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郑州大学硕士学位论文 1 部分取代苯化台物对茇光毒曲急性毒性研究 部分取代苯化合物对发光菌的急性毒性研究 ( 摘要) 研究生姓名：翟丽华指导教师：乐金朝 ( 郑州大学环境与水利学院，河南郑州4 5 0 0 0 2 ) 环境中有毒污染物的种类和数量日益增多，给生态环境造成巨大威胁，如何评价这 些污染物对环境的毒性影响越来越受到人们的关注。本文通过查阅国内外大量文献，对 有毒污染物的研究现状作了简要分析。在众多有机物中，单环、多环芳香族化合物及其 它们的各种取代衍生物占有重要地位，它们是很多石化和化工工业的原料和产品，种类 繁多，且毒性较大。同时，发光细菌作为毒性评价指示生物，具有方便、灵敏、经济， 与其它毒性数据有较好相关性等诸多优点。因此，本文采用发光细菌法作为急性毒性检 测方法，选取了1 7 种取代苯化合物作为受试化合物，测定了这些化台物的单一毒性及 部分化合物的联合毒性，对测定结果进行定性分析，并对单一化台物的毒性结果建立了 预测模型。最后测定了两种废水不同处理工艺对发光菌的毒性，初步评价了处理工艺对 毒性去除的影响。 首先测定了1 7 种取代苯化合物对发光菌的急性毒性，初步探讨了苯环上不同取代 基类型和取代位置对毒性的影响。同时，计算了理化意义明确的量子化学描述符和线性 溶剂化自由能参数，进而运用定量结构活性相关方法解析了毒性与化合物结构问的关 系。结果表明，该组化合物对发光菌的毒性与化合物的分子体积、面积问呈显著正相关 关系，经检验预测方程稳健、可靠，能够用于预测其它相似结构化合物的毒性。 在单一化合物毒性测定基础上，选取苯、苯酚、苯胺、硝基苯、对氯酚进行等毒性 的联合毒性研究，评价联合作用类型，并迸一步研究复合有机物变比例的联合毒性影响， 选取苯胺+ 苯酚、硝基苯+ 对氯酚、氯苯+ 苯胺、氯苯+ 苯酚、氯苯+ 对二氯苯5 组混合物 进行变比例的联合毒性研究，初步分析、评价混合物毒性的变化规律及影响因素。实验 郑州大学硕士学位论文 部分取代苯化合物对发光菌的急性毒性研究 表明，联合作用类型不但与其组成化合物类型有关，也与化合物含量密切相关，相同组 成的混合物在不同配比下其联合作用类型是变化的，这可能与化合物的联合作用机理有 关，有待进一步验证。 工业废水及生活污水大多处理后仍不能消除其对环境的毒性影响，其中，造纸废水 由于含大量有机氯化物，不易生物降解，而且有关城市污水的毒性影响报道也较少，因 此，本文最后选取某造纸厂中段废水及某污水处理厂各工艺出水，测定造纸废水经三种 混凝剂及三种超滤膜处理前后的毒性大小，结果表明，复合混凝剂( 硅藻土+ 硫酸铝) 对废水毒性的去除贡献最大，其次为硫酸铝，聚合硫酸铁( p f s ) 的影响最小。超滤膜 对废水毒性的效果较好，其中m w c 0 6 0 0 0 对毒性的去除贡献最大。对于某污水处理厂 废水，测定了废水沿处理工艺的毒性变化，结果表明，该处理工艺对废水的去除有一定 的效果，但出水中仍残留一些有毒有机物，因此，有必要对废水处理工程进行毒性控制。 【关键词】取代苯发光菌毒性联合毒性定量结构活性相关毒性加强指数 - 郑州大学硕士学位论文 部分取代苯化合物对发光菌的急性毒性研究 as t u d yo na c u t et o x icit yo fs o m es u b s tit u t e db e n z e n e s t op h o t o b a c t e rlu mp h o s p h o r e u m ( a b s t r a c t ) z h a jl i - h u ad i r e c t e db yy u ej i n - z h a o ( s c h o o lo f e n v i r o n m e n ta n dw a t e rc o n s e r v a n c y , z h e n g z h o uu n i v e r s i t y , h e n a n ，4 5 0 0 0 2 ) n o w a d a y si t i so n eo ft h ed i f f i c u l tp r o b l e m st h a th o wt oe v a l u a t et h et o x i c i t yo ft h e s u b s t i t u t e db e n z e n e st ot h ee n v i r o n m e n te f f i c i e n t l y p h o t o b a c t e r i u mp h o s p h o r e u mu s e da s b i o i n d i c a t o ri sc o n v e n i e n c es e n s i t i v ea n de c o n o m i c a l 1 7s u b s t i t u t e db e n z e n e sw e r es t u d i e d i nt h i sp a p e r t h ea c u t et o x i c i t yo f t h e s e1 7t e s t e dc o m p o u n d s a n dt h ec o m b i n e dt o x i c i t yo f 5 c o n i p o u n d sw e r em e a s u r e d t h ed a t ao fs i n g l ec o m p o u n d sw a sd i s c u s s e dr o u g h l ya n dt h e p r e d i c t e de q u a t i o n w a ss e t u p t h ee f f e c to fc o m b i n e d c o m p o u n d s w a s a n a l y s e d a p p r o x i m a t e l y t h et o x i c i t y o ft w ok i n d so fw a s t e w a t e r st op h o t o b a c t e r i u mp h o s p h o r e u m w a sm e a s u r e da tl a s t t h er e s u l t sc a nb eu s e dt oe v a l u a t et h e t o x i c i t yi m p a c t t ot h e e n v i r o n m e n to f t h et r e a t m e n tt e c h n i c so f t h e s ew a s t e w a t e r s t h ea c u t et o x i c i t i e so f17s u b s t i t u t e db e n z e n e st op h o t o b a c t e r i u mp h o s p h o r e u mw e r e m e a s u r e d ，a n dt h ee f f e c t so fs u b s t i t u t e dg r o u p sa n dp o s i t i o n so nt o x i c i t i e sw e r ed i s c u s s e d r o u g h l y t h em o l e c u l a rs t r u c t u r a ld e s c r i p t o r s ，s u c ha sq u a n t u mc h e m i c a lp a r a m e t e r sa n d l i n e a rs o l v a t i o ne n e r g yp a r a m e t e r s , w i t hc l e a rp h y s i c o c h e m i c a ls e n s e s ，w e r ec a l c u l a t e d ，a n d r e l a t i o n s h i p s b e t w e e nt o x i c i t i e so ft e s t e d c o m p o u n d s a n dt h e i rm o l e c u l a rs t r u c t u r a l d e s c r i p t o r sw e r ed e v e l o p e db yu s i n gq u a n t i t a t i v es t r u c t u r e a c t i v i t yr e l a t i o n s h i p ( q s a r ) t e c h n i q u e t h er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tt h e r ew a sas i g n i f i c a n t p o s i t i v ep r o p o r t i o n b e t w e e n t o x i c i t ya n di n t r i n s i cv o l u m eo ra r e ao fc o m p o u n dm o l e c u l e s , a n dt h ee q u a t i o n sw e r er o b u s t e n o u g ht h r o u g hj a c k n i f et e s t t h er e s u l t sw e r es a r i s l y i n gw h e nt h eo b t a i n e de q u a t i o nw a s u s e dt op r e d i c t2 7c o m p o u n d sw i t hs i m i l a rs t r u c t u r ea ss e l e c t e do n e s b a s e do nt h ed e t e r m i n a t i o no f s i n g l ec o m p o u n d s ，b e n z e n e p h e n o la n i l i n en i t r o b e n z e n e a n do - c h l o r o p h e n o lw e r es e l e c t e d t h e s e5c o m p o u n d sw e r ec o m b m e db ye q u a lt o x i c i t y m e t h o da n dt h et o x i c i t yt y p e sw e r ee v a l u a t e dt h e na n o t h e r5g r o u p sw e r ec h o o s e d t h e s e c o m p o u n d s w e r ec o m b i n e d b yv a r i e dp r o p o r t i o n a n dt h ec o m b i n e dt o x i c i t ye f f e c tw e r e a l s o d e t e r m i n e d t h el a wo ft h ec o m b m e d t o x i c i t ya n dt h ei n f l u e n c ef a c t o r w e r e a n a l y z e dr o u g h t l y t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ec o m b i n e dt o x i c i t yw a sr e l a t e dn o tt ot h e t y p e s b u tt ot h e c o n t e n t so f t h et e s tc o m p o u n d s t h et o x i c i t yo fw a s t e w a t e rt ot h ee n v i r o n m e n tw a sn o tw e l le l i m i n a t e db ym o s t t f e a t m e mp l a n t s t h ep a p e rw a s t e w a t e rw a sd i f f i c u l tt ob et r e a t e df o rh i 【g hc o da n dt o x i c - i - 二型查兰堡主堂堡丝苎 塑坌壁垡苎丝鱼塑型垄些堕塑墨丝查丝堡塞 c o m p o u n d s t h es e w a g ew a sa l s on o tt h i n km u c ho fi nt h el a s tp a r t , t h et o x i c i t yo f p a p e r i n t e r m e d i a t ew a s t e w a t e ra n ds e w a g ef r o md i f f e r e n tt r e a t m e n t sw e r em e a s u r e d f o rp a p e r w a s t e w a t e r , t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tw a s t e w a t e rw a ss t i l lp r o v i d e dw i t ht o x i c i t ye v e na t = t e r c o a g u l a t i o na l t h o u g ht h ec o m p o s i t ec o a g u l a t i o nr e a g e n tw a st h eb e s to n et og e tr i do ft h e t o x i c i t y o fw a s t e w a t e ro nt h eo t h e r h a n d ，i t st o x i c i t y c o u l db eg r e a t l y d r o p p e db y u l t r a f i l t r a t i o na n dm w c 0 6 0 0 0w a st h eb e s to i l e f o rt h es e w a g ef r o maw a s t e w a t e rt r e a t m e n t p l a n t , t h e e x i s t i n gt e c h n i c sc o u l dr e m o v ep a r tt o x i c i t y , b u tt h e r ew a ss o m et o x i c 畸l e f ti nt h ee f f l u e n ts ot h ec o n t r o l o f t h et o x i c i t yi m p a c to f t h et t e a t m e n tt e c h n i c sw a s v e r yi m p o r t a n t 【k e y w o r d s s u b s t i t u t e db e n z e n e s p h o t o b a c t e r i u m p h o s p h o r e u m a c u t e t o x i c i t y c o m b i n e d t o x i c i t yq u a n t i t a t i v e s t r u c t u r e a c t i v i t y r e l a t i o n s h i p st o x i c i t ye n h a n c e i n d e x i v - 磐挑大学颈士学链论文 部分取拽荤化台物对发免菌的怠性毒性研究 第二章绪论 1 。1 磷究背景 一有机污染物对环境的礴性影响概述 随着社会经济的发震，有机他合物的种类和数量目益增多，掭估计，目前全球为人 类应用的仡学晶己多达l o 万种，同时，每年还有数阻千计的新的入工合成的有视纯合 物问箧，而与合成化合物生产、应用和降解相关的还裔无数副产街、中间产物和降解产 物辞。这些纯合物以各种形式存在予环境中，时生态环境构成巨大威挤。 1 单有机污染物毒性影响 有毒有机污染物虽大多在环境中含量不高，但对人体的危害却很大。生态毒理学的 研究表明“1 ，这类化合物大多为生物难降解类型，对化学氧化和吸附也有阻抗作用，它 们可在水生生物、农作物和其他生物体中迁移、转化和富集，并其三致( 致癌、致畸、 致突变) 效应，在长周期、低剂量条件下，对生态环境和人体健康具有严重影响。 美国环俣岗( e p a ) 规定购优先控制的污染物中1 2 】，商机化合物为1 1 4 神，占总数 的8 8 。我国环保局1 9 8 9 年4 月通过的“水中优先控制髓污染物黑名单”中，包括1 4 类6 8 种有毒化学污染物，其中有机毒物占5 8 种，其余1 0 种为无机污染物。所以，在 优先控制污染物中，商机污染物因其危害太，所占比例也丈。 大量有虮污染物广泛谨在于巧境，特别是各种水体中，且太多为“三致”物质，对 生物体尤其是人类骞整投太的港褒性虫害，因此，研究有机污染物的环境毒矬影响具有 重要塞义。在污染控制管理中，有机污染物鬻被作为分振捡测和珊究的优先考虑对象。 2 复合有机污染搦熬毒性彩媳 现实环境中的有梳污染秘往往港灌台物形式存在。函诧，久袭在生活裙奎产活动孛 实际上不仅仅单独的接触莱个夕 深化学物，稀经常蔺时接融各种各样觞多种辨灞忧会 物，这种滗合物中革个缢矜之闻辩人体作用是有差剐豹。这些毒钫共同捧羯予生物体， 在梳体可壁现十分复杂酶交互作焉，最终对梳俸； 超综合翡霉性，毒瑗学将琵萃孛或以上 的外瀛化学裙对机俸交互作用称之为联合作用1 3 。联合作用不仅在程度上而且在类型上 都可能不丽子这骜纯合静攀弦律鬟耱憨纛。一觳扶为，当尼释毒窘因素惫害秘蒋对，霹 发生因类作甭裙翻作臻( a d d i t i o n a lj o i n ta c t i o n ) 、协同作瘸( s y n e r g i s t i c j o i n t a c t i o n ) 、 籀抗豫用( a n t a g o n i s t i c j o i n ta c t i o n ) 及独立作爝( i n d e p e n d e n t j o i n t a c t i o n ) 污染物迸入环境前同环境中箕他耪质筵两存在，稽互闻教生协同、糯翻、菇抗等复 郑州太学硬士学位论文 部分取代苯化台物对发光菌的急性毒性研究 杂作用，许多化合物单独存在时毒性较大，但合在一起，由于拮抗作用，毒性却会减少。 而另一些可能单独帝在时对生物没有毒性，但跟其他物质联合起作用时，对环境的毒性 会加大。 b i e s i n g e r 【4 】在实验中发现，单个金属存在时对大型蚤( 丑m a g n a ) 无毒的浓度，混 合后即可观察到明显的毒性作用。s p e c h a r 和f i a n d t l 5 1 研究指出，根据美国环保局的水 质标准配制的金属混合液，对鱼类和无脊椎动物都有毒性。v a nl e e u m e n l 6 1 等人也发现荷 兰的水质标准不足以保护水生生物，因为其混合物对生物有不利的影响。 所以，现实生活中有机污染物大多以混合物的形式对环境产生毒性影响，而现行的 生物毒性实验又大都是单一污染物的实验，毒理学研究中又常常只涉及单一化学物质在 不同剂量情况下对实验动物的急性或慢性毒性效应。现行的水质标准也是根据单一有机 物的毒性实验确定的，因而实际应用时不能有效的反映出有机物的毒性效应，所以确定 混合物中各化学成分的生物学效应间的相互作用、这些作用对总体毒性的影响、以及怎 样应用这些资料指导混合物的危险性评价受到越来越多的关注。 3 废水的综合毒性影响 水的卫生和安全研究方面，人们以往重视的主要是微生物和无机物污染，而当前水 体污染中，有机物污染最突出。这些有机污染物随工业废水或生活污水排入水体中，将 污染水环境并恶化水质，最终威胁到人类的健康。 大量有机污染物存在于废水中，它们之间互相影响，共同作用，使废水对环境产生 更为复杂的综合影响。人们不论是通过饮水和其它用水直接或间接地接触水中有机污染 物，还是因食用受到水体有机物污染的食物而通过食物链间接受到其影响，水体中的有 机污染物会对人体健康构成巨大威胁。但迄今为止，因废水中有机物种类繁多且组分复 杂，因而分析较难，人们对绝大部分有机污染物在环境中的行为( 光解、水解、微生物 降解、挥发、生物富集和吸附等) 及其可能产生的潜在危害尚无所知或知之甚少。因此， 水体有毒有机污染物的监测和控制研究成为了近三十年来世界各国环境研究领域科学 家和政府相关部门关注的焦点。 自2 0 世纪8 0 年代以来，发达国家在水环境毒物污染控制和生态风险管理领域已 取得了较大的发展，在改善水质、保障生态安全和人群健康等方面发挥了积极作用，令 人瞩目。 美国于1 9 8 4 年3 月颁布了“国家污染物排放削减制度”( n p d e s ) 。它要求在确定 排污许可证的特征化学污染物排放许可限的同时，采用全废水的生态毒性试验手段，禁 止致毒量的有毒污染物的排放，实施以全废水生态毒性法从废水毒性上控制废水中毒 物、有机毒物的排放和废水毒性削减( t o x i c i t yr e d u c t i o n ) 政策。这一政策的实施使废水的 生态毒性试验成为工业废水和城镇综合污水排放到淡水和海洋环境的控制和监测程序、 2 郑州太学硕士学位论文 部分取代苯化台物对发光菌的急性毒性研究 实施生态风险管理必不可少的组成部分。在加拿大，采用全废水生态毒性法来控制工业 废水的排放和实施生态风啥管理也已有相当长时阃，特别是应用于控制纸浆和造纸废水 排放和跟踪毒性监测。 英国也于1 9 9 6 年引入了全废水生态毒性法以控制组份复杂废水的排放和实施生态 风险管理，提出了以全废水生态毒性法控制废水排放和生态风险管理的技术路线1 7 , 8 i 。欧 洲其它国家如法国、德国、意大利和瑞典也己采用全废水生态毒性法控制工业废水和城 市综合污水的排放。 近几年来，我国不少地区的水体己遭到不同程度的有机毒物污染，甚至在某些饮用 水水源水中检出众多的有毒有机污染物。 在我国，目前仅以传统的废水特征化学污染物法控制废水排放。这传统方法虽是 实施水环境污染控制与风险管理的基本手段，但对于组份复杂、富含有机毒物的废水排 放的控制与风险管理存在许多缺陷【9 ，怕】。 因此，目前仅以传统的废水特征化学污染物法控制废水排放，难以达到生态风险管 理的目标，不可能真正有效控制有毒有机污染物排放至水环境。所以亟待研究和采用新 的毒性控制方法进行有机毒物污染的生态风险管理，与发达国家减小差距。 二有机污染物毒性检测方法及其筛选 目前环境监测般采用理化监测和生物监测两种方法。 1 理化分析方法 理化检验技术采用各种仪器和化学分析手段，对污染物的种类和浓度进行快速灵敏 的分析测定，其中些常规参数如温度、p h 值、溶解氧、氧化还原电位及电导率等能 连续监测，理化监测因其准确、可靠、快速等特点在环境检测中具有重要的作用。 有毒有机物对环境的毒理作用主要取决于这些物质的毒性程度和暴露水平，理化监 测的方法可精确的测定化学物质，甚至是痕量的浓度，给出待分析组分的精确含量，为 有毒有害化学品的有关标准和法规的制定提供依据。因而得到广泛的应用。 但通过理化方法获得的结果却不能直接给出污染物质对环境和生物的危害性评价。 污染物进入环境后同环境中其他物质共同存在，相互间发生复杂作用，所以，环境中的 各种生物接受的是综合影响，而理化监测只能检出各种成分的类别和含量，但不能对生 物所受的综合影响确切地进行评价。 随着生产和科学技术的不断发展，人类逐步认识到即使化学分析非常精确，也只能测 出污染物中化合物的成分、数量，而反映不出污染物对生物体危害的效应及程度。1 9 9 2 年，“北大西洋公约组织高科技讨论会”提出：“对于环境污染的监测，仅用化学方法是没 有意义的，应该将化学方法和生物方法兼而并用”1 1 1 1 。生物毒性法是一种快速监测分析 郑州大学硕士学位论文 部分取代苯化台物对发光菌的急性毒性研究 方法。它能够反映各种有毒污染物对环境影响的综合毒性，是一项综合性指标。 2 生物检测方法 ， 生物监测是利用生物的组分、个体、种群或群落对环境污染或环境变化所产生的反 应，从生物学的角度，为环境质量的监测和评价提供依据。生物监测的理论基础是生态 系统理论【1 2 | 。生态系统由生物部分和非生物部分组成，其中，生物部分包括生产者、消 费者和分解者。从低级到高级，生态系统包含有生物分子一细胞器一细胞一组织一器官 一器官系统一个体一种群一群落一生态系统等不同的生物学水平。污染物进入环境后， 会对生态系统在各级生物学水平上产生影响，引起生态系统固有结构和功能的变化。 生物监测正是利用生命有机体对污染物的种种反应，来直接地表征环境质量的好坏 及所受污染的程度。所以生物监测能反映环境诸因子，多成份综合作用的结果，能阐明 整个环境的情况。由于环境变化的效应从根本上是对以人为主体的生物系统的影响，因 此生物监测对环境素质的优劣更具有直接和指示作用。 所以，利用敏感生物测试化学污染物的毒性影响是对环境进行生物评价的基础。应 用生物检测手段进行有毒有机污染物的检测及评价受到越来越多的关注。 3 生物毒性测定方法的筛选 最早是一些生物学家针对污染的生物评价提出可行的方法，例如h a r t 利用淡水鱼 评价工业废水、化学物质和其他物质的毒性1 ，d o u d o r o f f 进行了工业废水对鱼的急性 毒性生物评价“。到了7 0 年代，生物评价越来越普遍。在急性毒性分析方面，新的检 测手段不断建立，其指示生物包括微生物“”1 、藻类“、底栖软体动物m 1 、浮游生物”“ 和鱼m 1 等。 ( 1 ) 微生物毒性检测法 传统的生物毒性评价以哺乳类、鱼类等为受试对象，因此实验操作复杂、周期长， 且仅适合于实验室内进行，不能满足快速监测需要。近年来，国内外研究人员一直在致 力于生物毒性试验新方法的探索和研究。其中，微生物毒性实验因其快速、简便、灵敏 和低廉的特点逐渐受到人们的重视和研究【2 “。 有毒化学品接触微生物后，可造成细胞内蛋白质物质泄漏，从而对微生物造成毒性 危害22 1 。用适当的指标把这些危害效应反映出来，就可对有毒化学品的的毒性程度和浓 度大小作出评价。根据微生物毒性实验测定的指标和在环境监测中的应用，一般可分为 细菌发光检测，细菌生长抑制、呼吸代谢速率或菌落数检测，生态效应检测等三大类型 2 2 1 。其中，细菌发光检测因其独特的生理特性、与现代光电检测手段完美匹备的特点而 备受关注，由此发展起来的发光细菌毒性测试( l u m i n e s c e n tb a c t e r i at o x i c i t yt e s t ，l b t ) 技术1 2 3 j 引人注目。 郑州大学硕士学位论文 部分取代苯化台物对发光苗的急性毒性研究 ( 2 ) 发光细菌检测法 a 发光菌检测法的产生及原理 发光菌的发光现象是其正常的代谢，在定条件下发光强度是恒定的，与外来受试 物( 无机、有机毒物，抑菌、杀菌物等) 接触后，其发光强度将有所改变。变化的大小 与受试物的浓度呈相关关系，同时与该物质的毒性大小有关。t h o m u l k l 2 4 1 认为外来受试 物通过下面两个途径抑制细菌发光：( 1 ) 直接抑制参与发光反应的酶类活性；( 2 ) 抑制细 胞内与发光反应有关的代谢过程( 如细胞呼吸等) 。 发光菌法即是利用灵敏的光电测量系统测定毒物对发光菌发光强度的影响。毒物的 毒性可以用发光菌发光强度降低5 0 时毒物的浓度即e c 5 0 表示。实验结果显示，毒物 浓度与菌体发光强度呈线性负相关关系。因而可以根据发光菌发光强度判断毒物毒性大 小，用发光强度表征毒物所在环境的急性毒性。 在应用发光菌进行各项生物毒性测定方面，美国的b a c k m a n 公司于1 9 7 8 年研制成 一种生物发光光度计( 或称生物毒性测定仪) ，商标名称“m i c r o t o x ”1 2 5 , 所用菌剂是明 亮发光杆菌i f , h o t o b a c t e r i u mp h o s p h o r e u f n ) ，其灵敏度可与鱼类9 6 h 急性毒性试验相媲 美 2 6 1 ，因其快速、简便、费用低廉而独具特色，从此，发光细菌毒性测试( l u m i n e s e e n t b a c t e r i at o x i c i t yt e s t ，l b t 1 技术在全世界范围内得到了广泛应用1 2 7 j 。 b 发光菌检测法的应用 由于l bt 技术具有应用范围广 2 9 - 3 0 i 、灵敏度高【3 1 1 、相关性好1 3 2 1 、反应速度快等 优点，因而被广泛应用于环境监测及环境质量评价中。 于晓丽等利用发光菌进行了8 种单因子生物毒性实验，确定了金属离子、非金属 离子对发光菌的半致死浓度。在此基础上，评价了某油田不达标采油污水的综合毒性， 指出污水毒性主要是由污水中有机物产生的，并对有机化合物的致毒机理进行了探讨。 吴伟1 3 3 1 等以明亮发光杆菌为指示生物，对不同水体中污染物的急性毒性进行了快速 检测，其结果与鱼类毒性实验可互相替代，并可应用于渔业水域的污染评价，实现对渔 业水体的现场连续监测，并进行预测预报。 乔鸿泽【3 4 1 等采用发光细菌测定法估算了两城市污水对河道水体污染的分担率，评价 了工厂排放废水的毒性，并据此确定污染源监督管理中应优先治理的工厂( 车间) 废水a 所以该法在工业废水的监督管理中有广泛的应用前景。 近年来，利用微生物发光细菌属毒性试验o 垤i c r o t o x ) 检测环境污染物急性毒性倍受重 视，并以检测时间短，灵敏度高而被世界各国广泛采用，我国于1 9 9 5 年也将这一方法 列为水质急性毒性的检验标准方法( g b f r l 5 4 4 1 - 1 9 9 5 ) 。 随着现代仪器和光电子技术在分析领域中迅速发展，l b ，t 技术和g c 、g c m s 及 - 5 苎塑查兰里兰兰竺笙奎 塑坌坚垡苎些皇竺翌垄垄苎望璺堡兰兰! 塑 _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ - - _ _ _ _ _ _ - - - _ _ _ _ - - _ _ _ _ _ _ - 一一 。_ 荧光、紫外等大型分析仪器相结合，为克服以上之不足，更加准确、定量地对环境污染 物急性毒性分析提供了保证。相信这一技术在我国的环保事业中将发挥越来越大的作 用。 1 2 课题意义 综上所述，有毒有机污染物对环境的毒性影响的研究中还存在大量基础性问题有待 开展。 1 目前对于单一化合物的毒性测定及分析报道虽较多，但其模型参数的选取大多无一 定规律，致使所得方程虽有较好相关性，但对于同类化合物的预测效果并不理想， 而且，由于所选参数的不定性，也不利于近一步揭示作用机理。随着进入环境中有 机物的种类及数量的逐渐增多，单一有机物的毒性作用机理、定量分析及预测等方 面的研究都有待进一步完善。 2 其次，有机物的联合毒性作用目前研究较少，且多采用等毒性混合方法，而实际生 活中复合有机物不仅是多组分更是变比例混合的，因此，混合物毒性变化规律及作 用机制有待于进一步开发。 3 现有工业废水排放较少考虑有机污染物的毒性影响，废水中所含的大量合成有毒有 机物一般难以被微生物所降解或完全去除，尽管这些污染物在水中浓度低，但毒性 危害大。而且，由于技术和经济原因，国内很少有对城市污水处理过程中的有毒物 质进行监测，我们应在评价现有处理工艺的基础上，力争能形成相应的废水毒性监 测方法从而有效的控制废水中有毒有机污染物的排放。 同时，仅依靠目前的监测方法及相关的环境标准难以使有机污染物得到有效的控 制。生物检测方法能客观真实的综合反映环境状况和污染对生态系统的影响，因而，在 有机污染物的控制和生态风险管理中应占据重要位置。而在生物检测法中发光细菌法因 其独特的生理特性、与现代光电检测手段完美匹配的特点而备受关注。 1 3 课题来源及研究内容 针对有机污染物研究现状的不足，科技部设立重大基础研究项目( n og 1 9 9 0 4 5 7 1i ) “区域水环境污染控制与修复原理”，该项目由清华大学环境科学与工程系承担，本研 究隶属该项目子课题“有毒有害污染物生态效应评价及其控制技术的开发”，将采用发 光细菌检测法进行有机污染物的毒性研究。 在众多有机物中，单环、多环芳香族化合物及其各种取代衍生物占有重要地位“， 这类有机物种类繁多，且大多对环境有较大危害，甚至对生物及人体产生致癌、致畸变 和致突变作用。目前有关此类化合物的测定及研究已有一些报道，但多不能较好地根据 郑州大学硕士学位论文 部分取代苯化台物对发光菌的急性毒性研究 所选模型参数解释作用机理，对同类化合物的预测效果也不太理想，因此，本研究在选 取受试化合物时，按照取代基的类犁、位置及取代基个数的不同选择了以下1 7 种取代 苯化合物：苯、苯胺、苯酚、氯苯、甲苯、硝基苯、对二甲苯、邻二甲苯、间二甲苯、 对苯二胺、邻苯二胺、间苯二胺、邻二氯苯、间二氯苯、对二氯苯、1 ，2 ，4 - 三氯苯、 对氯酚。 具体实验路线如下： 1 采用发光细菌法测定这1 7 种单一有机污染物毒性大小，按照取代基位置及个数 的不同进行定性分析，在此基础上，应用q s a r 方法对测定结果定量解析，建立 毒性模型，以便对同类化合物毒性进行预测。 2 在单一化合物毒性测定基础上，选取苯、苯酚、苯胺、硝基苯、对氯酚进行等毒 性的联合毒性研究，采用毒性加强系数法对其联合作用类型进行评价。在此基础 上进一步研究复合有机物变比例的联合毒性影响，选取苯胺+ 苯酚、硝基苯+ 对 氯酚、氯苯+ 苯胺、氯苯+ 苯酚、氯苯+ 对二氯苯5 组混合物进行变比例的联合毒 性研究，初步分析、评价混合物毒性的变化规律及影响因素。 3 当前，已有一些研究采用发光菌法测定及评价工业废水毒性，工业废水大多c o d 值较高而可生化性较差。其中，造纸废水由于含大量有机氯化物，不易生物降解， 因而处理过后的废水对环境仍有很大危害，但目前有关造纸废水的毒性影响报道 较少，因此，本研究最后将选取某造纸厂中段废水及某污水厂各处理工艺出水， 测定不同处理方法前后的毒性变化，评价处理工艺对毒性的去除效果。期望从生 物毒性角度和有机物的去除来优化或改进现有的处理工艺。 7 郑州大学硕士学位论文 部分取代苯化台物对发光菌的急性毒性研究 第二章实验及研究分析方法 2 1 发光细菌毒性测试方法介绍 发光细菌系低等微生物，位于生态系统食物链低营养级。发光现象是其正常代谢活 动，在一定条件下，发光强度是恒定的，与外来受试物接触后，其发光强度有所改变， 变化大小与受试物浓度有关。发光菌毒性测试法即是基于此原理，利用生物发光光度计 测定毒物的相对发光度，以此表示污染物的毒性水平。 本研究采用明亮发光杆菌t 3 小种( p h o t o b a c t e r i u mp h o s p h o r e u m ) 作为受试菌种。 明亮发光杆菌为发光杆菌属( p h o t o b a c t e r i u m ) ，在l b t 中应用较多，其最适温度为2 0 一3 0 ，p h6 - 9 ，基质为3 氯化钠溶液。 实验所用菌种为明亮发光杆菌t 3 小种冻干粉，所用毒性测定仪器为生物毒性测试 仪d x y - 2 型，均购自中国科学院南京土壤所。 明亮发光杆菌t 3 小种培养液组成如下： 酵母浸出汁05 9 ，胰蛋白胨0 5 9 ，氯化钠3 0 9 ，磷酸氢二钠o5 9 ，磷酸二氢钾0l g ， 甘油o 3 9 ，加蒸馏水至1 0 0 m l 。另加l6 9 琼脂粉可制成固体斜面。 一菌种的培养及毒性测试 1 冻干粉复苏 从冰箱2 - 5 室取出含有o 5 9 发光细菌冻干粉的安瓿瓶和2 的氯化钠溶液，用l m l 注射器吸取氯化钠0 5 m l 注入已开口的冻干粉安瓿瓶，充分混匀。2m i n 后菌种即复苏 发光( 可在暗室内检验，肉眼应见微光) 。之后将其转接到固体斜面上4 保存。实验前 从斜面上再转接到液体培养基中稀释成工作液，每毫升菌液应不低于1 6 万个细胞( 5m l 测试管) 或2 万个细胞( 2m l 测试管) ( 均为稀释平板法测定) 。在毒性测试仪上测出的 初始发光量应在6 0 0 1 9 0 0m y 之间，低于6 0 0m v 允许将倍率调至“x 2 ”档，高于1 9 0 0 m v 允许将倍率调至“x o 5 ”档。仍达不到标准者，更换冻干粉。 2 菌种培养 实验前，将一定量的菌种从固体斜面转接到液体培养基中，在2 0 ( 2 恒温振荡箱中培 养，转速为l o o r p m 。发光细菌世代周期为2 4 小时，实验测得发光菌的指数生长期为 6 5 h 一1 5 5 h 之间，处于这一时期的菌种发光稳定，易于测定。每次实验时，吸取一定量 已经培养好的菌液放入锥形瓶中，并加3 的氯化钠溶液稀释，使空白试样在毒性测定仪 中的读数介于6 0 0 - 1 8 0 0 之间。 郏卅l 大学母i 士学位论文 部分取代苯化台物对发光菌的急性毒性研究 3 毒性测试( e c 。值的测定) 本研究所测样品均为分析纯，以3 氯化钠溶液配成储备液。测定时各敷1 8 0 m i 样 晶加入2 m l 测试管，以1 8 0 r a l3 n a c l 溶液作为空白对比，菌液稀释搅拌均匀后取0 2 0 m l 于各测试管中，采角微型混合器使其混合均匀，并放入生物海性测定仪中，测定发光强 度。样品管与对比管发光度的比值即为相对发光率，将化合物浓度对数和相对发光率线 性回归，用直线内插法求出相对发光率为5 0 时所对应的化合物浓度，即为e g 。值( 单 位t o o l 1 ) ，一般用1 0 黛e c 5 0 表示。 2 2 有枧物联金毒性测定及谗份方法 a 类在生活和生产过程中，常常通过各种途径从食物、水和空气等按触多种环境化 学耪。环境中也往往是多种化学污染物同时并存。多种化学物作用于生物体时，与任何 一种单独作鞴时新产生酌毒性作淆都各不褶闻。它们在生物体肉往往呈蕊十分复杂的交 互作用，影响彼i 篼的啜收、分布、代谢转纯与毒注效应。因此，有格要对萁联合毒性进 行灞定和分析，为遗一步探讨其毒住作南辊理和采取防治对策打下基石毒。 一复台有机物及废水急性毒性的表达方式 1 羹接用对发光菌的抑制率表达，本实验中废水毒性的表达将采用此法。 2 采用样品的半数效应浓度e c ；。表达。 3 采用褥性参照物浓度表达样品毒性。 我国的标准方法中水质急性毒性承平常选用相当的参比毒物氯化汞浓度( 以m g 1 为单位) 来表征，但标准方法中选用的毒性参照物怂剧褥物质氯化汞，造成环境污染、 危害人t 拳健康。 本瀑题缀的实验硬究表明：器弛候选毒甥中，m n 。+ 对发光缨藏的海性搀划馋耀太小， 意援海戆积扔墓舞q 对发光细慧蛉毒性搀制l 乍用不太稳定嶷获愿撼准物的难度大。i l l z n 2 + 魏c u “具有易港、稳定、鬻见、价廉等优点，珏对环境影响较小，适台 乍为参照物。 比较z n z + 积c u ”，二考多次实验数掇的变异系数值接近，b 9 二者毒性稳定性基本提 月。但是槌对于e u 2 + 来说，z n 2 + 零身没有颇色，胡毽也接近7 ，所以选用z n 2 + 替 弋h g c l z 乍为毒性参照物更台逶。 困j 彗：，本实验中变比铡静联合毒性戮究帮分将采露该法来表示毒性a & g 在测定混合 物毒性时同瓣测褥z h ”的标准麴线，并鬟相应懿浓度表示混合物熬毒性大小- 二联合作鬻类登的评定 根据多种化学物同时作用于机体时所产生的毒性效应，可将化学物的联合作用分为 相加、协同、拮抗和独立四种作用。评价有机化台物的联合作用类型可有不同出发点， 一般敬其毒往终点进行评价。目前程毒理学实验中，一般采用比较预测e c s o 。坤和实铡 9 。 郑州大学硕士学位论文 部分取代苯化合物对发光菌的急性毒性研究 e c s o 。b s 的方法来判断两种或多种化学物联合作用类型。 1 毒性加强指数( t e i ) 法 以两种化学物的联合毒性作用为例，具体程序如下： ( i ) 分别测定a 、b 两个化学物的e c 5 。 ( 2 ) 将a 、b 按等毒性比例混合。即：根据单一组分的e c 5 0 计算出各自的加入量， 使每一组分对混合物毒性的贡献相同。 ( 3 ) 测定a 、b 混合物的e c 5 0 ( 4 ) 按下式求出混合物的预期e c ，。 1 一 ab1” e c 5 0 e x p 面互i 十趸瓦万十十面薯万 a 、b 、 、k 代表混合物中的各化合物。 式中a 、b 、n 分别为化学物a 、b 、n 在混合物中所占重量比。所以a + b + + n = 1 如预测e c s o 。口 实测e c ，o o b s，则t e i = 预测e c 5 。x p ，实测e c 出1 如预测e c 5 0 e x p 0 时为协同作用 t e i = 0 时为加和作用 t e i 0 时为拮抗作用 2 联合作用系数法 本法先求出各化合物各自的e c 5 0 值，并假设各化合物的联合作用是相加作用，从该 假设出发，计算出混合物的预测e c 5 0 。值，再通过实验求出实测混合物的e c 5 。o b 。值， 联合作用系数k = 混合物的预测e c 5 岫混合物的实测e c 5 0 0 b s 。混合物预期e c 5 0 。值计 算公式如前所述。如果混合物中的各化合物的联合毒性作