20170814 质粒构建流程.doc

20170814质粒构建流程武汉大学 Angelo一、引物设计1）取得目的基因序列，可选用数据库NCBI 2）软件分析目的基因可用酶切位点。使用primer5分析出序列不包含的酶切位点，即为可用酶切位点。 3）选择载体。根据转染细胞和实验室资源，选择合适载体。如pMSCV， 4）选择酶切位点。对照目的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点，选择二者共有的作为备选。载体上两个酶切位点的距离应有几十bp以上，选实验室常用酶切位点。 5）使用primer5设计目的基因引物，目的产物应包含从启动子到终止子前的全部碱基。 6）根据选择的酶切位点，查找对应的酶切位点保护碱基，将对应片段添加到设计的引物两端，注意酶切位点的前后顺序。一般选择三个保护碱基。 7）引物设计完成，送公司合成。 二、目的片段获取 方法一： 1. RNA提取 2. RNA反转录 获得目的片段 方法二：从韩家淮实验室索取（通常采用）具体流程：1、PCR扩增 PCR程序： 95 5min 95 30s 58 30s 72 延伸（根据基因片段大小设定时间） 35cycle 72 5min 22 保存 注：可根据不同基因调节退火温度，延伸时间，循环数。2、PCR产物纯化 1）根据PCR基因的大小配制1%-2%琼脂糖凝胶，放电泳槽里，点样并电泳10-20min2）割胶回收（产物电泳结果含杂带） 将含目的条带的琼脂糖凝胶切下（切得尽量小），放入1.5ml EP管。 加等体积（1g=1ml）GC buffer ,65水浴10min左右至胶溶解（溶液为淡黄色），混匀2min，进行试剂盒回收 溶液加入回收柱中，12000rpm离心，1min，废液倒回再离一次 弃废液，加500l washing buffer，离心12000rpm，1min 弃废液，加500l PW washing buffer，离心12000rpm，1min 空管离心12000g，2min，弃废液，柱子转移到新1.5ml EP管 加入30-50l elution buffer于硅胶膜上，室温孵育2min，离心13000g，1min标上基因名称，日期 电泳检测 三、载体和片段双酶切（分开酶切） 20l 反应体系如下片段： PCR纯化产物 16l FD buffer(10) 2l 酶A 1l 酶B 1l 反应条件：37水浴2h 加loading buffer（10）终止反应 注：buffer类别依使用的酶具体选择载体：载体质粒 大于1.5ug并补ddH2O至16ul FD buffer(10) 2l 酶A 1l 酶B 1l 反应条件：37水浴2h或以上 加loading buffer（10）终止反应 注：buffer类别依使用的酶具体选择四、载体酶切产物回收和纯化 片段一般不进行胶回收，只进行回收柱纯化1）一般配制1%琼脂糖凝胶，放电泳槽里，点样并电泳20-30min（琼脂糖凝胶配制： 琼脂糖凝胶（1%）30ml 琼脂糖粉 0.3g 1TAE 30ml 微波炉加热溶解，冷却一会儿后加入1l gold view核酸染料或溴化乙锭（有毒），混匀，倒板 ，插梭子。）2）割胶回收（产物电泳结果含从载体上切下来的杂带） 将含载体条带的琼脂糖凝胶切下（切得尽量小），放入1.5ml EP管。 加等体积（1g=1ml）GC buffer ,65水浴10min左右至胶溶解（溶液为淡黄色），混匀2min，进行试剂盒回收 溶液加入回收柱中，12000rpm离心，1min，废液倒回再离一次 弃废液，加500l washing buffer，离心12000rpm，1min 弃废液，加500l PW washing buffer，离心12000rpm，1min 空管离心12000g，2min，弃废液，柱子转移到新1.5ml EP管 加入30-50l elution buffer于硅胶膜上，室温孵育2min，离心13000g，1min 标上载体名称，酶切位点名称，日期 （片段同此相同）电泳检测五、连接 一般15l（20l） 连接体系：片段：载体=4:1=12.5ul（也要考虑到载体回收浓度） 10T4 buffer 1.5l T4 ligase 1l PCR仪中进行：22，1h（根据所连接上的片段大小进行选择连接时间） 4冰箱过夜保存或当天进行转化 注：连接产物-20可长期保存 六、转化 准备：碎冰，灭菌EP管、LB空液体培养基，带抗性培养板，超净工作台，移液枪，水浴锅加热42 1）将感受态细胞置于冰上，待其融化 2）超净工作台中，将连接产物10l 加入100l 感受态细胞，或质粒1-3l 加入100l 感受态细胞 3）轻混匀，冰浴30min 4）热击水浴42，90s，冰浴1min 5）加900l LB空培养基，摇菌80rpm，37，1h-2h 6）浓缩离心2500-3500rpm，2min，去清液留约200l 重悬管底菌体，涂板7）完全吸收后，37倒置培养12-16h 七、菌落PCR挑选阳性菌 1）挑单克隆菌落放入PCR体系中搅一下，再在新板划板（注意编号），每板挑10个菌。新划的板37倒置培养12-16h。2）以mix混合液（2）（含酶，Buffer，dNTP等）20l 体系配制菌落PCR反应液PCR程序： 95 5min 95 30s 58 30s 72 延伸（根据基因片段大小设定时间） 25-30 cycle 72 5min 22 保存 注：程序与DNA扩增一样 3）琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，记录含目的条带的菌落号备用。 八、测序 1. 摇菌 1）PCR检测有目的条带的菌落，挑选2-3个较好的以供摇菌 2）三角瓶中分装10ml LB抗性液体培养基 3）用10l 枪头挑起选择的菌落打到培养基中 4）37。250rpm摇菌12-16h 2. 送样 每瓶取1ml菌液，送华大基因测序 3. 比对 将测序结果与基因序列进行比对，比对正确则构建成功，比对错误则重新构建。 （注：数据库中基因序列可能有误，若出现少数突变，可换其他数据库比对试试） 九