（生物化学与分子生物学专业论文）植物不育表达载体的构建与功能分析.pdf

摘要 外来植物入侵已经成为危害本地生态环境和农林业生产的主要因素之一， 造成了巨大的经济损失。有不少外来植物是人们有意引进的，具有重要的利用价 值和经济价值。但是它们旺盛的自我繁殖能力和长期的栽培使得它们容易演化成 外来入侵物种，对当地的物种造成严重威胁。对于通过种子进行繁殖的外来植物， 如果能够培育出不育的品种，则就可以大大削弱、甚至消除其侵略性。 拟南芥a p 3 基因控制其雄蕊的发育。本试验根据a p 3 基因5 上游序列设计 引物，利用p c r 技术克隆了一个1 7k b 的a p 3 基因启动子，测序结果证明该 d n a 片段与g m b a n k 公布的序列一致。将该启动子与编码r n a 酶的细胞毒性 基因b a r n a s e 连接，构建成无花药植物基因表达盒pa p 3 - b a r n a s e - t n o s ，将该基因 表达盒切下后，克隆到由p c a m b i a 1 3 0 5 1 改造而成的质粒p c a m b i a p n n p n o s g u s 上，构成了无花药植物基因表达载体p c a m b i a p 蝴b a m a s e t n o s 。将 该载体转化根癌农杆菌e h a l 0 5 ，再用农杆菌感染烟草无菌苗叶片。感染的叶片 在m s + 2 m g lb a + 0 。1m g l n a a + l o o a m 乙酰丁香酮培养基上共培养3 d 后，再 转到选择再生培养基( m s + 2 m g lb a + 0 1m g ln a a + 1 0 0m g lt i m e n t i n + 5 0m g l k a n a m y c i n ) 上；不定芽形成后，将其切下，转到m s + im g l i b a + 5 0 m g l f i m e n t i n 上生根。2 2 株再生植株的叶片经g u s 染色液染色后，有1 7 株被染成蓝色，表 明它们是转基因植株。1 7 株基因植株移栽到温室后生长正常，为验证所构建的 无花药植物基因表达载体的功能创造了条件。 关键词：外来植物入侵a p 3 启动子烟草b a m a s e 基因农杆菌介导的转基因 a b s t r a c t i n v a s i o no fa l i e np l a n t sh a sb e e no n eo ft h em o s td c n g e r o uf a c t o r st h r e a t e n i n g e c o l o g i c a le n v i r o n m e n t sa n da g r i c u l t u r a la n df o r e s t r yp r o d u c t i o n ，m a n ya l i e np l a n t s w e l ei n t e n t i o n a l l yi n t r o d u c t e da n dt h e yh a v eg r e a tv a l u eo fu l t i l i z a t i o n 嬲w e l la s e c o n o m i c a lv a l u e b u tt h eg r e a ta b i l i t yo fs e l f - p r o p a g a t i o na n dl o n g - h i s t o r y c u l t i v a t i o nh a v em a d es o m eo ft h e mb e c o m ei n v a s i v es p e c i e ss e r i o u s l yt h r e a t e n i n g l o c a ls p e c i e s ，b r e e d i n gs t e r i l ec u l t i v a r so ft h e s es p e c i e sw o u l dg r e a t l yn e u t u r a l i z c ， t h e f ti n v a s i v e n e s s a p 3g e n eo fa r a b i d o p s i st h a l i a n ap l a y sak e yr o l ei np i s i t lf o r m a t i o n i nt h i s s t u d y , a1 7 k bf r a g m e n to f5 f l a n k i n go fa p 3g e n ew a sa m p l i f i e db yp c rw i t ht w o s p e c i a lp r i n l e r sa n dg e n o m i cd n ao fa t h a l i a n aa st e m p l a t e ，a n ds e q u e n c ea n a l y s i s s h o w e dt h a ti tw a si d e n t i t yt oa p 3g e n ep r o m o t e rp u b l i s h e di ng e n b a n k t h e p r o m o t e rw a sf u s e dw i t hb a m a s eg e n ee n c o d i n gr n a s ew h i c hi sc y t o t o x i c ，r e s u l t i n g i nag e n ee x p r e s s i o nc a s s e t t eo f n o n p i s t i lp l a n t s ，p a p 3 一b a r n a s e t n o s g e n ee x p r e s s i o n v e c t o ro fn o n p i s t i lp l a n t s ，p c a m b i a p 3 - b a m a s e t n o s ，w a so b t a i n e db ys u b c t o n i n g t h eg e n ee x p r e s s i o nc a s s e t t ei n t ot h ev e c t o rp c a m b i a - - p n n - p n o s - g u sd e r i v e df r o m p c a m b i a l 3 0 5 1 t h ev e c t o rw a st r a n s f o r m e di n t os t r a i ne h a l 0 5o f a g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n sa n dt h es t r a i nh a r b o u r i n gp c a m b i a - p 日, 3 - b a r n a s e - t n o sw a su s e dt o i n f e c ts t e r i l el e a fe x p l a n t so ft o b a c c o ( n i c o t i a n at a b a c u mc vx a n t h i n ) ，a n dt h e i n f e c t e de x p l a n t sw e r ec o - c u l t u r e do nm sm e d i u m s u p p l e m e n t e dw i t h2 m g lb a ，0 1 m g ln a aa n d1 0 0 a ma sf o r3d a y ；t h e r e a f t e r , t h ee x p l a n t sw e r et r a n s f e r e e do n t o m sm e d i u ms u p p l e m e n t e dw i t h2 m g lb a ，0 1m g ln a a ，5 0m g lk a n a m y c i na n d 1 0 0m 班t i m e n t i nf o ra d v e n t i t i o u sb u di n d u c t i o n p l a n t l e t sw e r er e g e n e r a t e da f t e rt h e b u d sw e r et r a n s f e r r e do n t om sm e d i u ms u p p l e m e n t e dw i t hl m e g li b aa n d1 0 0m 班 t i m e n t i n 1 7t r a n s g e n i cp l a n t l e t sw e r ei d e n t i f i e df r o m2 2r e g e n e r a t e dp l a n t l e t s b y g u s - s t a i n i n ga n dt h e yg r o wn o r m a l l ya f t e rt r a n s f e ri n t os o i li ng r e e n h o u s e k e y w o r d s ：a l i e np l a n ti n v a s i o na p 3g e n e p r o m o t e r b a r n a s e g e n e n i c o t i a n at a b a c u m a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o n 湖北大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研 究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文 不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研 究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律后果由本人承担。 论文作者签名： 日期：秒口7 年6 月坶日 学位论文使用授权说明 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，并提供目录检索与阅览服 务；学校可以允许采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存学位论文： 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公开学位论文的部分或全部内容。( 保 密论文在解密后遵守此规定) 作者签名： 指导教师签名： 楞牙 日期：矽一7 乎稠憎口 日期：彦毒7 ，多形p 第一部分文献综述 第一部分文献综述 1 生物入侵与简介 生物入侵是指外来物种( 包括动物、植物和微生物) 在某一地域蔓延，并对 当地的经济或环境，或人的健康造成危害的过程。进入2 1 世纪以来，特别是近 几年来，生物入侵成为全世界共同关心的话题，从政府官员、专家学者到普通百 姓，从学术刊物到报纸、电视、广播、网络等大众媒体，入们都在讨论着生物入 侵的危害和防治方法，这是因为生物入侵已经成为破坏人类生存环境和自然生态 系统的第二号杀手。过去人类活动所造成的生物入侵的危害已越来越明显、越来 越严重。据统计，美国、印度、南非外来生物入侵造成的损失每年分别高达1 5 0 0 亿美元、1 3 0 0 亿美元和8 0 0 亿美元。在现代社会中，便利的交通工具和频繁的 国际问密切的贸易往来和旅游，更是打破了自然界天然的物种隔离，加速了物种 的相互传播，加大了生物入侵的可能性。 我国是世界上物种多样性特别丰富的国家之一，外来入侵物种同样造成了非 常大危害和损失。据统计，我国因外来物种入侵每年损失约1 3 0 0 亿元人民币， 其中造成的农林经济损失就达5 7 4 亿元人民币。我国对外来入侵物种的调查始于 2 0 世纪9 0 年代初期。在我国的外来物种中，外来植物占有较大的比重。2 0 0 3 年 国家环保局公布了1 6 种危害最严重的外来入侵生物名单，包括紫茎泽兰、微甘 菊、空心莲子草、豚草、毒麦、互花米草、风眼莲( 水葫芦) 、假高粱、蔗扁蛾、 湿地松粉蚧、美国白鹅、非洲大蜗牛、福寿螺和牛蛙【1 】，其中植物占9 种。据 农业都的最新统计，入侵我国的外来有害生物多达4 4 0 多种，其中植物3 8 0 多种。 2 外来植物入侵的主要途径 外来植物入侵是指植物从其原生地，经自然或人为的途径，传播到另一个环 境定居、繁殖和扩散，最终明显影响改变迁居地的生态环境。主要途径有： 2 1 有意引种 中国从国外引入优良品种有着悠久的历史。早期的引入常常通过民族的迁移 和地区之间的贸易来实现。现在很多部门或单位包括农业、林业、园林等几乎都 在从外地或外国引种。其中大部分引种是以提高经济收益、观赏、环保等为主要 目的的，但是也有部分种类由于引种不当，成为有害物种。在我国目前已知的外 来有害植物中，超过5 0 的种类是人为引种的结果。具体分为： 湖北大学硕士学位论文 往左鱼旦亟药题撞物：作为蔬菜引进的番杏、尾穗苋、落葵；作为水果引进的番 石榴、鸡蛋果、葡萄、石榴等；我国传统中医药所采用的超过1 2 0 0 0 多种生物绝 大部分为中国原产，也有部分为外来物种，其中一些已经成为入侵种，如含羞草， 决明、十蕊商陆等。 佐基理堂揎塑：如熊耳草、秋英、堆心菊、万寿菊、加拿大一枝黄花、牵牛、圆 叶牵牛、马缨丹、含羞草、红花酢酱草等。马缨丹原产热带美洲，1 6 4 5 年问由 荷兰人引入台湾，作为观赏植物栽培。现在在中国热带及南亚热带地区蔓延，排 挤当地植物，堵塞道路。其植株具臭味，茎有刺，是一种有害灌木。其肉质果实 通过当地鸟类啄食可得到进一步的传播。 往蕴筮堇壁翅牡：作为牧草或饲料引进而造成入侵的例子很多，例如水花生、紫 苜蓿、白花草木樨、梯牧草、风眼莲等。俗称“水花生”的空心莲子草，2 0 世纪 5 0 年代，南方许多地方曾经将此草作猪饲料引种扩散，嗣后逸为野生。现已经 成为蔬菜、甘薯等作物田、柑橘园及人工草坪的主要害草【2 l 。 往左改羞巫撞揎物：为快速解决生态环境退化、植被破坏、水土流失和水域污染 等问题，人们往往片面地看待外来物种的某些特点，但忽视其危险性。目前已经 形成入侵的典型案例有薇甘菊和风眼莲等。在草坪草育种方面，除结缕草种子外 其他草的种子几乎全部依赖迸口，仅1 9 9 7 年进口量就达2 0 0 0 吨。到1 9 9 0 年为 止，我国先后引进了1 1 4 个不同的冷季草种，主要从美国引种。现在已经有一些 种类形成入侵现象。 2 2 无意引种 很多外来入侵生物是随人类活动而无意传入的。通常是随人及其产品通过飞 机、轮船、火车、汽车等交通工具，作为偷渡者或“搭便车”被引入到新的环境。 尤其是近年来，随着国际贸易的不断增加，对外交流的不断扩大，国际旅游业的 快速升温，外来入侵生物借助这些途径越来越多地传入我国。 2 3 自然传入 除了人为引种以外，外来入侵种还可先在周边国家或地区归化后，通过风力、 水流自然传入，鸟类等动物还可传播杂草的种子。例如，豚草和三裂叶豚草的传 入便是种子通过口岸进入我国f 3 1 ；而紫茎泽兰则是从中缅、中越边境自然扩散入我 国的，风和水也是自然扩散的原因之一。薇甘菊则可能是通过气流从东南亚传入 2 第一部分文献综述 广东吼 3 外来入侵植物的危害 在自然界长期的进化过程中，植物与其天敌相互制约、相互协调，形成了稳 定的生态系统。当一种植物传入一新的栖境后，在适宜的气候、土壤、水分条件 下，由于缺乏原产地天敌的抑制，极易大肆扩散蔓延，形成大面积单一优势群落， 破坏本地动、植物相，危及本地濒危动、植物的生存，造成生物多样性的丧失。 3 1 破坏生物多样性，危害生态系统 一个地区生态系统的形成往往要经过漫长的时间，稳定的生态系统是该地区 的人、动物、植物和微生物和睦相处的基础。某些外来植物引入后，依靠其繁殖 能力强、生长速度快等优势，压制或排挤本地植物的生长，形成了单一优势种群， 导致本地植物的种类和数量减少，甚至灭绝，破坏了原有的生物多样性，打破了 固有的生态平衡，使得原有的生态链断裂，其后果是难以估量。凤眼莲又称风眼 兰、水葫芦，原产南美，1 9 0 1 年作为花卉引入中国，并曾作为观赏和猪饲料及 净化水质植物推广种植，后逸为野生晰l 。由于其无性繁殖速度极快，现已广泛 分布于华北、华东、华中和华南的大部分省、市，尤以云南、江苏、浙江、福建、 四川、湖南、湖北等省和河南省南部较为严型6 1 。在河、湖、水塘中疯狂繁殖的 水葫芦覆盖着水面，使得其它水下生物由于长期得不到阳光而面临着灭顶之灾， 如水葫芦使得昆明滇池草海1 6 种高等植物只剩下3 种，6 0 种原生鱼种中的3 8 种面临灭绝【”。在我国西南大部分地区，紫茎泽兰的肆虐使得当地原有的植物群 落迅速衰退和消失，严重威胁到我国的生物多样性重点地区一西双版纳自然保护 区内许多物种的生存和发展。薇甘菊以其种子多、传播快、生命力强等优势在珠 江三角洲迅速蔓延，它攀缘、缠绕和覆盖其它植物，使得其它植物因长期缺少日 照而枯萎、死亡；目前，薇甘菊占领了国家级自然保护区内伶仃岛约5 0 的面积， 使猕猴、穿山甲、蟒蛇等国家重点保护动物面临着严重的食料短缺局面，使岛上 生物多样性受到了严重的威胁。外来植物互米花草目前已经成为整个上海崇明岛 的绝对霸主，它导致鱼类、贝类因缺乏食物而大量死亡，水产养殖业遭受致命创 伤，而生物链断裂又直接影响了以小鱼为食的岛上鸟类的生存。 3 2 与人类争夺地盘、危害农林牧渔业生产 由我国引入的野葛在美国很多地区泛滥成灾，它像绿色地毯一样覆盖在这些 地区的大地和其它植物上，使得人们耕种、居住都无法进行。 湖北大学硕士学位论文 在我国，水葫芦在江河湖塘等水面疯狂的生长，使得水产养殖和水面种植都 无法进行，并且堵塞航运，造成的经济损失无法估计，仅上海、江苏、广东、昆 明等地每年打捞水葫芦的费用达数十亿人民币。在四川省凉山彝族自治州1 5 个 县横行霸道的紫茎泽兰，侵占了1 5 的山林和草场，并以每年约3 0 公里的速度 向北、向东扩散蔓延。紫茎泽兰所到之处，原有的植物均被“排挤出局”，牛羊喜 吃的草类均告消失，而羊吃了紫茎泽兰则掉毛、生病，母羊不孕，并接二连三死 去，使凉山州的畜牧业遭受了空前打击，每年经济损失达数千万元，严重威胁着 凉山州在“西部大开发”规划中所确定的建立“绿色肉羊基地”的目标。2 0 世纪 6 8 0 年代，我国引进了4 种大米草以保护滩涂，人工种植和自然繁殖使其迅 速的扩散，现在大米草在我国8 0 多个县( 市) 沿海滩涂泛滥成灾，它破坏了滩涂 的生态系统，降低了生物多样性，致使大量鱼类死亡，造成了不可估量的经济损 失，在以水产业闻名全国的“蓝色宝库”福建省霞浦县东吾洋，大米草每年造成的 直接经济损失高达1 0 0 0 万元以上。 3 3 危害人类健康 众所周知，爱滋病、疯牛病、口蹄疫、禽流感等外来微生物对人类健康带来 的危害是巨大的，其实，有些植物的花粉也可以直接危害到人类的健康。虽然我 国有关对植物花粉过敏的人群统计的报道很少，但在美国和其它西方国家，每年 约有1 5 的人受花粉过敏症的侵扰。豚草和三裂叶豚草的花粉是引起人类花粉过 敏的主要病原物，可导致“枯草热”症；每年7 - 9 月，当豚草开花散粉时，体质过 敏者便会发生哮喘、打喷嚏、流清水样鼻涕等症状，体质弱者还可发生其它合并 症，甚至死亡【s l 。目前，豚草已经分布在我国东北、华北、华东、华中地区的1 5 个省市，加上我国人口多、密度大，如果一旦大面积爆发，其后果是不堪设想的。 3 4 污染环境，破坏园林和人文景观 水葫芦的“疯长”不仅破坏湖河的水景，而且大量的水葫芦沉积到水底，腐烂、 发酵后恶化水质，并散发出难闻的气味，严重影响了人们的生活。昆明市在2 0 世 纪7 旺8 0 年代建成了从市内大观河篆塘处滇池一西山的理想的水上旅游线 路，游人可以从昆明市内开始乘船游滇池和西山；但自2 0 世纪9 0 年代初，大 观河和滇池中的水葫芦成灾，覆盖了整个大观河以及部分滇池水面，致使这条黄 金旅游线路被迫取消，原来在大观河两侧的配套的旅游设施只好报废或改做他 用，目前大观河已改建成地下河。外来植物在公园和风景区等景点的生长会破坏 4 第一部分文献综述 园林结构和园林生态，降低园林观赏价值。目前，在我国城镇都建有草坪，外来 植物( 杂草) 的生长与蔓延则是对草坪最大的威胁，它们不仅破坏了草坪的结构， 影响了草坪的美观，而且还传播病虫害，增加了草坪养护的费用，并且也缩短了 草坪的使用寿命，降低了其使用价值。 4 防范外来植物入侵的方法 4 1 加强植物检疫 这种方法是防止外来植物侵入的第一道防线。通常需要制订出检疫对象，严 格检查从境外引入的作物种子、林木、花卉，有机肥料以及一些包装材料，防止 危险性植物随上述材料传入。植物检疫具有将新的外来有害植物抵御于国境之外 的优点，但对于已传入国境的、在国内传播的植物来讲，植物检疫就难以发挥更 大的作用。 4 2 化学方法 化学除草剂具有效果迅速，杀草谱广的特点。但在防除外来植物时，除草剂 往往也杀灭了许多种本地植物，而且化学防除一般费用较高，在大面积山林及一 些自身经济价值相对较低的生态环境( 如草原) 使用往往不经济、也不现实，此外， 对一些特殊环境( 如水库，湖泊) ，化学除草剂是限制使用的。另外对于许多种多 年生外来杂草，大多数除草剂通常只杀灭地上部分，难以清除地下部分，所以需 连续施用，防治效果难以持久。 4 3 人工及机械防除 人工及机械防除有害植物对环境安全，短时间内可迅速杀灭一定范围内的外 来植物。但当有害物种大面积发生时，需要相当多的劳动力，而且人工或机械防 除后，如不妥善处理有害植物残株；这些残株依靠无性繁殖有可能成为新的传播 来源。 4 4 生物防治 生物防治是指从外来有害植物的原产地引进食性专一的天敌将有害植物的 种群密度控制在生态和经济危害水平之下。生物防治方法的基本原理是依据植物 一天敌的生态平衡理论，试图在有害植物的传入地通过引入原产地的天敌因子重 新建立有害植物与天敌之间的相互调节、相互制约机制，恢复和保持这种生态平 衡。天敌一旦在新的生态环境下建立种群，就可能依靠自我繁殖、自我扩散，长 5 湖北大学硕士学位论文 期控制有害植物。因而生物防治具有控效持久、对环境安全、防治成本低廉的优 点。但对于那些要求在短时期内彻底清除的有害植物，生物防治难以发挥良好的 效果。因为从释放天孜到获得明显的控制效果一般需要几年甚至更长的时间。但 是引进天敌防治外来有害植物也具有一定的生态风险性，释放天敌前如不经过谨 慎的、科学的风险分析，引进的天敌很可能成为新的外来入侵生物，从而导致“引 狼入室”的后果。 中国对外来物种危害的认识还很大地局限于病虫害和杂草等造成的严重经 济损失方面，没有意识到外来物种对当地自然生态系统的改变和破坏。对没有造 成严重经济损失的，却正在排挤、取代当地物种，改变当地生态系统的物种没有 给予足够的重视。因而在许多自然植被的恢复过程和园林引种过程中，大规模地 有意或无意引入外来物种，结果必将造成中国当地丰富而特有的生物多样性丧 失。因此，需要加大立法和宣传力度，使人们充分认识到入侵植物的危害。同时， 在植物引种方面尤其要谨慎，对于拟引入的外来植物种类，不论其作何用途，必 需组织包括生物学家、植物检疫人员、环保专家在内的专家组的充分论证，经国 家动植物检疫局批准方可引入、试种，以防止引种后带来生态学灾难。要加强管 理，防止种苗的随意扩散。应进一步健全完善并有效实施植物检疫法及植物引种 条例，从法律上严格约束外来有害植物的传入。 5 植物基因工程在防治外来植物入侵中的作用 5 1 植物基因工程简介 植物基因基因工程技术是利用d n a 重组技术，有计划地在体外通过人工“剪 切”和“拼接”d n a 等方法，构建植物表达载体；将植物表达载体直接转入( 如利 用基因枪) 或者间接转入( 如利用农杆菌介导) 对植物基因组中，并通过植株再 生获得转基因植株，达到改良植物遗传性状的目的。目前，该技术广泛用于提高 植物的抗性( 抗病、抗虫、抗除草剂、抗旱、抗寒等) 、改善品质、提高产量【9 。3 1 ， 并且用于基因工程药物( 疫苗) 生产。 5 2 利用植物基因工程防治外来入侵植物的方法 在引入新的物种时，通过基因工程的方法来控制植物的有性繁殖，使其不能 在引种地无限制地繁殖扩张，或者对某些既有物种进行品种改良，使其危害有所 减少或者消除，在定程度a z , - 3 v a 防治外来植物的入侵及其危害。而培育不育植 6 第一部分文献综述 物，则是这种思路所希望达到的目标。 5 2 1 雄性不育基因工程技术 绒毡层是显花植物花粉发育过程中一种独特的分泌细胞，为发育的小孢子提 供营养物质。在小孢子母细胞完成减数分裂以前，绒毡层能适时地分泌营养物质 和提供能量，对于花粉的正常发育起决定作用。绒毡层的任何变化都可能影响到 小孢子的发育，从而导致雄性不育【。利用组织、器官特异性启动子控制细胞毒 性基因在绒毡层、花药或花粉中特异表达，选择性地破坏绒毡层、花药或花粉， 就可以阻止花粉发育、造成花粉败育，从而导致植物雄性不育。b a m a s e 基因是 h a r t l e y 等在淀粉芽孢杆菌的“r n a 酶r n a 酶抑制因子”防御系统中发现的 r n a s e 基因| 1 5 , 1 6 1 ，利用一些绒毡层特异启动子如t a 2 9 ，驱动b a r n a s e 基因的表达， 转入植物后，成功地得到了雄性不育烟草得到植株【l ”。通过上述途径获得雄性不 育植株还有油菜、水稻、小麦、玉米、甘蓝、番茄等作物。 研究表明，黄酮醇是玉米、烟草、矮牵牛等植物花粉萌发和花粉管生长所必 需的，苯基苯乙烯酮合成酶( c h s ) 是其生物合成的关键酶l l g l 。v a n d e rm e e r 等 首先报道了在矮牵牛属( p e t u n i a ) 中反义r n a 的表达在抑制了黄酮类色素的生物 合成，导致了转基因植株花粉变白，表现出雄性不育的特征，性状呈稳定的显性 遗传【1 9 l 。将这些具有组织专一性的启动子同反义基因或编码裂解酶( 如蛋白酶、 糖昔酶、核酸酶等) 的基因以及适当的标记序列连接后再导入植株，导致p a l 酶 活性降低，黄酮醇缺乏，花粉不萌发，可获得雄性不育的转基因植株，并应用于 杂交种子的生产中。黄科等人通过根癌农杆菌l b a 4 4 0 4 ( 含质粒反义c y p 8 6 mf 基因片段) 介导转化青花菜下胚轴，经卡那霉素选择压下连续选择、扩繁和生根 培养，获得了雄蕊发育不良，花粉不萌发转基因植株。转基因植株自交不能结实， 用转基因植株花粉对正常植株进行人工授粉，不能正常结实，表明转基因植株花 粉是不育的【2 0 1 。 胼胝质是在孢母细胞减数分裂完成后作为小孢子的临时膜分隔所产生的四 分孢子，以防它们之间相互粘连和融合，以及周围二倍体组织或邻近小孢子的影 响。同时也与小孢子外壁的沉积和形成有关。绒毡层中胼胝质酶合成与分泌的特 异性对于花粉的正常发育具有决定性作用。正常情况下，在小孢子形成外壁后， 胼胝质壁被绒毡层分泌出的p l ，3 葡聚糖酶( 胼胝质酶) 所分解，小孢子随后游离 7 湖北大学硕士学位论文 到药室中，该过程有严格的时间性【2 1 捌。w o r r a l l 等基于上述原理利用a 9 启动子 与致病性相关的b 1 ，3 葡聚糖酶基因构成表达质粒转化烟草，使其破坏胼砥质 壁，获得了转基因烟草不育系 2 3 1 。c u r t i s 等将p 1 ，3 葡聚糖酶连接在p s l 启动子 之下，用农杆菌介导法也获得了莴苣的雄性不育植株】。 5 2 2 雌性不育基因工程技术 植物的雌性不育通常是由雌性器官的发育异常而引起的，而正常植物的雌性 器官发育主要指子房的发育( 包括胚珠发育和胚囊形成) 。如果雌性器官中胚珠或 卵细胞发育受阻或败育，就表现出植物雌性不育现象( 包括隐性和显性雌性不 育) 。较典型的植物雌性不育具有一些明显的外观特征，如子房干瘪，无花柱和 柱头，种子发芽率低等，有些雌性不育同时还伴随雄性不育现象【2 卯。外源基因的 引入与植物育性是相关的。g r e e f 等研究了外源d n a 与植株雌性不育的关系，发现 外源d n a 可以首先构成与雌性不育相关的d n a 片段，编码蛋白质或多肽，严重干扰 细胞的功能和代谢：也可以构成某种启动予，在雌蕊细胞中选择性地指导雌性不 育d n a 的表达1 。同样也可以找出在植物雌性器官发育中起重要作用的基因，将 这些基因的特异启动子与细胞毒素基因连接，使细胞毒素基因在相关雌性器官发 育时定位表达，导致器官发育异常，从而获得雌性不育植物。 5 2 3 无籽植物培育技术 无籽果实通常是指果实没有种子、只有少量败育种子或种子数量比正常品种 少的果实。传统的无籽品种选育通常采用杂交育种、芽变、化学或物理因子诱变、 三倍体等方法。但传统育种方法育种进程缓慢，周期较长。随着基因工程在育种 领域的应用，可对单个基因进行操纵，即可对植物转入无籽基因，从而创造出无 籽性状。目前比较成功的基因工程方法是通过转入内源激素代谢或激素信号转导 相关基因诱导单性结实而获得无籽果实，已在番茄、茄子、草莓、树莓和甜瓜上 成功得到转基因无籽果实。s p e r m 等将子房特异表达基因d c f h 9 的启动子与生长 素合成关键基因i a a m ( 色氨酸单加氧酶) 基因融合，转入茄子和烟草后，i a a m 基因在子房特异表达，结果增加了子房生长素含量，获得了无籽茄子和烟草阳。 通过在种子中表达破坏种子发育的基因也可以诱导无籽果实的形成：诱导无籽果 实形成的另一个分子手段是通过转入酶促细胞破坏基因，使其在种子组织中表 第一部分文献综述 达，达到切除种子的目的。k o l t u n o w 等将b a m a s e 基因与大豆贮藏蛋白基因启动 - 子c g i 构建成嵌合基 司c 0 1 b a m a s e ，转入烟草( 有胚乳种子) 和拟南芥( 无胚乳种 子) ，并在心形期胚乳和胚中表达，结果使无胚乳的拟南芥种子显著变小、不育渊。 6 花形态建成的分子生物学基础 花的同源异型基因可以分为a 、b 、c 三个功能组，花器官性质的决定可以 用a b c 模型说明，a b c 模型是在研究拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) 突变体的基础 上建立的。拟南芥的花与其它许多花一样，由4 个轮( 花轮) 组成。最外侧的轮l 由4 个萼片组成，其内侧的轮2 有4 个花瓣，再内侧的轮3 有6 个雄蕊，最内侧 的轮4 是由2 个融合的心皮组成的雌蕊1 2 9 l 。a b c 模型就是将3 个同源异型基因 族分为3 种功能不同的基因组，每个组的基因在相邻的两个轮内起作用【3 0 】。a 功 能组基因a p e t a l a i ( a p l ) 、a p e t a l a ( a p 2 ) 在轮1 和轮2 ，特化萼片和花瓣的 形成，同时抑制c 功能基因在轮1 和轮2 的活性；b 功能组基因a p e t a l a 3 ( a p 3 ) 、 p i s t i l i a t a ( p i ) 在轮2 和轮3 ，特化花瓣和雄蕊的形成；c 功能组基因 a g a m o u s ( a g ) 在轮3 和轮4 起作用，对雄蕊和心皮的形成是必要的，同时又 有抑制a 功能基因在轮3 和轮4 的活性。哪一轮形成哪个器官决定于3 个功能 组基因的组合。只有a 功能组基因起作用时形成萼片，a 和b 功能组基因共同 起作用时形成花瓣，b 和c 功能组基因共同起作用时形成雄蕊，只有c 功能组 基因起作用时形成雌蕊。 9 塑韭盔兰塑主兰垡堡壅 第二部分材料与方法 1 实验材料 撞逝挝挝：在m s 培养基上生长的烟草( n i c o t i a n at a b a c u m mc v x a n t h i n ) 无菌 组培苗：拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) 。 苴登复载签：大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o i l ) 菌株d h 5 a ，根癌农杆菌( a g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n s ) 菌株e h a 一1 0 5 ，p u c l 9 一t a 2 9 b a r n a s e - n o s 载体，p c a m b i a - 1 3 0 5 1 系列载体，均由本实验室保藏。 2 试剂与溶液 本实验各种限制性内切酶、t 4d n a 连接酶、e x 砌酶，p c r 产物克隆载 体均购自t a k a r a 公司。d n ap c rp u r ek i t 和d n ag e le x t r a c t i o nk i t 购自v i t a g e n e 公司，t r y p t o n e 、y e a s te x t r a c t 为o x i o d 产品，其他生化试剂均为a r 或以上级。 实验溶液： ( 1 ) 溶液i ：5 0 m mg l u c o s e ，2 5 m mt r i s 。h c i ( p h 8 o ) ，1 0 r a me d t a ( p h 8 ，o ) ( 2 ) 溶液i i ：0 , 2 m n a o h ，i s d s ( 3 ) 溶液i i h5 mk a c ( 6 0 m l ) ，c h 3 c o o h ( i1 5 m l ) ，h 2 0 ( 2 8 5 m l ) ( 4 ) t e 缓冲液：1 0 m m i r i s h c i ( p h 8 o ) ，l m me d t a ( , p h 8 0 ) ( 5 ) 2 4 ：1 ：v ) 氯仿：异戊醇 ( 6 ) 4 mn h 4 a c ，5 mk a c ，3 mn a a c ( 7 ) i m l i a c ( 8 ) 1 0 s d s ，2 0 s d s ( 室温存放) ( 9 ) 5 0 x t a e 电泳缓冲液：2 4 2 9t r i s ，5 7 1 m l 冰乙酸，l o o m l0 5 me d t a ( p h 8 ，0 ) 室温存放 ( 1 0 ) 农杆菌裂解缓冲液：2 t r i t o n - x 1 0 0 ， 1 s d s ，1 0 0 m mn a c i ，l o m m t r i s 。h c l ( p h 8 ，l m me d t a ( 1 1 ) s t e ：1 0 0 m mn a c l ，1 0 m mt r i s 。h c i ( p h 8 0 ) ，l m me d t a ( p h 8 o ) ( 1 2 ) t e ：5 0 m mt r i s h c i ( p h 8 o ) ，1 0 m me d t a ( p h 8 o ) ( 1 3 ) 抽提缓冲液：1 0 0 m mt r i s t t c l ( p h 8 o ) ，5 0r e l y le d t a ( p h 8 o ) ，5 0 0m v ln a c i ， 1 0 r a m 巯基乙醇 l d 第二部分材料与方法 ( 1 4 ) 氨苄青霉素( a m p i c i l l i n ) ：1 0 0 r a g h a ( 水溶，过滤除菌，- 2 0 c 保存) ( 1 5 ) 卡那霉素( k a n a m y c i n ) ：1 0 0 m g m l ( 水溶，过滤除菌，- 2 0 c 保存) ( 1 6 ) t i m e n t i n ：1 0 0 m g m l ( 水溶，过滤除菌，一2 0 。c 保存) ( 1 7 ) 利福平( r i f a m p i e i n ) ：1 0 0 m g m l ( 无水乙醇溶，- 2 0 c 保存) ； ( 1 8 ) 乙酰丁香酮( a c e t o s y r i n g o n e ) ：1 0 0 m m o l m l ( 无水乙醇溶，- 2 0 c 保存) 3 拟南芥基因组d n a 的提取( c t a b 法) ( 1 ) 称取3 0 0 - - - 4 0 0 r a g 低压冷冻叶片材料，加入液氮迅速研磨成粉末，置于3 0 m l 离心管。 ( 2 ) 向离心管中加入9 m lc t a bb u f f e r ( 事先6 5 ( 2 预热) 。 ( 3 ) 6 5 水浴保温9 0 分钟，其问不断摇匀( 温和摇动) 。 ( 4 ) 将离心管取出，室温放置5 分钟，等c t a b 冷却到4 0 * ( 2 以下，加入4 5 m l 氯仿：异戊醇( 2 4 ：1 ) ，温和颠倒混匀l o 分钟。 ( 5 ) 室温离心，4 0 0 0 转离心1 0 分钟( 不能低于1 5 ，否则影响c t a b 效果) 。 ( 6 ) 将上清液转入新离心管，加入4 5 m l 氯仿：异戊醇( 2 4 ：1 ) ，温和颠倒混 匀l o 分钟，于室温4 0 0 0 转离心1 0 分钟。 ( 7 ) 将上清液转入新离心管，加入3 0 m r n a 酶( 1 0 r a g l ) ，温和混匀，于3 7 c 反映1 h 。 ( 8 ) 加入6 m l 异戊醇，轻轻摇匀，- 2 0 ( 2 冰箱放置2 0 分钟，于4 c 离心，8 0 0 0 转离心1 0 分钟( 离心机要提前开机预冷) 。 ( 9 ) 弃上清液，稍微吸干残留液体，向离心管中加入2 m lt e ，使d n a 溶解，4 c 放置6 - 1 2 h ，使其充分溶解。 ( 1 0 ) 将溶有d n a 的2 m li 1 3 分装入1 5 m l 小离心管，每管分装o 4 m l 。 ( 1 1 ) 加入等体积的酚：氯仿( 1 ：1 ) 4 0 c 叭，颠倒混匀，4 0 0 0 转离心5 分钟。 ( 1 2 ) 将上清液转入新的离心管，加9 0 0 p 1 无水乙醇( 事先冷冻) 颠倒混匀，2 0 ( 2 冰箱放置1 5 分钟，1 4 0 0 0 转离心1 0 分钟。 ( 1 3 ) 弃上清液，加i m l7 5 乙醇清洗d n a 沉淀，颠倒混匀，倒去上清液，滤 纸吸干，加5 0 5 t lt e 溶解，置于2 0 保存。 4 大肠杆菌，农杆菌感受态细胞制备及转化 4 1 大肠杆菌d h s a 感受态细胞的制备及转化： 盛墅盔绁照剑备； 湖北大学硕士学位论文 ( 1 ) 从保存菌种的平板上挑取单菌落，接种于盛有3 m ll b 液体培养基的试管中r 置于3 t c 摇床中震荡过夜，摇床转速为2 5 0 r p m 。 ( 2 ) 吸取l m l 菌液，接种于5 0 m ll b 液体培养基中放大培养( 5 0 0 m l 锥形瓶) ， 于3 7 。c 摇床中震荡培养4 h 左右，测得o d 6 0 0 达到o 5 左右即可开始制备感 受态细胞。 ( 3 ) 将菌液倒入3 0 m l 的预冷离心管中，冰上放置l o 分钟预冷，于4 c 下、4 0 0 0 r p m 离心1 0 分钟，弃上清液，让离心管中液体流尽。 ( 4 ) 加入2 0 m l 事先预冷的t s b 培养基，充分摇匀。 ( 5 ) 加入2 5 m l t s b 悬浮沉淀，加o 5 m l 事先灭菌后预冷的甘油( 防冻) 。 ( 6 ) 迅速将制备好的感受态细胞分装入预冷的1 s m l 离心管，1 5 0 州管，迅速置 于液氮中保存。 上述步骤均应实行无菌操作，需要事先灭菌，预冷的实验器具包括：移液器 枪头，甘油，1 5 m l 离心管，3 0 m l 离心管，t s b 培养基。制备过程中应尽量在冰 上操作，动作应迅速，以防温度升高导致感受态细胞失去活力。 筮业生翌! ( 1 ) 向装有感受态细胞的1 5 m l 离心管中加入待转化的质粒或者d n a 连接反应 溶液，于冰上放置3 0 分钟。 ( 2 ) 4 2 c 水浴热激9 0 秒，然后立即放于冰中2 分钟；向离心管中加入8 5 0 1 , t ls o c 培养基，置于3 7 摇床上培养1 h 。 ( 3 ) 将涂布有相应抗生索的平板，于3 t c 培养1 2 1 4 h ，挑取单菌落活化培养， 提取质粒d n a ，验证感受效率。 4 2 根癌农杆菌e h a 1 0 5 感受态细胞的制备及转化 盛受查绁跑剑备； 挑取e h a l 0 5 单菌落接种于含p d f 5 0 m g l 的1 0 m l y e p 液体培养基中2 8 c ， 2 5 0 转振摇培养至培养液变浑浊；取2 m l 的培养物加到5 0 m l 含相同的抗生素的 y e p 液体培养基中，2 8 c 振摇培养至o d 6 0 0 达到o 5 o 8 左右时，在无菌条件下 将菌液分装于4 0 m l 的离心管中，冰浴1 0 m i n 后，在4 c 、5 0 0 0 r p m 下离心5 m i n ： 弃上清，用1 0 m l 冰冷的2 0 m mc a c h 重悬菌体；再在4 、5 0 0 0 r p m 下离心5 m i n ， 弃上清；每管加入0 5 m l 冰冷的2 0 m mc a c h 重悬菌体，以l o o 此分装到预冷的 第二部分材科与方法 1 5 m l 的离心管中。 整丝生骤： 将待转化的质粒d n a 加到1 0 0 此感受态细胞中，混匀后置于冰上5 r a i n ，然 后转入液氮中处理5 m i n ，置于3 7 c 中水浴5 m i n 后，加入l m l 的y e p 液体培养 基中，混匀，2 8 c 振摇培养4 h ，在4 、5 0 0 0 r p m 下离心5 m i n ，弃上清，加入 1 0 0 p l