易经济。实际上。 由于农药的致癌、致畸、致突变的：三致”作用，残留农药对人和动物尤其是食物链的顶端人的危害 最大。2 0 0 4 - 年欧盟最新制定的有关拟除虫菊酯类茶叶中的最低检出限标准( m r l ，m g k g ) 中氯 氰菊酯的检出限由原来的0 5m g a g 下降n o 1m g k g ，其中苄呋菊酯、四溴菊酯和氟胺氰菊酯的最 低限低于目前检测限( 陈宗懋，2 0 0 4 ) 。r 1 e w i l l e m s e na h a i l e y 等研究了杀虫剂释放对海龟数 量的影响表明，海龟对于杀虫剂非常敏感；另据王毓秀等的研究，在目前认为可能干扰内分泌的 7 0 种化学物质中，农药占据了加多种。它们可降低生物的免疫能力并诱发肿瘤，损害神经系统等； 潘小琴等做的1 4 种常见农药对孕妇影响的调查表明，我们目前使用的多种农药对人类胚胎及胎儿 的发育具有一定的副作用，而多种农药的同时使用可能发生交互作用，对胎儿发育产生不良联合效 应( 潘小琴，1 9 9 1 ) 。英国的一项研究发现因使用羊用防腐浸液而长期接触有机磷农药会导致慢 性疲劳综合症。据估计，全世界每年有1 0 0 j 5 0 0 万的农民发生农药中毒事故。其中2 万例丧生( 农 药污染，2 0 0 7 ) 。 1 2 2 解决方法 对于环境中的农药残留的解决，可以采用禁用、物化方法和生物修复方法( a l e x a n d e r ，1 9 8 5 ) ， 物化方法工程大、费用高、副作用大，易引起二次污染、而且解决不彻底，生物修复方法具有高 效、安全、成本低、无二次污染、应用范围广等优势，主要有动植物修复、微生物修复、根际环 境的生物降解( 林冰，2 0 0 4 ) 。 传统的农药残留的处理方法是将果蔬采后用水洗或洗涤剂进行冲洗或浸泡，一般都是利用一 些农药的水溶性和热不稳定性的原理去除农药残留，或者对水果及果菜进行去皮处理。s m i t h 等报 4 中囝农业科学院硕上学位论丈第一章绪论 道自来水冲洗3 0 s 能去除莴苣上8 8 的马拉硫磷，吕金海等报道了浸泡时间延长，拉维因对乙酰 胆碱的抑制率明显降低常改等在实验室模拟果蔬农药污染，使用不同的洗涤方法：清水浸泡、 金鱼洗涤灵浸泡、沸水焯洗，考察了不同洗涤方式对甲胺磷、氧化乐果、1 6 0 5 这3 种农药的去除效 果，结果表明，沸水焯洗对小白菜和圆白菜上的甲胺磷的去除率分别达n 8 2 9 5 和6 2 0 5 ， 瓜果类蔬菜采用n1 5 的金鱼洗涤灵浸泡2 0 m i n ，对甲胺磷的去除率达到了5 0 以上，对韭菜中 的1 6 0 5 残留采用o 1 5 的金鱼洗涤灵浸泡2 0 m i n ，去除率达到了5 4 5 9 。化学处理方法主要有臭 氧处理和次氯酸钠处理，有研究表明：农药经臭氧处理后的产物主要是醛、酮、有机酸等小分子。 还有研究报道，臭氧氧化后的产物比底物更亲水，蔬菜经臭氧处理后，其表面残留的农药被分解 成易溶于水的有机小分子，水冲洗便可除去，而臭氧本身则分解成氧气，不会造成二次污染。k h a n 等人曾利用4 0 ，以o 1 m o l ln a o h 做以除去农药( k h a n 等，1 9 8 8 ) ：s u s a n 等用老鼠肝上皮细胞 评价了臭氧氧化马拉硫磷、d d t 、d e e t 后产物的毒性，研究结果表明没有毒性产物生成，次氯酸 盐加入水中能产生次氯酸，次氯酸在低p h 值时具有较强的氧化有机物的能力，因此可用于果蔬表 面农药残留处理。过氧乙酸、二氧化氯，双氧水也在果蔬农药残留处理中有所应用。o n g 等研究 比较了臭氧及次氯酸盐降解苹果表面残留的保棉磷、克菌丹、伐虫眯的效能，三占米显示臭氧作 用1 5 m i n 降解率分别达到7 5 、7 2 、4 6 ( 陆胜民等，2 0 0 4 ；吕金海，2 0 0 5 ) 。物理方法处理 果蔬农药残留是一般常用的方法，但水洗或洗涤剂洗涤的效果和应用范围终究有限。化学方法处 理果蔬农药残留的方法不失为一种较好的替代方法。但是现有的研究对农药臭氧处理后产物的毒 性的确定仅限于少数的几种农药有报道指出，而且次氯酸盐处理农药残留可能会生成一些粘在果 蔬表面的有毒或致癌的有机氯化合物。因此化学处理的使用受到一定的限制。 农药可以通过渗透、食物链等途径进入生物体内，生物体内的一系列酶促反应和代谢过程可 以将其转化为低毒或者无毒结构。土壤中一些大型土生动物( 如蚯蚓) 和水体中的某些低级水生 生物能吸收和富集环境中的残留农药，并通过自身代谢作用，把部分农药分解成低毒或无毒产物。 植物降解有机农药有二种机制：直接吸收并在植物组织中积累非植物毒性的代谢物，一旦农药 被吸收，植物可以通过木质化作用将其储藏于新的植物结构中，也可以通过代谢、矿化，挥发将 其无毒化；植物释放的酶可使有机农药降解得非常快，即使植物死后其释放的酶仍可继续发挥 分解作用，已经证实来自植物的五种酶( 脱卤酶、硝酸还原酶、过氧化物酶、漆酶和腈水解酶) 对 有机污染物的分解起着重要的酶促作用。微生物对有机农药的降解代谢有酶促和非酶促两种方式， 以酶促方式为主要形式，当农药污染物浓度较高时，微生物通过酶对农药分子的特殊毒性基团进 行代谢，使其失去毒性，并在代谢过程中将农药分子当作自身需要的碳源物质，从中获得生长所 需的能量。当农药浓度较低时，农药分子在广谱酶的作用下进行水解代谢或共代谢。非酶促反应 方式是生物降解的辅助方式，如通过产生辅助因子促进其他反应的进行，或者改变p h 值而促使反 应进行，或者是微生物的其他代谢产物作为农药分子降解的电子受体或电子供体。根际环境是一 个由土壤、植物、微生物、水分、空气、根系分泌物及体外酶等形成的距离植物根系数毫米到1 厘 米的特殊的生态系统，根际环境包含有土壤圈、水圈、大气圈和生物圈，在根际环境中这些圈层 之间互相进行物质和能量的交换，相互作用，相互促进，提高了农药的降解和代谢速率。在根际 环境中，植物和微生物生长、代谢、分泌各种酶，进行活跃的生命活动，土壤酶加上大量根际生 物的作用，使根际环境中的农药迅速分解，甚至一些单种酶难以降解的成分，在各种微生物和酶 的共同作用下也能快速降解。 5 中国农业科学院硕十学位论文第一章绪论 生物降解技术因其不易造成二次污染，保护了生态系统的完整性，具有得天独厚的优势，还具 有高效，安全、成本低、应用范围广等优点，能够做到污染前预防、污染后防治。国内外研究最 多的就是利用微生物降解修复环境中的农药残留。微生物能以农药作为碳源和能源，对农药进行 代谢或者共代谢，从而达到修复环境的目的。 1 3微物生物修复农药残留 生物修复技术是近2 睥来发展起来的一种有效的用于污染土壤治理的方法，生物修复即利用 生物降解环境中有毒有害物质。消除污染，减少其浓度的修复方法。大体上，可以将生物修复分 为原位生物修复和异位生物修复。原位生物修复( 就地生物修复) 即污染土壤或水体不经过搬运 或运输，而是通过投加微生物、营养盐、电子受体等方法进行原位生物降解。异位生物修复即利 用物理化学方法将受污染物质搬离原地进行集中生物降解，通常对于污染严重的土壤与水体多采 用该技术。生物修复主要包括动植物修复、微生物修复，其中微生物修复工程简单，处理费用相对 较低且能较彻底地将有机污染物降解为最终产物，目前国内外研究比较广泛，具有很好的应用前 景和发展潜力。 1 3 1 降解拟除虫菊酯类农药的微生物种类 国内外已经利用从环境中筛选和诱变育种等方法得到多种细菌，真菌、放线菌等降解有机农 药的微生物，降解各类农药的主要微生物如表1 一l ，在国内，主要侧重于研究拟除虫菊酯类农药的 环境行为和残留消解动态的工作。近些年国内也筛选出几种拟除虫菊酯类农药降解菌株，中国科 学院广州地球化学研究所虞云龙、樊德方等，1 9 9 6 年筛得假单胞菌属( p s e u d o m o n a ss p ) ，福建农 林大学王兆守等，2 0 0 3 年筛得阴沟肠杆菌( e n t e r o b a c t e r c l o a c a p ) 、荧光假单胞菌( p s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n s ) 和恶臭假单胞菌( p s e u d o m o n a s p u t i d a ) 。南京农业大学许育新等，2 0 0 4 年筛得放线菌 红球菌属( r h o d o c o c c l u s p ) 。中山大学梁卫驱2 0 0 5 年筛得克雷勃氏杆菌( k l e b s i e l l a s p ) 袭1 - 1 ：降解有机农药的徽生物种类 t a b l el 一1 ：t h eb a t e r i ad e g r a d a t i n gt h eo r g a n i cp e s t i c i d e s 农药种类主要微生物种类 有机磷 有机氯 三嗪类 氨基甲酯 假单孢菌( r a n in l 等，1 9 9 4 ) 、芽孢杆菌、黄杆菌、黄单胞杆菌、短杆菌、 小球绿藻、镰孢酶、镰刀菌、节细菌、根瘤细菌青霉、木霉、曲霉 假单胞菌、芽孢杆菌、节细菌、棒状杆菌、五色杆菌、土壤杆菌、微球菌、 黄单胞杆菌、埃希氏杆蘸、链球菌、梭状芽孢杆菌、镶刀菌、镰孢酶、菱 属硅藻、无色杆菌、黄杆菌、枝动杆菌、诺卡氏菌、气杆菌、曲霉、青霉、 木霉、根霉 曲霉、青霉、根霉、木霉菌、镰刀菌、尖刀菌 假单胞菌、无色杆菌、节细菌、曲霉、青霉、根霉 6 中嗣农业科学院硕十学位论文第一章绪论 拟除虫菊酯 产碱菌、阴沟肠杆菌( 王兆守，2 0 0 3 ) ，芽孢杆菌( m a l o n e y ，1 9 9 3 ) 、假单 胞菌、无色杆菌、不动杆菌( 肖红利，2 0 0 4 ) 、克雷勃氏杆菌( 粱卫驱，2 0 0 5 ) 如表1 - 1 所示，目前人们所筛得的具有拟除虫菊酯类农药降解能力的的微生物菌属相较于有机 磷、有机氯降解菌株要贫乏有机磷、有机氯类农药由于旋用历史长，而且这两种农药的残效期 长，环境残留率高，所以目前的筛菌工作主要集中筛选降解这两类高残留农药的微生物菌株，而 对于人畜低毒拟除虫菊酯类农药。人们重视不够，随着欧盟、日本等国家进口产品农药最低残留 限量的逐渐降低，拟除虫菊酯类农药残留对我国出口贸易形成的绿色壁垒，严重影响了我国的经 济发展，并且近些年菊酯类农药生物和人类中毒事件不断发生，以及全球人类环境意识的提高， 使得菊酯类农药残留的微生物修复成为科研工作者的研究热点，首先就是要筛选能够高效降解拟 除虫菊酯类农药的微生物，增加具有降解能力的微生物种类，根据各种微生物的不同特性，对受 污染的土壤和水体进行生物修复，推动我国环境改善、生态修复的步伐。2 ( d 4 年国内首例农药残 留微生物降解技术在山东滨州示范成功，在我国环境污染物微生物生物修复领域中，迈出了具有 重大意义的一步，但是还没有实现真正意义上的大规模施用。在自然生态环境中。温度、湿度、 p h 等条件复杂，同时存在很多土著微生物，它们会影响降解菌株的生长，甚至有可能对降解菌产 生拮抗或者致死作用。由于目前筛得的降解拟除虫菊酯类农药的菌株不多，具有高效降解效率的 更少，而且随着菊酯类农药的不断发展，有更多新型高效的菊酯类农药投入使用，自然环境中能 够筛得的菌株有限并且不是所有的土著微生物都能够利用纯培养的方法获得，所以利用基因工 程方法构建高效广谱的农药降解工程菌株势在必行。 1 3 2 微生物降解农药的途径 农药降解途径、降解菌株对农药的降解机理以及代谢产物的研究可以使我们了解农药在环境 中的去向和归宿，促进微生物修复的合理化和产业化。活体微生物对农药的作用分为两类：一类 是微生物直接作用于农药，大多数都是由酶促反应引起，亦称为微生物的农药代谢：另一类是微 生物的活动改变了化学和物理环境而间接作用于农药。作用方式主要有矿化和转化两种，矿化作 用主要是有机物在微生物作用下完全分解为无机产物的过程，即有机物达到彻底降解，这种作用 可以使农药彻底降解，降低了在降解过程中产生对环境存在潜在威胁的中问产物，是农药降解的 最理想方式；转化作用是由于微生物的共代谢作用所引起的，微生物以某种碳源生长时，能同时 代谢某些化台物，但是不能以这些化合物为唯一碳源，只是对这类物质的结构产生部分改变，生 成与农药母体相似的中问产物，而不是达到农药的彻底降解，在自然条件下，环境中微生物主要 以共代谢方式作用于农药残留。微生物通过胞内或胞外酶直接作用于周围环境中的农药，降解作 用主要是通过酶催化的一系列水解方式进行的代谢，其中包括：( 1 ) 广谱性酶的偶然性代谢，如 水解酶、氧化酶等；( 2 ) 由基质结构与农药相似的酶进行的共代谢；( 3 ) 由利用农药作为能源 适应酶进行的降解代谢，另外，还有通过p h 改变、辅酶或化学产物的降解，主要的降解反应类 型有；氧化、还原、水解、合成等，农药的微生物降解很多属于共代谢类型。目前研究较为清楚 的微生物降解农药的途径如袭卜2 所示。 7 中同农业科学院硕七学位论文第一审绪论 衰卜玉徽生物誓促降解有机农药的途径 t a b l e l 一2 ：t h ep a t h w a y so fd 昭r a d a t i o no ft h em i c r o o r g a n i s m 途径机理举饲 水解作用 脱卤作用 氧化作用 硝基还原 甲基化 去甲基化 去氨基 轭合作用 酯键和酰胺键水解马拉硫磷、氯菊酯 取代基上的卤被h ，羧基等取代d d t 插入1 个羟基或形成1 个环氧化物多菌灵和2 ，4 一d n 0 2 转变为n h 22 4 二硝基酚、对硫磷 加入甲基五氯酚、四氯酚 脱去甲基或其他烃基敌草隆 脱氨醚草通 中间代谢产物与异生素进行合成反应 2 0 t t t 纪8 哞代，研究者发现微生物降解农药的实质是酶促反应，共生或纯培养微生物对农药 的降解作用都是在酶的参与下完成的。在许多情况下，降解作用是在多种酶的协同作用下完成的。 ( f u m i o ，1 9 8 3 ) 等根据酶对农药的代谢特点，将酶分为三类：( 1 ) 偶发代谢的酶：这里，微生物 虽然能代谢农药，但不可以利用农药作为能源；( 2 ) 分解代谢的酶：微生物可利用农药作为能源或 农药诱导酶利用农药作为能源；( 3 ) 解毒代谢的酶：微生物降解农药不是出于利用它们作为能源， 而是处于抵抗这些农药的毒性。在国内外都有从微生物中对拟除虫菊酯类农药降解酶类分离纯化 的报道，早在1 9 9 3 年，美国m a l o n c y 等人从蜡状芽胞杆菌( b a c i l l u sc e r e l l ) s m 3 中分离纯化得到 了氧菊酯酶；我国在2 0 0 4 年，由福建农林大学林淦等从分离纯化到拟除虫菊酯类农药降解酶，并 对其性质进行了研究。这些降解酶有些是微生物固有的。有些是由于变异产生的。 经过研究人员多年的研究结果发现( a l l a nw a l k e r 等，1 9 8 6 ) ，农药降解酶在降解农药残留的应 用中，与降解微生物相比，具有以下几个方面的优点：( 1 ) 农药降解速度快，效率高。酶作用于农 药底物，可以在数小时之内去除农药；( 2 ) 安全无毒副作用。酶是一类蛋白质，在它变性之后，很 容易转化，易于去除，对环境不产生二次污染；( 3 ) 农药降解酶通常比产生这类酶的微生物菌体或 生物体更能忍受异常环境条件，如氯氰菊酯降解粗酶，p h 值为6 o 和1 1 0 时，该酶对农药的降解 率为4 5 左右，在温度为4 c 与5 0 c 时，其降解率均在2 5 左右。由此可见，该酶对高温和低温都 有很强的适应能力，而产生该酶的不动杆菌( a c i n e t o b a c t e rs p ) 在同样条件下生长缓慢或者不生 长：( 4 ) 即使农药的浓度比较低，酶也能进行催化 ( 5 ) 酶不受微生物吞食者和毒素的影响；( 6 ) 在土壤修复中，酶由于体积小，在土壤中移动性强，降解农药不需要借助特定的吸收机制；( 7 ) 具有比微生物更宽广的降解谱。由于农药通常都具有相似的结构，只是取代基不同而已，所以降 解酶相较于菌株具有广谱性，在降解某种农药的同时，亦可以同时对其它农药进行降解，所以， 农药降解酶具有良好的应用前景。可降解农药的酶有多种，主要有加氧酶、脱氢酶、偶氮还原酶 和过氧化物酶等。根据酶在微生物细胞中存在的位置，酶分为胞内酶和胞外酶。虞云龙等进行了 有机磷和拟除虫菊酯农药酶促降解的研究，发现主要是胞内酶在起作用( 虞云龙等，1 9 9 7 ) 。人们设 想利用降解酶作为净化农药污染的有效手段，有关农药降解酶的研究已经受到广泛关注。2 0 0 6 年 范云六院士带领和指导的研究课题组，首次在世界上成功研制出“有机磷农药降解酶制剂”，这种 8 中同农业科学院硕士学位论文第一章绪论 制剂可与蔬菜、水果等农产品表面残留的农药发生化学反应，使剧毒农药瞬间变为无毒、可溶于 水的小分子，以达到蔬菜水果的迅速脱毒，而且该酶做成的洗涤液对环境不会有二次污染，在利 用生物技术快速、简便解决蔬果农药残留领域，取得了具有里程碑意义的进步。 目前，酶在农药生物修复中的研究主要集中在降解酶的分离纯化、降解酶类的特性、降解酶 活性的外部影响因子、酶的降解性能、酶的降解谱、降解机理、降解酶类的固定化技术以及酶在 农药降解中的具体应用等，都是利用生物化学方法从蛋白质角度得到微生物的降解酶类，并再这 个基础上进行化工和应用角度的研究。国内外科研工作者已经分离纯化得到的农药降解酶类如表 卜3 举例。由表中可以看出；分离纯化得到的有机磷类农药的降解酶类较多，对于菊酯类农药的降 解酶类分离纯化得较少，国内关于菊酯类降解酶的研究主要在于胞内粗酶的活性，以及相关特性 和粗酶动力学方面，分离纯化方面还是空白。从各种研究表明：生物主要通过酯酶类和氧化酶类 ( s t e i e r t 等，1 9 8 9 ；c h i a k i 等，1 9 8 7 ) 对拟除虫菊酯类农药进行分解代谢，如库蚊中的羧酸酯酶和 哺乳动物的微粒体酶系对菊酯类农药的降解，1 9 9 3 年m a l c y 等分离到的氯菊酯酶也属于羧酸酯 酶。 寰1 - 3 ：从微生物中分离纯化的农药降解冀 ! 垫! ! ! ：兰：! 堕巴里笪韭趔竖塑! 壁垒竺堡! 堕墅塑型堡璺型婴 农药酶类来源备注 随着分子生物学与基因工程技术的不断发展和更新，有关农药降解酶的研究逐渐趋向于降解 酶基因的克隆与表达。从分子水平，利用各种现有的生物学方法