（生物化学与分子生物学专业论文）真菌紫杉醇的分离纯化和产物鉴定.pdf

摘要 摘要 真菌发酵生产紫杉醇因其生物可控性、资源可持续性而具有广阔的市场前 景。但是真菌发酵液中产物众多，而且黏度很大，这就给后期的分离纯化增加 了困难，同时也带来了成本的提高。 论文首先对液相色谱法检测该真菌发酵物中紫杉醇的条件进行了优化，结 果表明最佳条件为甲醇：水( v v ) = 7 0 ：3 0 ，柱温3 5 ，流速1 0 m l m i n 。在该条件 下，绘制了紫杉醇的标准曲线，得到的方程为y = 2 2 1 7 1 0 7 3 x + 3 5 0 0 9 在浓度范围 1 0 p g m l 1 0 0l ag m e 之间线性良好，r = 0 9 9 9 2 ( 嗡) 。 固相萃取技术是液相色谱中应用很广的一种前处理技术。我们分别考察了 两种填料的c 1 8 ( y w g 和f u i j i ) 和碱性氧化铝固相萃取作为前处理手段的效果， 并且对其进行了优化和改良。结果表明：c 1 8 填料的固相萃取采取活化、上样、 水淋洗、2 0 q j 醇淋洗和8 0 甲醇洗脱的步骤较佳，f u j i 和y w g 回收率分别为 4 4 7 和5 6 5 左右。经过改良后的碱性氧化铝固相萃取采用有机溶剂直接洗脱， 不仅将紫杉醇直接洗脱，同时节省了有机溶剂和处理时间，而且回收率均高于 1 0 0 ，在采用氯仿作为洗脱溶剂，反复洗脱5 次时，回收率为1 1 3 ，采用乙酸 乙酯为洗脱溶剂，反复洗脱3 次的条件下，效果最佳，回收率也达到了1 3 6 。 这可能是由于碱性氧化铝催化紫杉醇类似物生成了新的紫杉醇。经过质谱鉴定， 所收集的紫杉醇具有和紫杉醇标准品一样的离子峰。因此，碱性氧化铝固相萃 取是紫杉醇前处理的有效手段。 分子印迹技术具有良好的特异性、目的性，广泛应用于氨基酸分离和药物 分析等领域。首次研究了紫杉醇的分子印迹整体柱技术。结果表明分子印迹效 果和不锈钢柱管长度以及合成温度密切相关。选用同样的比例，不锈钢柱管的 长度不同，合成温度不同，则效果也会差别很大。同时考虑到成本降低，所以 采用了不锈钢柱管的长度为1 0 c m 较佳。 关键词：紫杉醇；真菌；高效液相色谱；固相萃取：分子印迹 a b s t r a c t a b s t r a c t f u n g it a x o le n j o y s ap r o m i s i n gm a r k e t , b e c a u s ef u n g ic a l lb eg e n e t i c a l l y m o d i f i e da n ds u s t a i n a b l e h o w e v e r , t h e i rf e r m e n t a t i o nb r o t ha r ef u l lo f i m p u r i t i e sa n d h a v eal a r g ev i s c o s i t y , s ot h ep r o d u c t i o nc o s t si n c r e a s e f i r s t l y ， w e o p t i m i z e d t h ec o n d i t i o n so f h j 【g hl i q u i dp e r f o r m a n c e c h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) w h i c hw a su s e dt os e p a r a t et a x o lf r o mo t h e r s t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h e o p t i m i z e dm o b i l ep h a s ew a sm e t h a n o l - w a t e r7 0 ：3 0 ( v v ) ，t h e t e m p e r a t u r e w a s3 5 ，t h e s p e e d w a s1 0 m l m i r t , a n dw i t ha nu v s p e c t r o p h o t o m e t e rm o n i t o r e da tw a v e l e n g t ho f2 2 7 n l nf o rt a x 0 1 l i n e a rc a l i b r a t i o n g r a p h s ) = 2 2 1 7 1 0 7 3 x + 3 5 0 0 9w e r eo b t a i n e df o rt a x o lo v e rt h ec o n c e n t r a t i o nr a n g eo f 10 l 鲈i l l 0 1 m g m l 丽t l la g o o dc o r r e l a t i o n ( r = 0 9 9 9 2 ，n _ 6 ) t h el i m i to fd e t e c t i o n w a s0 1 肛g m l ( t h es i g n a l t o - n o i s er a t i oi s2 ) s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ( s p e ) t e c h n o l o g yi sw i d e l yu s e df o rp r e t r e a t m e n to fh i g h l i q u i dp e r f o r m a n c ec h r o m a t o g r a p h y t w ok i n d so fc 18 ，y w ga n df u j i ，a n db a s i c a 1 2 0 3w e r es t u d i e dw i t hr e c o v e r yr a t ea sp a r a m e t e r w ea l s oo p t i m i z e da n di m p r o v e d t h ec o n d i t i o n sf o re l u t i o n t h ep r o c e s so fc18s p ew a sa c t i v a t i o n 、s a m p l el o a d 、w a t e r e l u t i o n 、m e t h a n o l w a t e r ( v v ) 2 0 ：8 0e l u t i o na n dt a x o le l u t i o n 、析t hm e t h a n o l - w a t e r ( v v ) 8 0 ：2 0 a n dt h er e s u l t sa l s os h o w e dt h a tf u j ih a dab e t t e rd a t at h a ny w g f o r 5 6 5t 04 4 7 w h i l e b a s i ca 1 2 0 3h a dr e c o v e r yr a t eo fm o r et h a n10 0 w h e n c t a o r o f o 衄w a su s e dt oe l u t et a x o lf i v et i m e sf r o mt h eb r o t h ，t h er a t ew a s1 13 ； w h e na c e t i ce s t e rw a su s e do nt h es a m ew a yf o rt h r e et i m e s ，t h ed a t aw a s13 6 t h a t m a y b ec a u s e db yc a t a l y t i ca b i l i t yo fb a s i ca 1 2 0 3 ，w h i c hc a nc a t a l y z ea n a l o g u e so ft a x o l i n t ot a x o l ，f o re x a m p l e7 - e p i t a x o lo rd a b b e s i d e s ，t h eb a s i ca 1 2 0 3w a so n l yo n es t e pe l u t i o n , s oi tc o n s u m e dl e s ss o l u t i o na n d t i m e a n dt h ec o l l e c t i o nw a si d e n t i f i e dt ob et a x o lb ym s o b v i o u s l y , t h el a t t e rw a st h e b e s tm e t h o df o rt a x o lp r e t r e a t m e n t d u r i n gr e c e n td e c a d e s ，m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r s ( m i p s ) a r ew i d e l y c o n s i d e r e dm i m i c so fn a t u r a lm o l e c u l a rr e c e p t o r ss u i t a b l ef o rad i v e r s i t yo f a b s t r a c t a p p l i c a t i o n sr a n g i n gf r o mb i o m i m e t i cs e n s o r s ，t os e p a r a t i o n sa n db i o c a t a l y s t s t a x o l m i p si sf i r m l ys y n t h e s i z e d ，w h i c hu s e dm a aa sf u n c t i o n a lm o n o m e r ，e d m aa s c r o s s l i n k i n ga g e n t s ，a i b na si n i t i a t o r , c h l o r o f o r ma n de i c o s a n o la sp o r ef o r m i n g a g e n t t h er e s u l ta l s os h o w e dt h a tt h em i p se f f i c i e n c yw a sc o n n e c t e d 、衍t l lt h el e n g t h o fs t a i n l e s ss t e e lc o l u m n c o n s i d e r i n gt h eh i g hv a l u eo ft a x o la n dt h ee f f e c t ，10 c mi s b e t t e r k e yw o r d s ：t a x o l ；f u n g i ；h i g hl i q u i dp e r f o r m a n c ec h r o m a t o g r a p h y ； s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ；m o l e c u l a ri m p r i n t e dt e c h n o l o g y i 主要英语缩略语索引 英文缩写 h p l c s p e t l c m s m a a e d m a a i b n m i p d a b 主要英文缩略语索引 英文全称中文全称 h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y高效液相色谱 s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n 固相萃取 t h i n - l a y e rc h r o m a t o g r a p h y 薄层层析 m a s ss p e c t r u m 质谱 a - m e t h y l a c r y l i ca c i d a 甲基丙烯酸 e t h y l e n eg l y c o ld i m e t h a c r y l a t e乙二醇二甲基丙烯酸酯 a z o b i s i s o b u t y r o n i t r i l e 偶氮二异丁腈 m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r分子印迹聚合物 1 0 d e a c e t y l b a c c a t i n 1 0 去乙酰基巴卡亭 南开大学学位论文使用授权书 根据南开大学关于研究生学位论文收藏和利用管理办法，我校的博士、硕士学位获 得者均须向南开大学提交本人的学位论文纸质本及相应电子版。 本人完全了解南开大学有关研究生学位论文收藏和利用的管理规定。南开大学拥有在 著作权法规定范围内的学位论文使用权，即：( 1 ) 学位获得者必须按规定提交学位论文( 包 括纸质印刷本及电子版) ，学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存研究生学位论文， 并编入南开大学博硕士学位论文全文数据库；( 2 ) 为教学和科研目的，学校可以将公开 的学位论文作为资料在图书馆等场所提供校内师生阅读，在校园网上提供论文目录检索、文 摘以及论文全文浏览、下载等免费信息服务；( 3 ) 根据教育部有关规定，南开大学向教育部 指定单位提交公开的学位论文；( 4 ) 学位论文作者授权学校向中国科技信息研究所和中国学 术期刊( 光盘) 电子出版社提交规定范围的学位论文及其电子版并收入相应学位论文数据库， 通过其相关网站对外进行信息服务。同时本人保留在其他媒体发表论文的权利。 非公开学位论文，保密期限内不向外提交和提供服务，解密后提交和服务同公开论文。 论文电子版提交至校图书馆网站：h t t p ：2 0 2 1 1 3 2 0 1 6 1 ：8 0 0 1 i n d e x h u n 。 本人承诺：本人的学位论文是在南开大学学习期间创作完成的作品，并已通过论文答辩； 提交的学位论文电子版与纸质本论文的内容一致，如因不同造成不良后果由本人自负。 本人同意遵守上述规定。本授权书签署一式两份，由研究生院和图书馆留存。 作者暨授权人签字： 2 0 年月日 南开大学研究生学位论文作者信息 论文题目 姓 名 学号答辩日期年月日 论文类别博士口学历硕士口硕士专业学位口高校教师口同等学力硕士口 院系所专业 联系电话e m a i l 通信地址( m g 编) ： 各注：是否批准为非公开论文 注：本授权书适用我校授予的所有博士、硕士的学位论文。由作者填写( 一式两份) 签字后交校图书 馆，非公开学位论文须附南开大学研究生申请非公开学位论文审批表。 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 学位论文作者签名： 年月日 第一章绪论 第一章绪论 第一节紫杉醇简介 1 9 5 8 年，美国国家癌症协会发起一项历时2 0 余年的筛选3 50 0 0 多种植物 提取物的计划，以寻找安全有效的抗肿瘤新药。在这项计划实施的过程中，美 国化学家w a n i 和w i l l 于1 9 7 1 年从美国西海岸的短叶红豆杉( t a x u sb r e v i f o l i a ) 树皮 中提取出一种抗肿瘤物质并命名为紫杉醇，并于同年w a n i 等确定了其化学结构 i l l 。此后各国药理学家、药物化学家对紫杉醇进行了大量研究，h o r o w i t z 等报告 了紫杉醇的作用机理【2 】；在1 9 8 3 年到1 9 8 9 年的临床研究过程中发现，紫杉醇对 卵巢癌和肺癌的治疗效果最好。二期临床中，紫杉醇对卵巢癌的最高有效率可 达4 8 ，部分缓解率最高为3 1 ，完全缓解率最高为1 3 7 ；紫杉醇对肺癌的 有效率为3 7 0 t 3 1 。1 9 9 2 年1 2 月，紫杉醇被美国药品与食品管理局( f d a ) 批 准用于治疗晚期卵巢癌，此后，美国食品药物监管局( f d a ) 又相继批准紫杉 醇用于治疗转移性乳腺癌( 1 9 9 4 年) 、与艾滋病关联的k p a o s i s 恶性肿瘤( 1 9 9 7 年) ， 并与顺铂联合使用，作为治疗晚期卵巢癌( 1 9 9 8 年) 和t n , 细胞肺癌( 1 9 9 9 年) 的一线用药。紫杉醇展现出广阔的应用和发展前景。 此后，临床上陆续发现紫杉醇的一些新作用，其中包括与抗艾滋病药物合 用可治疗卡波济氏肉瘤( 一种艾滋病人特有的恶性肿瘤) ，还对结肠癌、直肠癌、 膀胱癌和转移性乳腺癌等一系列的棘手肿瘤，对肺癌、头部和颈部肿瘤、恶性 黑色素癌和肉瘤等，均展现出一定疗划4 1 。此外，临床上还观察到它对其他疾病 的治疗也有一定的应用潜力。例如，它具有抗类风湿性关节炎、抗疟的作用， 对中风、早老性痴呆和先天性多囊肾病也有一定的疗效【4 1 。美国癌症研究所称其 为过去1 5 年中开发的最好的抗癌药物。紫杉醇与阿霉素和顺铂类抗癌药物并列 为2 0 世纪9 0 年代抗肿瘤药的三大成就。 2 第一章绪论 1 1 1 紫杉醇的结构和理化性质 紫杉醇( p a c l i t a x e l ，商品名t a x 0 1 ) 是一种二萜类化合物，也是第一种被发现 的显示抗癌和抗白血病的具有紫杉烷环结构的化合物。其分子式为c 4 7 h 5 l n o l 4 ， 分子量为8 5 3 9 2 ，难溶于水及许多药用溶媒，在水中的溶解度仅为0 0 0 6 m g m l ， 在p h 2 - - - 5 范围内紫杉醇比较稳定，碱性条件下很快分解，在甲醇钠溶液中发生 剧烈反应，酸性条件下比较稳定。此外，定条件下，紫杉醇可被m n 0 2 、j o n e s 试剂氧化，但极难还原，其化学性质相对稳定。其结构式如下图： 图1 1 紫杉醇结构式 o 1 1 2 紫杉醇的作用机理 紫杉醇具有独特的抗癌作用机制，能诱导与促进微管蛋白聚合、微管装配 与微管稳定，从而阻止肿瘤细胞的生长【5 1 。微管是真核细胞的一种组成成分，它 是由两条类似的多肽( a 着n 1 3 ) 为单位构成的微管蛋白二聚体形成的。正常情况 下，微管与微管蛋白二聚体之间存在动态平衡。紫杉醇可以使两者之间失去动 态平衡，导致细胞在有丝分裂时不能形成纺锥体和纺锥丝，抑制了细胞的分裂 和增殖。体外研究表明，紫杉醇浓度依赖性地、可逆性地结合到微管上，特别 是结合n n 端微管蛋白的口亚蛋白上。这作用降低了聚合所需的微管蛋白浓 度，使动态平衡向着微管装备的方向移动，增加聚合的速度与产量，破坏了正 3 第章绪论 常的平衡状态。另外，紫杉醇诱导形成的微管较短9 j 。同时可咀抑制有丝分裂 所必需的徽管网的正常状态再生，会阻止正常的有丝分裂纺锥体的形成，导致 染色体断裂并抑制细胞复制与转移。紫杉醇改变了细胞有丝分裂过程使有丝 分裂持续时间从05 h 增加到1 5 h ，并抑制细胞质分裂。这导致形成多核细胞， 这些多核细胞继续回复到g l 期，然后试图再次进行有丝分裂，但在有丝分裂巾 没有阻止细胞( a r r e s t i n gc e l l s ) 。在许多细胞中还观察到微棱。抑制纺锥体的形成 似乎与这种不正常的有丝分裂有关i 7 , g , q 。 0 脚 图1 2 紫杉醇结合于睁微符蛋白( 1 3 - t u b u l i n ) 的疏水区。紫杉醇3 位与阻t u b u l i n n 末端 的1 - 3 l 氨基酸残基结台，2 位与 t u b u l i n2 1 7 - 2 3 3 氧基酸结合，7 位与1 3 - t u b u l i n a r 9 2 8 2 结 合。 1 1 3 紫杉醇的供需矛盾 紫杉醇对多种癌症疗效确切，药理作用独特，在业界有“抗肿瘤之王”的美誉， 甘前尚无可替代产品。全世界约有2 0 0 0 万癌症患者，有近2 0 0 万人需要使用紫 杉醇。美国每年有6 万病人需要使用紫杉醇进行治疗。中国每年约有1 7 0 万人 成为癌症新患者，而我国乳腺癌和卵巢癌的发病率高于美国，人口基数也是美 国的6 倍，估计我国每年至少有3 0 万乳腺癌和卵巢癌的患者需要紫杉醇类药物 进行治疗。 在紫杉醇需求快速增长的同时，紫杉醇的药源解决途径成为关注的焦点。 因为紫杉醇仅见于裸予植物红豆杉科的红豆杉属和澳洲红豆杉属植株体内。世 界约有11 种紫杉属植物，主要分布在北半球温带和亚热带。除浆果紫杉、加拿 第一章绪论 大紫杉和杂交品种曼地亚紫杉外，其余紫杉属植物均生长缓慢，需百年以上才 能成树。用树皮作原料生产紫杉醇意味着整棵树的死亡，资源不可再生。由于 人们的过度采伐，本已十分有限的红豆杉资源储量日益减少。因此，资源不可 再生性和紧缺性是紫杉醇生产的主要矛盾。 紫杉醇含量极低，只有树木干重的0 0 0 0 1 0 0 0 8 ，加之紫杉醇溶解性差， 平均产量只有0 0 1 5 1 1 0 j ，生产l k g 紫杉醇，一般需要7 0 0 0 k g ( 相当2 0 0 0 - , 2 5 0 0 棵红豆杉树木) 的原料【l 叭。有人估计，治疗一个卵巢癌患者需要6 棵树龄6 0 1 0 0 年的红豆杉树【1 1 1 。随着药品使用范围的扩大，所需红豆杉的数量将十分可观， 这也给红豆杉资源带来严重威胁，可能造成生态环境严重的破坏。如果不改变 现有的资源供给和生产水平，即便将全部的天然资源采伐，也只能满足短期的 需要。因此，在紫杉醇作为投资新药发展的后期，其使用已不受安全和疗效的 制约，而是被药源资源的供应所限制。 第二节紫杉醇的生产途径 为了解决紫杉醇的供需之间的矛盾，国内外学者进行了大量的研究工作， 努力摆脱天然植物的来源限制，取得了令人瞩目的成就。现将其归纳如下： 1 2 1 人工栽培 人工栽培是目前解决紫杉醇来源的较好途径之一。采用种子繁殖及扦插等 无性繁殖手段，大量培育红豆杉幼苗，开辟人工种植园，用此方法获得的灌木 型红豆杉生长快，产量高【1 2 】。近年来，美国等大力发展t a x u sm e d i ah i h c s i i 的人 工栽培，使资源短缺的现状得到明显缓解。美国施贵宝公司和我国云南农科院 高山经济植物所等己开始大量种植。 1 2 2 化学全合成 化学全合成紫杉醇，已于1 9 9 4 年在实验室获得了成功 1 3 , 1 4 1 。但是由于紫杉 醇手性基团过多，合成路线复杂，成本高、产率低，至今无法应用于工业生产。 1 2 3 化学半合成 化学半合成是以从红豆杉属植物的枝叶中提取的巴卡亭i i i ( b a c c a t i r d ) 或 5 第一章绪论 1 0 去乙酰基巴卡亭i i i ( 1 0 d e a c e t y l b a c c a t i n ，1 0 d a b ) 为前体，进行紫杉醇合成【l 5 1 。 其过程较全合成简单，成本较低。因为1 0 d a b 和巴卡亭在红豆杉属植物中的 含量较紫杉醇丰富，分离提取也较紫杉醇容易，而且树叶是可再生资源。从长 远看，化学半合成是解决紫杉醇资源问题比较有效的办法之一，也是目前紫杉 醇生产公司普遍采用的手段 1 6 , 1 7 】。 1 2 4 植物细胞组织培养 c h r i s t e n 首次利用植物细胞悬浮培养技术生产紫杉醇后【l 引，研究吸引了众多 的实验室跟进。这方面的研究也取得了一定的进展。e s ca g e n e t i c s 公司在1 9 9 2 年美国癌症协会主持的第二次紫杉醇研讨会上宣布他们用细胞培养法所得产物 紫杉醇含量为树皮的2 5 倍。中国的甘烦远等发现云南红豆杉细胞在发酵罐 中生长速率达到1 2g l ，紫杉醇含量为0 1 1 9 ，约为成年树皮中含量的1 2 倍， 为栽培植株的4 0 倍【l9 1 。但是这项技术同样存在一些问题，如培养细胞的褐化、 生长周期长等【2 0 2 1 1 。虽有该技术进入生物反应器放大阶段的试验，但未见实际应 用的报道，短期内成功应用的可能性较小。 1 2 6 真菌发酵法 1 9 9 3 年，美国m o n t a n a j + 大学植物病理系的s t i e r l e 博士等【2 2 】从短叶红豆杉( z b r e v i f o l i a ) 的韧皮部中分离得到一种能产生紫杉醇的内生真菌安德鲁紫杉菌 ( t a x o m y c e sa n d r e a n a e ) 。s t i e r l e 掣2 3 】采用质谱( m s ) 、免疫化学、色谱( t l c 、 玎p l c ) 和放射性同位素标记等方法，证明了安德鲁紫杉菌的三周培养物中存在 紫杉醇及其类似物，而且证实这些紫杉醇的结构与性质和红豆杉树木中的完全 一样。能产生紫杉醇的红豆杉内生真菌的发现，是紫杉醇资源研究的重要进展。 安德鲁紫杉菌的发现为紫杉醇的生产开拓了一条崭新的道路。 无论是从生态还是经济条件的角度来看，利用植物内生真菌作为药源是一 项不会枯竭的资源，微生物发酵的方法具有以下优点：( 1 ) 微生物作为工业生产 的源泉，可以在发酵罐中进行，可以源源不尽的进行生产；( 2 ) 微生物发酵的方 法容易扩大化，利于工业化生产；( 3 ) 微生物的生长仅仅需要一般的培养技术， 在收集紫杉醇之前，可以通过改善培养环境、改进技术来提高产量；( 4 ) 微生物 易于通过基因工程等方法筛选高产菌株，提高紫杉醇的产量；( 5 ) 内生真菌生长 迅速，易于培养，应用的培养基相对比较便宜；( 6 ) 可望满足市场的需求，降低 6 紫杉醇的价格。 植物内生真菌是一类应用前景广阔的资源微生物，用微生物发酵的方法生 产紫杉醇，是解决药源问题的有效途径。目前为止，据不完全统计，全球已经 发现了3 0 多株具有紫杉醇生产能力的真菌。见下表： t a x o m y c e s aa n d r e a n a e 。 m o n o c h a e t i as p t b p 一2 f u s a r i u ml a t e r i t i u mt b p - 2 a l t e r n a r i as p j a - 6 9 p e s t a l o t i o p s i sm i c r o s p o r aj a - 7 3 p e s t n t o t i o 品i sm i c r o s p o r nn e 3 2 2 1 p i t h o m y c e ss p p - 9 6 p e s t a l o t i ab i c i l i at b x - 2 p e s t a l o t i o p s i sm i c r o s p o r a 脑细黑：糍牙删伽 c 4 口5 2 6 】 p e s t a l o t i o p s i sm i c r o s p o r a c x - 2 t b r e v i f o l i a zb a c c a t a zb a c c a t a t c u s p i d a t a t c u s p i d a t a z w a l l a c h i a n a z s u m a t r a n a zb a c c a t a zw a l l o c h i o n a z a x o d i u m d i s t i c h u m 0 0 2 4 0 0 5 0 o 1 0 2 0 1 3 0 o 1 5 7 0 2 6 8 0 5 0 0 0 0 9 5 1 0 8 l 6 0 7 0 1 4 8 7 0 4 9 8 7 第一章绪论 第三节紫杉醇分离纯化的难点 紫杉醇作为一种天然产物，它的分离纯化面临着许多困难，具体表现在以 下几个方面： 1 3 1 紫杉醇在原料中含量极少 无论是植物体还是在细胞培养物中，紫杉醇的含量都非常低，如红豆杉树 皮中紫杉醇平均含量仅为0 0 1 5 。而植物或真菌培养液中紫杉醇的含量也普遍 较低。如何在大量的原材料中高回收率地提取出极少量的目的物，是非常困难 的事情。 1 3 2 紫杉醇结构类似物特别多 紫杉醇类似物( a n a l o g u e s ) 是在自然界中存在的或在细胞培养或微生物发酵 过程中产生的结构、性质比较相近的紫杉烷类化合物。目前在植物中发现的紫 杉烷类物质多达1 0 0 多种，主要结构类似物则有十多种。常见的有巴卡亭、 1 0 去乙酰巴卡亭、1 0 去乙酰紫杉醇、7 表1 0 去乙酰紫杉醇、三尖杉宁碱、 7 表紫杉醇等，由于性质结构与紫杉醇相近，使得与它们的分离非常困难，这也 成为许多工作者研究的重点。 表1 2 紫杉醇结构类似物 1 3 3 紫杉醇在分离过程中易转化 紫杉醇作为一种生物大分子物质，受温度、有机溶剂、酸、碱等环境条件 的影响，易降解或异构生成其它紫杉烷类物质。如紫杉醇在强酸性或弱碱性环 8 第一章绪论 境条件下会降解为巴卡亭i 或发生表位异构生成7 表紫杉醇；温度较高时也会 发生降解反应，生成相应的小分子物质。 1 3 4 实际应用对紫杉醇纯度要求高 紫杉醇作为一种抗癌药品，临床应用对其纯度的要求非常高，一般要大于 9 9 0 ，这就对紫杉醇的纯化精制工艺提出了严格的要求。 基于上述因素，加之众所周知的紫杉醇资源问题，使得改进或开发新工艺， 寻求更为方便廉价的分离技术，越来越成为研究者们关注的热点【3 5 , 3 6 , 3 7 】。 第四节紫杉醇粗提工艺概述 紫杉醇的分离纯化工作开展较早。最早的分离工艺是1 9 6 6 年采用4 0 0 根试 管的逆流分配色谱法，从1 2 埏太平洋红豆杉树皮中提取了o 5 克紫杉醇，共历 时两年，这种工艺十分繁琐，收率极低【l j 。随着分离手段的不断进展，分离工艺 也获得了很大的改进，收率大为提高，分离时间大大缩短。目前为止，主要采 用的分离提取手段有以下几种： 1 4 1 溶剂萃取 目前采用的前处理方式仍然液液萃取为主。现在从植物或细胞培养物中提 取紫杉醇的程序通常如下：先用甲醇、乙醇或二氯甲烷、甲醇反复浸提数次， 溶剂回收；然后所得浸膏用二氯甲烷：水或三氯甲烷：水进行分配萃取，弃去 水相，上层有机相进行减压蒸馏或烘箱干燥；最后残留物用一定量的甲醇或乙 腈冲洗，进行薄层分析( t l c ) 或进一步h p l c 分析检测。余广鳌【3 8 】等寻找了 浸取紫杉醇的最佳溶剂，对不同溶剂浸取红豆杉细胞中的紫杉醇进行了研究， 结果发现在乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇、乙醚、二氯甲烷、氯仿等7 种溶剂 中，单一溶剂的浸取效果以甲醇最好，而乙醚、氯仿、二氯甲烷浸取效果较差。 锅田惠助【3 9 】对提取溶剂也作了系统研究，结果表明，在乙酸乙酯、甲醇、乙酸 乙酯甲醇、乙酸乙酯二氯甲烷和乙酸乙酯丙酮等溶剂中，以乙酸乙酯：丙酮( 1 ：1 ) 的提取效果最好，一次便可以使紫杉醇的提取量高于以往常用溶剂所能得到的 量。周东坡实验室对真菌发酵液紫杉醇的萃取工艺进行了研究，结果表明，按 菌丝重量和加入甲醇体积1 ：1 0 的比例( g ：m e ) 进行甲醇搅拌提取，过滤后得甲 醇提取清液，再将甲醇提取清液与发酵液滤去菌丝后得清液合并，合并液中加 9 第一章绪论 入l 倍体积二氯甲烷，每次萃取4 h ，萃取3 次，紫杉醇萃取效率最高【4 0 1 。 1 4 2 沉淀法 沉淀法( p r e c i p i t a t i o n ) 是利用某种沉淀剂使需提取的药物或杂质在溶液中的 溶解度降低而形成无定形固体的过程。沉淀法的优点是设备简单、成本低、沉 淀剂原材料易得，在产物浓度越高的溶液中，沉淀越有利，收率越高。沉淀虽 然一般只能达到初步纯化的目的，但是技术较为成熟，在大规模生产中仍然被 广泛应用。p a n d e y f 4 1 1 等将紫杉醇粗提物用甲醇、丙酮等极性溶剂溶解，通过添 加己烷、石油醚或者轻汽油等非极性溶剂将紫杉醇沉淀析出，非极性杂质则残 留于母液中。b u i k h a c l 4 2 1 等用甲醇溶解紫杉醇浸膏后，向溶液中加入碱性水溶 液或酸性水溶液，将紫杉醇等目标产物沉淀析出，酸性或碱性杂质则残留于母 液中被废除。但是过程中生成的沉淀非常细微，也难以完全回收，导致紫杉醇 的较大损失。 1 4 3 超临界萃取 提取紫杉醇常常需用大量的有机溶剂，回收利用困难，带来一定的环境污 染。因此，为了减少污染，超临界流体萃取( s u p e r c r i t i c a lf l u i de x t r a c t i o n , s f e ) 法 技术被应用于该领域的研究中。超临界流体萃取技术作为一种分离不易挥发物 质的技术，优点是节能，可使用生理惰性溶剂在低温下分离组分而不破坏化学 结构。超临界流体最常用的萃取剂是c 0 2 。c h u n 掣4 3 1 利用超临界萃取法从东北 红豆杉叶中提取紫杉醇和三尖杉宁碱，比传统的溶剂提取法具有较高的提取效 率。 j e e m n g s 】等进行了超临界流体萃取法的研究，结果发现，短叶红豆杉( t a x u s b r e v i f o l i a ) 树皮中的紫杉醇大部分都能得到有效的提取，回收率达8 5 以上，对 紫杉醇的选择性也比传统的单纯乙醇溶剂好得多。 此外，v a n d a n a t 4 5 】等利用超临界的n 2 0 以及与乙醇的混合物，从红豆杉树皮 中提取紫杉醇。 由于超临界流体萃取技术对仪器设备的要求较高，因此限制了其应用，但 国内外学者正在积极开发，且已经证实c 0 2 超临界萃取是一种很有前途的分离萃 取方法。 1 0 第一章绪论 1 4 4 固相萃取法 固相萃取( s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ，s p e ) 是近2 0 年才发展起来的技术m 】。固相 萃取技术是基于液相和固相对化学的选择性的不同而将目的化学物提取出来的 技术，具有可重复性强、节省溶剂等优点，已经广泛应用于样品的前处理、微 量毒物分析、生物样本分析和药物研究等方面。 目前已有部分学者 4 7 , 4 8 1 将固相萃取技术用于紫衫烷类物质的分离纯化。通常 做法是将含有紫衫烷类物质的原料加入固相萃取装置，然后进行梯度洗脱。紫 杉醇易溶于有机溶剂，当经过以非极性物质做填料的固相小柱时，可以被吸附， 而色素等杂质是易溶于水的，经过的时候不会被保留，或者被水洗掉。另一方 面，发酵液中还有其他物质会被保留，但是可以根据极性的差异，来采取梯度 洗脱的方法来分离。 由于植物材料中紫杉醇的含量很低，且成分复杂，给提取工作造成了很大 的困难，用s p e 方法可以快速除去浸膏中的脂、蜡及色素等杂质，获取初步纯化 的紫杉醇。张志强等【4 9 】比较浸膏经s 印p a k c l 8 硅胶、苯基以及氧化铝固相萃取， 结果发现浸膏经氧化铝固相萃取后，不仅供试品中大量的亲水性物质、脂类物 质被去除，更重要的是最难与紫杉醇分离的7 表紫杉醇的峰也随之去除，而且 效果明显优于c 1 8 和苯基的填料。庞欣【5 0 1 等利用苯基预柱结合高效液相法，成 功解决了真菌发酵产物杂质多、产量低的问题，纯化了某真菌紫杉醇。 s p e 目前已被证明是一种省时间、省溶剂、萃取效率高以及选择性好的新型 萃取方法，因而倍受青睐。分析生物样品中紫杉醇的含量，s p e 己成为进行预处 理时必不可少的一步。 1 4 5 其他方法 微波辅助萃取法：g h a s s e m p o u r 6 0 1 等采用甲醇和水作为溶剂，采用超声波作 为辅助来萃取细胞培养物中的紫杉醇。结果表明：萃取温度和溶剂对萃取结果 有着较大的影响，而萃取时间的影响不是很大。 胶团萃取法：p h o n g p a i c h i t l 6 i 】等利用粗提物中的紫杉醇能够聚集到胶团的亲 水层中，而脂类和一些非极性的杂质被吸附到有机溶剂中的性质来实现紫杉醇 的纯化。实验结果显示：当采用c e t y l p y r i d i n i u m c h l o r i d e ( c p c ) 的浓度为7 5 1 1 第章绪论 ( w v ) ，有机溶剂采用甲醇己烷= 1 5 1 ( v v ) 萃取温度和萃取时间分别为2 5 。c 、 3 0 m i n 的时候，萃取效果最好。 第五节紫杉醇的纯化方法概述 不论是从天然的红豆杉属植物，还是从人工培养的植物组织细胞，还是真 菌发酵液中提取紫杉醇，都涉及到杂质和紫杉醇结构类似物的去除。因此，研 究紫杉醇的纯化方法，无论是基础研究还是工艺研究，都是很有意义的。 1 5 1 色谱法 紫杉醇纯化最早用到的技术就是色谱法。制备色谱法是迄今为止人类掌握 的对复杂混合物分离效果最高的一种方法【6 2 1 。这种以物理化学为基础的分离纯 化技术由于具备效能高、选择性好、速度快等优点，在5 0 年代后期得到了迅速 发展，并且在生化领域广泛采用。在用液相色谱纯化紫杉醇时，操作大都在室 温下进行，所用填料经过了多种相应的化学修饰和覆盖，流动相的性质也较温 和，有利于保持紫杉醇原有的构象和生理活性。 早期使用的方法还有高效液相色谱法。紫杉醇的h p l c 分析始于8 0 年代末， 随后得到广泛应用( 见下表) 。 表1 3 紫杉醇主要的检测手段 样品固定相流动相 树皮、针叶多孔石墨碳柱二氧环己烷水( 4 6 ：5 4 ) 1 6 3 1 血液、尿液 c 8 乙腈甲醇水( 4 ：l ：5 ) 岬1 细胞培养物 c 1 8 乙腈水( 5 2 5 ：4 7 5 ) 1 6 5 1 血浆、细胞培养物 c 1 8 甲醇水( 1 3 ：7 ) l 的j 注射针剂 c 1 8 甲醇水( 4 9 ：5 1 ) 1 6 7 1 愈伤组织 c 1 8 乙腈甲醇水( 1 ：4 ：5 ) 1 6 8 1 注射针剂pfp乙腈水( 梯度) 6 9 1 树皮、针叶 c n 乙腈甲醇0 1 m 醋酸铵 树皮、针叶 愈伤组织 细胞培养物 真菌发酵液 m e t a c h e mt a x s i l p h e n o m e n e x 伽( s i l z o r b a xs wt a x s i l c 1 8 ( 2 6 5 ：2 6 5 ：4 7 ) 1 7 0 】 乙腈水甲醇( 梯度) 1 7 1 l 乙腈水( 5 2 5 ：4 7 5 ) 【7 2 l 庚烷甲醇( 1 ：1 ) 1 7 3 1 甲醇水( 7 0 ：3 0 ) 1 7 4 1 1 2 第一章绪论 同时高效液相色谱法也是检测紫杉醇常用的方法。 紫杉醇纯化方法还有胶束电动毛细管色谱法、树脂吸附法和高效逆流色谱 法等。 1 5 2 化学反应法 化学反应法( c h e m i c a lr e a c t i o nm e t h o d ) 是先把不易与紫杉醇分离的物质通 过化学反应转化成为容易与紫杉醇分离的物质，然后再经过适当途径加以分离。 k i n g s t o n 等【5 1 l 用o s 0 4 处理紫杉醇与c e p h a l o m a 彻曲e 的混合物。o s 0 4 能选择性的氧 化c e p h a l o m a n n i n ec 1 3 侧链末端的双键，使之形成二元醇，而紫杉醇却不受影 响。这种方法有较好的效果，可使紫杉醇的纯度达到9 5 ，但因毒性太大而不 能用于实践。m u r r a y 等【5 2 j 利用含1 1 0 0 3 的空气氧化c e p h a l o m a n n i n e 、t a x u s i n 、 b r e v i f o l i a 中的某些烯键，而对紫杉醇、c e p h a l o m a n n i n e 、t a x u s i n 、b r e v i f o l i a 中的 中的另一种烯键却不起反应，通过硅胶柱层析就可以有效的纯化其中的紫杉醇。 除了用氧化方法外，薛迎春又发现用溴加成的方法【5 3 】来分离，与其他方法相比， 溴加成具有安全、成本低、炒作简单易行等优点。从这些结果不难看出，化学 反应法免去了过色谱柱层析等繁琐手段，分离纯化紫杉醇的效果很好，有望成 为紫杉醇大规模分离纯化的一种理想方法。 1 5 3 药物靶点法 药理作用靶点法( p h a r m a c o l o g i c a la c t i v et a r g e tp o 缸m e t h o d ) ，是肖剑于1 9 9 9 年【5 4 】首次提出的一种全新的紫杉醇分离纯化方法。药物的作用靶点是指药物在 生物体内发生作用时进攻或结合的组织。紫杉醇的药理作用结果表明，紫杉醇 的药理作用靶点是体内的微管，微管是微管蛋白的聚合态。微管蛋白的最主要 特征是高温下聚合成微管，低温下解聚成微管蛋白。与紫杉醇最难分离的三尖 杉宁碱( c e p h a l o m a r m i n e ) 不具有这种特性。通过初步研究，在一定的条件下， 紫杉醇与三尖杉宁碱( c e p h a l o m a n n i n e ) 的混合物经药理作用靶点法纯化后，紫杉 醇的纯度可达9 5 以上。 作为一种紫杉醇纯化新技术，药理作用靶点法具有以下几个特点：( 1 ) 依据 天然抗癌物质与其药理作用靶点的可逆特异性结合作用来进行分离纯化，较常 规的萃取、柱层析及各种组合色谱等方法具有简便、高效特异性的特点；( 2 ) 紫 杉醇与其药理作用靶点微管，在天然抗癌物质及药理作用靶点两方面都具有代 1 3 第一章绪论 表性，其研究成果易于推广到其他抗癌物质及其药理作用靶点的物质，具有普 遍应用价值。 1 5 4 薄层层析法 薄层层析法( t h i n 1