（生物化学与分子生物学专业论文）皖南尖吻蝮蛇毒基因结构与功能研究.pdf

一 生里型垫盔堂堕主兰堡堡墨 摘要 皖南尖吻蝮蛇毒金属蛋白酶基因结构与功能研究 通过筛选皖南尖吻蝮蛇( 月班i s t r o d o na c u t u s ) 毒腺c d n a 文库和r t p c r 方法，从皖南 足吻蝮蛇( a g k i s t r o d o na c u t u s ) 毒腺得到四种蛇毒金属蛋白酶基因。 p - i 型蛇毒金属蛋白酶a c u t o l y s i na 的完整基因，c d n a 长度为1 6 3 2 b p ，其开放阅读框 乓编码4 1 3 个氨基酸残基。，通过与g e n b a n k 数据库比较，表明它为蛇毒出血毒金属蛋白酶类 基因。它编码信号肽区，酶原区和金属蛋白酶结构域。其中信号肽区由1 8 个多为疏水性的氨 基酸残基组成：酶原区中有1 6 9 个氨基酸残基并有保守的p k 粥g v t 序列：金属蛋白酶区由2 0 3 个、氨基酸残基组成，含有保守的锌离子结合序列h e x i ( i t x x g x x i 。在金属蛋白酶区后还含有由2 3 卜氨基酸残基组成的间隔区编码基因。其c d n a 推断的氨基酸序列与化学测定的a c u t o l y s i n a 晌n 端1 3 氨基酸序列完全一样。它与由晶体结构推导出来的a c u t o l y s i na 氨基酸序列基本 一致。 p - i 型蛇毒金属蛋白酶a c u t o l y s i nc 完整基因序列，全长为1 6 5 0 b p 。其开放阅读框共 编码4 1 7 个氮基酸残基。和a c u t o l y s i na 非常相似，它编码信号肽区，酶原区和金属蛋白 酶结构域。在金属蛋白酶区后还含有由2 5 个氨基酸残基组成的间隔区编码基因。其c d n a 推 断的氮基酸序列与其晶体学序列基本致。 p i i 型蛇毒金属蛋白酶a g a c u t i n 基因，全长为1 4 7 1 b p 。其开放阅读框共编码4 7 9 个氨 堆酸残基。它除了含有信号肽区，酶原区和金属蛋白酶结构域外，在金属蛋白酶区后还含有 由9 0 个氨基酸残基组成的间隔区和去整合蛋白区，其中含有r 6 d 三肽序列。+ p - ii i 型蛇毒金属蛋白酶a c u t o l y s i nd ，全长2 5 0 8 b p ，编码6 0 9 个氨基酸。它除了含有 置自酶结构域外，还含有类去整合蛋白结构域和富含半胱氨酸结构域，类去整合蛋白结构域 由9 3 个氨基酸残基组成，没有发现去整合蛋白中普遍存在的r g d 三肽序列，而相对应的是 q e c d ；富含半胱氮酸结构域中由1 2 3 个氨基酸残基组成，其中含有1 3 个半胱氨酸残基。在 金属蛋白酶区后还含有由间隔区、类去整合蛋白结构域和富含半胱氮酸结构域j 比较分析了 蛇毒金属蛋白酶和a d a m s 结构的相似性，提出了蛇毒金属蛋白酶和a d a m s 均具有金属蛋白酶 和粘附功能的假设。 用离子交换柱( d e a e - s e p h a d e xa 一5 0 ) 层析和凝胶过滤( s e p h a d e xg - 7 5 ) ，从皖南尖吻 蝮蛇毒中分离得到一非酶组分，a c u t i n ，分子量为2 8 k d a ，等电点( p i ) 为5 0 a c u t i n 的 n 端氨基酸序列测定表明它和a c u t o l y s i nd 的类去整合蛋白结构域的氨基酸序列完全相同， 浇明a c u t i n 是大分子量出血毒金属蛋白酶的翻译后加工产物，证实了( 类) 去整合蛋白和蛇 毒金属蛋白酶来源于同一分子前体的假设。细胞粘附试验表明，a c u t i n 能够抑制胶原诱导 的血小板凝集，但不抑制a d p 和凝血酶诱导的血小板凝集。它还抑制小鼠成纤维细胞n i h 3 t 3 阳转癌基因t 6 一1 7 和i 型、i v 型胶原的粘附作用。 将a c u t o l y s i nd 的克隆入p g e x z t 载体中，转化大肠杆菌t g l ，用i g r g 诱导表达， 表达产物具有抑制胶原诱导的血小板凝集活性，但不抑制a d p 和凝血酶诱导的血小板凝集。 蛇毒出血毒金属蛋白酶中有强出血，弱出血和不出血之分，但造成出血活性差异的分子 几理目前尚不清楚。) 通过一级结构分析，结合空间结构，探讨了蛇毒金属蛋白酶的出血机理， 牛提出了用定点突变手段研究出血机制的突变位点。 电娃词：皖南尖吻蝮蛇( a g k i s t r o d o na c u t u 曲，蛇毒金属蛋白酶；( 类) 去整合蛋白：克隆表 ，主，序列分析，血小板凝集，细胞粘附，出血机制 一 堕壹壅塑坚塑壹垒墨垄旦堕垄璺堕塑要望堂生茎 a b s t r a c t s t u d yo nt h es t r u c t u r e - f u n c t i o nr e l a t i o n s h i p o fm e t a n o p r o t e i n a s eg e n e sf r o m a g k i s t r o d o n a c u t u s f o u rc d n a sw e r eo b t a i n e df r o mt h es n a k ev e n o mo f a g 船t r o d o na c u t u sb ys c r e e n i n gc d n a l i b r a r ya n d r e v e r s et r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n a c u t o l y s i nat h a tb e l o n g st ot h ep i e n c o d e s4 1 3a m i n oa c i d s i tc o n t a i n ss i g n a lp e p t i d e s e q u e n c e ，z y m o g e nd o m a i na n dp r o t e i n a s ed o m a i na n dd i s i n t e g r i nd o m a i n h i g l lc o n s e r v e d k m c g v tm o t i fa n ds i g n a t u r ez i n c * b i n d i n gm o t i fh e x x h x x g x x he x i s t si nz y m o g e nd o r r l a i n a n dt h ec a t a l y t i cr e g i o no fm e t a l l o p r o t e i n a s ed o m a i nr e s p e c t i v e l y t h ee d n a p r e d i c t e da m i n o a c i ds e q u e n c ei si d e n t i c a lt ot h ec h e m i c a ln - t e r m i n a ls e q u e n c ea n dt h ec r y s t a l l o g r a p h i cs e q u e n c e o f a c u t o l y s i na a c u t o l y s i nc a n n t h e rp im e m b e r ，h a s1 6 5 0 b o ，w h i c he n c o d e s4 1 7a m i n oa c i d s t h ec d n a p r e d i c t e da m i n oa c i ds e q h e n c ei sa i m o s ti d e n t i c a lt ot h ec r y s t a l l o g r a p h i cs e q u e n c eo f a c u t o l y s i nc a g k a c u t i ni sam e m b e ro fc l a s sp - i it h ec d n ae n c o d e saf u l l 1 e n g t hp r e c u r s o ro f an o v e l 0 1 a t e l e ta g g r e g a t i o ni n h i b i t i o n i tp r e d i c t sac o m p l e t eo p e nr e a d i n gf r a m ee n c o d i n g4 7 9a m i n oa c i d r e s i d u e s i tc o n t a i n ss i g n a l p e p t i d es e q u e n c e ，z y m o g e nd o m a i n a n dp r o t e i n a s ed o m a i na n d d i s i n t e g r i nd o m a i n h i g hc o n s e r v e d k m c g v tm o t i fa n d s i g n a t u r ez i n c b i n d i n g m o t i f h e x x h x x g x x he x i s t si nz y m o g e nd o r a a i na n dt h ec a t a l y t i cr e g i o no fm e t a l l o p r o t e i n a s e d o m a i nr e s p e c t i v e l y t h e d i s i n t e g r i n d o m a i nc o n t a i n sr g dt r i p e p t i d e s e q u e n c e w h i c h i s s u g g e s t e dt ob i n dt op l a t e l e tr e c e p t o r t h ep r e d i c t e da m i n oa c i ds e q u e n c es h a r e sh i g hh o m o l o g o u s w i t ho t h e rs n a k ev e n o m h e m p r r h a g i cm e t a l l o p r o t e i n a s e s a n d d i s i n t e g r i n s t h ep r o c e s s i n g m e c h a n i s mo f t h ep r e c u r s o ri sa l s od i s c u s s e d a c u t o l y s i ndi st h ei a r 龋s n a k ev e n o mm e t a l l o p r o t e i n a s e i ti s2 5 0 8 b pi n1 e n g t hw h i c h e n c o d e sac o m p l e t eo p e nr e a d i n gf r a m eo f 6 0 9a m i n oa c i dr e s i d u e st h a ti sh i 吐l ys i m i l a rt ot h a to f h e m o r r h a g i cm e t a l h i p r o t e i n a s ej a r a r h a g i nf r o mb o t h r o p sf o r a r a e a ，c a t r o c o l l a s t a t i nf r o mc r o t a l u s 。l t r o xa n da c l df r o ma g k i s t r o d o nc o n t o r w i xl a t i c i n c t u s a c u t i ni sam u l t i d o m a i nm o l e c u l e c o m p o s e do fs i g n a lp e p t i d e 。z y m o g e nd o m a i n ，p r o t e i n a s ed o m a i n ，d i s i n t e g r i n 1 i k ed o m a i na n d c y s t e i n e r i c h d o m a i n t h e z y m o g e nd o m a i n c o n t a i n sp k l m c g v tm o t i f , w h i c hj s h i g h l y c o n s e r v e di na l m o s ta l 】v e n o mm e t a l l o p r o t e i n a s e s t h ep r o t e i n a s ed o m a i nc o n t a i n st h ec o n s e r v e d s i g n a t u r ez i n c b i n d i n gm o t i fh e x x h x x g x x h i nt h ec a t a l v t i cr e g i o n t h ea r e - g l y - a s p ( r g d 、 s e q u e n c ef o u n di nd i s i n t e g r i ni sr e p l a c e db ys e r - g l u - c y s - a s p ( s e c d ) i nt h ed i s i n t e g r i n l i k e d o m a i n t h en - t e r m i n a ls e q u e n c eo ft h ed i s i n t e g r i n 1 i k ed o m a i ni si d e n t i c a lt ot h ec h e m i c a l s e q u e n c eo fa c u t i n t h i s i n d i c a t e st h a ta c u t i ni sad i s i n t e g r i n 1 i k e c y s t e i n e r i c ht w o d o m a i n p e p t i d ea n dt h ep o s t t r a n s l a t i o n a lp r o d u c to f al a r g e rh e m p r r h a g i cm e t a l l o p r o t e i n a s e b ym e a n so fi o ne x c h a n g e ( d e a e - s e p h a d e xa - 5 0 ) a n dc o l u m nc h r o m a t o g r a p h y ( s e p h a d e x “- 7 5 ) an o n e n z y m a t i cp e p t i d en a m e da c u t i nw a sp u r i f i e df r o mt h ev e n o mo ft h ef i v e p a c e d s n a k e ，a g k i s t r o d o na c u t u s i t sm o l e c u l ew e i g h ta n di s o e l e c t r i cp o i n t ( p da r e2 8k d aa n d5 0 r e s p e c t i v e l y i t sn - t e r m i n a la m i n oa c i ds e q u e n c ei sd e t e r m i n e d s e q u e n c ea n a l y s i si n d i c a t e st h a t a c u l i nc o n t a i n s d i s i n t e g r i n 1 i k e a n dc y s t e i n er i c hd o m a i n sa n ds h a r e sh i g 1 s i m i l a r i t y w i t l l d i s i n t e g r i n - l i k e c y s t e i n e - r i c hc o n t a i n i n gp e p t i d e si a r a r h a g i n - c ，c a t r o c o l l a s t a t i n - ca n dc l a s sp 一1 i i h e m o r r h a g i cm e t a l l o p r o t e i n a s e sh t aa n dh r l bf r o ms n a k ev e n o m i ti n h i b i t sc o l l a g e n i n d u c e d b u tn o ta d p - t h r o m b i n i n d u c e dp l a t e l e ta g g r e g a t i o n c e l la d h e s i o na s s a yi n d i c a t e st h a ta c u t i n i n h i b i t st h ea d h e s i o no f n i h 3 t 3t ot y p eia n dt y p ei vc o l l a g e n h o m o l o g yc o m p a r i s o ni n d i c a t e st h a ts n a k ev e n o mm e t a l l o p r o t e i n a s ea n da d a m s s h a r eh i g h s i m i a r i t y , a n dw ep r o p o s eh y p o t h e s i st h a tb o t hs n a k ev e n o mm e t a l l o p r o t e i n a s ea n da d a m s h a v e p r o t e o l y t i ca n da d h e s i v ef u n c t i o n s k e yw o r d s ：a g k i s t r o d o na c u t u s ；s n a k ev e n o mm e t a l l o p r o t e i n a s e ；d i s i n t e g r i n ；c l o n ea n de x p r e s s i o n s e q u e n c ea n a l y s i s ；p l a t e l e ta g g r e g a t i o n ；c e l la d h e s i o n 致谢 本论文是在刘兢教授的悉心指导和关怀下完成的，她渊博的学识，严谨的 学术态度，科学献身的精神以及高尚的人格，使我受益匪浅，永远是我学习的楷 模。知遇之恩，永生不忘；师生之情，重于泰山! 王玉珍教授和徐卫华副教授在我的论文工作中给予了许多有益的建议和指 导，在此表示衷心感谢! 在三年学习期间，得到了生命科学学院许多同学的指导和帮助。本实验室 的刘爱萍老师和承新博士在各方面给予了无私的帮助；李平和周明同学在实验过 陧和论文整理中给予了大力协助；程联胜、沈轩、蔡云飞、金戈、张家琳同学和 兆科药业公司的刘燕女士在基因克隆中给予了帮助；姜勇博士、涂晓明同学在基 因麦达方面给予了积极合作；朱学勇博士、黄庆秋、刘四九同学在晶体学方面给 予了大量指导。在此一并表示诚挚的谢意! 感谢生命科学学院院长施蕴渝院士，牛立文教授和滕脉坤教授给予的支持 晕口鼓励! 感谢国家自然科学基金委为课题提供基金支持 最后特别感谢我的妻子章健和女儿刘雨昕及岳父母一家，她们的理解，支 陪，温暖和默默奉献使我全身心投入于学习和工作，顺利完成该论文 谨以此文献给养育我的祖国和人民! 堕堕叁堕塑墅墨全璺里皂壁茎鬯壁塑皇些壁婴壅一 第一篇综述 蛇毒中含有许多不同生物活性酶，包括金属蛋白酶、类凝血酶、丝氨酸蛋白水解酶、磷 腾酶、磷酸二酯酶、磷酸单酯酶、l 一氨基酸氧化酶、乙酰胆碱酯酶、精氨酸酯酶、5 核苷酸 酶、透明质酸酶、n e d 一糖苷水解酶等。蛇毒中还含有许多具有不同生物活性的多肽，包括突 触前和突触后神经毒素、钾通道结合神经毒素、细胞毒素、肌肉毒素、心脏毒素和血小板凝 轾扣帝0 齐0 r u s s e l le ta 1 ，1 9 8 0 ：t ue ta 1 ，1 9 8 8 ：s r o c k e re ta 1 ，1 9 9 0 ：n i e w i a r o w s k i e t l 1 9 9 4 。影响血液系统平衡的成分主要有以下几类 f r a n c i ss m a r k l a n dj r ，1 9 9 7 ：1 、 促凝血成分，如凝血因子v 激活物( f a c t o rva c t i v a t o r s ) ，凝血因子x 激活物( f a c t o rx ：t l v a t o r s ) 凝血因子i x 激活物( f a c t o ri xa c t i v a t o r s ) ，凝血酶原( 凝血因子i i ) 激 物( p r o t h r o m b i na c t i v a t o r s ) 以及促血纤维蛋白原凝聚物( c l o t t i n gf i b r i n o g e n ) 。2 、 抗凝血成分，如蛋白c 激活物( p r o t e i nca c t i v a t o r s ) 、i x x 因子结合蛋白( f i x x b i n d i n g e ，r o t e i n s ) 、磷脂酶a ( p h o s p h o l i p a s ea ) 。3 、纤溶酶，其中一类是直接水解纤维蛋白的金 属蚩自酶( f i b r i n o l y t i cm e t a ll o p r o t e i n a s e s ) ，另一类是纤溶酶原激活物( p l a s m i n o g e n e c t v a t o r s ) 。4 、出血毒金属蛋白酶( h e m o r r h a g i cm e t a l l o p r o t e i n a s e s ) ，它可以降解血管 挂底膜成分造成血液外渗，引起局部或系统出血。5 ，血小板凝聚诱导剂和血小板凝聚抑制剂 fp l a t e l e ta g g r e g a t i o ni n d u c e r sa n di n h i b it o r s ) 。 几乎所有的蛇毒金属蛋白酶( s n a k ev e n o mm e t a l l o p r o t e i n a s e s ，s v m p s ) 都含有锌离子 j # 位于酶活性中心，其分类归属尚未统一。按照h o o p e r 分类法 h o p p e r ，1 9 9 4 ，根据与锌 离子配位的配位体的数目、类别及分布情况，将s v m p s 作为一个亚家族归属于m e t z i n c i n s 家 族，同该家族的还有虾红素亚家族( a s t a c i n s ) ( g o m i s - r u t he ta l ，1 9 9 3 ) 、细菌内肽酶亚 家旗( s e r r a t i a s ) ( d a h l e re ta l ，1 9 9 0 ) 和间质金属蛋白酶亚家族( m a t r i x i n s ) ( b l u n d e l l ec n l ，1 9 9 4 ) 。m e t z i n c i n s 家族成员都含有锌离子结合的特征序列h e x x h x x g x x h ，其中h 为 锌离子的三个配体，并具有一个含甲硫氨酸残基的相似结构即甲硫氨酸转折( m e t - t u r n ) 。而 p l u n d e l l 将s p s 和间质金属蛋白酶同归属于m m p 超家族。 蛇毒金属蛋白酶的研究大体上可以划分为这样几个阶段：1 、早期酶的分离纯化和它造 成的外观病理过程( 1 9 8 0 年之前) ；2 、一级结构的测定( 氨基酸序列和基因序列) 以及结构功 能关系的研究( 1 9 8 0 1 9 9 0 ) ；3 、借助现代生物学手段如基因重组技术，结构生物学技术以及 地代细胞学，组织化学在分子水平上研究结构功能关系等( 1 9 9 0 - 至今) 。但该领域的研究水平 土e 不高，许多问题没有解决或者还没有提出建设性的问题。它的研究从很大程度上讲是参照 哺乳动物和人的间质金属蛋白酶进行的，而间质金属蛋白酶的研究无论在深度，广度，对其 所参与的基本生物学过程的阐述以及和重大病理学过程的关系，相关药物的开发利用上都取 得了重大突破，因此有许多知识值得借鉴。另外，最近和蛇毒金属蛋白酶有密切联系的一类 新蛋白家族，a d a m 已成为研究的热点，并取得了惊人的成果，且进展速度非常迅速。对这两 “领域的充分理解和借鉴，会对蛇毒金属蛋白酶的研究提供许多启迪，有利于对蛇毒金属蛋 f 酶研究思路的开拓。因此本篇首先较详细概述这两方面的研究内容，然后介绍蛇毒金属蛋 f 酶的研究现状。 一一 生旦型堂堇查盔堂竖主堡塞一一 第一章间质金属蛋白酶( m a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e s ，脚s ) 研究 进展 第节引言 细胞与细胞，细胞与胞外基质( e c m ) 间的相互作用对于生物的正常发育和功能非常重要 fe o l 】s s e n slm 。1 9 9 6 。细胞与胞外基质问的相互作用通过独特的负责水解不同e c m 组分的 ! 矗白水解体系的作用进行调节。通过调节e c m 结构的整体性和组份，这些酶体系在由基质分 。诱发的信号控制过程中起关键作用。这些分子调节细胞的生殖、分化和死亡。e c m 的更新 棚重建必须高度调节，无控制的蛋白水解作用可导致异常发育和许多病理条件的产生，其特 i 是e c m 组份过度降解或不被降解。间质金属蛋白酶( m m p s ) 是调节细胞和基质组成的一类 e 要酶 p a r s o n ssl ，1 9 9 7 。它们是能够裂解一种或多种e c m 组分及非基质蛋白的锌依赖 性的内肽酶。它们包括一大类拥有共同结构和功能的酶，是不同基因的产物。这些酶存在于 l e 常健康个体，大量证据表明m m p s 在正常和疾病过程包括胚胎发育、伤口愈台、怀孕和分娩、 骨质吸收、乳房退化、发炎、关节炎、牙周炎和癌症中起重要作用 j e f f r e yje ta t ， 1 9 9 1 ：d e l a i s s ejm ，e ta 1 ，1 9 9 2 ：t a l h o u kre ta 1 ，1 9 9 2 。然而对册s 的主要兴趣 瞩中在它们在特定疾病中的作用，瑚p s 同癌症扩散的联系己引起极大兴趣，因为它们代表着 一类诱人的靶蛋白。天然的脚s 抑制剂、人工合成抑制剂也已开发并为这类疾病的治疗提供 r 希望。 第三节m m p s 的结构和功能 根据结构组成大多数i b p s 家族成员含有3 个基本的、明显不同、高度保守的结构域 ；m a s s o v aie ta 1 ，1 9 9 8 ；n 端前肽、酶催化区和羧基端的类血红素结合蛋白区( 图1 ) 。前 肽由大约8 0 一9 0 个氨基酸组成，其中包括一个半胱氨酸残基，通过其侧链疏水基团和催化中 心的锌离子相互作用。前肽中包括一高度保守的序列( r o s x p b ) ，通过水解去除前肽导致酶 原激活，因此p 家族所有成员均以无活性形式产生。催化区含2 个锌离子和至少一个与不 同残基配位的钙离子。第一个锌离子位于活性中心，与b t p s 的催化作用有关。酶区中有保守 的催化区锌离子结合位点h e x x h x x g x x h ，三个组氨酸残基同锌离子螯合。第二个锌离子( 又 弥结构锌) 和钙离子位于距活性中心约为1 2 m 的催化区中。催化锌离子对m m p s 的蛋白水解 ；舌性必不可少，3 个同催化锌离子配位的组氨酸残基在所有的m m p s 中保守。 阁1 m m p 家族成员的结构域组成( 以分子最大、结构域最多的明胶酶b 作代表，其它的瑚p s 成员均含有 、 mc 、e 但不同成员可能缺少其它结构域) a ：信号肽： b ：酶原区；c ：催化区；d ；纤粘连蛋白的明 皎结合区；e ：锌离子结台区： f ：胶原结合区；g ：血红素结台蛋白区 对位于催化区中的第二个锌离子和钙离子的作用知之甚少，但已表明 嫩p s 与结构锌离子和钙 离子拥有很高的亲和性。类血红素结合蛋白区高度保守且和血红素结合蛋白拥有序列相似性， 莨h 目类血红素结合蛋白区在同b b f p s 组织抑制荆结合和相互作用中起重要作用。 2 一 堕堕叁堕堕墅童垒昼量自堕董垦矍塑皇婴! i 堡壅 从功能上讲胛s 主要有以下特点：( 1 ) 它们是至少可降解一种胞外基质成分的酶( 2 ) 艺们全含有锌离子，可被螯台剂抑制( 3 ) 它们以无活性形式分泌，需要激活才具有蛋白水解 ，舌性( 4 ) 它们可被组织) 胁l p s 抑制剂( t i m p s ) 抑制( 5 ) 它们拥有非常相似的氨基酸序列 h a r r i s l ! p ta 1 、1 9 9 0 。根据该定义，m ) s 可以分为以下成员：c o l l a g e n a s e s ，s t r o m e l y s i n s ， ej a t i n a s e s 和m a t r i l y s i n s 。然而最近发现的酶s t r o m e l y s i n3 和膜型金属蛋白酶( m 瑚胪) 矿人了金属蛋白酶的定义。s t r o m e l y s i n3 符合上述定义规定的所有条件，但其主要底物可 能是丝氨酸蛋白酶抑制剂s e r p i n 家族。通过失活该抑制剂，s t r o m e l y s i n3 可能增强了更为 普遍的蛋白水解级联反应。m t 一肼p 也许代表了m m p s 一重要的新亚群，至少4 个新成员在m r n a - k 平上得以鉴定。已证明灯、卿是与膜相连而非分泌性的，其主要底物似乎为无活性的 删卜2 ，它的作用是一特异性激活剂。表1 为已知m m p s 成员及其作用底物。 表1 金属蛋白酶以及底物 第三节生物活性调节 b i p s 的表达是高度调节的，且这种调节发生在许多不同水平。转录水平受基因表达的调 i 蛋白水平上受蛋白水解激活的调节以及同t i m p s 的结合，它们是相互独立的。 ：l ) 基因表达水平调节 正常删p s 基因表达是高度控制的以维持正常组织功能。研究表明在转录水平上删p s 受 爷种生长因子，c y t o k i n e s 、癌基因和肿瘤启动子的正负调节 m c d o n n e l lse ta 1 1 9 9 0 3 。 i ：有证据表明s t r o m e l y s i n 一1 和i n t e r s t i t i a lc o l l a g e n a s e 基因的正调节受原癌基因在这 些启动子的i 临近2 1 0 b p 内的特异d n a 序列上作用的调节。这些基因含有一t r e ( t p a 应答元件) 或a 卜l ( 激活子蛋白一1 ) 结合位点，被原癌基因c - f o s 和c j m 产物识别或反式激活。它们 蔓 ：禽有一p 卧一3 元件，识别c - e t s 癌基因。r a t s t r o m e t y s i n 经e g f 的诱导需要c f o s 和rj u n e d 癌基因产物的诱导和蛋白激酶c 的激活。i n t e r s i t i a lc o l l a g e n a s e 经h a 、v m o s 、v s r c 1 p a 的诱导也需要t r e 。肿瘤坏死因子一d ( t n f d ) 对i n t e r s i t i a lc o l l a g e n a s e 的诱导 主里型堂垫查盔堂竖主堕苎一 也与c - i u n 的诱导有关并需要t r e 。来自血小板的生长因子，神经生长因子和i l 一1 对 s t r o m e l y s i n 的诱导可能也通过相似途径起作用。g e l a t i n a s e a 的启动子区域非常不同于 sc r o m e l y s i n 一1 、s t r o m e l y s i n 一2 和c o l l a g e n a s e ，最显著的差别是缺少一明显t a t a 盒和a p i 位点。g e l a t i n a s eb 基因含有t a t a 和类a p 一1 基序，但还不清楚它们是否以真正的转录因子 起作用。研究表明转化生长因子一d ( 1 b f p ) 通过上游称之为t g f 抑制元件( t i e ) 来抑制 s t r o m e l y s i n 基因表达的e g f 诱导。 ( 2 ) - 咿s 的蛋白水平激活 除了与膜结合的m t - n n p s ，其它所有m m p s 都是以无活性的酶原形式分泌出来的，它们需 瑶激活才能对e c m 起作用。各类h m 巾的酶原形式和成熟蛋白的差异见表2 。在体外，所有g m p s 呵被有机汞化合物( 如4 - 氯基酚已酸汞) 激活，但与 i m p s 生理激活有关的因子还不清楚a r j 证明人蛐胆一1 和m y 2 9 能被某些丝氨酸激活，而m 口一2 却不能被它激活 o k a d a ye t a l ，1 9 9 0 ： s u z u k ike ta 1 。1 9 9 0 。 许多研究表明金属蛋白酶家族的成员能够相互激活 i t oae ta 1 ，1 9 9 5 ，这在对产生 f 细胞的细胞膜上姗一 b 母的研究中得以阐明。g r - g l p 激活m m p 一2 ，而卿一2 主要由基质中的 成纤维细胞产生，因此产生于肿瘤细胞和周围基质的因子间发生了相互关系。金属蛋白酶体 q 的活化可能是其生物学行为的关键步骤，因为正是激活维持了基质降解平衡，该机制的确 定将开拓新的治疗观念。 茈2 四类金属蛋白酶酶原形式和成熟蛋白间分子量和氨基酸残基间的差异 m a t ( o l l 、t r g e l 酶原形式酶原形式 分子量氨基酸残基数目 成熟蛋白成熟蛋白 分子量氨基酸残基数目 ( 3 ) 金属蛋白酶组织抑制剂对删p 的抑制 t i m p s 是一多基因家族。至少有三个成员：t i m p i 、t i 肝一2 、t i 肝一3 和t i 肝一4 。通过 旧删p s 以1 ：1 摩尔比结合形成紧密非共价复合物而抑制m m p s 活性 m u r p h yge ta 1 ，1 9 9 5 。 i i m p 一2 和m 肝一2 间存在更为复杂的相互关系。天然抑制剂选择性地结合于无活性的酶原，结 合区域不同于其抑制结合点。这些结合方式也许在灯卜姗p 对h 咿2 的细胞激活中非常重要。 t i m p s 在基质合成和m m p s 对基质的降解平衡中起重要作用，只要有m 俨s ，就有t i m p 存 t 。如在恶性肿瘤中删p s 过表达时，t i m p 也过表达，早期研究表明m 俨s 的上调节同类似的 ? i m p s 的上调节有关。然而最近研究表明h m 噼s 和t i m p s 可能独立调节，有时是相互调节。因 此肿瘤中存在某一因子造成m m p 表达超过t i m p s 从而改变了基质成分降解平衡。相反，t i m p s 过量产生会阻止基质降解及肿瘤侵染 m c d o n n e l lse ta l ，1 9 9 0 ；g r i g i o n iwf 。1 9 9 4 。 t i m p l 为一糖蛋白( m r 为3 0 k d ) ，其c d n a 和氨基酸序列已有报道 c a r m i c h a e ldfe ta 1 9 蹦 。和正常的或未被极度感染的细胞相比，在高度侵染的细胞中t i m p l 水平下降1 0 2 0 4 一一 壁壹叁堕塑蝗童垒星垄皂壁苎里鱼塑量塑鳇盟窒 倍。利用反义r n a 诱导来侵染的m u r i n e 细胞系的t i m p 水平降低，进一步证明了t i m p 水平的 f 降导致侵染转移活性的升高的假设。有了重组t i m p ，许多研究着眼于应用t i 肝一l 作为抗 侵染剂的潜在治疗用途。在体内和体外测定中已表明r t i m p 抑制肿瘤细胞侵染的能力。羊膜 f 生侵染测定中，加入5 g m l r t i m p 导致完全抑制了鼠黑痣瘤细胞系b 1 6 一f i o 的侵染能力。为 研究r t i m p 的体外作用将高侵染能力的鼠胚胎细胞系h r a s l ( 被h a - r a s 侵染) 注射到裸鼠鼠 曜静脉中，经反复注射r t i m p 后，这些细胞定居肺的能力被抑制到8 3 。系统注射r t i m p 也 ，! 成功地用于治疗老鼠中由胶原诱导的关节炎 m c d o n n e l ls e ta 1 ，1 9 9 0 。 t i m p 一2 为非糖蛋白( m r2 3 k d a ) ，它和有活性的间质胶原酶反应，也能阻止该酶从5 2 k d a 艺活性前体向4 2 k d a 活性形式的活化过程 d e c e r c k ya e ta 1 ，1 9 8 9 。尽管t i m p 一1 和t i m p 一2 两者都能抑制其它金属蛋白酶亚类所有成员，但t i m p 2 对g e l a t i n a s e a 的抑制活性比t i m p 一 更大。重组t i t j l p ( r t i 肝) 在体内均已表现出抑制肿瘤细胞侵染的能力。许多研究者已着手 号虑t i m p 作为抗侵染药物的潜在治疗用途。 尽管使用纯化和重组t i m p 的研究相当成功，并认为通过抑制金属蛋白酶的活性而起作 ：目，但必须说明谨慎从事，因为已表明t i 船s 有一类生长因子的活性。可能的话，模拟含有 、 胱氨酸的肽或前肽区域的药品可被开发成治疗制剂。已有几种h m 巾s 催化区的晶体结构被解 b ，有可能设计出制剂和活性中心结合从而抑制它们的活性。 第四节m 舻s 在肿瘤中的作用 肿瘤从良性状态到恶性状态的转化涉及到原发肿瘤和e c m 间许多重要的相互关系。这些 日互关系包括基底膜的降解，通过下衬联结组织基质的侵染以及活的肿瘤细胞通过小血管和 淋e ：血管侵染，从而导致向更远部位转移。在远部位发生了进一步的相互关系：通过血管壁 向外侵染到周围基质，降解基质使肿瘤细胞扩展，新生血管( a n g i o g e n e s i s ) 侵入肿瘤细胞 l 、保证肿瘤生长 p a r s o n ssle ta 1 ，1 9 9 7 。 由于这些作用涉及到胞外基质的降解和组织再造，故认为 咿s 在肿瘤发展中起作用。 许多应用细胞系的体外研究己表明h 岍s 的过表达与大多数侵染表型有关。动物中的肿瘤扩散 研究也表明胶原酶表达和肿瘤扩散问的关联。由此看来，肿瘤细胞必须在以下几个方面表现 出其侵染特征。进入和离开循环系统，渗透进入正常组织。l i o t t a e ta l 1 9 8 6 已提出肿瘤侵 染的三步理论：( 1 ) 肿瘤细胞吸附于基质膜，该过程通过细胞表面特异性受体介导，这些受 体特异性地同基质成分比如层粘连蛋白、纤连蛋白、胶原等结合。( 2 ) 分泌破坏性的酶，局 部降解基质成分。( 3 ) 肿瘤细胞转移到经蛋白水解的基质部位。肿瘤细胞要侵染周围组织， 必须穿过一系列的由胞外基质分开的组织腔，胞外基质由基质膜和其下的细胞间质组成。胞 外基质是由许多纤维蛋白如胶原，层粘连蛋白、纤连蛋白和糖蛋白组成的网状结构。过去 ：认为胞外基质是仅为生物体提供结构支持的插入结构，现在则发现胞外基质的降解对许多 i ：常及病理过程有着重要影响，比如胚胎发育、肿瘤侵染和关节炎。 胃癌：删p s 由一些胃癌细胞系表达且m m p s 的表达和侵染相关。免疫组织化学研究表明 人胃癌中的明胶酶表达比正常粘膜中的高，且表达量和肿瘤状态等级相关，但与t i m p 一2 表达 导负相关 g r i g i o n iwfe ta 1 ，1 9 9 4 。用来自新鲜人肿瘤组织分离块的培养基酶谱进行了 两个重要研究。酶谱在有活性和无活性删p s 间明显不同。第一个研究表明m 伊一2 和删p 一9 在 辣自胃( n = 1 5 ) 和结肠直肠( n = 1 5 ) 正常和恶性组织中均有表达但发现有活性( 被加工激活) 的 6 7 k d a 酶只在恶性组织中表达。n o m u r a 等在4 6 个胃癌中发现相似的结果，6 2 k d a 酶存在于5 9 的癌中和2 3 的正常细胞中。他们还发现m t m m p 表达和有活性的6 2 k d a 酶的相关性，尽管只 a5 个病人中进行了m t 一删p 分析。这些结果支持他们先前： 作表明的m t 一舯是删p - 2 的一 一一 主曼型芏堇查盔