（生物化学与分子生物学专业论文）漆酶基因在毕赤酵母中高效表达.pdf

漳酶基因在毕赤酵母中高效表达 摘要 根据真菌漆酶铜结合区保守的氨基酸序列设计简并引物，扩增t r a m e t e ss d 4 2 0 基因组，结合长距离反向p c r ( l 叫p c r ) ，成功获得薪型漆酶同工酶基因l a c e 。克 隆得到的肠f e 宇列长2 7 1 7 b p ，包括完整的结构基因( 2 1 3 0 b p ) 、5 - 和3 - 非编码区。根 据已得到的t r a m e t e ss p a h 2 9 2 l a c b 和t r a m e t e ss d 4 2 0 l a c a 、l a c b 、a c c 、a c d 、a c e 6 条漆酶基因的d n a 序列，设计特异引物，以逆转录产物为模税扩增得到相应基因 的e d n a 序列。序列分析结果表明，这- z 出c d n a 序列长度在1 5 6 0 1 5 7 8 b p 之问，与其 它不同来源的真菌漆酶e d n a 具有较高的一致性( 5 0 ) 。基于e d n a 推导的氨基酸 序列中均含有保守的l o 个h i s 残基和1 个c y s 残基，且酶分子中含有多个潜在的n 糖 基化位点 将t r a m e t e ss p a h 2 8 - 2 a c b 、t r o m e t e ss p 4 2 0i a e c 克隆到表达质粒p p i c 9 k 上， 以* 因子前导序列为分泌信号，在毕赤酵母( p i c h i a p a s t o r i s ) g s i1 5 细胞中进行异 源表达。经m d 板和b m m 板( 含有底物a b t s ) 筛选得到分泌漆酶的阳性转化子， 转化子在b m m 液体培养基( 台有0 3 m m o b l c u $ 0 4 和o 8 丙氨酸( 耐v ) ) 中2 0 0 c 摇瓶培养。l a c b 的转化子g s b l 在第1 3 天酶活达到3 2 x 1 0 4 u l ，a c e 的转化子g s e l 发酵9 天的酶活为1 6 2 x 10 4 u 凡。 g s b l 分泌的重组漆酶b ( r l a c b ) 对底物a b t s 的为6 6 7 t m a o l l ，为天然漆 酶b ( n l a c b ) 的4 倍( 1 7 7 p m o l l ) 。以a b t s 为底物，r l a c b 的最适温度为4 5 ， 低于n l a e b 的最适温度( 5 5 0 c ) 。n l a c b 在p h 5 4 时最为稳定而r l a e b 的最适稳 定p h 向碱性方向发生了漂移( p h 7 4 ) 。相对n l a e b ，r l a c b 具有更宽的p h 稳定性 范围( p h 3 0 9 0 ) 。 以纯化的r l a c b 、n l a c b 和g s e l 分泌的重组漆酶c ( r l a e c ) 粗发酵液对终浓度 5 0 m g l l 约染料进行脱色实验，结果表明，在较低的漆酶浓度下( 终浓度g - - 6 0 u l ) ， 三种酶对三甲基类和偶氮类染料均有莨好的脱色作用，小分子介体a b t s ；f f l h b t 能 够显著提高漆酶对染料的脱色效率和脱色速率。 关键词：染料脱色，基因克隆，异源表达，t r a m e t e $ s p a h 2 8 - 2 ，t r a m e t e $ s p 4 2 0 n 漆酶基因在毕赤酵母中高效表达 a b s t r a c t an o v e ll a c c a s eg e n e ( t a c 目w a gc l o n e df r o mt h eg c n o m i ed n ai s o l a t e df r o m t r a m e t a ss p 4 2 0 ，u s i n gt h ed e g e n e r a t ep f i m e r sb a s e do l lt h ec o n s e r v e dc o p p e r - b i n d i n g r e 舀o n si nf u n g a ll a c c a s e s l o n gd i s t a n c e - i n v e r s ep c r ( l d - i p c r ) w a gu s e dt oa m p l i f y t h ef l a n k i n gs e q u e n c o f t h eg e n e t h ed n as e q u e n c eo f l a c eo b t a i n e dw a g2 7 1 7b a s e p a i f s ( b p ) i nl e n g t h ，i n c l u d i n gt h ee n t i r es t r u c t u r eg e n e ( 2 1 3 0b p ) a n dt h e5 - a n d 3 - n o n c o d i n gr e g i o n s p e c i f i cp r i m e r s ，u s e dt oa m p l i f yt h ec d n as 。q a e n c e so fl n c b f r o mt r a m e t a ss p a h 2 8 - 2a n dl a c 五 k b ，l n c c ，l a c da n dl a c ef r o mt r a m e t e ss p 4 2 0 ， w c l ed e s i g n e da c c o r d i n gt ot h e i rc o r r e s p o n d i n gd n as e q u e n c e s t h e s ee d n a s e q u e n c e s o b t a i n e df r o mr e v f f f s et r a n s c r i p t i o np r o d u c t sr a n g e df r o m 1 5 6 0b pt o1 5 7 8b p t h es i x g e n e sd i s p l a yr e l a t i v e l yh i g hi d e n t i t yo f o v e r5 0 w i t ho t h e rl a c c a s eg e n e sf r o md i f f e r e n t f u n g a ls t r a i n s b a s e do nt h ea m i n oa c i ds e q u e n c e sd e d u c e df r o mt h ee d n as e q u e n c e s ， t h ec o n s e r v e da m i n oa c i dr e s i d u e si nc o p p e r - b i n d i n gr e g i o n s ，i n c l u d i n gt e nh i sa n do n e c y sr e s i d u e s , a n ds e v e r a lp u t a t i v en g l y e o s i l y z a t i o ns i t e sw o r ef o u n di nt h ep e p t i d e c h a i n so f t h e s el a c c a s eg e n e s b o t l lt r a m e t e ss 口a h 2 8 - 2l a e ba n dt r a m e t e ss p 4 2 0 a e cw e r ei n s e r t e di n t ot h e e x p r e s s i o nv e g t o rp p i c g ka n dh e t e r o l o g o u s l ye x p r e s s e di nt h ep i c h i ap a s t o r i ss t r a i n g s l l 5u s i n gt h el e a d e rs e q u e n c eo fm - f a e t o ra sas e c r e t i o n s i g n a l ，r e s p e c t i v e l y l a c e a s e - p r o d u e i n gt r a n s f o r m a n t sw e r es c r e e n e do u tb ym dp l a t e sa n db m mp l a t e s c o n t a i n i n gs u b s t r a t ea b t s ，s e v e r a lt a r g e tc l o n e sw e r es h a k i n g l yc u l t u r e da t2 0 。ci n b m mm e d i u mc o n t a i n i n g0 3m m o i lc u s 0 4a n do g a l a n i n e t h el a c e a s ea c t i v i t yo f t r a n s f o r m a n tg s b lw 廿ll a c br e a c h e d3 2 x 1 0 4 u ln t ! i e rd - d a yc u l t u r ea n dt h el a c c a g e a c t i v i t y o f t r a n s f o r m a n tg s c lw i t hl a c c r e a c h e d1 , 6 2 x 1 0 4 u l a t t e r 9 - d a yc e l lg r o w t h t h ea p p a r e n t 岛v a l u e ( 6 6 7p m o l l ) o f t h er e c o m b i n a n tl a c e a s er l a e b ，d e r i v e df r o m l a c b , w a s4f o l d st ot h a to ft h ec o r r e s p o n d i n gn a t i v el a c c a ( n l a c b ) t h eo p t i m a l t a m p e r a t u r eo fr l a e bo p t i m a lf o ro x i d i z i n gs u b s t r a t ea b t si s4 5o c 1 0 w e rt h a nt h a to f n l a c b ( 5 5o c ) n l a c bi sm o s ts t a b l ea tp h5 4w h e r e a sr l a c ci sm o s ts t a b l ea tp h7 4 f u r t h e r m o r e ，r l a c bh a sab r o a d e rp hr a n g eo h3 0 - 9 o ) f o rt h es t a b i l i t yi nc o m p a r i s o n w i t hn l a l e b t h ep u r i f i e dl a c c a s e so f r l a c ba n dn l a c ba n dt h ec u l t u r es u p e r a a t a n to f r e e n m b i n a n t n i 堡堕苎璺垄里鲞壁里! 塞塾墨鲨 1 a e c a s er l a c cd e r i v e df r o m a c c w e r eu s e dt 0d e e o l o r i z es e v e r a ls y n t h e t i cd y e sa ta n h a l c o n c e n t r a t i o no f5 0m g ，l t h el c s t d t $ s h o w e d 廿嫩a l it h et h r e el c a s 黯p o s s e s s e dm e a b i l i t yt od e c o l o r i z ed y e so ft r i a r y l m e t h a n ea n da z ot y p e st e s t e d e v e na tl o w c o n c e n t r a t i o n sr a n g i n gf r o m8u lt o6 0u 凡t h ep r e s e n c eo fl o wm o l e c u l a rr e d o x m e d i a t o r so fa b t sa n d 哪ts i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e dt h ee f f i c i e n c ya n dv e l o c i t yo f d c o o l o r i z a t i o n k e y w o r d s ：d y ed e c o l o r i z a t i o n ，g e n ec l o n i n g ，h e t e r o j o g o u se x p r e s s i o n ，t r a m e t e ss p a h 2 8 - 2 ，t r a m e t e ss p 4 2 0 棒酶基困在毕赤酵母中高效表达 a m d e d n a r a c e a b t s h b t d 1 t r e d t a d e p c r l a c b n l a c b r l a c c l d - i p c r o d c o o r f p a g e p d a r t - p c r s d s t l c u t 2 c u i 3 c u s t r e x r e m r e a r e 邛t o x - g a l m c s 缩略词表 a m p i c i l l i n d n a c o m p l e m e n t t or n a r a p i da m p l i f i c a t i o no f c d n ae n d 2 ，2 - a z i n o b i s ( 3 - e t h y l b e n z o t h i a - z o l i n e - s u l p h o n a t e ) i - h y d r o x y b n e z o t r i a z o l e d i t h i o t h r e i t o l e t h y l e a e d i a m i n et g w a a c 斌i ca c i d d i e t h y p y r o c a r b o n a t o p r o t e i np r o d u c to f r e c o m b i n a n tl a c b p r o t e i np r o d u c to f n a t i v el a c b p r o t e i np r o d u c to fr e c o m b i n a n tl a c c l o n g d i s t a n c e - i n v e r s ep o l y m e r a s ec h a i nr e , a c t i o n o p t i c 司d e n s i t r 矾6 0 0 n m o p e nr e a d i n gf r a m e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e t r o p h o r e s i s p o t a t o - d e x t r o s ea g a r m e d i u m r e v e r s et r a n s c r i p t i o n - p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n s o d i u md e d e c y ls u l f a t e t y p cl c o p p e r t y p e 2c o p p e r t y p e3c o p p e r s t r e s sr e s p o n s ee l e m e n x e n o b i o t l e - r e s p o n s i v ee l e m e n t m e t a l - r e s p o n s i v ee l e m e n t a n t i o x i d a n t - m s p o n s i v ee l e m e n t i s o p r o p y l 辟d - t h i o g a l a c t o s i d e 5 - b r o m o 4 - c h l o r o - 3 - i n d o l y l1 3 - d - g a l a e t o p y r a n o s i d e m u l t i p l ec l o n i n gs i t e a m i n oa c i d v 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得摩渺惕或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料与我一阿工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：秀协31 凡 签字日期：谢年6 月f 中日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解鹏小吃有关保留、使用学位论文的规定有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授弩型_ 女净埸可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 、 。i ， 学位论文作者签名：荡砌肖b 导师签名： 鎏“。1 签字日期：劫年月i 垆日 签字日期： z 移年口易月i 妒日 学位论文作者毕业去向： 工作单位 通讯地址 电话 邮编 文献综述 第一章文献综述 一漆酶综述 1 漆酶简介 1 1 濠酶 漆酶( 苯二醇：氧氧化还原酶。l a c c a s c ，e c i 1 0 3 2 ) 是一种含铜的多酚氧化酶， 和植物中的抗坏血酸氧化酶、哺乳动物的血浆铜蓝蛋白同属蓝色多铜氧化酶( b l u e m u l t i - c o p p e r o x i d a s e ) 家族漆酶能够催化氧化多种酚类和非酚类化合物，同时伴随 有4 个电子的转移，将分子氧还原成水： 4 i 【+ 0 2 卅r 十2 h 2 0 真菌漆酶的分子量大多在5 0 - 8 0 k d a 之间，结构中含3 5 0 的碳水化合物，等电 点p i 在3 5 之间，多为单体酸性蛋白酶，但也有二聚体、四聚体( 柄孢漆酶i ) 和碱 性漆酶的报道。漆酶蛋白中般含有4 个铜原子，但也有例外，有的漆酶只含有两 个铜原子从p l e u r o t u so s t r e a t u s 纯化的漆酶只含有一个铜原子，含有两个锌原子和 一个铁原子，在6 0 0 n m 附近处没有光吸收，为白色漆酶【l 】。大多数漆酶在5 0 6 0 0 c 时 能保持稳定，最适反应温度在4 0 一8 0 0 c 之间，最适反应p h 在3 0 6 0 之间，酸性条件 下催化效率较高。叠氮钠被认为是漆酶有效的抑制剂，其它化合物如d t t 、巯基乙 酸、半胱氨酸等对漆酶也有一定的抑制作用。漆酶广泛的存在于真菌和植物中，尤 其是白腐真菌中，最近几年在昆虫和细菌中也发现了漆酶样活力此外，也有漆酶 存在于动物的肾脏和血清中的报道体3 4 5 1 根据磁学和光谱学性质不同，可将漆酶中4 个铜原子分为3 类：i 型c u 2 + ( t i c u ) 和i i 型c i l 2 + ( t 2 c u ) 各一个，是单电子受体，呈顺磁性；i i i 型c u z + ( t 3 c u ) 两个， 是双电子受体，呈反磁性i 犁_ c u 2 + 形成单核中心，在6 0 0 n m 附近处有较强光吸收： 型c u 2 + 和i i i 型c u 2 + 形成三核中心；i i 型c u 2 + 具有e p r ( 电子顺磁共振效应) 性质； m 型c u 2 + 由于两个c u 2 + 之间偶联，导致t 3 c u 2 + 的e p r 性质消失，但在3 3 0 h m 附近有宽 的吸收肩峰 1 2 漆酶结构 漆酶基因在毕赤酵母中高效表达 由于真菌漆酶为糖蛋白，难以获得x 衍射分析用的单晶，因此关于漆酶结构的 研究进展一直比较缓慢，直到1 9 9 8 年才第一次制备了来i 刍c o r i o l u s c i n e r e u s 的漆酶晶 体【6 1 ，并解析了其结构。为了获得高质量的衍射晶体，漆酶蛋白被内切糖苷酶f 做了 去n 糖基化处理，导致这个结构蛋白缺失了t 2 c u ，因而没有活性。 该酶蛋白的单体分子c a 3 个e u p r e d o x i n 1 i k e 结构域( 1 ，2 ，3 ) 组成，形成球状结 构( 7 0 5 0 4 5 a ) 。单核的t i c u 位于结构域3 界面上，与2 个h i s 残基和1 个c y s 残基 结合，t 2 c u 与t 3 c u 形成的三核中心位于结构域l 和3 的界面上。第三个结构域中除 了有争s a n d w i c h ，还有4 个短的螺旋区，最后一个螺旋位于c 末端，由结构域l 的 c y s _ 8 5 和结构域2 的c y s - 4 8 7 形成的二硫键来稳定。漆酶的第二对二硫键存在于结构 域1 和结构域2 ( c y s - l1 7 - c y s - 2 0 4 ) 之问，一个伸展t 拘l o o p ( 氨基酸2 8 4 - 3 2 7 ) 连接结 构域2 和3 ，a s n - 3 4 3 上有n 琏接的n - 乙酰葡糖胺( 图1 1 ) 图1 - 1c o o l u sc i t w r e u s 漆酶的结构州 f i g ! - 1s t r u c t u r eo f c o r t o l u sc n e r e u sl a c z a s e 2 0 0 2 年，p i o n t e k 等 7 1 报道了第一个具有活性的漆酶晶体结构，其分辨率为1 9 a ， 酶蛋白来自于担子菌t r a m e t e sv e r s i c o l o r 同年，另一种来自子囊菌m e l a n o c a r p u s a l b o m y c e s 活性漆酶的晶体也被解析，分辨率为2 a a 。这两种晶体结构都是含有全部 铜原子的活性漆酶结构，虽然在一级结构上同源性较低，但它们的折叠方式与 c o r i o l u sc i n e r e u s 漆酶类似 s l 。目前，共有8 个漆酶获得了晶体结构。 文献综述 1 3 潦爵催化机翻 漆酶是单电子氧化还原酶，它催化不同类型底物氧化反应的机理主要表现在两 方面：一方面是底物自由基中间体的生成，漆酶可催化氧化酚类和芳香胺类化合物， 同时分子氧被还原为水( 图1 - 2 ) 。在这一过程中，漆酶从被氧化的底物分子中提取 一个电子，使其形成自由基，该自由基不稳定，可进步发生聚合或解聚反应。在 0 2 存在下，还原态漆酶被氧化，0 2 被还原为水。 ( a ) 一i 一 ( b ) 图l - 2 典型的漆酶反应：c a ) 以氢醌为底物；( b ) 以丁香醛连氮为底物。 f i g 1 - 2 t h e t y p i c a lr e a c t i o n o f l a c s e ：( a ) h y d r o c h i n o n ea s t h es u b s w 啦； ( b ) s y r i n g a l d a z i n e a st h es u b a t e 另一方面，漆酶催化底物氧化和对0 2 的还原是通过4 个铜离子协同传递电子和 价态变化来实现的，漆酶通过4 个连续的单电子转移氧化还原性底物，将分子氧还 漆酶基因在毕赤酵母中高效表达 原为水。还原性底物结合于t i c u 位点，t i c u 从底物中提取1 个电子，该电子通过 c y s - h i s 途径传递到t 2 t 3 c u 三核中心位点，该位点结合了第二底物分子氧。接受 t 1 c u 的电子，并传递给氧，使其还原为水。完成反应的漆酶中4 个c u 都被氧化成c u 2 十， 整个反应过程需要4 个连续的单电子氧化作用来使漆酶充分还原，所以漆酶被称为 “分子电池”，通过单个的氧化反应来积累电子，还原分子氧。氧的还原可能分两 步进行，两个电子转移产生过氧化氢中间体，该中间体再被另两个电子转移作用还 原成水。 知 分予 使让囊) c 扩c 矿c u ，- c 矿c 矿c 时卜 c c c 矿惟刖c 扩c 扩c 矿寺鹰囊。4十j“ 2 h + c 伊c p c 印；饭让奎 c p c 伊c 可+ h ，o 量 一 1 4 漆酶的应用 1 4 1 生物修复和生物脱毒 生物修复( b i o r e m e d i a t i o n ) 是利用生物，特别是微生物催化降解有机污染物， 来修复被人类生产和生活活动所污染和破坏的局部环境，使之重现生机的过程，其 目的是除去环境中的污染物，使其浓度降至环境标准规定的安全浓度之下漆酶能 够降解酚类等多种有毒化合物，包括氯代酚、多氯联苯、二氧六环、二氯苯胺、有 机磷杀虫剂和人工合成染料等怫1o 】 1 4 2 有机合成 漆酶用于有机合成还处于探索阶段1 9 8 2 年e c k e n r o d e 等用真菌漆酶催化文朵灵 等氧化，合成了对恶性疾病白血病有特殊疗效的长春花碱，反应温和，方法简单， 克服了化学合成该药物操作麻烦、试剂昂贵，毒性大等缺点【1 2 1 。前苏联学者s e m i o n o v 等还将漆酶用于多肽的合成，除去羧基保护苯胼基团，以空气中的氧气为氧化剂， 文献综述 使反应在接近中性p h 和室温下进行。 1 4 3 医学 用过氧化氢酶分析血清中的葡萄糖、尿酸等组分时，血清中的胆红素有很大干 扰，将血清经过固定化漆酶处理可减少1 8 - 2 4 的胆红素，固定化的漆酶能反复使用 5 0 余次。 1 4 4 食品工业 啤酒、果汁等饮料储存期间往往出现浑浊或沉淀，与其中含有酚类或芳胺类物 质有关。用漆酶预先处理麦芽汁，除去其中的酚类，可以提高啤酒的质量和透明度。 苹果汁经固定化漆酶处理后，能除去其中的儿茶素、绿原酸、根皮苷等酚类物质， 使果汁可以长期储存，保持澄清 1 4 5 生物传感器 漆酶在催化过程中消耗0 2 ，伴随着电子的传递，很容易将此过程转化为电信号 而用于高度灵敏的检测已有漆酶在生物检测中应用的报道，包括免疫检测、生物 传感器等。g h i n d i l i s 等用固定化漆酶制成的电位免疫传感器对茶叶中丹宁酸进行分 析【1 4 】。 2 漆酶基因克隆 2 1 漆酶基因克隆 自1 8 8 3 年漆酶被发现起，由于漆酶具有重要的潜在应用价值，一直是化学和生 物学等领域十分活跃的研究课题，特别是1 9 9 0 年以来，漆酶的研究取得了长足的发 展前期的研究工作主要集中于漆酶在生物体内功能，如在真菌自身发育分化中的 定位，分布、专一性，以及在侵染植物中扮演的角色等1 1 5 1 近年来，多种来源的漆 酶蛋白被分离纯化，其理化性质和分子结构特征己被深入分析，不同来源的漆酶基 因得到克隆，包括来自真菌、植物、昆虫，细菌等( 表i 1 ) 克隆漆酶的基因序列， 有利于在基因水平上对漆酶蛋白进行性质改良，为进一步研究漆酶基因的重组表达 和漆酶基因表达的调控机制奠定了基础。 2 2 漆酶基因克隆方法 漆酶基因克隆方法有p c r 法、r 1 p c r 法、基因组文库探针杂交筛选法、e d n a 漆酶基因在毕赤酵母中高效表达 表1 1 已克隆到的部分漆酶基因 t a b l e1 - lp a r to f c l o n e dl a c c a s eg e n e s 文库探针杂交筛选法、表达文库抗原筛选法等1 9 8 8 年，f r o h m a n 等首次利用快速 扩增c d n a 技术从白腐菌po s f 坩q t u s 中克隆到漆酶p 0 ) 【i 基因【1 6 】；后来的学者多用 r t - p c r 技术来获得漆酶基因，研究者建立基因组文库或c d n a 文库，然后设计探针 在文库中筛选的方法来克隆漆酶基因。c o l l 等运用基因组文库和c d n a 文库克隆到担 子菌p m i ( c e c t2 9 7 1 ) 的漆酶l a c c a s ei 基因”日z h a o 等通过建立基因组文库并进行 文库筛选和产物克隆，再通过竞争性r t - p c r ( c o m p e t i t i v er t - p c r ) 方法分析了不 同转录水平的漆酶基因1 1 8 o a n a s t a s i a 等首先建立了基因组文库，并将文库与c r a s s a 漆酶探针杂交，克隆得到l a e l 、l a c 2 和l a c 3 等3 个漆酶基因，利用竞争性r t - p c r 方法 检测g a e u m a n n o m y c e sg r a m i n i sv a t t r i t i c i 的l a c l 、l a c 2 和肠订漆酶基因的不同转录水 平。近年来，有学者利用漆酶蛋白中保守铜离子结合位点的氮基酸序列，设计简并 引物来克隆漆酶基因【i 虮。如h o s h i d a 等利用保守的c u l 和c u i v 区设计简并引物，扩增 基因组，然后用5 姒c e 和3 i r a c e 得到c d n a 的5 端和3 。端序列，得到t r a m e t e s s a n g u i n e d 自：j 5 个漆酶同工酶基因序列刚。t e m p 等利用c u i 和c u l l 区设计了简并引物， 扩增得到p y c n o p o r u sc i n n a b a r i n u 的部分c d n a 序列，然后用5 - r a c e 和3 - r a c e 得到 i c c 3 - 2 的e d n a 全长，再根据l c c 3 2 的c d n a 设计引物扩增如订2 的d n a 序列【2 “。 3 潦酶异潭表达 多数真菌分泌漆酶有产量低、发酵周期长、成本高、不易操作等缺点，无 法满足漆酶工业化应用大量廉价漆酶的需要，且在漆酶的生产中一般需要有毒化学 诱导剂诱导，后处理难度大，也增加了生产成本。因此，提高漆酶的产量是真菌漆 酶研究急需解决的问题。 1 9 9 0 年，日本科学家k o j i m a 首次成功对c o r o o u sh z r s u t u s 的酚氧化酶基因进行 了克隆，并实现该基因在酿酒酵母( 岛b 舢叼堆船卯，删妇 卵) 细胞异源活性表达阱1 。 表1 2 漆酶基因重组表达总结 t a b l e1 - 2s u m m a r yo f e x p r e s s i o nf o rr e c o m b i n a n tl a e e a s e s 7 漆酶基因在毕赤酵母中高效表达 1 9 9 7 年，j n s s 等将来自t r a m e t e sv e r s i c o l o r 的漆酶基因克隆到p i c h i ap a s t o r i s 表达系统 中进行了表达，表达量达到1l m g l 2 3 1 。1 9 9 9 年，来i j c o p r i n u sc i n e r e u s 的漆酶基因 在a s p e r g i l l u so r y z e 6 p 实现了较好的表达，表达产i t s 8 - 1 3 5 m g l 。2 0 0 2 年， p y c n o p o r u xc i n n a b a r i n u s 漆酶l a c l 在a s p e r g i l l u sn i g e ，中实现了活性表达，表达量为 7 0 m g l f 2 5 1 。2 0 0 4 年a l v e s 等报道担子菌p y c n o p o r u sc i n n a b a r i n u s 同源表达漆酶基因， 最高产量达到1 2 9 l t 2 6 】，为漆酶的产业化应用带来新的希望( 表1 - 2 ) 。 二毕赤酵母表达系统 目前，已有多种蛋白质异源表达系统被开发出来，如大肠杆菌表达系统、酵母 表达系统、丝状真菌表达系统、哺乳动物表达系统以及植物表达系统等。这些表达 系统具有各自优、缺点。大肠杆菌表达系统具有周期短、表达产量高、操作简单等 优点，但是该系统不能对蛋白质进行翻译后修饰，难以表达糖蛋白等结构复杂蛋白 质；丝状真菌表达系统、哺乳动物表达系统以及植物表达系统等表达系统能够对表 达的蛋白进行糖基化等修饰，但目前还存在有表达效率低、操作复杂等缺点。酵母 表达系统既有原核生物生长快、操作简单的优点，又具有真核生物能够对蛋白质进 行翻译后修饰的优点，能够表达糖蛋白等结构复杂蛋白。酵母表达系统主要有酿酒 表达系统和毕赤酵母表达系统等。酿酒酵母具有一定的局限性，如产量低、表达质 粒易丢失、外源基因过度糖基化、分泌效果差、不适合高密度发酵等1 2 ”基于上述 问题，人们利用其它酵母菌株构建了可高效稳定表达外源基因的新表达系统，即甲 醇营养型酵母表达系统。作为第二代酵母表达系统，它克服了酿酒酵母表达系统的 诸多不足，成为目前应用广泛的较为理想的基因表达系统。 1 毕赤酵母表达系统的构建及特点 毕赤酵母( p i c h i a p a s t o r i s ) 表达系统是上个世纪7 0 年代随着人们对甲醇利用酵 母的研究而发展起来的最初的目的是寻找甲醇利用菌来消化环境中的甲醇，从而 发现了p 缸l l l 细p 础廊等几种甲醇利用酵母，当初毕赤酵母只用于制备单细胞蛋白， j 文献综述 由此形成了毕赤酵母的发酵技术。8 0 年代毕赤酵母被开发成一种异源表达系统，到 1 9 8 5 年，c r e g g 等首次报道了利用c 犯1 2 - 聚乙二醇介导原生质转化法成功的将带有 h i s 4 选择标记的质粒转入组氨酸脱氢酶基因缺陷型只p a s f o r i s 株g s l l 5 中，使转化 效率提高到1 0 5 转化子，岭。在1 9 9 4 年。f a b e r 等又发现了电击法可提高酵母细胞的转 化率，且线状的质粒比环状的质粒转化效率高【2 ”。 作为真核生物表达系统，pp a s t o r i s 表达系统相比其它表达系统具有较大的优 势，如能对蛋白质翻译后加工、菌体生长速度快、操作简单、费用低廉、适合高密 度发酵、表达产量高等优点p p a s t o r i s 表达系统采用了醇氧化酶( a l c o h o l o x i d i a s e ， a o x i ) 的强启动子，在无其它碳源存在的条件下，能以甲醇为唯一碳源，并且受 甲醇唯一调控。只p a s t o r i s 自身的分泌性蛋白很少，利用酿酒酵母的静信号肽能将外 源蛋白质分泌到细胞外，这些都有利于重组蛋白的下游纯化工作对表达漆酶来说， p p a s t o r i s 具有独特的优势，因为pv a s t o n s 在发酵的过程中不产生纤维素酶，其表 达产生的漆酶粗酶液可以直接应用于造纸业等，而无需对重组酶进行纯化的下游工 作，大大减少了成本 2 9 1 2 毕赤酵母表达系统的宿主菌 目前用作毕赤酵母表达系统的宿主菌主要有3 类，它们的区别在于c i o x 两个基因 中一个或两个缺失而导致对甲醇利用能力的高低变化，三类菌株都为h i s 4 基因缺陷 型( 表1 3 ) 。最常用的是菌株g s i l 5 ，它含有a o x l 和a o x 2 基因，所以在含甲醇的培 表1 3 巴斯德毕赤酵母表达宿主菌 t a b l e1 - 3p p a s t o r i sh o s ts t r a i n s 漆酶基因在毕赤酵母中高效表达 基上快速生长；第二类a o x l 缺失，为a r 9 4 基因所代替，因此菌株只依靠a o x 2 基因来 利用甲醇，在含甲醇培养基上以缓慢速度生长；第三类是近年开发的一类菌株： s m d l l 6 3 、s m d l l 6 5 、s m d i l 6 8 ，这是一类蛋白酶基因缺失的宿主菌，为外源蛋 白质提供了减少降解的环境，从而提高外源蛋白的表达量，具有广泛的应用价值。 3 毕赤酵母表达系统的载体 毕赤酵母表达质粒有自主复制的游离质粒和染色体整合质粒两类，因游离质粒 不稳定、易丢失，所以一般采用整合型质粒作为外源基因表达载体，这些载体又为 分胞内、胞外表达两种类型( 表1 4 ) ，其具有的共同结构包括5 - a o x l 启动子、编码 n 端分泌信号( s i g ) ，多克隆位点( m c s ) ，转录终止和p o l y a 形成基因( t t ) 、 3 - a o x l 序列、3 、删终止序列、组氨酸脱氢酶筛选标志基因( h i s 4 ) 、抗氨苄青霉 索基因( a m p ) 、大肠杆菌p b 9 3 2 2 质粒片段( 复制起点c o l e i ) 以及克隆外源基因 需要的特定限制性内切酶位点等。 表1 4 巴斯德毕赤酵母表达载体 t a b l e1 - 4t h ee x p r e s s i o np l a s m i d sf o rrp a s t o r i s 4 影响外源基因表达的因素 文献综述 影响外源基因在p 口甜f d j 由中表达的因素主要有以下几个方面：( 1 ) 外源基因的 结构及其编码蛋白的性质：( 2 ) 整合在酵母基因组上外源基因的拷贝数量- 外源基 因需要与酵母染色体上基因组发生同源重组，双位点和多拷贝整合一般可获得高表 达量；( 3 ) 溶解氧和发酵温度。pp 船幻睹对培养温度较严格，过高或过低的温度都 不利于其表达外源基因：( 4 ) 甲醇的添加量。甲醇诱导时间一般相对较长，要到 1 5 0 - 2 0 0 h 后外源蛋白表达才能到达高蜂，这样残留的少量甲醇一方面使外源蛋白降 解变性失活，另一方面对宿主细胞造成压力和毒害：( 5 ) 发酵设施及其发酵参数 的影响等 三漆酶产业化应用存在的问题 漆酶由于其重要的催化性能，具有广泛的应用价值，日益受到重视，特别是近 年来漆酶在环保上的应用更是成为人们研究的热点真菌漆酶的产业化应用需要大 量廉价的漆酶制剂，但野生型真菌的漆酶合成效率较低，且一般需要使用有毒性的 化学诱导剂诱导，给漆酶的纯化后处理带来困难，生产过程容易造成污染。因此， 高效、清洁、低成本的生产漆酶是漆酶产业化应用迫切需要解决的问题。 四研究内容和方案 1 研究内容 漆酶是公认的木质索降解酶之一，广泛分布于真菌、植物、细菌、昆虫中，能 够有效的降解酚类和芳胺类有毒化合物近年来，漆酶新功能被不断的发现，逐渐 成为酶工程学和环境科学等科学领域的研究热点 t r a m e t e ss p a h 2 8 - 2 和t r a m e t e ss p 4 2 0 是本实验室自行筛选的两株高效产漆酶 菌株，在不同的诱导条件下产生不同的漆酶同工酶组分3 l i 在邻甲苯胺存在的条 件下，t r a m e t e ss p a h 2 8 - 2 主要合成漆酶同工酶a ；而在在3 j 二羟基甲苯存在的条 堕堕茎里垄生查壁墨壹墼墨垄 一 件下，该菌株主要合成漆酶同工酶b 【3 1 】。t r a m e t e ss p 4 2 0 在前期进行的实验中，仅 合成一个漆酶同工酶组分( 同工酶e ) 。t r a m e t e ss p a i - 1 2 8 - 2 的l a c a 、l a c b 、a c c3 个 基因d n a 序列也已经被克隆 3 2 1 。 本研究将以这两株真菌为材料，拟克隆其不同的漆酶同工酶基因c d n a 序列， 并尝试在毕赤酵母异源活性表达漆酶蛋白，为提高漆酶生产效率和进一步在基因水 平上对漆酶蛋白质进行改造奠定物质基础。 茎鳖堡堕 2 实验方案 图l - 3 新型真菌漆酶基因的克隆及其异源表达的研究方案 f i g 1 - 3s c h e m eo f m o l u l a rc l o n h l gs n dh e t e r o l o g o u sc x p r s i o no f n o v e ll a l a s cg e n e s 圈圆 |ii；南 ；。；：。，一 ；，ii。t 整鳖苎里垄望查壁堡! 墨墼茎垄 一 第二章漆酶基因克隆及序列分析 真菌漆酶多以同工酶形式存在，由基因家族编码【m3 5 1 ，其同工酶组分因菌株不同的生 长环境或生理状态而差异表达【3 4 1 。目前有多种来源的漆酶基因得到克隆，包括植物、真菌、 昆虫、细菌等。克隆漆酶的基因序列，可以对漆酶在基因水平进行改造，有利于漆酶蛋白 的性质改良；为深入了解漆酶的结构和功能间的关系以及开展漆