（应用化学专业论文）荧光微球的分散聚合法制备与表征.pdf

摘要 摘要 荧光微球是一种新型功能高分子材料，广泛应用于生物医学工程中。目前我国实际生产 中应用的荧光微球。全部依赖进口。因此研究荧光微球的制各方法具有重要的现实意义。论 文首先制各了丹磺酰氯烯丙基胺荧光单体。并以丹磺酰氯烯丙基胺和八羟基喹啉铝作为荧光 单体制备出4 种不同大小、体系的荧光微球，对单体的结构以及荧光微球的粒径及粒径分布 等进行了表征。 以偶氮二异丁腈( a i b n ) 为引发剂，聚乙烯吡咯烷酮( p v p ) 为分散剂，在甲酵水混合溶剂 中，采用分散共聚法通过优化反应条件，制备出了粒径在5 0 0 姗、p d i 在0 2 左右的单分散 苯乙烯与丹磺酰氯烯丙基胺共聚荧光微球，其荧光发射峰位于5 1 5 n m 。 以偶氮二异丁腈( a i b n ) 为引发剂，聚乙烯吡咯烷酮( p v p ) 为分散剂，在甲醇水混合溶剂 中，采用分散共聚法通过优化反应条件，制备出了粒径在1 6 1 91 1m 、p d i 在0 4 左右的单分 散甲基丙烯酸甲酯与丹磺酰氯烯丙基胺共聚荧光微球，其荧光发射峰位于5 2 0 h m 。 采用分散共聚法，制各出了粒径在5 0 0 衄、p d i 在0 2 左右的单分散苯乙烯丹磺酰氯 烯丙基胺共聚荧光微球种子；然后采用动力学种子溶胀法制备出了粒径在2 0 0 0 n m 左右的大 粒径苯乙烯丹磺酰氯烯丙基胺荧光微球，胀大倍数接近4 倍。 采用物理包覆聚合法通过优化反应条件，制备出了粒径在3 - 5um 、p d i 在0 3 左右的甲 基丙烯酸甲酯一八羟基喹啉铝聚合荧光微球。并对添加荧光物质a 1 q 3 的分散聚合与普通分散 聚合进行了研究。 关键词：荧光微球、分散聚合、丹磺酰氯烯丙基胺、种子溶胀、物理包覆 东南大学硕士学位论文 a b s t r a c t f l u o r e s c e n tm i c r o s p h e r ei san e wk i n do ff u n c t i o n a lp o l y m e rm a t e r i a lw h i c hi sm a i n l yi n b i o m e d i c a le n g i n e e r i n ga 舰s t u d i e so nt h ep r e p a r a t i o no f t h ef l u o r e s c e n tm i c r o s p h e r ea r eo f g r e a t p r a c t i c a ls i g n i f i c a n c eb e c a u s et h i sk i n do fm a t e r i a lu s e di nc h i n ai si m p o r t e d i nt h i sp a p e r , d a n s y l a l l y l a m i n em o n o m e rw a ss y n t h e s i z e da n df o u rk i n d so ff l u o r e s c e n tm i c r o s p h e r e sw e m p r e p a r e d w i t h d a n s y l a l l y l a m i n e o ra 1 q 3a sm o n o m e rb yc o p o l y m e r i z a t i o na n dp h y s i c a l m e t h o d s t h es h u c t a r eo f t h em o n o m e ra n ds i z ea n ds i z ed i s t r i b u t i o nw mc h a r a c t e r i z e d n e wm o n o d i s p e r s ef l u o r e s c e n tm i c r o s p h e r e sw i t ht h es i z ea b o u t5 0 0n ma n dp d l0 2w e r e p r e p a r e db yd i s p e r s i o np o l y m e r i z a t i o no fd a n s y l a l l y l a m i n e w i t hs t y r e n ei nm e t h a n o l w a t e r r e a c t i o nm e d i a u s i n gp o l y v i n y l p y r r o l i d o n e 俨v p ) a sas t e r i cs t a b i l i z e ra n d 2 , 2 - a z o b i s i z o b u t y r o n i t r i l e ( a i b n ) a sa ni n i t i a t o ri ns u i t a b l ec o n d i t i o nf o ri m p l o i t i n gt h em e t h o d o f c o p o l y m e rf l u o r e s c e n tm i c r o s p h e r e s t h em i c r o s p h e r e se m i ta t5 1 5n m n e wm o n o d i s p e r s ef l u o r e s c e n tm i c r o s p h e r e sw i t ht h es i z ea b o u t1 6 1 9uma n dp d l0 4w e r c p r e p a r e db yd i s p e r s i o np o l y m e r i z a t i o n o fd a n s y l a l l y l a m i n ew i t h m e t h y lm e t h a c r y l a t e i n m e t h a n o l w a t e rr e a c t i o nm e d i am i l l gp o l y v i n y l p y r r o l i d o n e ( p v p ) i sas t e r i cs t a b i l i z e ra n d 2 , 2 - a z o b i s i z o b u t y r o n i t r i l e ( a i b n ) a s 锄i n i t i a t o ri ns u i t a b l ec o n d i t i o nf o ri m p l o i t i n gt h em e t h o d o f c o p o l y m e rf l u o r e s c e n tm i c r u s p h e r a s t h em i c r o s p h e r e se m i ta t5 2 0n l n s e e dp a r t i c l e sw i t ht h es i z ea b o u t5 0 0n n la n dp d l0 2 , w a sp r e p a r e da n dt h a nw e l ef u r t h e r s w o l l e nt 0a b o u tf o u rt i m e si nd i a m e t e rb ym e a n so f d y m a n i cs w e l l i n gm e t h o d f l u o r e s c e n tm i c r o s p h e r e sb yp h y s i c a le n c a p s u l a t i n gm e t h o do fm e t h y lm e t h a c r y l a t ea n da i q 3 w i t l lt h es i z ea b o u t3 - 51 1ma n dp d l0 2w e r ep r e p a r e d k e y w o r d s ：f l u o r e s c e n tm i e r o s p h e r e ；d i s p e r s i o np o l y m e r i z a t i o n ；d a n s y l a l l y l a m i n e ；s e e d s w e l l i n g ；p h y s i c a le n c a p s u l a t i n g i i 东南大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包 含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育 机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：馥日期：碰侄乡 东南大学学位论文使用授权声明 东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学 位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外， 允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括刊登) 论文的全部或部分内容。论文 的公布( 包括刊登) 授权东南大学研究生院办理。 研究生签名： 名：纠彳 b 强9 州。年j 弓j 第一章绪论 1 1 前言 第一章绪论 白1 9 5 5 年美国里海大学乳液聚合物研究所v a n d e r h o f l 匍b r o d f o r d 公布他们制备高度均一 粒径的聚苯乙烯微球的方法i l 】以来，高聚物微球的制各己成为高分子科学的一个新的研究领 域。目前，多功能、高性能聚合物微球的合成备受人们关注，并取得了一定的成果，己开发制 备出一系列具有不同分子量、不同结构、不同表面特性及功能的聚合物微球。功能性聚合物 微球以其本身固有的比表面积大、吸附性强、凝集作用大和表面反应能力强等特性，以及人 们根据不同的用途而赋予的各种性状如生物特异结合性，中空多孔性、磁性、荧光性等，在 标准计量、生物化学、免疫医学、分析化学、化学工业、情报信息、微电子领域以及某些高 新技术领域得到广泛的应用。其中。荧光微球便是一种特殊的功能高分子微球，由于其具有 稳定的形态结构及稳定而高效的发光效率，在许多领域尤其是生物医学领域有很重要的应 用【2 】。目前，国内在各个领域应用的荧光微球基本上全部依赖进口，而国内的有关荧光微球 研究的报道仅限于有限的专利1 3 , 4 1 ，因此，当务之急是迅速建立起在此领域的研究体系，通过 对荧光微球的制备方法的研究，扩展荧光微球的品种，通过对载体与荧光物质的相互作用的 研究。制备出更稳定及具有更高量子效率和光谱范围的荧光微球，以扩大其应用范围和深入 其应用程度，并且能够使荧光微球国产化，这对于我国生物医学工程发展具有重要的意义。 东南大学硕士学位论文 1 2 文献综述 1 2 1 荧光微球的定义及分类 荧光微球是指直径在纳米级至微米级范围内，负载有荧光物质，受外界能量刺激能激发出 荧光的固体微粒。其外形可为任意形状，典型外形为球形。荧光微球的载体多为有机或无机 聚合物材料。它具有相对稳定的形态结构以及发光行为。受外界条件如溶剂、热、电、磁等 的影响比纯粹的荧光化合物小。根据载体及荧光物质的不同，荧光微球可分为两类：( 1 ) 无机， 有机荧光微球；( 2 ) 有桃有机荧光微球。 1 无机，有机荧光微球 此类荧光微球可分为两种，一是以无机材料为载体，而荧光物质为有机化合物。典型的 无机载体为硅胶。如m a k a r o v a 5 1 等以中空的硅胶“纳米微泡”包覆荧光物质荧光素异硫氰酸 酮d ( f i t c ) ，获得了纳米荧光探针。t r a u 与b a n e r s b y 【6 】贝0 报道了以硅胶为载体的荧光微球在药 物及基因的高通量筛选中的应用。二是以有机高分子为载体，荧光物质为无机物。b a r b e m - - o u i u e m 【7 】将带有活性基团的聚合物微球与带有活性基团( 如氨基酸、羧酸等) 的无机荧光纳 米晶体( 半导体微晶或金属氧化物掺杂微晶) 相结合，制备了聚合物荧光微球，直径从零点几 微米到几百微米不等，可用于多对象的混合检测，其荧光强度高于传统的荧光微球。 2 有机有机荧光微球 此类荧光微球的载体是合成或天然高分子材料，其负载的荧光物质是有机物。r e m b a u m 嗍以带可自由基聚合官能团的荧光物质( 结构为f - a b o ，其中f 为发色基，o 为双键，a ，b 为可 相互缩合的官能团) 与带活性官能团( 如- o h ，一c o o h 、- n h 2 、- c n ) 的丙烯酸类单体进行 水相悬浮聚合，并用交联剂交联得到高光量子、高稳定性且生物相容的聚合物荧光微球。其 平均直径为7 u m 。将其标记细胞膜，可探测膜上受体的性质、数量及分布情况。 h a u g l a n d t 9 , 1 0 】等在其专利中报道了一类有机，有机荧光微球的制备及应用。此类荧光微球 用未标记的大分子微球在荧光物质的有机溶液中染色而得，而荧光物质是多种荧光染料的 混合物，其发射峰和激发峰可依次叠加，造成染料系列中的能量转移，从而增大整个荧光微 球的s t o k e s 转移，使检测更加准确灵敏。在所得到的荧光微球外部敷涂功能基，可与生物活 性基团结合。从而能与被检测物结合并对其进行检测。其优点是可对目标物进行多个或单个 标记与检测。 2 第一章绪论 1 2 2 荧光微球的制备方法 1 吸附法( 染色法) 此种方法多用于有机，有机荧光微球的制备。有机荧光材料一般为非水溶性的物质，将其 溶解在丙酮、酒精等水溶性的有机溶剂中，再将其与载体的水分散体系混合，荧光材料即会 析出并被吸附到载体上，如f i 晷1 所示。许多文献降”1 报道了用此种方法制各荧光微球的详细 过程。 o 喇”n 救l bm o rs p h 口1 r c o f i g 1p r e p a r i n gf l u o r e s c e n tm i c r o s p h e r eb yu s i n gd y i n gm e t h o d 2 球外悬挂法 将带有活性基团的荧光材料颗粒与表面带有功能基团的聚合物微球结合，可以获得在 聚合物微球表面悬挂有荧光小球的“大”荧光微球。此法所制备的荧光微球其发光物质是 以“点”状态结合在聚合物微球上的，如f i g 3 所示。c h a n d l e r ( ”1 等在一个微米级的聚合物大 球上结合2 3 个纳米级的荧光小球( 用染色法获得，并外带功能基) 制备了球外悬挂型的荧 光微球可用来对核酸及酶进行检测。 o f i g 3p r e p a r i n gf l u o r e s c e n tm i c r o s p h e r eb yu s i n gh a n g i n gm e t h o d 3 包覆法 通过此种方法，可以制备无机侑机荧光微球及有机堵机荧光微球。其基本原理是将荧 光材料均匀分散在介质中。利用聚合反应、微胶囊化方法或分子自组装方法制备出荧光微 球。制备出的荧光微球几乎都具有明显的核壳结构。包覆法有两种形式，如f i g 2 所示。其 中a 表示荧光材料包在载体内部，b 则恰好相反，表示荧光材料包覆在载体外部。 3 东南大学硕士学位论文 l b n b o 川一 o f i g 2p r e p a r i n gf l u o r e s c e n tm i c r o s p h e r eb yu s i n ge n c a p s u l a t i n gm e t h o d k u m a c h e v a 1 4 j 5 等用多步种子乳液聚合合成了核，壳型荧光微球，其核层为含有荧光物 质的丙烯酸酯聚合物。壳层为丙烯酸酯聚合物连续相。c h e u n g “1 先制备出带羧基、羟乙基、 甲氧基的丙烯酸乳胶粒，其粒径在2 0 0n m 4 0 0 n m ，然后透析除去乳化剂及游离离子，接着 与荧光胺及二胺反应，制各出粒径为3 0 0 h m 的荧光微球，经过测试与计算，每平方微米上有 5 0 0 0 0 0 0 分子的荧光物质，其数量大大超过荧光显微镜测试所需最低限度的1 0 0 0 分子，也远 远超过以前所制备的荧光微球。可以通过在微球表面接上抗体或抗生素蛋白，对细胞表面抗 原及d n a 序列进行测定。经过实验证明，他们所制各的生物荧光微球具有很高的稳定性及 检测灵敏度。s c h w a r d ”1 等利用带功能基的可聚合单体。对体积小于细胞粒度的均匀高分子 微球分散体系进行溶胀聚合反应，得到细胞大小的粒度均匀球体，然后用带功能基的扩链剂 与其反应，再将产物与荧光物质反应得到荧光微球。所得微球被用做流式细胞检测的标样。 另外，利用分子自组装技术，y a n g l l s 等制备了以高聚物为核，荧光薄膜为中间层，免疫球蛋 白为外壳的荧光微球。可用于免疫检测。 4 共聚法 此法是特指带有可聚合官能团的荧光物质与可聚合官能团的有机单体进行聚合所制备 的均一结构的荧光微球。荧光物质在微球中的分布基本上是均匀的，如f i g 4 所示。此种方法 多用于有机，有机荧光微球的制备。前述r e m b a m 【8 l 制备荧光微球的方法即为共聚法的典型 例子。 婚瓣刚 l 蝴；日_ - h o f l wl p h r t f i g 4p r e p a r i n gf l u o r e s c e n tm i e r o s p h e r eb yu s i n ge o p o l y m e r i z i n gm e t h o d 4 第一章绪论 上述四种方法皆为单一性制备方法，实际上。很多情况下是将上述诸方法结合用以制备 荧光微球。z h a n g ”1 等将染色法和共聚法共用制备了一类颇具特色的新型荧光微球。其中至 少含有一个球形( 球壳形) 荧光物质区域，其截面表现为与球同心的环形或圆盘，如果含有 两种以上的荧光物质，两光环边界不产生弥散，通过光谱特征或光强很容易进行甄别与测 定。其方法是先用染色法获得核层浅层染色的微球，然后利用种子聚合法与可聚合荧光单体 或非荧光单体共聚获得多层荧光微球，最后将微球进行浅表染色获得多荧光区域的荧光微 球。 1 2 3 荧光微球的应用 1 生命科学研究及生物医学工程研究中的应用 荧光微球在生命科学及生物医学工程研究中有其重要的应用刚。如：( 1 ) 细胞表面抗原 的检测，包括c d 4 p c d 8 表面抗原的绝对计数；细胞表面低丰度表达受体的分析；骨髓移植受体 内供体红细胞的检测；白色念珠菌抗原检测等。( 2 ) 退行性神经病变示踪物，荧光微球具有无 毒、与神经细胞结合时间长以及受注射部位影响极小的特点。( 3 ) 吞噬功能的检测，0 1 6 2 1 0 um 大小的荧光微球适合于这一类的研究，如分析大鼠中性粒细胞、人横纹导管细胞、小鼠 腹膜巨噬细胞、人多核白细胞的吞噬功能或不同调理素调理作用对吞噬功能的影响等。( 4 ) 血流分析，1 0 1 5um 大小7 种颜色的荧光可供研究组织中局部血流情况，如肿瘤脉管血流 速率、视网膜和脉络膜循环、肺泡微管的功能直径定位等。( 5 ) 敏感性诊断试剂，如替代一些 已开展应用的微球诊断试验：胶乳凝集试验、微球捕获e l a s a 、双位点夹心法等，它较传统比 色方法更为灵敏：另有新近诞生的流式微球分析技术( c y t o m e t r i eb e a da r r a yc b a ) 通过将不 同荧光强度的聚苯乙烯微球包被上多种高特异性的单克隆抗体。在微球“三明治”平台上进 行可溶性蛋白的检测，由此而使得i 份微量标本可同时1 次定量分析多种可溶性蛋白，大大节 约了样本量和操作时间，灵敏度也较传统的e l l s a 方法更高，重复性好。( 6 ) 质量控传蛇l o pm 直径，大小均一，表面定量吸附不同荧光素的树脂颗粒可用于流式细胞仪的质控，在样品测 试前调整仪器对测试信号的放大系数，以保证各次实验结果具有高度的重复性，这类微球标准 品按其应用被分为以下2 类：即定量荧光标准微球和准值荧光标准微球。 2 在高通量药物筛选中的应用 所谓高通量药物筛选饵t s ) ，是使用机器人和自动化系统，从大量的样本中鉴别出对确 5 东南大学硕士学位论文 定的分子靶标有相互作用的少量活性化合物的一种现代药物筛选技术。它是利用已有的化合 物进行筛选，是一种大规模，高效率、高灵敏度的筛选方法【2 l j 邻近闪烁分析( s p a ) 的发 展促进了h t s 的开发与发展。其基本原理是通过亲和结合，将放射配基结合到具有受体的闪 烁球体( 荧光微球) 上，从而产生光子，避免了放射配体标记分析中的游离配基与结合配基 的分离过程，使得放射配基分析可以以全自动化的方式进行圈。使荧光微球表面带上能与被 检测物结合的配体，被检测物被放射标记，当将两种物体混合，能与微球结合的被检测物的 放射能激发荧光物质产生荧光，而不能与微球结合的被检测物，由于距离较远，其放射能在 水中湮灭，不能激发荧光，从而可以对其进行不分离产物的检测，减少成本及放射性危险 【“】。由此可见荧光微球在药物的高通量筛选中的重要地位。在h t s 中。既可以使用无机有机 荧光微球，如t r a u 与b 甜e r s b 严1 报道的以硅胶为载体的荧光微球在药物及基因的高通量筛 选中的应用；又可以使用有机，有机荧光微球进行筛选，d e s m a r a i s p 3 1 等在其专利中使用有机 有机荧光微球来检测磷酸酶和蛋白酶即为一例。 1 2 4 丹磺酰氯的合成 丹磺酰氯( d a n s y l - c i ) 。化学名为：n n 二甲氨基一5 一萘磺酰氯；英文名为： 1 - d i m c t h y l a m i n o n a p h t a a l e n e - 5 一s u l f o n y lc h l o r i d e ；化学式为：c 1 2 h 1 2 c i n 0 2 s ；结构式如下： s 0 2 c l 丹磺酰氯是一种常见的荧光标记物，其荧光量子产率、最大荧光发射波长位置以及荧光 各向异性等基本荧光行为与其所处微环境性质密切相关，因此在生物医学工程方面有着广泛 的应用，不但可用作标记核酸、蛋白质、氨基酸 2 4 1 ，还可用作合成各种荧光单体以用于制备 能用于免疫学和血液学等医学检测的功能性荧光微球 2 5 1 。目前国内丹磺酰氯主要依赖进口， 价格非常昂贵。因此，研究丹磺酰氯及含丹磺酰的荧光单体的实验室合成具有重大的意义。 文献报道的合成路线如下： 6 第一章绪论 n a h c 0 3 其中，第一步反应为1 氨基6 萘磺酸的二甲基化，利用1 一氨基5 萘磺酸和碳酸氢钠为原 料，慢慢滴加甲基化试剂硫酸二甲酯，保持温度5 - 6 c ，反应5 d , 时；然后升温至6 0 7 0 ( 2 并 保持3 0 分钟。冷至室温，浓盐酸调节p h 值到1 ，过滤得固体，以盐酸重结晶两次得n n 一二甲 氨基一5 萘磺酸白色片状晶体。 第二步反应为n , n - 二甲氨基5 萘磺酸磺酰化合成丹磺酰氯，文献报道有两种方法：方 法一，以二氯亚砜作酰化剂并以二甲胺基甲酰胺( d 仃) 作溶剂脚；方法二，以五氯化磷作酰 化剂在无溶剂存在下进行固相反应制备伽。 1 2 5 分散聚合微球制备技术 制各聚合物微球的传统方法是乳液聚合法和悬浮聚合法。乳液聚合只能制备粒径为 0 1 0 7 u m 的颗粒，悬浮聚合制备的聚合物微球粒径则一般在1 0 0 1 0 0 0 u m 之间，且是多分散 性的。采用无皂或低皂乳液聚合法制成的单分散聚合物微球粒径接近l u m ，但难于制备粒径大 于l u r e 的聚合物微球。如何获得单分散性微米级聚合物微球，引起了不少科学家的兴趣。近年 来国内外学者对制备微米级微球的各种聚合方法进行了深入研究，表l 列出了各种制备聚合 物微球的方法口q 。其中分散聚合法和种子溶胀法被认为是两种比较有效的方法。种子溶胀 法的反应条件苛刻，难于控制，分散聚合则可以一步获得微米级粒度均匀的产品，并且适用于 不同类型单体的聚合。目前国内外学者在制备微米级单分散聚合物微球时多采用分散聚合方 法。 7 $ $ 刚 东南大学硕士学位论文 囊1 几乎喇备聚仓钧徽球雕聚舟方法比较 分散聚合是一种新的聚合方法，于2 0 世纪7 0 年代由英国i c 公司的研究者们最先提出。分 散聚合是由于涂料工业界为了改变乙烯基涂料和丙烯酸酯类涂料的成膜依赖于稀溶液多次 涂布的状况，通过采用以有机溶剂为介质分散相，从而形成稳定的胶态分散体系以取代传统 的有机高分子溶液类涂料而发展起来的。分散聚合是一种由溶于有机溶剂( 或水) 的单体通过 聚合生成不溶于该溶剂的聚合物，而且形成胶态稳定的分散体系的聚合工艺。体系的胶态稳 定性来源于聚合物粒子表面吸附存在于连续相中的两亲高分子稳定剂或分散剂，其本质为 立体稳定作用。因此，分散聚合也可以认为是一种特殊的沉淀聚合，其产物的聚集受到阻碍， 且粒子尺寸得到控制。和一般沉淀聚合的区别在于。分散聚合沉析出来的聚合物不是形成粉 末状或块状，而是聚结成小颗粒，并借助于分散剂悬浮在介质中，形成类似于聚合物乳液的稳 定分散体系。 1 分散聚合机理 分散聚合的典型配方为：4 0 6 0 的溶剂或混合溶剂，3 0 5 0 单体或混合单体，3 1 0 的分散剂，单体量1 的引发剂及诸如助分散剂和链转移剂等其它添加剂。目前，对分散聚 合的机理研究尚不充分，主要倾向于两种机理，一是齐聚物沉淀机理，二是接枝共聚物聚结机 理，其机理示意图如图l ，图2 所示。大多数人则认为在聚合过程中两种机理都存在，他们将 分散聚合过程分为如下几个阶段：反应开始前 单体，分散剂及引发剂都溶解在介质中，当反应 温度上升至引发剂分解温度时，引发剂分解产生自由基，引发单体聚合；当反应生成的齐聚物 链长达到某一些临界值时，就独自或相互聚结成核，并从介质中析出；这些核又相互聚结而形 成聚合物粒子，与此同时也吸附分散剂以及分散剂与聚合物链所生成的接枝共聚物，使其颗粒 得以稳定；在颗粒成欧阶段聚合物粒子将继续吸收介质中的单体与齐聚物，捕获游离的核，并 在颗粒内部聚合而使其粒径逐渐增大，直至反应结束。在分散聚合中，从成核聚结到聚合物粒 子形成。是反应体系由均相到非均相的转变时期。这一转变虽然持续时间很短，但却决定了整 个体系中所形成聚合物的颗粒数目，而且颗粒数目在随后的反应中应当保持不变，才能最终获 8 第一章绪论 得粒度均匀的产品。 之，毫昂7 乏 认之一 ，i - ， 、i 。、，v 4 f ：、夕 。， r jl e i f b j ( 1 1 ：；i 笋” 1 0pm 的单分散聚合物微球。该方 法适用于各种疏水单体的聚合，可用低碳脂肪酵作分散介质。目前研究最多的仍然是醇和水 体系，在该体系下可以制备粒径达到近2 0t tm 的微球。 东南大学硕士学位论文 1 2 7 荧光微球的市场需求和开发前景 目前，荧光微球分析技术是一项新兴的生物医学技术，在生命科学研究的各个领域有着 十分广泛的应用，国内的免疫学检验以及高通量药物筛选等领域中用到的各种荧光微球 1 0 0 依赖进口，价格十分昂贵，基本上单价在2 0 0 0 - 5 0 0 0 元r _ , m l ，因此，同过实验研究，使得 荧光微球国产化，不但具有十分重要的经济意义，而且对于我国科技领域填补这项技术空白 有着现实意义。 1 2 8 本文研究目的及内容 本论文总的思路是分别运用化学方法和物理方法来进行荧光微球的制备。首先，进行荧 光物质的合成，通过合成寻找到一种发光效率稳定，同时又易于制备的有机发光分子；其次， 选择合适的高分子载体，分别运用化学和物理的方法，将荧光物质结合到高分子微球上；最 后，确定一条稳定的制各路线，从而能够制备不同大小，粒径均匀，发光效能稳定的荧光微 球。 1 2 第二章丹磺酰氯烯丙基胺荧光单体的制备 第二章丹磺酰氯烯丙基胺荧光单体的制备 2 1 前言 丹磺酰氯( n n 二甲氨基一5 一萘磺酰氯，d a n s y l - c 1 ) 是一种常见的荧光标记物，其荧光 量子产率、最大荧光发射波长位置以及荧光各向异性等基本荧光行为与其所处微环境性质密 切相关，因此在生物医学工程方面有着广泛的应用，不但可用作标记核酸、蛋白质、氨基酸， 还可用作合成各种荧光单体以用于制备能用于免疫学和血液学等医学检测的功能性荧光微 球。目前国内丹磺酰氯主要依赖进口，价格非常昂贵。因此，研究丹磺酰氯及含丹磺酰的荧 光单体的合成具有重大的意义。 本文以1 氨基5 萘磺酸为原料，经甲基化制成n , n - - - - - 甲氨基5 萘磺酸；然后再用五氯化 磷进行酰氯化制得丹磺酰氯。丹磺酰氯与烯丙基胺进行酰胺化反应得到丹磺酰氯烯丙基胺。 合成路线如下： 2 2 实验部分 2 2 1 试剂与仪器 1 氨基5 萘磺酸 硫酸二甲酯 碳酸氢钠 五氯化磷 烯丙基胺 三乙胺 丙酮 9 9 化学纯 分析纯 化学纯 化学纯 分析纯 分析纯 f l u k a a g 试剂公司 上海凌峰化学试剂有限公司 上海久意化学品有限公司 上海同方精细化工有限公司 山东鲁岳化工有限公司 中国医药集团上海化学试剂有限公司 南京中东化玻仪器有限公司 1 3 $ 芦 笙 $ k 一 $ 器 洲 东南大学硕士学位论文 石油醚分析纯南京化学试剂一厂 搅拌机、真空循环水泵、旋转蒸发仪 红外光谱仪：n i e o l e t - 1 7 0 ( k b r 压片) 核磁共振仪：b r u k e rd r x ( 3 0 0 m h z ) 型 2 2 2 实验方法 1 n n - 二甲氨基5 萘磺酸的合成 在- - d 烧瓶中加入2 9 a 克碳酸氢钠和1 0 0 m l 水，搅拌溶解，然后慢慢加入2 2 3 克1 - 氨 基5 萘磺酸，降温至5 - 6 c ，搅拌3 0 分钟，然后，缓慢滴加2 3 m l 硫酸二甲酯，滴完后在5 - 6 反应5 小时。然后升温至6 0 7 0 c 并保持3 0 分钟。冷至室温，浓h c i 调节p h 到1 ，过滤 得固体，以o 1 n 的盐酸重结晶两次得n , n - z q l 氨基5 萘磺酸白色片状晶体2 2 5 克，产率 9 0 ，m p 2 3 0 c ，i r ( k b r , c m 1 ) ：3 4 2 3 ，3 0 4 8 ，2 6 6 3 ，1 6 4 3 ，1 3 9 6 。 n , n - - - - - 甲氨基5 萘磺酸红外图谱 2 丹磺酰氯的合成 将8 克n n 二甲氨基- 5 萘磺酸与1 1 2 克五氯化磷放入研钵中，加入少量水，研磨2 - 3 小时，然后将糊状物倒入冰水混合物中，有淡黄色固体产生，过滤，真空干燥2 4 小时。将 干燥后的固体用无水乙醚萃取，然后将萃取液蒸干，得到丹磺酰氯的粗品，用石油醚重结晶 两次得到橙黄色晶体4 6 3 克，m p 7 0 7 2 ( 文献，m p 6 9 c o 飞，产率5 4 1 4 第二章丹磺酰氯烯丙基胺荧光单体的制备 瓜衄锄1 ) ：3 0 7 9 ，2 9 4 4 2 8 3 4 ，2 7 8 8 ，1 6 1 0 ，1 5 6 9 ，1 3 6 5 ，1 1 7 2 1 h n m r ( c d c l 3 3 0 0 m h z ) 2 9 3 - 3 0 3 ( 6 h ) ，7 2 8 - 7 3 0 ( 1 d , 7 5 8 - 7 6 1 ( 1 i - - i ) , 7 7 0 - 7 7 3 ( 1 h ) ，8 3 7 - 8 3 9 ( 1 h ) 8 4 5 8 4 7 ( 1 印，8 7 2 8 7 3 ( 1 m 丹磺酰氯红外图谱 毒， 。“、，= 。：“一-”5 j 铂6 备蠢憾t 鞠蝴峨* ? | “t 1 j = 1 。“：、x 卜，“，。，。 一，t ；披姒 o 。“、 ， + ，热鏊g 撵 。 丫、n ，j ，。f 了_ ”匹? ：了墨_ 了：”了一了曩l 丹磺酰氯核磁图谱 3 丹磺酰氯烯丙基胺的合成 将0 2 9 克烯丙基胺和1 3 5 克丹磺酰氯溶于5 0 m l 丙酮中，加入o 5 1 克三乙胺，在0 1 2 搅 拌反应6 小时，然后蒸千溶剂，将固体溶于二氯甲烷中，先后用3 的碳酸氢钠溶液和3 东南大学硕士学位论文 的乙酸溶液洗涤数次，无水硫酸镁干燥过夜，蒸干二氯甲烷得到粗品，用石油醚重结晶两次， 得到丹磺酰氯烯丙基胺的针状淡绿色透明晶体1 1 2 克，产率7 6 m p 8 l 一8 2 2 3 结果与讨论 2 3 1 丹磺酰氯烯丙基胺的表征 丹磺酰氯烯丙基胺的结构经红外光谱及核磁共振光谱确证，图1 和图2 分别是其i r 和 h n m r 图谱。 图1 丹磺酰氯烯丙基胺的红外光谱 1 6 第二章丹磺酰氯烯丙基胺荧光单体的制备 l j 2 3 2 影响因素 图2 丹磺酰氯烯丙基胺的核磁图谱 第一步1 氨基- 5 萘磺酸的二甲基化以硫酸二甲酯为甲基化试剂，反应温度对该反应影 响较大，若温度过低，反应很难进行。如果温度过高，将会导致很多副产物，收率偏低且难 以纯化。经多次试验，我们选择反应温度为5 - 6 1 2 ，以o 1 n 盐酸作为重结晶溶剂，可使该步 精品收率达9 0 。 第二步n , n - - _ ：甲氨基5 萘磺酸磺酰化合成丹磺酰氯文献报道有两种方法。方法一以二 氯亚砜作酰化剂并以二甲胺基甲酰胺( d m f ) 作溶剂；方法二以五氯化磷作酰化剂在无溶剂存 在下进行固相反应。我们首先对第一种方法进行了研究，虽然得到了丹磺酰氯产品，但收率 太低，根本达不到文献收率。究其原因，主要是二氯亚砜作酰化剂，若不用溶剂，n , n 一二甲 氨基5 一萘磺酸无法溶解，但加入d m f 作溶剂后，由于该反应产生大量的氯化氢，而氯化氢 极易与d m f 结合难以挥发掉而保留在溶液中。因此反应结束后，生成的是丹磺酰氯盐酸盐， 需用碱性的碳酸钠中和，在此过程中导致部分生成的丹磺酰氯重新水解变成了原料，致使收 率偏低。 对第二种方法研究表明，用五氯化磷作酰化剂单纯按文献方法不加任何溶剂进行固相反 应，收率也很低，主要因素可能是固相固相间难以完全反应。为此我们进行了改进，考虑 1 7 o j y ?v | x ，科瑙 弑譬一 ；l p 州_、；r崩| ；| l 移f ! 疆 东南大学硕士学位论文 到n , n - _ - e p 氨基- 5 萘磺酸很难在极性小的有机溶剂中溶解，而丹酰氯在低温下又与水反应 很慢。我们选择将五氯化磷先在空气中暴露一断时间吸收少量水份后再与n , n - - - 甲氨基，5 - 萘磺酸一起研磨，这样可使反应混合物很容易形成糊状物，使得反应收率有了很大的提高 在第三步丹磺酰氯与烯丙基胺的酰胺化反应中，我们采用了三乙胺作缚酸剂，丙酮作溶 剂，由于烯丙基胺非常活泼，因此在选择在较低的温度下反应即可。生成的丹磺酰氯烯丙基 胺固体及其二氯甲烷溶液在紫外灯下显示与丹磺酰氯一样的强烈绿色荧光，由于其分子结构 中含有烯双键结构，因此可作为荧光单体与甲基丙烯酸甲酯、苯乙烯等单体共聚生成荧光高 聚物并可通过调控聚合过程形成为荧光标记的高分子微球，在免疫学和血液学等医学检测及 高通量的药物筛选中有潜在的应用前景。 2 4 结论 以l 一氨基5 萘磺酸为原料，经甲基化、磺酰化两步反应合成了丹磺酰氯，对文献方法 进行了改进，总收率达4 9 ，并通过丹磺酰氯与烯丙基胺的反应合成得到了丹磺酰氯烯丙 基胺荧光单体，该单体在制备荧光标记的高分子微球方面有潜在的应用。 1 8 第三章分散聚合法制各苯乙烯与丹磺酰氯烯丙基胺共聚荧光微球 第三章分散聚合法制备苯乙烯与丹磺酰氯烯丙基胺共聚 荧光微球 3 1 前言 目前荧光微球的制各方法分物理法和化学法。物理法是将荧光染料吸附在聚合物微球表 面或包覆于其中，这种方法制备的荧光微球存在大小不一、荧光物质分布不均以及易脱落等 缺点。而化学法是将含荧光生色团的单体与其它单体通过悬浮聚合、乳液聚合以及分散聚合 等方法共聚而成，这样制得的荧光微球各方面性能均较为稳定，其中，分散共聚制备的微球 粒径适于在0 1 1 0 微米之间且具有很好的单分散性，特别适合在生物医学领域的应用。本文 采用甲醇，水极性混合溶剂作为反应介质，以聚乙烯吡咯烷酮( p v p ) 为分散剂，偶氮二异丁腈 ( a m n ) 为引发剂，采用分散共聚制各出了微米级单分散新型苯乙烯，丹磺酰氯烯丙基胺荧光 微球。研究了反应介质，引发剂浓度、分散剂浓度等各种聚合参数对微球粒径及粒径分布的 影响。 3 2 实验部分 3 2 1 试剂与仪器 丹磺酰氯烯丙基胺荧光单体( d a a ) 苯乙烯( s t )化学纯 偶氮二异丁腈( a i b m化学纯 聚乙烯吡咯烷酮( p v p ) 进口分装 甲醇分析纯 离心沉淀机 自制 上海凌峰化学试剂有限公司( 减压蒸馏后使用) 上海试剂四厂( 重结晶后使用) 上海凌峰化学试剂有限公司 上海实意化学试剂有限公司 光学显微镜( 日本尼康公司) 日本电子公司的j e m 2 0 0 0 e x 型透射电子显微镜 美国b e c k m a n - c o u l t e r 公司n 4 - p l u s 光子相关光谱( p h o t o nc o r r e l a t i o ns p e c t r o s c o p y ，p c s ) 1 9 东南大学硕士学位论文 3 2 2 实验方法 将p v p 溶于由甲醇和水组成的混合溶剂中般入装配冷凝管、温度计和氮气导管的四 口烧瓶中，升温至一定温度，通氮气0 5 h 后，缓慢加入溶有a i b n 和丹磺酰氯烯丙基胺荧光单 体的苯乙烯溶液，搅拌速度2 0 0 r p m ，7 0 c 恒温反应2 4 h 后，即得微球乳液样品。将乳液样品离 心分离，除去上层清液，再加入甲醇洗涤，反复数次，得到聚合物微球乳液样品。反应配方与反应 条件如表1 所示，如无特殊说明，反应条件均按照标准条件进行。 表1 分散共聚的反应参数 3 3 结果与讨论 3 3 1 荧光微球的表征 1 透射电镜表征 将所得聚合物微球样品稀释后。以日本电子公司的j e m 2 0 0 0 e x 型透射电子显微镜观测 共聚物微球形貌。图1 为按标准条件进行下得到的微球的透射电镜照片。从中可见微球呈 球形，平均粒径为5 7 4 n m 第三章分散聚台法制备苯乙烯与丹磺酰氯烯丙基胺共聚荧光微球 图1 微球的透射电镜照片 2 微球粒径分布表征 将所得聚合物微球样品加水稀释后。用美 蓍b c c k m a n - c o u l t e r 公司n 4 - p l u s 光子相关光谱 ( p h o t o nc o r r e l a t i o ns p e e l r o s e o p y , p c s ) 测定共聚物微球的粒径及粒径分布一其结果分别见表 2 , 3 ，4 。图2 为按标准条件进行下得到的微球的粒径分布曲线。 图2 微球的粒径分布曲线 3 微球的发光光谱 图3 为丹磺酰氯烯丙基胺荧光单体的氯仿溶液以及微球分别溶解于氯仿的溶液和分散 于甲醇中的荧光光谱。从中可看出丹磺酰氯烯丙基胺单体在氯仿溶液中的最大发射峰位于 5 0 5n m ，而微球的氯仿溶液的荧光光谱发射峰位于5 1 5n m ，相对于单体红移了1 0r i m ，这是 由于丹磺酰氯烯丙基胺的侧健上具有双键，而在聚合物中此双键己因共聚而消失。微球分散 于甲醇介质中的荧光光谱与微球氯仿溶液几乎完全一致，表明微球有效地阻止了荧光生色团 2 1 东南大学硕士学位论文 的聚集，不存在n 面的重叠效应，这对于用于生物样品的检测非常重要。 4 0 04 5 05 5 5 06 0 08 5 0 w _ a h ( r i m ) 图3 荧光光谱( a ：丹磺酰氯烯丙基胺的氯仿溶液， b ：微球的氯仿溶液，c ：微球分散于甲醇) 3 3 2 反应介质组成对于荧光微球粒径和粒径分布的影响 分散聚合对介质的性能要求很高，既要能溶解单体、引发剂、分散剂，又要不溶解所生成 的聚合物。目前，用于制备聚苯乙烯等聚合物微球的反应介质，大都采用醇类或醇类和其它组 分的混合物。反应介质的组成与性质将会直接影响体系的聚合过程。从而影响聚合产物的粒 径及其分布2 ”川。本实验选用不同比例的甲醇水混合溶剂作为反应介质，制备出粒径分布均 匀、球形度良好的苯乙烯丹磺酰氯烯丙基胺共聚物微球。 反应介质组成对分散聚合的影响见表2 。可以看乳随着反应介质中甲醇相对于水比例的 减小，共聚物微球的粒径呈下降趋势，其粒径分布也呈变窄趋势，当甲醇水比例为8 0 2 0 时， 可以得到粒径分布均匀的共聚物微球，其平均粒径为5 7 4n , n l ，p d i 值接近0 2 。这是因为相 对于甲醇而言，水对于苯乙烯，丹磺酰氯烯丙基胺共聚物的溶解性更差。随着体系中水量的增 加，反应介质对共聚物链段的溶解性降低，使得临界链长下降，聚合物链的沉淀速率上升，导致 核粒子数目上升，故所得微球的粒径减小，粒径分布变窄。但当水量继续增大时，苯乙烯和丹 磺酰氯烯丙基胺混合单体在介质中的溶解性很差，此时该体系已不适于作为该分散共聚体系 的反应介质。例如，当甲醇，水比例为7 5 2 5 时，微球粒径虽较小，但粒径分布变宽，且球形 度很差。 一，)参#-羞_口3 第三章分散聚合法制各苯乙烯与丹磺酰氯烯丙基胺共聚荧光微球 3 3 3 引发剂浓度对于荧光微球粒径和粒径分布的影响 如表3 所示，当引发剂用量从单体用量的1 上升至1 j 4 时，微球的粒径从5 7 4n m