（生物化学与分子生物学专业论文）狭叶松果菊中eac4h基因的克隆分析、原核表达载体的构建及前体添加物对其绿原酸积累的研究.pdf

摘要 詈e l i i i 一 一i l i i 曼i 曼曼量量曼曼曼鼍曼曼曼 狭叶松果菊中e a c 4 h 基因的克隆分析、原核 表达载体的构建及前体添加物对其绿原酸积 累的研究 生物化学与分子生物学专业硕士研究生冯巍 指导教师谈锋教授 摘要 狭叶松果菊( e c h i n a c e a a n g u s t i f o l i adc ) 是菊科( c o m p o s i m e ) 松果菊属( e c h i n a c e a ) 植物，原产美洲，是北美印第安人的传统草药。其主要活性成分为咖啡酸衍生物、烷基酰胺 类物质及多糖类物质。狭叶松果菊提取物具有增强机体免疫功能、抗各种感染、抗氧化、抗 肿瘤等作用，其疗效得到了越来越多的临床肯定，成为国际市场需求量最大的植物药之一。 狭叶松果菊中咖啡酸衍生物主要包括松果菊苷( e c h i n a e o s i d e ) 、菊苣酸( c i e h o r i ea e i d ) 、 洋蓟酸( c y m 瞳n ) 、咖啡酸( c a f f e i ea c i d ) 以及绿原酸( c h l o r o g e n i ea c i d ) 等，但含量极低。从上 世纪7 0 年代开始，人们开始尝试采用不同的方法提高目标次生代谢产物的含量，其中开展生 物合成代谢研究是提高次生代谢物中有效成分的方法之一。研究表明，咖啡酸衍生物的生物 合成是典型的苯丙烷代谢途径，尤其是绿原酸的生物合成途径已基本阐明。但在狭叶松果菊 中甚至松果菊属植物中咖啡酸衍生物的生物合成途径研究甚少，尤其是对此代谢途径上的关 键酶、限速酶基因的克隆、功能验证等尚未见报道。 本文以狭叶松果菊组培苗为材料，采用e d n a 末端快速扩增( r a p i da m p l i f i c a t i o no fe d n a e n d sr a c e ) 技术，首次从狭叶松果菊组培苗中分离克隆出苯丙烷代谢途径上的第二个关键酶 基因肉桂酸- 4 - 羟化酶( e i n n a m a t e4 - h y d o r x y l a s ec 4 h ) 基因( e a c 4 h 1 ) 的全长e d n a 及其同 源基因( 勖“册) 的全长e d n a ，并对其进行了相关研究。另外，首次通过培养基中添加前 体物对狭叶松果菊组培苗中绿原酸积累进行了研究。本文的主要研究内容及结果如下： 1 e a c 4 h 1 基因：利用r a c e 技术得到一个全长为1 6 7 2 b p 的e a c 4 h 1 基因的e d n a 序列 ( g e n b a n k 登陆号：e u 6 7 6 0 1 9 ) 。根据生物信息学分析该基因e d n a 含有一个1 5 1 8b p 的开 放阅读框( o r r 3 ，编码一个由5 0 5 个氨基酸残基组成的蛋白质；预测的分子量约为5 7 8 4 k d a ， 等电点q i ) 为9 1 5 。对该基因的氨基酸水平进行同源比对表明，e a c 4 h 1 蛋白与其它物种的 c 4 h 蛋白具有较高的同源性，并且具有细胞色素p 4 5 0 蛋白家族的保守区域。同时，成功构建 了p e t 3 2 a - c 4 h 1 原核表达载体，为进一步研究e a c 4 h 1 蛋白的原核表达、纯化及功能研究奠 定了基础。 西南大学硕士学位论文 2 e a c 4 h 2 基因：在克隆e a c 4 h 1 基因的过程中，得到了其家族同源基因e a c 4 h 2 ( g e n b a n k 登陆号：e u 8 5 3 3 0 4 ) 。该基因的e d n a 序列全长为1 6 7 6 b p 。根据生物信息学分析该基因e d n a 含有一个1 5 1 8b p 的开放阅读框( o r , r 3 ，编码一个由5 0 5 个氨基酸残基组成的蛋白质：预测的 分子量约为5 7 7 8 k d a ，等电点i ) 为9 1 6 。对该基因的氨基酸水平进行同源比对表明，e a c 4 h 2 蛋白与其它物种的c a i - i 蛋白具有较高的同源性，并且具有细胞色素p 4 5 0 蛋白家族的保守区域。 3 前体添加物对狭叶松果菊中绿原酸积累的研究：通过向狭叶松果菊组培苗的培养基中 添加不同浓度的苯丙氨酸( 0 、5 、1 0 、2 0 、3 0 r a g l ) 和酪氨酸( 0 、5 、l o 、2 0 、3 0 r a g l ) ，培 养3 0 天后，用反相高效液相色谱法( r p 砌l c ) 测定不同处理下整株组培苗中绿原酸的含量 表明，苯丙氨酸和酪氨酸的添加都对狭叶松果菊中绿原酸的积累有影响：苯丙氨酸在添加浓 度为3 0 m g l 时，绿原酸的积累量最高，达到9 7 3 8 7m e m e ，而酪氨酸在添加浓度为5 m g l 时， 绿原酸的积累量最高，达到8 8 7 5 0 m e d m l 。 关键词：狭叶松果菊肉桂酸- 4 一羟化酶基因克隆载体构建前体添加物 绿原酸 i i a b s t r a c t m o l e c u l a rc l o n i n g ，c h a r a c t e r i z a t i o na n dp r o k a r y o t i c e x p r e s s i o nv e c t o rc o n s t r u c t i o no fe a c 4 h f r o m e c h i n a c e a a n g u s t i f o l i a dca n ds t u d i e so i lt h e a c c u m u l a t i o no f c h l o r o g e n i c a c i di n d u c e d b y p r e c u r s o r s p o s t g r a d u a t eo fb i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l a rb i o l o g y ：w e if e n g s u p e r v i s o r ：p r o f f e n gt a n a b s t r a c t e c h i n a c e a a n g u s a f o l mdcw h i c hi sn a t i v et on o r t ha m e r i c a ni sat r a d i t i o n a li n d i a n s h e r b t h em a i na c t i v ec o m p o u n d so fe a n g u s t i f o l i aa r ea l k a m i d e s ，p o l y s a c e h a r i d e s ，e a t f e i ca c i dd e r i v a t i v e sa n ds o0 1 3 - s i n c ee a n g u s t i f o l i ap r e p a r a t i o n sh a v em a n ye f f e c t ss u c h 锄 i m m u n o s t i m u l a t i o n ，a n t i m i e r o b i a l ，a n t i o x i d a n t , a n t i t u m o r , i th a sb e e no i l eo ft h em o s td e m a n df o r i n t e r n a t i o n a lm a r k e t t h ec a f f e i ca c i dd e r i v a t i v e so f e a n g u s t i f o l i am a i n l y i n c l u d ee c h i n a c o s i d e ，c i c h o r i c a c i d , c y n a r i n , c a f f e i ca e i d , c h l o r o g e n i ca c i da n ds oo n , b u tt h ec o n t e n ti sv e r yl o w p e o p l eh a v e 埘e d t ou s eal o to f m e t h o d st op r o d u c tu s e f u ls e c o n d a r ym e t a b o l i t es i n c e1 9 7 0 s b i o s y n t h e s i sp a t h w a yi s an e wm e t h o dt og a i nt h eu s e f u lc o m p o n e n t s r e c e n t l y , t h er e s e a r c hs h o w st h a tt h eb i o s y n t h e s i so f e a f f e i ca c i dd e r i v a t i v e si st y p i c a l l yp h e n y l p r o p a n o i dp a t h w a y , e s p e c i a l l yt h eb i o s y n t h e s i sp a t h w a yo f c h l o r o g e n i ca c i dh a sb e e nk n o w nc l e a r l y h o w e v e r , f e wg e n e so fk e ye n z y m eo rr a t e l i m i t i n g g l l z y l i l ei nt h i sp a t h w a ya r ec l o n e da n df u n c t i o ni d e n t i f i c a t i o n i nt h i sp a p e r , t h eg e n ec i n n a m a t e4 - h y d o r x y l a s e ( d e s i g n a t e de a c 4 h 1 ) a n di t sh o m o l o g o u sg e n e ( d e s i g n a t e de a c 4 h 2 ) w h i c ha r et h es e c o n ds t e pk e ye i z y m ei np h e n y l p r o p a n o i dp a t h w a ya r ef i r s t l y i s o l a t e df r o mt i s s u ec u l t u r es e e d l i n go fe a n g u s t i f o l i ab yr a p i da m p l i f i c a t i o no fe d n ae n & ( r a c e ) t e c h n i q u e c h a r a c t e r i z a t i o n , f u n c t i o n a lp r e d i c t i o na n dc o n s t r u c t i o n o ft h et w on o v e lg e n e sa l e s t u d i e d i na d d i t i o n ，t h i sp a p e rd o e st h er e s e a r c h0 1 3t h ea c c u m u l a t i o no fc h l o r o g e n i ca c i db yu s i n g t h em e t h o do fp r e c u r s o r sf e e d i n g t h em a i nr e s e a r c ha s p e c t sa r e 雒f o l l o w s ： 1 e a c 4 h ig e n e ：t h ef u l l - l e n g t he d n as e q u e n c eo fe a c 4 h ii sc l o n e db yu s i n gr a c e t e c h n i q u e a c c o r d i n gt ot h ea n a l y s i so fb i o i n f o r m a t i c s ，t h ef u l l l e n g t he d n ao f e a c 4 h 1 ( g e n b a n ka c c e s s i o n ： e u 6 7 6 0 1 9 ) i s1 6 7 2 b p c o n t a i n i n ga1 5 1 s b po p e nr e a d i n g 丘锄e ( o r f ) e n c o d i n gap e p t i d eo f5 0 5 a l n i l l oa c i d sw i t hac a l c u l a t e dm o l e c u l a ri t i 嬲so f5 7 8 4 k d aa n da l li s o e l e e t r i ep 0 硫o f9 1 5 i i l 西南大学硕士学位论文 曼曼皇曼寰i , , qi -=1it 曼詈葛 c o m p a r a t i v ea n db i o i n f o r m a t i ca n a l y s i sr e v e a l st h a te a c 4 h ip r o t e i nh a se x t e n s i v eh o m o l o g y w i t h c 4 h sf i - o mo t h e rs p e c i e sa n dc o n t a i n sc o n s e r v e dr e s i d u e so w n e db yt h ec y t o c h r o m ep 4 5 0p r o t e i n f a m i l y m o r e o v e r ，p r o k a r y o t i ee x p r e s s i o nv e c t o ro fp e t 3 2 a - c 4 h 1 i sc o n s t r u c t e ds u c c e s s f u l l y ， w h i c hi st h ef u n d a m e n t a lw o r kf o re a c 4 h1p r o t e i n se x p r e s s i o n ，p u r i f i c a t i o n ，f u n c t i o n a lr e s e a r c h 2 e a c 4 h 2g e n e ：t h ee d n a s e q u e n c eo fe a c 4 h 2 ( o e n b a n ka c c e s s i o n ：e u 8 5 3 3 0 4 ) i so b t a i n e d w h i l ee a c 4 h 1i s c l o n e d a c c o r d i n gt ot h ea n a l y s i so fb i o i n f o r m a t i c s ，t h ef u l l l e n g t he d n ao f e a c 4 h 2i s 16 7 6 b p ，c o n t a i n i n ga1 51g b po r fe n c o d i n gap e p t i d eo f5 0 5a m i n oa c i d sw i t ha c a l c u l a t e dm o l e c u l a rm a s so f5 7 7 8 k d aa n da ni s o e l e c t r i cp o i l l to f9 1 6 c o m p a r a t i v ea n d b i o i n f o r m a t i ea n a l y s i sr e v e a l st h a te a c 4 h 2h a se x t e n s i v eh o m o l o g yw i t hc 4 h sf r o mo t h e rs p e c i e s a n dc o n t a i n sc o n s e r v e dr e s i d u e so w n e db yt h ec y t o c h r o m ep 4 5 0p r o t e i nf a m i l y 3 s t u d i e so nt h ea c c u m u l a t i o no fc h l o r o g e n i ca c i di n d u c e db yp r e c u r s o r s ：a d d i n gd i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o no f p h e n y l a l a n i n eo rt y r o s m et ot h em e d i u mf o rt i s s u ec u l t u r es e e d l i n go f e a n g u s t i f o l i a , t h e yb o t hh a v ee f f e c to nt h ea c c u m u l a t i o no fc h l o r o g e n i ca c i db yr p h p l c t h er e s l u l t ss h o wt h a t t h ec o n t 铡to fc h l o r o g e n i ca c i di sh i g h e s t ( 9 7 3 8 7m g 砒，a n d8 8 7 5 0 m g m lr e s p e c t i v e l y ) w h e nt h e a d d e dc o n c e n t r a t i o no f p h e n y l a l a n i n ei s3 0 m g lo rt y r o s i n ei s5 m g u k e yw o r d s ：e c h i n a c e a a n g u s t i f o l i a ； c i n n a m a t e 4 - h y d o r x y l a s e ；c l o n i n g ； p r o k a r y o f i ce x p r e s s i o nv e c t o rc o n s t r u c t i o n ；p r e c u r s o r ；c h l o r o g e n i c a c i d i v 缩略词表 缩略词表 5 5 西南大学硕七学位论文 独创性声明 学位论文题目：迭吐整墨蕴圭丝鲻基圈鲍壶隆佥堑：愿拯蠢达 惑篮的抱瘦区煎签鋈拉堑盘基錾屡堕塑墨的盟窒 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加 了标注。 “ 学位论文作者：吗熬签字日期：加叩年l - 月砂日 学位论文版权使用授权书 。本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生部可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 学位论文作者签名：玛纨 签字日期：如哆年 月砂日 月了日 第1 章文献综述 第1 章文献综述 1 1 植物次生代谢基因工程研究概况 1 1 1 植物次生代谢产物的概念及其类型 植物次生代谢产物指从初生代谢产物经不同的生物代谢途径生成的一系列不同的中间 或最终产物，这些化合物并非生物有机体或细胞生长繁殖所必需，但对于植物自身在复杂环境 中的生存和发展却起着不可替代的作用，其产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期 的特异性。例如，吲哚乙酸、赤霉素直接参与生命活动的调节；木质素为细胞次生壁的重要组 成成分；叶绿素、类胡萝卜素等萜类物质作为光合色素参与光合作用过程等【l l 。植物次生代谢 产物种类繁多，应用广泛，除了药用成分外，有的还可用于生产染料、杀虫剂、食品的调味 剂、香料和工业原料等。因此，对植物次生代谢进行遗传改良，以培育能够大量合成和积累 目标次生代谢物的植物品种，受到愈来愈多的关注。植物次生代谢物的化学生态学功能及其 对农产品品质的影响也倍受关注。植物次生代谢调控的生物化学、分子生物学和基因工程研 究已成了当今国际生物界十分活跃的前沿研究领域【2 】。 植物次生代谢产物种类繁多，结构迥异。包括酚类、黄酮类、香豆素、木质素、生物碱、 糖类、萜类、甾类、皂苷、多炔类和有机酸等，目前其分类方法主要有加下三种：根据化 学结构不同，分为酚类、萜类和含氮有机物等1 3 】；根据结构特征和生理作用不同，分为抗生 素( 植保素) 、生长刺激素、维生素、色素、生物碱与植物毒素等：根据其生物合成的起 始分子不同，分为萜类、生物碱类、苯丙烷类及其衍生物等三个主要类型。 1 1 2 植物次生代谢产物的合成途经及调控 1 1 2 1 植物次生代谢产物的合成途径 植物次生代谢产物的合成途径主要有苯丙烷代谢途径、异戊二烯代谢途径和生物碱合成途 径等。 苯丙烷类代谢途径【4 】是指从苯丙氨酸到羟基肉桂酸( 或香豆酸) 及其衍生物的合成途径，该 途径广泛存在于植物中。在该代谢途径中，苯丙氨酸经过多次酶促反应，可分别合成水杨酸、 呋喃香豆素、绿原酸、木质素、芪、原色酮、类黄酮( 包括黄烷酮、黄烷醇、花青素苷等) 和异黄酮等多酚类次生代谢物5 1 ，酚类合成代谢途径见图1 - 1 1 6 】。研究表明，在大多数植物苯丙 烷类化合物代谢途径中包含两个基本途径，即莽草酸( s h i k i m i ca c i d ) 途径和丙二酸( r r 谢o r n c a c i d ) 途径门。莽草酸途径主要参与高等植物的苯丙烷类代谢，丙二酸途径则为真菌或细菌的合 成途径。在高等植物体中，通过莽草酸途径可将赤藓糖一4 一磷酸( 磷酸戊糖途径) 与磷酸烯醇式 丙酮酸( 糖酵解途径) 结合经中产物莽草酸( 故名为。莽草酸途径”) 转化为芳香族氨基酸一苯 丙氨酸和酪氨酸。这两种芳香族氨基酸为苯丙烷类化合物生物合成的起始分子。 西南大学硕士学位论文 异戊二烯代谢途径可分别合成包括激动素、赤霉素、类胡萝卜素、甾醇、叶绿索等在内 的单萜、倍半萜、二萜和多萜等次生代谢物【8 1 。在异戊二烯代谢途径中，由乙酰c o a 反应而 生成的异戊烯焦磷酸( i s o p e n t c n y ld i p h o s p h a t c ，口p ) 可进步合成香叶基焦磷酸( g e t a n y d i p h o s p h a t e ，g p p ) 、法尼基焦磷酸( f a m e s l yd i p h o s p h a t e ，f p p ) 和叶基香叶基焦磷酸( g e r a n y l g e r a n y l d i p h o s p h a t c ，c k 3 p p ) ，后者分别在单萜环化酶、倍半萜环化酶和二萜环化酶的催化作用下被分 别环化成单萜、倍半萜和二萜次生代谢物：由f p p 也可进一步合成鲨烯和甾醇及多萜次生代 谢物。植物i p p 的合成有两条不同的途径。一条是由乙酰, c o a 经过甲羟戊酸合成，该途径合 成的i p p 主要用于合成甾醇、倍半萜和三萜次生代谢物【8 】；另一条i p p 合成途径是卜脱氧一木 酮糖- 5 - 磷酸合成支路，该途径合成的i p p 主要用于合成质体中的二萜、单萜、类胡萝卜素、 异戊二烯等次生代谢物【9 】 植物生物碱中萜类吲哚生物碱、苄基异喹啉生物碱、莨菪碱和烟碱、嘌呤生物碱等均有 其特定的生物合成途径吲哚生物碱含有吲哚环和次番木鳖苷( s e c o l o g a n i n ) ，由香叶醇合成 的次番木鳖苷和色胺在异胡豆苷合酶( s t r i c t o s i d i n es y n t h a s e ，s t r ) 的催化作用下可合成萜类吲 哚生物碱的共同合成前体异胡豆昔( s t r i c t o s i d m c ) ，再由异胡豆苷进一步合成长春碱等多种吲 莽草奠途径 上 芥子油营+ 幸丙氯奠 卜氯觏_ 取队u 内桂破 l 甓和i 冉桂卅空基化h c 4 x ) r1 蔑一4 妞簟l 囊啡馥卜本黯素 譬豆- 沁o 撒- i ( 4 c l )l 童尔一舍栅c m s )量曩 i- 0 膏尔酮还赢蠢( c h r ) 0 蠢尔一异相- 瓢c h l ) i 鼻如塞塑：1 2 1 至苎型塑! 坚旦_ 一咖 l 异冀一台应_ c r 瑙， 异；胃j 堕晤生点噬匿薹簦整曼笾女! ! k 再度烯基化异黄靛) _ 弃土_ 立墅型啦垡塑型趔卫 卜一舍黼t 簟擅蠢 图卜1 酚类主要代谢途径1 6 1 f i g u r e1 1 m a i nm e t a b o l i cp a t h w a yo f p l a n tp h e n o l s 哚类生物碱；酪氨酸在酪氨酸多巴脱羧酶( t y r o s i n e d o p ad c c a r b o x y l a s e ，t y d c ) 催化作用下转化 为多巴胺和4 一羟基一苯乙醛，多巴胺和4 一羟基一苯乙醛进步缩合，生成苄基异喹啉生物碱合成 2 第1 章文献综述 的主要前钵( s ) - n o r c o c l a u r i n e ，再进一步合成各种苄基异喹啉生物碱：烟碱和莨菪碱等生物碱生 物合成起始于鸟氮酸或精氨酸脱羧反应，在鸟氨酸或精氨酸脱羧酶催化作用下，均脱羧合成腐 胺，再在腐胺n 一甲基转移酶的催化作用下合成n 一甲基- 4 - 氨基一丁醛并快速转化为卜甲基一一 吡咯啉正离子，后者进一步分别转化为烟酸和托品酮，其中托品酮在托品酮还原酶i 和托品酮 还原酶催化作用下，分别合成平一托品和托品，托品与来自于苯丙氨酸的托品酸反应，合成东 莨菪胺，在东莨菪胺羟基化酶催化作用下进一步羟基化，相继生成6 一b 一羟基一东莨菪胺和东莨 菪胺等生物碱f 1 0 1 1 1 2 2 植物次生代谢调控 代谢频道：植物次生代谢物的合成途径通常是以不同类别的次生代谢物合成途径为单位 即代谢频道( m e t a b o l i cc h a n n e l ) h i 的形式存在。不同代谢频道分布在植物不同的器官、组织、 细胞或细胞内不同的细胞器即分隔( c o m p a r u n e n t ) 内，不同代谢频道的数量性状位点可能分布在 不同的染色体上【1 2 ”】，它们受发育进程的调控，分别在植物不同发育阶段启动，也可以受不 同的诱发因子作用而启动。特定代谢频道的启动及其相关的特定次生代谢物的合成由代谢频 道中的关键酶的表达来决定，而合成量则取决于限速酶的表达情况。其中的关键酶或限速酶 往往是多基因家族编码的同功酶中的特定成员，负责特定次生代谢物的合成。代谢频道内的 有关酶可以以多酶复合体的形式存在于细胞内的不同部位并可协同表达，代谢频道内的多个 酶活性的协同提高，可显著地提高次生代谢物的产量1 1 4 1 。苯丙烷中央代谢途径n 5 】、类黄酮1 6 1 和异黄酮合成支路1 1 7 1 均以代谢频道存在。例如，养麦细胞中苯丙氨酸裂解酶( p h e n y l a l a n i n e a m m o n i a - l y a s e ，p a l ) 和查尔酮合成酶( c h a l c o n es y n t h a s e ，c h s ) 等酶线形排列，通过与内质网膜上 的膜蛋白肉桂酸一4 _ 羟基化酶( c r a t e4 - h y d r o x y l a s e ，c 4 h ) 和黄烷酮一3 一氢氧化酮酶( f l a v a n o n e 3 - h y d r o x y l a s e 。f 3 h ) 松散的联系而分布在细胞质中1 1 8 】；拟南芥细胞中的c h s 、查尔酮异构酶 ( c h a l c o n ei s o m e r a s e ，c h i ) 、f 3 h 和二氢黄酮醇还原酶( d i h y d r o k a c r n p f e v o l4 - r e d u c t a s e , d f r ) 之间 相互联系，这些酶在空间上呈现球形排列，c h s 不仅与c h i ( 均与内质网膜相互联系) 相连， 而且还与f 3 h 和d f r 相连，在这些多酶复合体中，f 3 h 、c a h 、阿魏酰- 5 - 羟基化酶等细胞 色素p 4 5 0 酶多充当细胞膜“锚”的作用，将相关的酶组装固定在内质网膜上这些酶组成代谢 频道【1 9 o l 。植物异戊二烯代谢途径中也存在代谢频道。例如，番茄果实甾醇和胡萝卜素的合 成分别由不同的3 一羟甲基戊二酰一c o a 还原酶( h y d r o x y m e t h y l g l u t a r y l - c o ar e d u c t a s e ，i 珈g r ) 等 位基因所控制【2 1 】在植物细胞中，生物碱长春多灵生物合成过程分别在细胞质、液泡、液泡膜、 内质网膜、类囊体膜等5 个以上细胞分隔区内完成；苄基异喹啉生物碱的合成途径中除了小 擘碱桥酶外，其它主要酶均依赖于细胞色素p 4 5 0 、位于内质网膜或内质网延伸膜分隔内阎 次生代谢物生物合成“代谢频道”的存在，有效地隔离了次生代谢物合成过程的中间产物 在细胞内扩散，有利于底物与酶的有效结合和酶促反应的顺利进行，减少次生代谢途径中不同 支路之间争夺底物的现象及有毒中间产物对细胞的伤害，并使细胞内多种类型次生代谢物的 3 西南大学硕士学位论文 置1 1 - -ii i i - - 一, i i , 舅舅曼舅 合成途径得以同时存在 2 3 】 次生代谢物合成的调控：植物次生代谢物合成途径中关键酶的分离及其基因的克隆是植 物次生代谢酶促反应机制研究的基础。近年来，植物次生代谢物合成途径中有关酶的基因克 隆及其分子生物学研究倍受重视，已克隆了许多有关基因。植物次生代谢物合成途径中的酶 依其底物专一性程度可分为两种类型，一种类型是催化合成具有次生代谢物特定立体结构基 本骨架( b a s i cs k e l e t o n ) 的专一性酶。如苯丙烷代谢途径中的p a l 、c h s 、类固醇硫酸酯酶( s t e r o i d s u l f a t a s e ，s t s ) 、异黄酮合成酶( i s o f l a v o n es y n t h a s e ，i f s ) 等以及生物碱合成途径中的小擘碱 桥酶、氧甲基转移酶等属于这种类型。第二种类型酶负责第一种类型酶催化反应的产物进一 步修饰反应，如羟基化酶、脱氢酶和单氧化酶等。这些酶对其底物基团的置换方式的专一性 程度不高，这可能是导致植物组织往往合成一系列相关次生代谢物的主要原因之一【2 引。 特定植物次生代谢物合成与积累量取决于其合成途径中的限速酶，它们在植物次生代谢 物生物合成途径中往往位于代谢支路分叉口或位于次生代谢物合成途径的下游，负责催化合 成次生代谢物一般合成前体。例如：p a l 、c 4 h 、4 一香豆酰- c o a - 连接酶( 4 - e o u m a r a t ec o c n z y m e a l i g a s e ，4 c l ) 是苯丙烷类代谢途径中的关键酶，也是合成途径中的限速酶，它们在植物苯丙烷 次生代谢物合成途径中位于代谢之路的分叉口或位于次生代谢物合成途径的下游，负责合成 苯丙烷类次生代谢物的一般合成前体芦1 。 次生代谢转录因子：特定次生代谢物合成与否、合成量的多少是植物在发育调控下及 各种生物或非生物诱发因子的诱导作用下，由其合成途径( 代谢频道) 中的多个酶活性表达所 共同作用的，受诱发因子诱导下的信号传递、转录因子活性、重要合成基因( 关键酶、限速酶) 表达等多个环节的影响。其中转录因子与次生代谢物合成有关结构基因结合，激活其表达是 次生代谢物合成途径( 代谢频道) 启动前的重要分子事件，它不仅决定特定次生代谢物合成、 积累量的多少，还决定次生代谢物合成的时间、空间分布以及对环境条件的响应【2 钔。 1 1 3 植物次生代谢基因工程策略 随着对植物次生代谢网络的研究和认知的深入，以及分子克隆和遗传转化技术的飞速发 展，应用基因工程对植物次生代谢途径的遗传特性进行改造，即植物次生代谢基因工程的研 究日益增多，已发展为具有广阔应用前景的热点研究领域1 2 5 1 。迄今，已建立的植物次生代谢 途径基因修饰的策略主要有： 导入单个、多个靶基因( 例如编码目标途径限速酶的基因) 或个完整的代谢途径。使 宿主植物合成新的目标物质。例如，强化转基因植物中与生物碱合成有关的t y d c 和酪氨酸 脱羧酶( t y r o s t n ed e c a r b o x y l a s e ，t d c ) 基因的表达，可减少吲哚芥子油苷的含量增加吲哚生 物碱的含量【捆。将长春花的t d c 连接组成型启动子再转入到长春花中，转基因长春花中色胺 的含量有显著增加【2 7 3 ，将长春花中t d c 和s t r 的嵌合基因连接组成型启动子再转入长春花， 转基因长春花培养细胞中萜类吲哚生物碱含量有所提高( 2 9 】 4 第1 章文献综述 通过反义r n a 或r n a 干涉等技术减少靶基因的表达，从而抑制竞争性代谢途径，改 变代谢流方向和增加目标物质的含量例如，通过反义基因技术，可降低饲料和树木中木质素 含量，从而提高饲料的饲用价值和木材的造纸质量和效益f 2 9 1 。通过咖啡酰辅酶a - o 甲基转 移酶( c a f f e o y lc o c n z 3 q n e a - 3 - o - m e t h y l t r a n s f e ：i a s e ，c c o a o m t ) 反义基因的遗传转化，有效 地降低了转基因烟草中木质素含量【3 0 1 。 对控制多个生物合成基因的转录因子进行修饰，更有效的调控植物次生代谢以提高特定 化合物的积累。例如：将从长春花中分离得到的荣莉酸诱导型的a p 2 区域转录因子o r c a 3 基因在长春花中组成型表达，使生物碱合成途径中的酶的表达增强，导致了萜类吲哚生物碱 合成量的提高p 1 1 。 1 2 松果菊中咖啡酸衍生物及相关合成酶基因肉桂酸- 4 - 羟基化酶概述 松果菊原产美洲，是印地安人的传统草药，被用作治疗外伤、蛇咬、头痛及感冒已有上 百年的历史3 2 1 在北美、欧洲、等地被广泛用于治疗上呼吸道感染及提高免疫力【3 3 】。其提取物 具有明显的抗氧化蚓和免疫抑制作用【3 3 1 。在已知的松果菊属植物中，狭叶松果菊( e a n g u s t i f o l i ad c ) 、淡紫松果菊( ep a l l i d a ( n u _ t t ) ) 和紫花松果菊( ep u r p u r e a ( l ) ) 三种具 有药用价值3 5 1 研究表明，其主要活性成分为咖啡酸衍生物、烷基酰胺类物质和多糖类物质 r 3 6 】 1 2 1 松果菊中的咖啡酸衍生物概述 表1 - 1 咖啡酸衍生物名称 t a b l e1 1t h en a n l eo fc a f f e i ca c i dd e r i v a t i v e s 化合物名称化合物名称 绿原酸( c h l o r o g e n i ca c i d ) 菊苣酸甲酯 咖啡酸( c a f f e i ca c i d ) d _ 鼠李糖毛蕊糖苷 菊苣酸( c i c h o r i ca c i d )2 一氧一咖啡酰基一3 一氧一阿魏酸酒石酸 洋蓟酸( c y m r i n )咖啡酸乙酯 松果菊苷( e c h m a c o s i d e )3 一丙二酰葡萄糖洋蓟苷 单咖啡酰基酒石酸( c a f t 硎ca c i d )2 一氧代一阿魏酰基酒石酸 毛蕊糖苷( v e r b a s c o s i d e ) 2 3 一氧一双阿魏酰基酒石酸 异绿原酸( i s o c i c h o r i ca c i d )2 一氧一咖啡酰基一3 一氧一香豆酰基酒石酸 6 - 0 - 咖啡酰松果菊糖苷( 6 - o - e a f f e o y l - e c h i n a c o s i d e ) 2 一氧一咖啡酰基- 3 - 氧一阿魏酰基酒石酸 2 。3 一氧一双- 5 o 一2 羰基一1 3 ( 3 ，4 一双羰基苯基) 一乙基卜2 一氧一咖啡酰基- 3 - 杨一 5 - o 一羰基一i b ( 2 4 - 双羰基苯 咖啡酰基酒石酸基) 一乙基卜咖啡酰基) 酒石酸 松果菊中的咖啡酸衍生物：具有较高的抑制h i v 1 整合酶的活性p 7 3 引。从松果菊属中分 西南大学硕士学位论文 离鉴定的咖啡酸类衍生物【3 9 t 删见表1 - 1 1 。2 1 1 绿原酸( c h l o r o g e n i c a c i d c h a ) c h a 是由咖啡酸( c a f f e i ca c i dc a ) 与奎尼酸( q u i n i ca c i d ) 组成的缩酚酸，异名咖啡单宁 酸，化学名3 一o - 咖啡酰奎尼酸( 3 - o - c a f f e o y l q u m i ca c i d ) ，分子式：c - sh ，。瞻，分子量：3 5 4 3 0 ， 是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙烷类化合物。 c h a 的半水合物为白色或微黄色针状结晶，在1 1 0 1 2 时变为无水物，与稀盐酸共热产生 咖啡酸，熔点2 0 8 1 2 ，比旋光度 a d - - 3 5 2 。( c = 2 1 8 ) 。c h a 在2 5 c 时水中溶解度约为4 ，易 溶于乙醇、丙酮、甲醇等极性溶剂，微溶于乙酸乙酯，难溶于氯仿、乙醚、苯等亲脂性有机 溶剂。c h a 是由咖啡酸与奎尼酸形成的酯，其分子结构中有酯键、不饱和双键及多元酚三个 不稳定部分。在从植物提取过程中，往往通过水解和分子内酯基的迁移而发生异构化。由于 c h a 的特殊结构，决定了其可以利用乙醇、丙酮、甲醇等极性溶剂从植物中提取出来，但是 由于c h a 本身的不稳定性，提取时不能高温、强光及长时间加热。c h a 的供试液放置于棕色 瓶、冰箱( 2 ) 保存时最为稳定。 图1 - 2 绿原酸生物合成途径伽 f i g u r e1 - 2t h ep a t h w a yo fc h l o r o g e n i ca c i db i o s y t t t h e s i s 绿原酸是一种重要的生物活性物质，具有抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝利胆、抗肿 瘤、降血压、降血脂、清除自由基和兴奋中枢神经系统等作用1 4 1 1 同时，绿原酸是一种新型高 效的酚型天然抗氧化剂，在某些食品中可取代或部分取代目前常用的人工合成的抗氧化剂嗽l ； 由于绿原酸具有抗氧化作用，它可以保护胶原蛋白不受活性氧等自由基的破坏并能有效防止 紫外线对人体皮肤的伤害作用。现在已有多项关于添加绿原酸用于抗脲酶化妆品、防止紫外 线、皮肤防晒剂以及染发剂对头发损伤的欧洲专利【4 3 】 植物中c 姒的生物合成包括了一系列的酶促反应。其生物合成途径如图1 - 2 4 5 l 1 2 1 2 菊苣酸( c i c h o r i ca c i d ) 菊苣酸，化学名( 2 r ，3 r ) 一2 ，3 一双 ( e ) 一3 一( 3 ，4 一二羟基苯基) 丙一2 一烯酰 氧 丁二酸，分子 式为c ：2 h - | 0 m 分子量4 7 4 3 7 。其晶体呈丝状，针型。熔点为2 0 6 c 。天然菊苣酸旋光度为 【a 】+ 3 8 3 5 。( m e o h ，c ：1 5 5 5 m o i 1 ) 。易溶于乙醇、甲醇、二恶烷和丙酮，微溶于乙酸乙酯和 6 第1 章文献综述 醚，不溶于轻石油、苯和氯仿，易溶于热水，但在温度为2 0 c 时，仅有0 5 可溶m 】。 菊苣酸具有增强免疫功能、抗炎作用，并能抑制透明质酸酶，保护胶原蛋白免受可导 致降解的自由基的影响，具有抑制h - 1 和h i v - 1 整合酶的作用【4 兀。 1 2 1 3 松果菊苷( e c h i n a c o s i d e ) 松果菊苷，异名紫锥菊苷。分子式为c 3 5 h 4 6 0 2 0 ，分子量7 8 6 7 3 无定形粉 末， a d 2 2 - 3 9 6 。( c = 1 1 ，甲醇) 。熔点1 3 6 - 1 4 0 c ，易溶于甲醇、水。 松果菊苷具有抗肿瘤、壮阳和抗衰老，抗氧化游离基、抑制脂质过氧化，治疗糖尿病相 关疾病，缓解精神紧张症，抑制辜酮5 a - 还原酶作用f 4 钔。近年研究表明，松果菊苷还具有抗 s h s y 5 y 神经元凋亡、抗衰老、改善学习记忆等神经保护作用1 4 9 1 。 1 2 2c 4 h 概述 c 4 h 是一种研究比较广泛的p 4 5 0 单加氧酶，该酶由r u s s e l l 和c 0 姗【5 0 】首次从豌豆芽中发