（生物化学与分子生物学专业论文）烟草叶片蔗糖酶的分离纯化及部分性质研究.pdf

两南人学硕i j 学位论文 摘要 烟草叶片蔗糖酶的分离纯化及部分性质研究 生物化学与分子生物学专业研究生武忠亮 指导教师唐云明教授 摘要 蔗糖酶( e c 。3 1 2 2 6 ) 是一种水解酶，j 泛存在丁动物、植物，微生物等各种生物体内。 蔗糖酶在高等植物物质的贮存和光合作川产物的运输中起重要的作川。它不可逆的催化蔗糖 水解为果糖币l 葡萄糖，为植物的生k _ 手ij 发育提供碳源和能源。蔗糖酶在蔗糖由源组织向库组 织的运输中也贝有重要的作_ i 蔗糖酶破认为是植物体内碳水化合物代谢中的笑键酶。而且 蔗糖酶还可以参与植物体的细胞分化和膨人、信号传导、以及对机械损伤、病菌侵害利对各 种胁迫的响应锋方面。 烟草属舣子叶植物纲( d i c o t y l e d o n e a e ) 、管花日( t u b i f l o r a e ) 、茄科( s o l a n a c e a e ) 、烟草属 ( n i c o t i a n a ) ，足收获叶片的佧物，烤烟是州南地区乃至全国重要的经济作物之一，我国卷烟i ： 业生产中的重要材料米源。伴随着吸烟与健康的问题烟草产品的质域控制在过左的儿年中。 成了全球日菇笑注的话题。 糖作为一个必要的成分存在丁所有的烟草晶种之中糖类的特征和品质不仅强烈的影响 着作为卷烟生产中原材料烟叶的质馘品质，而且还会影响最终的卷烟l ：业产品质带。糖不仅 作为烟草中的一个犬然组成成分。弗且也经常被州米添加剑卷烟生产中，被认为是一种安全 的卷烟产品生产香味荆和保湿添加剂。蔗糖、果糖、葡萄糖等糖类是有机酸、类明箩h 素和 其它营养成分及芳香物质合成的基础原料。而且研究表明存在丁烟草中的这些化台物的含鼙 在烟n i 的质量分级中具有很重要的作h j 。 本实验主要通过对烟草叶片蔗糖酶的分离纯化、理化性质，酶促动力学特性以及功能基 团的化学修饰笛方面进行了研究，以期能够为在烟草栽培，烟叶生产及卷烟加l ：过稃中提供 相应的理论基础结果如卜； 1 蔗糖酶的分离纯化 l 两南人学硕f 学位论文 捅要 以烟草叶片为材料通过组织捣碎、缓冲液抽提、超滤。硫酸铵分级沉淀、d e a e s e d h a r o s e 离子交换层析、s e p h a c r y ls - 2 0 0 凝胶过滤层析。以s d s p a g e 检测其纯度获得了屯泳纯的 烟草n l 。片蔗糖酶。纯化倍数为1 3 8 倍，比活性为6 5u m g 同收率为1 7 4 。 2 蔗糖酶的性质研究 结果表明，蔗糖酶全分子母为1 2 9 k d ，弧基分子鼙为6 3 5 k d 表明蔗糖酶是由两个相同 的弧基组成。酶促动力学性质研究表明。蔗糖酶的最适p h 值为4 0 在p h3 0 5 5 的范用内 比较稳定最适温度为4 5 c 温度高丁5 5 c 以上不稳定酶的特征米氏常数k m 值为1 3 m m o l l ，最人反应速度v m a x 为7 6 7 p g m i n 。 3 金属离子及e d t a 的影响 在实验中h g z 、p b 2 + ，a g + 及e d t a 对蔗糖酶的抑制能力最强，而c ，a s 5 对蔗糖酶 的活性也有一定的抑制作h 1 m n 、c f 则能促进酶的活性，m g z ，k 对蔗糖酶的活性无影 响。 4 蔗糖酶的化学修饰 采h jp m s f 、n b s 、l a c 、 b r a c 、s u a n 、t n b s ，p c m b ，d t t 笛修饰荆在一定的条 什r 修饰蔗糖酶，表明：p m s f 、n b s 、p c m b 笛显并地抑制酶的活力，而b r a c i a c ，t n b s 、 s u a n 、d 1 广r 笛对酶的活力影响不人。 关键词：蔗糖酶分离纯化性质功能基团 2 两南人学顺i 学位论文 a b s t r a c t p u r i f i c a t i o na n ds o m e p r o p e r t i e so f s u c r a s e f r o mt o b a c c o ( n i c o t i a n at o b a c u m 三) l e a v e s d i s c i p l i n e ：b i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l a rb i o l o g y d i r e c t i o n ：e n z y m o l o g ya n de n z y m ee n g i n e e r i n g s u p e r v i s o r ：p r o f t a n gy u n m i n g m a s t e rc a n d i d a t e ：w uz h o n g l i a n g a b s t r a c t s u c r a s e ( e c 3 i 2 2 6 ) i sw i d e s p r e a di np r o k a r y o t e sa n de u k a r y o t e s s u c r a s ec a t a l y z e st h e i r r e v e r s i b l eh y d r o l y s i so f s u c r o s ei n t og l u c o s ea n df r u c t o s e ，t h em a i n f o r m so f c a r b o na n de n e r g y s u p p l i e si np l a n tg r o w t ha n dd e v e l o p m e n t s u c r a s ep l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nt r a n s f o r m i n gt h e p h o t o s y n t h e t i cp r o d u c t sf r o mt h es o u r c et i s s u et ot h es i n kt i s s u e i np l a n t s ，d u et ot h ec e n t r a lr o l eo f s u c r a s ei na s s i m i l a t et r a n s p o r t w h i c hi sc o n s i d e r e da sak e ye n z y m ef o rc a r b o h y d r a t em e t a b o l i s m m o r e o v e r , s u c r a s ea l s op l a y si m p o r t a n tf u n c t i o n si nc o n t r o l l i n go f c e l ld i f f e r e n t i a t i o na n dc e l l e n l a r g e m e n t ，s i g n a lt r a n s d u c t i o n ，a n dp l a n tr e s p o n s et ow o u n d i n g , i n f e c t i o na n dk i n do f s t r e s s f i r e c u r e dt o b a c c oi so n eo f t h ei m p o r t a n tc a s hc r o p si nt o b a c c o g r o w i n ga r e ai nc h i n a , a n da m a i ns o u s e o f r a w m a t e r i a l f o r t o b a c c o m a n u f a c t u r i n g o v e r t h e p a s t f e w y e a r s , c o m p a r e d w i t h s m o k i n ga n dh e a l t h ，q u a l i t yc o n t r o lf o rc i g a r e t t ep r o d u c th a sb e e na ni n c r e a s e di n t e r e s ti ng l o b a l s u g a r sa r ei n e v i t a b l e c o n s t i t u e n t si na l lt y p e so f t o b a c c om a t e r i a l ，a n db o t ht h e i rq u a n t i t i e sa n d p r o p o r t i o n ss t r o n g l ya f f e c tn o to n l yt h eq u a l i t yo f t o b a c c oa sar a wm a t e r i a l b u tt h ep r o p e r t i e so f t h e f i n a lt o b a c c op r o d u c t sa sw e l l s u g a r sa r ef r e q u e n t l ya d d e dt ot o b a c c od u r i n gt h em a n u f a c t u r i n g p r o c e s s ，b e i n gg e n e r a l l yr e c o g n i z e da ss a f et o b a c c oa d d i t i v e s a r eu s u a l l yr e p o r t e dt os e r v ea s f l a v o u ra n dh u m e c t a n t s u g a r sl i k es u c r o s e ，g l u c o s ea n df r u c t o s ea r et h em a t e r i a l sb a s i sf o rs y n t h e s i s o f o r g a n i ca c i d ，c a r i o t e n o i d s ，a n do t h e rn u t r i e n ta n da r o m a t i ci n g r e d i e n t s t h e r e f o r er e l i a b l e d e t e r m i n a t i o no f t h e s ec o m p o u n d si nt o b a c c oa p p e a r st ob ee s s e n t i a lf o rt h ec l a s s i f i c a t i o no f t o b a c c o m a t e r i a la c c o r d i n gt oi t sc o n t e n t t h er e s u l t so f o u rs t u d yw e r ef o l l o w e d ： 两南人学彤! | 。学位论文 a b s t r a c r 1 p u r i f i c a t i o no fi n v e r t a s ef r o mt o b a c c oi e a v e s c r u d ee n z y m es o l u t i o n sw e r ao b t a i n e df r o mt o b a c c ol e a v e sb yt i s s u e sm a s h i n g 、u l t r a f i l t r a t i o n a n ds e q u e n t i a la m m o n i u ms u l p a t ep r e c i p i t a t i o n a n dt h e ni n v e r t a s ew a sp u r i f i e db yd e a e s e p h a r o s ei o n - e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h ya n ds e p h a c r y ls - 2 0 0g e lf i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h y t h e p u r i f i e ds u c r a s ew a sc h a r a c t e r i z e db ys d s p a g e t h es p e c i f i ca c t i v i t yw a s6 5 u m g , p u r i f i c a t i o n f o l dw a s2 1 6 t h ea c t i v i t yr e c o v e r yo f s u c r a s ew a s1 7 4 2 p r o p e r t i e so f s u e r a s e t h em o l e c u l a rw e i g h to f t h ee n z y m ei s1 2 9 k da n ds u b u n i ti s6 3 5 k da sa s s a yb ys e p h a c r y l s 2 0 0a n ds d s p a g e t h ek i n e t i cc h a r a c t e r so f t h ee n z y m eh a v eb e e ns t u d i e d t h eo p t i m u mp h a n do p t i m u mt e m p e r a t u r ef o rt h ee n z y m ea r ep h4 0a n d4 5 c k mi s1 3 m m o l la n dt h ev m a xi s 7 6 7 p g m i n 3 1 n h i b i t o r so f s u c r a s e a m o n gs e v e r a l m e n t a l i o n s h 9 2 + 、p b 2 , a g + a n d e d t aa r e ：s t r o n g l y i n h i b i t e d t h ea c t i v i t y , c ，+ 、 a s 5 + h a v el i t t l ee f f e c to ns u c r a s e 。m 9 2 + ，k + h a v en oe f f e c to ni t ，b u tm n 2 t 、c u 2 + c a na c t i v a t e st h e e n z y m ea c t i v i t y 4 c h e m i c a im o d i f i c a t i o no f f l u c r a s e s u c r a s ew a ss e l e c t i v e l ym o d i f i e db yp m s f 、n b s 、i a c 、b r a c 、s u a n 、t n b s 、p c m b 、 d t t t h er e s u l t ss h o wt h a tp m s f ，n b s 、p c m bi n h i b i t e ds u c r a s ea c t i v i t ys t r o n g l y ，w h i l eb r a c 、 i a c 、t n b s 、s u a n 、d 下th a v el i t t l ee f f e c to ni n v e n a s ea c t i v i t y k e yw o r d s ：s u c r a s e ，p u r i f i c a t i o n ，p r o p e r t i e s ，m o d i f i c a t i o n 2 独创性声明 学位论文题目：恤冀垒s 整痖鲢五窭苍趟望垒醒臣 ：缯蕴二 一一一一 一 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为 获得西南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者：烈慝毛签字日期：弦7 年r 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：苗不保密， 口保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名：拔高彰 签字日期：涧年r 月f 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 掣赣：冀瓢b 日 签字日期：伊7 年中月搿日 电话：() 邮编： 两雨人学硕卜掌位论文 义献综述 第一部分文献综述 1 1 蔗糖酶概述 蔗糖酶( s u c r a s e ，e c 3 2 1 2 6 ) ，又称为转化酶( i n v e r t a s e ) ，在六大蛋白酶类属于 第3 类一水解酶类作用于糖基，水解氧一糖化合物。在1 8 2 8 年d u m a s 等就首先 指出，酵母发酵利用蔗糖时需要这种酶的参与1 8 6 0 年b e r t h o l e t 从啤酒酵母 ( s a c c h a m m y c e sc e r e v i s i a e ) 研磨液中用酒精沉淀将其分离。蔗糖在蔗糖酶的催化下， 水解成为两种还原糖d 葡萄糖和d 果糖“1 。 d 毗嘀葡萄糖 。芦、h 6 h 洲2 0 群h o 瑰x 也 肛弘呋嘀果储 可以看出，蔗糖酶水解由葡萄糖和果糖所形成的p 1 ，2 糖苷键，为p 一呋喃果糖 苷酶( 3 - f r u c t o f u r a n o s i d a s e ) ，蔗糖酶具有键的相对专一性，还可以催化棉子糖水解生 成蜜二糖和果糖，但对蔗糖的亲和力最大( 即k m 最小) ，不能水解松二糖、松三 糖等“1 ，虽然二者的分解产物是葡萄糖和果糖，但他们不是以b 1 ，2 糖苷键连接， 所以可以用底物特异性来分析纯化蛋白是否为b 呋喃果糖苷酶。 蔗糖是光合作用的产物，也是植物体内光合产物由叶( 源) 到果实( 库) 的主要 运输形式。在大多数高等植物中，其动力是由蔗糖浓度梯度所引起的膨压，这种 蔗糖浓度梯度受到库器官中蔗糖的利用率和依赖于a t p 的蔗糖跨膜运输的调节。 在不同的亚细胞区域，蔗糖可以进入不同的利用途径；进入糖酵解和三羧酸循环 产生a t p 和n a d a h ：也可以合成初级产物，促进植物生长发育；或转变为多聚 物如淀粉、三酰甘油酯等，便于长期贮藏；或转变为次级产物，使植物能应付昆 虫和其他环境的挑战。蔗糖作为碳源和能源被利用”1 ，首先要被裂解形成己糖。蔗 糖酶在植物的运输贮藏、碳水化合物代谢中发挥主要作用“并在渗透调节“1 、抗逆 性生长繁殖删、以及信号传导”1 方面也发挥着重要的作用。 蔗糖酶不可逆的催化蔗糖水解为葡萄糖和果糖，随着对蔗糖酶研究的深入， 两南人掌磺卜学位论文 文献综述 人们发现蔗糖酶不仅存在于能进行光合作用的源组织“( 叶片) ，也广泛存在于非 光合作用的库组织“( 果实、根、花药等) 中。 1 2 蔗糖酶的分离纯化 蔗糖酶广泛存在于微生物、动物和植物中，】9 1 3 年，m i c h a e f i sm e n t e n s 就对 蔗糖酶进行了研究，在过去的几十年中，已从多种组织( 主要是植物) 中分离纯化 了蔗糖酶，并对其理化性质和动力学性质进行了研究。目前蔗糖酶的研究主要集 中在对蔗糖酶的源库关系调节、对植物生长发育的调控、糖分组成的调控、胁迫 响应和信号传导等生理功能方面的研究。 蔗糖酶常规的提取方法是用缓冲液匀浆抽提、硫酸铵分级沉淀、d e a e - 纤维 素( 琼脂糖) 离子交换层析、s e p h a d e x 凝胶过滤层析等多步组成，不同柬源的蔗糖 酶，提纯方法略有不同。 张振清“”从大豆叶片中经d e a e 纤维素柱层析分离出3 种蔗糖酶。分别经过 s e p h a d e xg 2 0 0 凝胶过滤，最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳，证明三种蔗糖酶都得到了 较好的纯化。它们有相近的最适p h ，酶i 最适p h 约为5 左右，酶l l 和i i i 的最适 d h 在4 5 之间。三种蔗糖酶的k m 值( 蔗糖) 基本相同，约为1 3 m m o l l 。但是它 们的v m a x 相差较大，三种蔗糖酶的分子量非常接近，在7 1 k d 7 6 k d 之日j 。 张利平1 用d e a e 纤维素柱层析对白兰瓜子叶蔗糖酶进行分离：发现细胞质 可溶性部分含有4 种蔗糖酶同工酶，其中3 种为酸性蔗糖酶( i 、i i 、l i i ) ，其最适p h 分别为5 4 0 、4 3 0 和4 7 3 ；另外一种为碱性蔗糖酶，其最适p h 为7 4 0 。在白兰瓜 子叶生长后期( 7 l l d ) ，酸性蔗糖酶i 、i i 和i i i 的活性略有升高，衰老发生后( 1 7 2 3 d ) 活性显著下降，衰老后期碱性蔗糖酶活性消失。 唐云明等通过硫酸铵分级平i d e a e 琼脂糖交换柱层析和s e p h a c r y ls - 2 0 0 凝胶 层析分别从柑橘叶片“”和甘薯叶片“”中分离得到蔗糖酶，凝胶层析测定全分子量 分别为8 0 k d 和7 9 4 k d ，s d s p a g e 测得亚基分子量分别为4 0 k d 和3 9 8 k d ，表明这 两种酶均由两个相同的亚基组成k m 分别为1 6 m m o l l 和1 2 m m o l l ，最适p h 都在 5 0 左右，p h 稳定性在4 o 6 0 之日j 。 褚波等经过组织捣碎、硫酸铵分级沉淀、d e a e s e p h a r o s e 离子交换层析、 s e p h a c r y ls - 2 0 0 凝胶过滤从接骨草叶片1 中分离纯化得到3 种蔗糖酶同工酶，对3 种 同工酶进行s d s p a g e 和i e f 电泳均显示一条蛋白带，其亚基分子量分别为4 5 8 k d 、 4 4 3 k d 和4 3 2 k d ：凝胶过滤测得全酶分子量分别为9 1 2 k d 、8 9 1 k d 和8 7 4 k d ，这3 种同工酶均有两个相同的亚基组成，其表观k m 值分别为3 0m m o l l 、5 7 1 m m o l l 和6 5m m o l l 。v m a x 分别为9 8 p g m i n 、4 8 g m i n 和3 5 p g m i n ，同工酶i 和i i i 在p h4 4 5 0 时有最大的活性，同工酶i i 则在p h3 9 4 2 时有最大活性，均在p h3 6 范围内 2 西南人掌顼i 学位论文 史献综述 比较稳定。它们均在5 0 下有较好的稳定性。 目前除了上述几种蔗糖酶以外现在还已经从c a r r o t ( d a u c u sc a r o t a ) “”， s u g a r c a n e ( s a c c h a r u mo f f i c i n a r u m ) “帕。s o l a n u mt u b e r o s u mt u b e r s 。 a s p e r g i l l u sn i g e r a s 0 0 2 3 ，r h o d o t o r u l a g l u t i n i s ，j a p a n e s ep e a r ( p y r u s s e r o t i n a ) f r u i t 汹1 ，b a m b o o ( b a m b u s ae d u l i s ) c e i l s 。“，等物种中分离纯化出蔗糖酶，不 同物种蔗糖酶的分子量差异比较大，通过分析，蔗糖酶分子量一般在3 5 2 7 0 k d 之间：最适p h 值一般在4 5 左右；k m 值1 0 2 0 0 m m o l l ，重会属离子如c o ”、c u “、 h g ”、a g 等对蔗糖酶都有不同程度的抑制作用，其中大多数植物的蔗糖酶对h g ”极 其敏感。 1 3 蔗糖酶的分布 1 3 1 动物中的蔗糖酶 唾液是牙齿的外环境，唾液中某些成分的变化与牙齿健康有十分密切的关系， 其中唾液蔗糖酶对摄入蔗糖的分解作用，直接影响到龋齿的发生和发展。研究 表明，短期内给与儿童高糖饮食，可使唾液蔗糖酶活性显著提高，说明糖类能在 短时间内诱导酶活性的增加，加速蔗糖降解为葡萄糖和果糖，而唾液中的蔗糖酶 主要由口腔中的变链菌、乳酸杆菌、唾液链球菌、放线菌、奈氏菌和酵母菌等“” 产生，水解蔗糖生成葡萄糖和果糖，利于细菌本身的吸收和利用。当口腔卫生不 良时，产酸菌增加，蔗糖酶的量也增加。这也提示唾液蔗糖酶活性能够反映儿馥 患龋齿的危险程度。 j 下常人体小肠内，含有由小肠绒毛上皮细胞分泌合成的蔗糖酶。水解蔗糖 生成葡萄糖和果糖，供小肠消化和吸收。在口腔和十二指肠的唾液淀粉酶和胰淀 粉酶的作用下，糖产生初级代谢产物麦芽糖、麦芽丙糖和a 一糊精。只有在小肠蔗 糖酶和其他酶的作用下，才能产生最终消化产物葡萄糖“”。 蔗糖酶在大肠粘膜组织中活性极低，部分粘膜组织尚缺乏该酶活性。币常仅 存在于小肠粘膜的蔗糖酶，其活性可在大肠癌组织中显著提高1 。陈维顺等测定 了大肠正常粘膜与肿瘤组织中的蔗糖酶活性，结果表明，蔗糖酶在正常的大肠粘 膜组织内活性极低，但随着组织恶性转化，其酶活性成梯度增高。以大肠癌升高 最明显，腺瘤次之，结果提示蔗糖酶活性升高与大肠粘膜癌变有关。而且，肿瘤 内蔗糖酶活性与肿瘤大小呈f 相关，也随异型增生程度的加重而递增，重型异型 增生腺瘤的蔗糖酶活性与大肠癌相似。表明蔗糖酶在生物学特性上能较早地反映 大肠腺瘤的的恶变趋势，该酶活性可能对于判断大肠的良恶性疾病，预测腺瘤恶 变有重要的临床意义”1 明雨人学仔! f 。掌位论文 文献综述 1 3 2 微生物中的蔗糖酶 蔗糖酶广泛存在于酵母、曲霉、青霉和细菌中，现大多以酵母属或假丝酵母 作为蔗糖酶的生产原料。工业上生产果葡糖浆主要用酸水解的方法，该法虽然具 有量大、快速的特点，但其也存在很大的弊端，如反应条件剧烈、产物易分解或 聚合、精制工序复杂、色泽难去除等。采用生物酶法则可以克服上述缺点，有效 地实现蔗糖工业化生产果葡糖浆，而这一目标的实现则依赖于蔗糖酶高产菌株选 育的重大突破。 j e n s e n 等首先报道了s e r p u l i n ah y o d y s e n t e r i a e 和s e r p u l i n ai n n o c e n s 中存在 可被诱导的蔗糖酶。在蔗糖的诱导下s e r p u l i n ah y o d y s e n t e r i a eb 2 0 4 产生了细胞伴 随蔗糖酶活性，这种蔗糖酶能分解蔗糖、棉籽糖，最适p h 为5 7 6 2 。陈庆森等 利用活性干酵母协和产黄青霉汹1 ( p e n i c i l i u mc h r y ) 作蔗糖酶的原料，以尘产蔗糖 酶。d a nv 等从黑曲霉中筛选出蔗糖酶生产菌m i u g l 1 5 ，分泌的胞外蔗糖酶在 4 0 4 5 的酸性介质中比酵母( s a c c h a r o m y c e ss p e c i e s ) 的胞内蔗糖酶具有更强的热 稳定性m i 。随着培养基和发酵条件的不同，黑曲霉蔗糖酶可发生透膜转移，胞外 蔗糖酶更容易从发酵液中分离。 吴伟祥等人在8 7 个喀麦隆栋榈酒酵母( c a m e r o o n i a np a l mw i n ey e a s t ) 分离物中 得到2 个分离物对乙醇( 1 6 1 7 ，v v ) 和糖类具有高的耐量。可生长于含有高达 5 0 ( w v ) 葡萄糖的培养基中，且具有较高的蔗糖酶活性。在以糖蜜发酵乙醇的生产 中具有潜在的价值。按形念学和生理特性推断，y a 2 属中日j 假丝酵母( c a n d i d a i n t e r m e d i a ) 而y a 0 4 为啤酒酵母( s a c c h a r o m yc e s c e r e v i s i a e ) 。 周中凯采用固态法培养蔗糖酶尘产菌生产成本低，易实现工业化，实际操作 中可由企业内部培养、过程易操作、投入低m 】，水解蔗糖生产果葡糖浆易实现工 业化生产、工艺流程短、生产线投入低、产品质量易控制，具有极强的市场竞争 力，为果葡糖浆的生产提供了又一原料和有效方法。 1 3 3 土壤中的蔗糖酶 土壤作为“特殊的有机体”，其中的土壤动物或遗骸、植物根系及残体和微生 物能够产生具有生物活性的土壤酶类，在土壤的碳、氮、磷循环中具有重要作用， 是土壤新陈代谢的催化剂。由于土壤酶活性易受到环境中化学、物理和生物等因 素的影响，一定程度上可以灵敏地反映环境状况m “川。蔗糖酶是土壤中的重要酶 类与多种物质有相关性，对增加土壤中易溶性营养物质起着重要作用，是评价 土壤肥力的重要指标m 周世萍等采用模拟方法探讨，毒死蜱污染土壤酶活性的变化规律脚1 ：表明， 有机质含量高的土壤，毒死蜱对土壤蔗糖酶具有明显的抑制作用，在酸性和中性 4 啊雨人掌顾i 学位论文 文献综述 条件下，活性的抑制幅度较大，在试验所设的培养时间内，毒死蜱对蔗糖酶活性 的抑制总的变化趋势呈现先激活后抑制。抑制程度的大小随外界环境的变化而变 化。对土壤蔗糖酶活性的抑制与土壤有机质含量、作用时自j 及酸度条件有关，建 议对于有机质含最较高的土壤，采用蔗糖酶活性作为表征土壤毒死蜱污染程度的 监测指标。 杨春璐等实验中h g 的加入可使草甸棕壤中蔗耱酶在低浓度时被激活，高浓度 时被抑制，黑土蔗糖酶随h g 浓度增加，酶活性持续下降蔗糖酶活性可在一定程 度上表征土壤h g 污染水平，h g 与豆磺隆同时添加对土壤蔗糖酶的影响存在交互作 用，有机质可起到降低毒性的作用不同土壤类型中有机质含量较高的土样表现 出拮抗作用，有机质含量较低的土样主要为协同作用，h g 与呋喃丹同时添加后， 除有机质含量较高的土样在低浓度时有一定的缓冲作用( 拮抗作用) 外，其余均表 现为协同作用 李永红通过室内培养研究了不同浓度单嘧磺隆对土壤呼吸强度和蔗糖酶活性 的影响，第8 d 时，单嘧磺隆显著抑制土壤蔗糖酶活性，且抑制作用和单嘧磺隆浓 度表现出i f 相关不超过1 0 倍田日j 推荐剂量的单嘧磺隆( 0 0 2 5 i t g g ) 对土壤蔗糖酶的 抑制作用很短暂，处理1 2 d 以后抑制作用消失。极高浓度单嘧磺隆( 2 5p g ) 持续显 著抑制土壤蔗糖酶活性1 。 不同浓度乙醇对土壤蔗糖酶活性的影响以及不同底物( 蔗糖) 浓度对乙醇与蔗 糖酶活性关系的实验结果表明：乙醇可明显抑制土壤蔗糖酶活性，其浓度与土壤 蔗糖酶活性呈显著或极显著相关，其作用方式为直接抑制：底物浓度可放大乙醇 与土壤蔗糖酶活性之间的关系，乙醇加入导致土壤蔗糖酶的k m 和v m a x 减小，揭 示其作用机理为完全抑制作用，包括竞争性和非竞争性抑制作用呻1 。 依艳丽研究发现3 种土壤风干状态下蔗糖酶的活性都较低，但土壤湿涧后酶活 性提高。磁处理效果受土壤湿度影响，对蔗糖酶磁处理使酶活性提高幅度是风干 土 湿土。从磁处理后酶活性提高的幅度看是蔗糖酶 淀粉酶，本研究采用的磁处理 使土壤蔗糖酶活性和淀粉酶活性均有不周程度的提商，但这种作用随土壤类型不 同而有较大差别，如磁处理使土壤蔗糖酶活性提高的大小顺序基本是黑土 棕壤 白浆土，总之，选择适宜的磁处理，可明显地提高土壤蔗糖酶的活性，以利于土壤 肥力的发挥“ 1 3 4 植物中的蔗糖酶 植物的种子中，子叶的功能是作为营养物质的贮减者，子叶见光转绿后其 作用又与功能叶类似，具有较强的光合作用和代i 身 活动。这就决定了子叶的主要 代谢特征是贮藏物质和光合产物的降解和输出。衰老启动后代谢的主流是细胞的 两南k 学硕l 学位论文 文献综述 有序降解，表现在与蔗糖代谢密切相关的蔗糖酶活性变化趋势是酸性蔗糖酶活性 明显下降。衰老子叶中蔗糖酶活性的降低导致能量和碳源的不足，使子叶各种 生理活动不能j 下常运行，另一方面，由于蔗糖酶活性的下降而导致细胞内蔗糖的 大量累积，使衰老后期子叶中碳水化合物外运到生长旺盛组织成为可能，可以认 为。子叶衰老引起的蔗糖酶活性下降反来又可以加速子叶的衰老，有利于幼苗的 生长。 蔗糖为光合作用的终产物，被蔗糖酶水解为单糖而参加器官建成，与花芽分 化密切相关。李兴军等的研究结果表明：在花芽孕育期问，蔗糖水平变化过程与 蔗糖酶呈相反趋势。花芽发端l i ，蔗糖水平先降低后明显地积累。而蔗糖酶活性 则先升高再降至最低。发端期，蔗糖水平降低而蔗糖酶活性增加。新梢旺长而消 耗还原糖，使供给芽体的还原糖减少，从而抑制花芽分化，降低成花率“。 节果梨花芽分化临界期蔗糖酶活性增强，为细胞的可溶性糖类提供可利用的 六碳糖，蔗糖酶活性在分化l 临界期达高值。说明前该酶活性升高有利于花芽形，奈 分化。花蕾、花等分化期蔗糖酶活性下降，花瓣分化期，蔗糖酶活性变化不大， 从雄蕊分化期进入雌蕊分化期。蔗糖酶活性升高。可见蔗糖酶活性的变化与花芽 形态分化各时期生理变化密切相关“”。 可溶性酸性蔗糖酶是决定甜菜块根贮藏质量的关键酶。曾宪彬等的研究结果 表明，可溶性酸性蔗糖酶与块根贮藏质量关系最为密切3 。低温贮藏是马铃薯加 工中减少原料损失的主要措施，低温能降低块茎的呼吸消耗。延长休眠期，但同 时也易造成还原糖的积累，影响油炸加工品质1 。发现块茎的还原糖含量与其炸 片色泽指数具有极显著的直线正相关关系，葡萄糖和果糖两种还原糖，高温条件 下与块茎中的游离氨基酸反应，使炸片变黑或变成褐色。 而且贮藏过程中由于呼吸代谢加强，细胞内积累了大量的有机酸使得细胞汁 液酸化，从而有利于提高可溶性酸性蔗糖酶的活力”。此外，不良贮藏条件改变 了细胞膜通透性，使一部分贮藏型蔗糖转变成代谢型蔗糖，继而破坏了可溶性酸 性蔗糖酶和贮减型蔗糖的区域化分布，加速了蔗糖的降解。 1 4 植物蔗糖酶的生理功能 植物叶片通过光合作用生成碳水化合物，然后运向非光合组织，在库组织中， 蔗糖被分解为己糖，为植物生长发育提供碳源和能源，蔗糖酶在高等植物糖代谢中 起着关键的作用，蔗糖酶酶在调节韧皮部糖的卸载、贮藏器官中糖的组成、参与 植物逆境胁迫的响应、植物早期生长发育以及信号转导等方面都具有重要的作用 m 】，由于本试验研究的是植物烟草。所以对于植物蔗糖酶的生理功能和调节过程 予以详细的叙述 6 1 4 1 参与叶片光合作用 叶片光合作用的产物主要以蔗糖为主“蔗糖酶也决定着光合产物在淀粉和 蔗糖之间的分配，蔗糖酶活性较高，蔗糖消耗速率增大，质外空问表达酵母蔗糖 酶的转基因植物叶片，碳水化合物大量积累，光合作用受到抑制，同化物运出减 少生长延缓。b u s s i s 发现所有超表达蔗糖酶的转基因植物的叶片光合速率部降低， 但降低的原因有所不同，有些是由于己糖积累：卡尔文循环酶活性水平降低，与 糖酵解有关的酶活性升高；有些是由于叶片细胞渗透压升高所致“。 成熟健康的叶片主要的功能是蔗糖的合成与输出，然而这些器官中蔗糖酶的 活性往往很高令人有些不解，对此，k i n g s t o n 等“”有三种解释：叶片蔗糖酶活 性具有组织和细胞区域化分靠，如表皮、毛状体和维管组织内细胞对蔗糖分解代 谢有特别的需要，因而其蔗糖酶活性非常高。在光合细胞中，蔗糖酶可能作为 蔗糖感知途径中一个重要要素参与碳代谢的调节，通过糨调和细调反馈，改变叶 绿体中同化物分配和自身的净同化速率。有些蔗糖酶可能充当替代合成的角色， 参与体内大的寡糖或多糖的合成( 如果聚糖) 。 1 4 2 参与贮藏器官碳水化合物的组成 植物的果实、块茎、肉质根等贮藏器官中的碳水化合物组成受蔗糖酶的调节， 蔗糖酶与己糖的积累密切相关m 。z h u 发现在低蔗糖含量的甘蔗品种中，蔗糖酶 活性总足商于高蔗糖含量的品种，认为这是蔗糖酶基因在发育过程中表达水平不 同所致”“。在野生型的贮藏蔗糖的番茄( l y c o p e r s i c o n p i m p i n e l l i f o l i u n ) 果实中，蔗 糖酶基因在转录水平上是沉默的，在发育的果实中其m r n a 的量极少，蔗糖酶活性 非常低，而在经驯化的贮藏己檐的栽培种番茄( o p e r s i o ne s c u l e n t u m ) 果实中。蔗糖 酶活性在成熟丌始时就迅速升高。转基因植物的研究也证明了这一点，采用反义 r n a 抑制蔗糖酶的活性，可以提高番茄果实中蔗糖的含量，改变果实可溶性糖的 组成，并影响发育后期糖的快速积累，导致果实变小m 。马铃薯采后冷处理造成 的淀粉降解和蔗糖的重新合成，被随后冷诱导的蔗糖酶水解为葡萄稽和果糖，在 转基因马铃薯的块茎中对冷诱导的蔗糖酶反义抑制，并没有改变响应低温释放的 可溶性糖的总量，却改变了已糖蔗糖的比率”，证实了蔗塘酶在决定贮藏器官糖 分组成中的作用。 1 4 3 参与细胞对胁迫的向应 当植物受到胁迫，例如受伤或病菌侵染，许多基因活性的一系列防御反应被 诱导。通常植物对胁迫的代谢响应是呼吸升高，强化细胞壁以及产生防御复合物 等，这些代谢活性的提高可能更多的地依靠蔗糖流向受伤或被侵染的位点来实现 7 阴雨人掌坝i ：掌位论史 文献综述 的，而且伴随着高水平己糖的快速积累。a n d e r s o n 研究表明干早胁迫导致玉米发 育早期子房败育是由于干旱抑制蔗糖酶基因的表达。己糖不仅作为碳源和能源， 而且似乎在胁迫信号传递中起着重要作用”。例如在转基因( 酵母蔗糖酶基因) 烟 草植株中，系统获得抗性( s y s t e m i ca c q u i r e dr e s i s t a n c e ) 明显增强“病理相关基 因的转录也要求一定的己糖起始浓度，说明己糖分泌途径对防御相关基因的活化 是必需的。 1 4 4 参与植物的生长发育 己糖不仅是组织生长所需要的能源和碳源”，也是细胞伸长的驱动力，蔗糖 酶可相对地维持细胞的渗透压，增加细胞壁的可塑性，促进细胞伸长和植物生长。 g i b e a u t 发现在燕麦臼v e n as a t u a ) 叶枕下方蔗糖酶活性高出近3 倍，有利于渗透势 梯度的形成，从而促进生长”1 。向同葵下胚轴细胞的伸长也与蔗糖酶活性呈极显 著的相关性”“。康乃馨花瓣的生长主要是细胞扩大引起的，在其花瓣中也检测到 了很高的蔗糖酶活性和还原糖含量m 1 。在蚕豆发育过程中，营养物质贮藏之前的 阶段，蔗糖酶介导的蔗糖卸载造成了较低的蔗糖己糖比率，此时子叶具有较高的 减数分裂活性，伴随种皮中蔗糖酶活性的降低，蔗糖己糖比率显著增大，蚕豆籽 粒便从细胞分裂阶段过渡到了贮藏阶段因此认为胚的生长与高水平的己糖相关， 而细胞分化和贮藏物质的合成则是由高浓度蔗糖触发的由此可见，蔗糖酶决定 了籽粒的碳水化合物组成和发育m 。反义基因转化的番茄果实明显较小( 比对照小 约3 0 ) ”，导入蔗糖酶反义基因后，大多数植株育性也明显较低m 1 。这些研究都 表明了蔗糖酶可能通过对糖分和代谢流的调节在植物尘长发育中起重要作用。 i 4 5 在信号传导中的作用 植物体内糖水平调控着植物的萌芽、丌花到衰老的生长发育过程* “，近年来 研究表明，糖作为一个信号分子能激活或阻遏植物体内许多基因的表达眦1 。j a n g 提 出，植物细胞能感受和响应细胞问的己糖信号，并且由己糖激酶催化的己糖磷酸 化是信号转导途径的关键环节”对拟南芥转基因植株的研究表明。植物中存在 一条依赖于己糖激酶的葡萄糖信号转导途径”。因为蔗糖酶催化蔗糖分解为葡萄 糖和果糖，调节着蔗糖和己糖的比率。因此蔗糖酶对于信号产生和多种代谢过程 具有重要意义。s h e r s o n 认为蔗糖酶决定了从胞外为细胞提供的是蔗糖还是己塘， 胞外己糖的进入很可能作为种信号调控着细胞的活性呻1 。 w e s c h k e 研究发现，大麦颖果在淀粉积累之前，蔗糖酶基因在第一层胚乳细胞、 最外层的珠心和胚乳转移细胞中表达己糖载体基因在果皮内表达量极少，在花 后3 d 的多核胚乳中和花后7 d 的胚乳转移细胞中表达量很高，这种时空表达显示了 8 两雨人掌硕i + 学位论文 文献综述 在胚乳腔中由蔗糖酶作用释放的己糖通过己糖载体吸收，传递到中央胚乳的非细 胞区，供给具有有丝分裂活性的胚乳细胞，在颖果发育过程中，己糖充当了信号 分子的角色”1 。 1 5 蔗糖酶基因的表达调控 1 5 1 受器官和发育特异性调控 t y m o w s k e a 分析了拟南芥不同发育时期不同器官中两种蔗糖酶基因的表达情 况。发现它们的表达具有明显的发育和器官特异性，而且还受到环境因子的调节 。在百合花花芽旧，胡梦h 1 中也存在花特异性表达的酸性蔗糖酶基因。e l l i o t t 等发现野生种与栽培种番茄蔗糖酶核甘酸序列在一个内含子和调节区存在细小差 别，可能j 下是这些差别影响着基因的表达调节，野生种番茄蔗糖酶基因的表达比 栽培种番茄要早些盯0 。a n d e r s o n 报道了玉米中可溶酸性蔗糖酶的m r n a 在受粉前 和受粉后早期发育中，其含量均高于细胞壁结合的酸性蔗糖酶的m r n a ，后者只有