（生物化学与分子生物学专业论文）纤维床固定化酪丁酸梭菌产丁酸的研究.pdf

浙江理工大学学位论文版权使用授权书 刚i f f f 洲j f j j j 川f j j i y 17 4 7 3 0 1 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。 本人授权浙江理工大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密口，在 不保密口 。 学位论文作者签名：脚 日期：w 协年弓月z j 日 年解密后使用本版权书。 指导教师签名： 日期：w 加年弓月叫日 本研究由 国家8 6 3 计划 ( n o 2 0 0 7 a a 0 217 0 3 ，n o 2 0 0 7 a a l0 0 5 0 4 ) 和浙江省自然科学基金 ( n o y 3 0 8 0 1 8 3 ) 提供资助 at h e s i ss u b m i t t e dt oz h e j i a n gs c i - - t e c h u n i v e r s i t yf o rd e g r e eo fm a s t e r o fs c i e n c e t i t l e ：p r o d u c t i o no fb u t v r i ca c i dw i t hc l o s t r i d i u m c a n d i d a t e sn a m e ：x i 盆壁g 至i i 望盆坠 s u p e r v i s o r ： m a j o r ： c o l l e g e ： s u b m i s s i o nd a t e ： 坠：2 q q 2 研究生学号鱼2 2q 2 q ! q 垒垒 浙江理工大学硕士学位论文 摘要 丁酸是一种在化工、食品、医药等行业中具有广泛用途的化学物质，本论文 以酪丁酸梭菌为丁酸生产菌种，开展了纤维床固定化发酵葡萄糖和糖蜜产丁酸的 研究。首先为确保实验室现有菌种为酪丁酸梭菌，对其进行了菌种鉴定。通过菌 种形态观察、革兰氏染色，以及1 6 s r r n a 序列分析，结果可以肯定实验室保存 菌种为酪丁酸梭菌，并进行了进化树的构建。接着进行了酪丁酸梭菌利用葡萄糖 和糖蜜产丁酸的发酵工艺研究。在游离分批发酵中考察了葡萄糖浓度、氮源浓度 和种类对丁酸生产的影响，结果显示最佳葡萄糖浓度为6 0 l ，最佳氮源浓度为 l o l ，玉米浆为工业化生产的合适氮源。在葡萄糖为底物的丁酸发酵中进行了 游离细胞发酵、固定化细胞发酵、分批发酵、流加发酵等发酵模式的比较。在葡 萄糖为底物的纤维床固定化流加发酵中丁酸达到了2 4 8 8g l 的高浓度，丁酸比 葡萄糖的得率为0 4 6e g ，比游离流加发酵提高了5 8 6 ( 0 4 6e g 和0 2 9 9 g ) ， 结果表明固定化流加发酵是丁酸发酵的高效模式。本论文最后就主要以固定化流 加模式考察了酪丁酸梭菌利用糖蜜发酵产丁酸的情况。对糖蜜中的三种主要单糖 进行分批发酵，结果表明酪丁酸梭菌能有效利用糖蜜中的各种单糖，以模拟混合 糖为碳源进行固定化流加发酵时丁酸的终浓度达到了3 2 5 0g l ，丁酸对糖蜜的 得率为0 3 9 g 。进一步利用真实糖蜜进行固定化流加发酵，丁酸的最高浓度达 到了4 0 1 le e l ，丁酸的得率也高达0 4 2 g ，比利用模拟糖发酵的结果有很大的 提高。同时以硫酸预处理过的糖蜜进行发酵能显著提高丁酸浓度，硫酸预处理糖 蜜分批发酵产丁酸的浓度达到3 4 6 l ，而未处理糖蜜的只有2 6 1z d l 。 关键词丁酸酪丁酸梭菌纤维床反应器固定化16 s r r n a 糖蜜 浙江理一f 大学硕+ 学位论文 a b s t r a t e b u t y r i ca c i di sa l li m p o r t a n tc h e m i c a lw h i c hh a sm a n ya p p l i c a t i o n si nc h e m i c a l ， f o o da n dp h a r m a c e u t i c a li n d u s t r i e s i nt h ep r e s e n ts t u d y , c l o s t r i d i u mt y r o b u t y r i c u m w a se m p l o y e df o rt h ep r o d u c t i o no fb u t y r a t e b yi m m o b i l i z e di n af i b r o u sb e d b i o r e a c t o ru s i n gg l u c o s ea n dc a n em o l a s s e s a tf i r s t , t h ei d e n t i f i c a t i o no ft h es t r a i n s t o r e db yt h el a b o r a t o r yo fz h e j i a n gu n i v e r s i t yw a sc a r r i e do u ti no r d e rt oe n s u r ei ta s c l o s t r i d i u mt y r o b u t y r i c u m t h r o u g ht h em o r p h o l o g yo b s e r v a t i o no ft h es t r a i n 、g r a m s t a i n i n g ，a n dt h e16 s r r n as e q u e n c e si d e n t i f i c a t i o n ，t h es t r a i nc a l lb ei d e n t i f i e da s c l o s t r i d i u mt y r o b u t y r i c u ma n dt h ep h y l o g e n e t i ct r e ew a sb u i l t t h e nt h ef e r m e n t a t i o n p r o c e s so fc l o s t r i d i u mt y r o b u t y r i c u mf o rt h ep r o d u c t i o no fb u t y r a t ef r o mg l u c o s ea n d c a n em o l a s s e sw a sc a l c u t a t e d b a t c hf e r m e n t a t i o n sw i t hf r e ec e l l sw e r ec o n d u c t e dt o i n v e s t i g a t et h e i n f l u e n c eo fg l u c o s ec o n c e n t r a t i o n 、n i t r o g e nc o n c e n t r a t i o na n d n i t r o g e ns o u r c e so nt h eb u t y r a t ep r o d u c t i o n ，a n dt h er e s “l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m a l c o n c e n t r a t i o no fg l u c o s ea n dn i t r o g e nw a s6 0 e g la n d10 e l l ，t h es u i t a b l en i t r o g e n s o u r c ef o ri n d u s t r yu t i l i z a t i o nw a st o ms t e e pl i q u o r t h e nt h ep e r f o r m a n c eo fb u t y r a t e p r o d u c t i o nf r o mg l u c o s ew a se v a l u a t e dw i t l lf l e ec e l l sa n di m m o b i l i z e dc e l l si nb a t c h a n df e d - b a t c hm o d e t h eh i g hb u t y r a t ec o n c e n t r a t i o no f2 4 8 8g lw a sg o ti nt h ef e d b a t c hf e r m e n t a t i o n 、析t 1 1i m m o b i l i z e dc e l l si nt h ef i b r o u s - b e dr e a c t o r ，a n dt h ey i e l do f b u t y r a t ef r o mg l u c o s ew a si m p r o v e db y5 8 6 ( 0 4 6e g gv so 2 9 e g g ) c o m p a r e dw i t l l t h er e s g l t sw i t hf r e ec e l l si nt h ef e db a t c hm o d e t h er e s g l t ss h o w e dt h a tt h ef e d b a t c h 、啊mc l o s t r i d i u mt y r o b u t y r i c u mi m m o b i l i z a t i o ni nt h ef i b r o u sb e dr e a c t o rw a sa s u i t a b l ef e r m e n t a t i o np r o c e s sf o rb u t y r a t ep r o d u c t i o nw i t hh i g hp e r f o r m a n c e a tl a s t t h ep r o d u c t i o no fb u t y r i ca c i df r o mc a n em o l a s s e sw a si n v e s t i g a t e dw i t hi m m o b i l i z e d c e l l so fc l o s t r i d i u mt y r o b u t y r i c u mi naf i b r o u s b e db i o r e a c t o ri nf e db a t c hm o d e t h e r e s l x l t so fb a t c hf e r m e n t a t i o ns h o w e dt h a tt h et h r e em a i ns u g a r se x i s t i n gi nt h ec a n e m o l a s s e sc o g l db eu t i l i z e de f f i c i e n t l yb yc l o s t r i d i u mt y r o b u t y r i c u m b yu s i n go n e m o d e lm e d i u mc o n t a i n i n gd i f f e r e n t s u g a r s w i t hs i m i l a r c o m p o s i t i o n s ，ah ig h c o n c e n t r a t i o no fb u t y r a t e ( 3 2 5 0e g l ) a n dp r o d u c ty i e l d ( 0 3 9e g g ) w e r ea c h i e v e di n i i 浙江理工入学硕+ 学位论文 t h ef i b r o u s - b e db i o r e a c t o rs y s t e m f o u r t h m o r e ，ah i g h e rc o n c e n t r a t i o n ( 4 0 11g l ) a n d y i e l d ( 0 4 2g g ) o fb u t y r a t ec o l x l db ea t t a i n e db yu s i n gw a s t ec a n em o l a s s e si nt h e s a m ef b bs y s t e m a l s o ，f e r m e n t a t i o no fc a n em o l a s s e sp r e t r e a t e dw i t hs i t l f u r i ca c i d w a sp e r f o r m e dt of u r t h e ri n c r e a s et h ec o n c e n t r a t i o no fb u t y r a t ec o m p a t e dw i t ht h e u n p r e t r e a c t e dc a n em o l a s s e s ( 3 4 6g cv s2 6 1g l ) i nb a t c hm o d e k e yw o r d sb u t y r i ca c i dc l o s t r i d i u mt y r o b u t y r i c u mf i b r o u s b e db i o r e a c t o r i m m o b i l i z a t i o n l6 s r r n ac a n em o l a s s e s i i i 浙江理工大学硕士学位论文 目录 摘要i a b s t r a t e i i 第一章文献综述1 1 1 丁酸的性质及用途1 1 2 丁酸的生产方法及生产状况2 1 2 1 丁酸的生产方法2 1 2 2 生产状况3 1 3 丁酸的生产菌株3 1 4 酪丁酸梭菌的生理特征及菌种鉴定4 1 4 1 酪丁酸梭菌的生理特征4 1 4 2 细菌鉴定4 1 5 代谢途径6 1 6 丁酸发酵研究进展一8 1 6 1 丁酸发酵工艺8 1 6 2 细胞固定化10 1 6 3 纤维床固定化反应器1 1 1 7 糖蜜原料发酵1 4 1 7 1糖蜜的特性15 1 7 2 糖蜜的利用1 5 1 8 研究内容16 第二章实验材料和方法1 8 2 1 菌种18 2 2 仪器与试剂18 2 2 1 主要仪器18 2 2 2 常用试剂1 9 2 3 培养基和培养条件一l9 2 3 1 主要培养基19 2 3 2 培养方法2 0 2 4 分析测定方法2 0 2 4 1p h 测定方法2 0 2 4 2 含菌量测定2 0 2 4 3 各种碳源浓度的测定2 l 2 4 4 发酵液中丁酸、乙酸的测定2 1 第三章酪丁酸梭菌的鉴定2 2 3 1 材料和方法2 3 3 1 1 菌株2 3 3 1 2 仪器设备2 3 3 1 3 化学试剂2 3 3 1 4 培养基2 3 3 1 5 菌种形态观察2 4 3 1 6 菌种1 6 s r r n a 鉴定2 4 3 2 结果分析2 6 a 浙江理t 大学硕士学位论文 3 2 1 菌种形态结果2 6 3 2 2 革兰氏染色结果2 7 3 2 31 6 s r i a 鉴定结果2 7 3 2 小结3 1 第四章纤维床固定化酪丁酸梭菌发酵葡萄糖的研究3 2 4 1 材料和方法3 3 4 1 1 菌种3 3 4 1 2 培养基3 3 4 1 3 培养方法3 3 4 1 4 分析测定方法3 4 4 1 4 1p h 测定方法3 4 4 1 4 2 含菌量测定3 4 4 1 4 3 葡萄糖的测定方法3 4 4 1 4 4 发酵液中丁酸、乙酸的测定3 5 4 2 结果与分析3 5 4 2 1 游离酪丁酸梭菌生长曲线的测定3 5 4 2 2 初始葡萄糖浓度对丁酸生产的影响3 6 4 2 3 氮源对丁酸生产的影响3 6 4 2 4 游离分批发酵3 8 4 2 5 游离流加发酵3 9 4 2 6 固定化重复分批发酵3 9 4 2 7 固定化流加发酵生产丁酸4 0 4 3 小结4 1 第五章纤维床固定化发酵糖蜜的研究4 2 5 1 材料与方法4 2 5 1 1 甘蔗废糖蜜4 2 5 1 2 菌株4 3 5 1 3 培养基4 3 5 1 4 培养方法4 3 5 1 5 分析测定方法4 4 5 1 5 1p h 测定方法4 4 5 1 5 2 含菌量测定4 4 5 1 5 3 各种碳源浓度的测定4 4 5 1 5 4 发酵液中丁酸、乙酸的测定4 4 5 1 6 糖蜜预处理方法4 5 5 2 结果与分析。4 6 5 2 1 酪丁酸梭菌对不同碳源的利用4 6 5 2 2 以模拟混合糖为底物的纤维床流加发酵生产丁酸4 7 5 2 3 以废糖蜜为底物的纤维床流加发酵生产丁酸4 7 5 2 4 不同预处理方法对废糖蜜发酵生产丁酸的影响4 8 5 3 小结与讨论4 9 结论5 0 参考文献5 2 b 浙江理工大学硕十学位论文 第一章文献综述 丁酸是一种在化工、香料、医药等行业中应用广泛的短链脂肪酸，近年来出 现了供不应求的状况。但是由于世界石油价格的上涨，基于石油裂解产品的丁酸 化学合成工艺生产成本越来越高，同时化学合成法本身污染大，操作条件苛刻等， 从石油资源的有限性和环境保护考虑应该选择其他合理高效的生产方式。同时随 着人们健康意识的增强，天然有机产品在医药领域的应用受到了更多的青睐，因 此微生物发酵方法制备丁酸也得到越来越多的关注。微生物发酵法具有原料利用 广泛、反应条件温和、环境污染少等优点。国内外在丁酸发酵方面作了广泛研究， 并取得了不少进展，一些发酵工艺的优化、菌种的改造和新型反应器的出现使微 生物发酵法大规模生产丁酸成为可能。 1 1 丁酸的性质及用途 丁酸又称乙基乙酸，英文名称n b u t y r i ca c i d ；n b u t a n o i ca c i d ，分子式 c h 3 c h 2 c h 2 c o o h ，相对分子量或原子量8 8 1 0 ，密度0 9 5 8 7 ，熔点一4 5 ，沸 点1 6 3 ，闪点7 6 6 7 ，粘度1 6 1m p a s ，折射率1 3 9 9 1 。丁酸为无色油状液 体，浓的正丁酸有令人厌恶的臭味。在室温下，能与水、醇、醚等有机溶剂互 溶，在盐的水溶液中溶解度较小，能随水蒸气挥发。丁酸的钙盐在冷水中比在热 水中溶解度大，并与水形成共沸物。丁酸常以酯的形式或游离状态存在于自然界 中，例如，丁酸的甘油酯存在于奶油中，所以丁酸又称酪酸；丁酸丁酯存在于桉 树中；游离的丁酸存在于动物的汗液和粪便中。 丁酸及其衍生物的用途十分广泛，主要包括化工原料、食品、香料、医药等。 作为化工原料，丁酸主要用来制造丁酸纤维素、醋酸丁酸纤维素，这些是涂料工 业中最常用的一些纤维素有机酸酯。纤维素酯具有良好的互溶性，可改善涂料流 动性能、流平性、户外耐久性、颜料定向性和柔韧【1 。3 】。丁酸用于合成各类丁酸 酯，纤维素阻燃剂和其他有机合成，主要衍生物是丁酸甲酸、丁酸乙酯、a 溴代 丁酸、丁酰胺、丁酰苯胺、丁酰氯、丁酸三甘油脂、丁酰氨基苯乙醚、丁酰氨基 茴香胺等等。丁酸也广泛用于制造清漆和模塑粉。在食品和香料工业中，丁酸可 浙江理下大学硕士学位论文 直接添加在乳制品中以提高奶油风味，丁酸与低级醇形成的酯类被广泛作为香味 添加剂【4 1 。这些酯具有不同的香味，例如丁酸甲酯似苹果香，乙酯似菠萝香，异 戊酯似梨香，用于配制各种水果香型食用香精和大曲型酒用香精以及烟草香精 等，可用于糖果、饮料、冰淇淋等食品1 5 】。丁酸是食物纤维或聚糖等膳食纤维在 结肠中经厌氧菌发酵后生产的短链脂肪酸，除具有影响营养物质的消化代谢和肠 道微生物区系、增加免疫等作用外，还可以抑制癌细胞生长【6 7 j ，国内外对在分子 和细胞水平上的作用机制进行了大量的动物实验和临床研究1 8 _ 引。 丁酸的生产方法及生产状况 1 2 1 丁酸的生产方法 1 丙烯羰基化法【1 3 1 此法以丙烯和合成气为原料，先羰基化生成丁醛，在丁醛生成塔中通入氧气 使其氧化为丁酸，而丁醛作为中间产物存在。反应会有副产物异丁酸产生，以 s n c l 2 、c o c l 2 等为催化剂，可以提高生成正丁酸的选择性，抑制副产物的生成。 丙烯羰基合成法生产投资过大，并且中间产物为正丁醛，随着直接采用正丁醛氧 化制正丁酸的工业化的广泛采用，该法已逐步被淘汰。 2 正丁醛氧化法【1 4 】 这种方法具有工艺路线简单、生产控制方便、原料单一、产品收率高等优点， 在工业上应用广泛。以正丁醛为原料、氧气或空气作为氧化剂，有无催化剂均可 完成的反应。如果用催化剂则选择过渡金属以及c u 、a g 、c e 、碱金属和碱土金 属。液相反应时，催化剂选择金属羧酸盐，气相反应则使用沉淀于硅胶、氧化铝 等上的金属氧化物。 3 正戊醇硝酸氧化法以正戊醇为原料，在沸腾的浓硝酸中先发生消除反 应，失去一分子水而生成烯烃，烯烃再进一步被硝酸氧化而失去一个碳原子，生 成正丁酸 4 微生物发酵法 微生物发酵生产丁酸主要用到的原料是淀粉和蔗糖，淀粉需要经过酸解、酶 解成葡萄糖后用于发酵。微生物发酵研究还选用了一些其他廉价原料，如工业和 农副产品：乳清、谷物秸秆、稻草等，通过提高原料的酸解或酶解得到葡萄糖和 2 浙江理工大学硕士学位论文 木糖等单糖的效率，在连续搅拌反应器或固定化反应器中进行发酵生产。 目前工业化生产丁酸以化学合成方法为主，微生物法仍难以和化学合成法相 竞争，主要原因是受到两方面的限制：( 1 ) 丁酸的选择性取决于细胞生长，一般 较低；( 2 ) 和其他有机酸发酵一样，都会受到终产物的抑制，难以提高浓度，从 而导致了低的生产效率和分离提取困难等问题【1 5 1 6 1 。要提高微生物发酵的竞争 力，应该寻找廉价和易于处理的副产品作为原料，寻找更有效的处理方法以提高 处理效率，选择高产菌种，并优化反应系统等。 1 2 2 生产状况 目前全世界正丁酸的产量为3 0 0 0 0 吨年，主要集中在中欧及美国的几大公司： 国内正丁酸用户主要分布在长江三角洲、珠江三角洲和天津等地，国内先后有十 二家生产厂生产正丁酸，但规模都很小，质量差，产品纯度只有9 8 左右，无法与国 外产品抗衡。近年来我国丁酸年产量有所增加，产品纯度可达到9 9 5 以上。主 要生产厂家为：齐鲁石化第二化肥厂精细化工厂( 20 0 0 吨年) ，淄博三昊精细化 工有限公司( 1 00 0 0 吨年) ，淄博隆邦化工有限公司( 60 0 0 吨年) 等。2 0 0 0 年以 前国内高纯度正丁酸基本依靠进口，产品主要来源于德国的赫斯特公司、哈斯公 司及美国的伊斯曼公司，年进口量在1 5 0 0 2 0 0 0 吨左右【1 7 】。 1 3 丁酸的生产菌株 能发酵产丁酸的微生物种类很多，其中大多数是严格厌氧菌，微生物催化生 产丁酸也大多是一个厌氧过程。产丁酸的微生物如表1 1 所示，主要包括梭菌属 ( c l o s t r i d i u m ) 、丁酸弧菌属( b u t y r i v i b r i o ) 、丁酸杆菌属( b u t y r i b a c t e r i u m ) 、八 叠球菌属( s a r c i n a ) 、真杆菌属( e u b a c t e r i u m ) 、梭杆菌属( f u s o b a c t e r i u m ) 、巨 球形菌属( m e g a s p h e r a ) 。产黑色素拟杆菌( b a c t e r o i d e sm e l a n i n o g e n i c u s ) 、溃蚀 密螺旋体( t r e p o n e m ap h a g e d e n i s ) 等【1 8 】。这些菌种可用从土壤、污水、动物肠 道系统、污染的乳制品等中分离得到。最佳培养条件一般是3 0 3 7 0 c ，p h6 5 7 0 ， 在纯二氧化碳或氮气环境中或者1 ：9 的氮气和二氧化碳的混合气中【1 9 】。常用的 碳源包括葡萄糖、乳糖、蔗糖、淀粉等。其中梭菌属由于发酵产丁酸的产量相对 较高、稳定性较好，被认为最具商业应用价值。梭菌是革兰氏阳性厌氧芽孢菌， 3 浙江理工大学硕七学位论文 丁酸梭菌( c l o s t r i d i u mb u t y r i c u m ) 、酪丁酸梭菌( c l o s t r i d i u mt y r o b u t y r i c u m ) 、 丙酮丁醇梭菌( c l o s t r i d i u ma c e t o b u t y l i c u m ) 、巴斯德梭菌( c l o s t r i d i u m p a s t e u r i a n u m ) 、拜氏梭菌( c l o s t r i d i u mb e i j e r i n c k i i ) 等是产丁酸的代表种，而这 些种也常被用来发酵生产溶剂丙酮、丁醇、1 ，3 丙二醇、气体等1 2 0 。2 4 1 。 表1 1 产丁酸菌种 t a b l e1 1s o m eb u t y r a t e - p r o d u c i n gs t r a i n s o r g a n i s m s 微生物 c l o s t r i d i u m b u l y r i v i b r i o b u l y r i b a c t e r i u m s a r c i n a e u b a c t e r i u m f u s o b a c t e r i u m m e g a s p h e r a b a c t e r o i d e sm e l a n i n o g e n i c u s t r e p o n e m ap h a g e d e n i s 梭菌属 丁酸弧菌属 丁酸杆菌属 八叠球菌属 真杆菌属 梭杆菌属 巨球形菌属 产黑色素拟杆菌 溃蚀密螺旋体 1 4 酪丁酸梭菌的生理特征及菌种鉴定 1 4 1 酪丁酸梭菌的生理特征 酪丁酸梭菌是一种典型的产丁酸微生物，由于发酵乳酸破坏乳酪的品质而被 人们熟知，现代拉丁语中t y r o b u t y r i c u m 的意思就是从干酪中产生丁酸的细菌1 2 5 | 。 酪丁酸梭菌为直杆菌，1 5 4 5u n 。以周生鞭毛运动。孢子卵圆，次端生。革兰 氏阳性。细胞壁含有d l 二庚基二酸；葡萄糖是唯一的细胞壁糖。不水解明胶。 表面菌落圆形，直径o 5i r l l r l 、突起、边缘完整、灰色、半透明、表面有光泽。 在含有可发酵碳水化合物的肉汤中生长良好。发酵产物主要包括大量的醋酸和丁 酸。牛奶变酸或不变化。d n a 的g + c 含量为2 8 克分子。不发酵核糖醇、纤 维素和赤藓糖醇。可发酵果糖、葡萄糖、甘露醇、甘露糖、木糖。 1 4 2 细菌鉴定 细菌鉴定不仅是进行遗传学分析的前提，而且是应用微生物于生物工程所需 4 浙江理 ：大学硕十学位论文 要的一条必要的预试信息。细菌的鉴定方法分为传统方法和分子生物学方法。传 统方法依据的是形态特征和生理生化特性，采取的主要方法是对细菌进行纯培养 分离，再进一步对获得的分离物进行形态学、生理生化反应特性及免疫学特性的 分析鉴定。随着分子遗传学和分子生物学的不断发展，分子生物学技术和方法被 用于各种微生物的遗传特征和分子差异的研究，1 6 s r r n a 序列分析方法是菌种的 分离鉴定和系统分类学的常用方法【2 6 】。分子方法与传统方法相比更加方便、快 捷，对细菌的鉴定能力大为扩展，某些特性的测定也更加精确，而且可以表达分 离物间系统发育关系等。 细菌r r n a 按沉降系数分为3 种，分别为5 s 、1 6 s 和2 3 sr r n a ，它们分别 含有的核苷酸约1 2 0 、1 5 4 0 、2 9 0 0 个。1 6 sr r n a 由于大小适中，既能体现不同 菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类 学家接受，是细菌的系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟。细菌的1 6 s r r n a 的结构【2 7 j 如图1 2 所示，由1 0 个保守区和9 个高变区( v 1 v 9 ) 两部分组 成。其中保守区为所有细菌共有，细菌间无差别，能反映生物物种的亲缘关系， 可变区具有属或种的特异性，序列则随菌间的亲缘关系不同而有一定的差异，能 显示出细菌不同分类等级水平上的特异性。可变区序列因细菌不同而异，恒定区 序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将1 6 sr r n a 片段扩增出来， 利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。人们已经通过 核蛋白体1 6 ( 或1 8 ) s r r n a 序列水平，将生物重新划分为三个域：古茵域、细菌 域和真核生物域。根据1 6s r r a n 建立的生命树认为，生命由细菌域( b a c t e r i a ) 、 古菌域( a r c h a e a ) 和真核生物域( e u c a r y a ) 构成，三域生物间序列相似性 7 0 ：同种序列相似性 9 7 。 5 1 0kf 0硌咯 l | l ；， ? 7 - - q v a r i a n er e g i 。n c o n s e e d r e g i o n 图1 21 6 sr r n a 的结构 f i g1 2d i a g r a mo f1 6 s r r n ag e n es t r u c t u r e 1 6 s r n a 进行分子生物学的鉴定的基本方法如图1 3 所示，主要包括：首先 5 浙江理j 1 = 大学硕士学位论文 提取细菌总d n a ，设计引物利用p c r 方法扩增1 6 s r r n a 序列，纯化p c r 产物 并进行测序，得到序列信息。将序列与基因库中序列进行比对，用分析软件进行 物种确定和基因比较。 圜 1 5 代谢途径 图1 31 6 s r r n a 菌种鉴定流程 f i g1 31 6 s r r n a i d e n t i f i c a t i o np r o c e d u r e 丙酮丁醇发酵曾是传统的大宗发酵( 仅次于乙醇) ，丁酸的合成途径是在研 究丙酮丁醇发酵的过程中获得的。梭菌发酵产酸的途径如图1 4 所示2 8 1 ，底物有 戊糖和己糖( 比如木糖和葡萄糖) ，代谢产生的终产物包括丁酸、乙酸、二氧化 碳、氢气和乳酸等。葡萄糖代谢是通过e m p 途径( e m b d e n m e y e r h o f - p a r n a s p a t h w a y ) 即糖酵解途径产生丙酮酸，而木糖是通过h m p 途径( h e x o s e m o n o p h o p h a t ep a t h w a y ) 且 j 戊糖磷酸途径产生丙酮酸，丙酮酸经丙酮酸脱氢酶催化 生成乙酰辅酶a ，同时伴随氢气的产生。代谢葡萄糖发酵生产的总反应可以参照 以下公式【2 9 】： 1c 6 h 1 2 0 6 - o 8c 3 h 7 c o o h + 0 4c h 3 c o o h + 2 c 0 2 + h 2 丁酸发酵时总是耦联乙酸的生成，这可以通过细胞生长对能量的需求来解 释。丁酸和乙酸的代谢合成途径大致相同，在乙酸合成过程中可以产生4 摩尔 a t p ，而在合成丁酸过程中，只有3 摩尔a t p 形成，细胞生长旺盛时对能量的要 求使乙酸必然合成。丁酸和乙酸的代谢合成途径大致相同，乙酰辅酶a 是生产 乙酸和丁酸的共同前体，是至关重要的代谢中间物。在乙酸合成中，乙酰辅酶a 通过磷酸转乙酰酶( p t a ) 作用生产乙酰磷酸，乙酰磷酸经乙酸激酶( a k ) 催 化形成乙酸。丁酸的产生过程较复杂，需要更多酶的参与，两分子乙酰辅酶a 在硫解酶的催化下脱去一个c o a 生成乙酰乙酰辅酶a ，乙酰乙酰辅酶在p 羟基 丁酰辅酶a 脱氢酶的催化下生成b 羟基丁酰辅酶a ，进一步由巴豆酸酶催化形 6 浙江理工大学硕士学位论文 才 b u t y r y l p d p 、 2 ( 4 ) 卯尸、f b u l w r a t e p f i g1 4 梭菌属代谢产酸途径 ( 1 ) 磷酸转乙酰酶( 2 ) 乙酸激酶( 3 ) 磷酸转丁酰酶( 4 ) 丁酸激酶( 5 ) 硫解酶； ( 6 ) p 羟基丁酰辅酶a 脱氢酶，巴豆酸酶，丁酰辅酶a 脱氢酶( 7 ) 铁氧换蛋白还原酶 ( 8 ) 氢化酶( 9 ) 乳酸脱氢酶( 1 0 ) n a d 依赖的乳酸脱氢酶 f i g 1 4t h em e t a b o l i cp a t h w a y si n v o l v e di nb u t y r a t ef e r m e n t a t i o n ( 1 ) p h o s p h o t r a n s a c e t y l a s e ；( 2 ) a c e t a t ek i n a s e ；( 3 ) p h o s p h o t r a n s b u t y r y l a s e ；( 4 ) b u t y r a t ek i n a s e ； ( 5 ) a c e t y ic o aa c e t y l t r a n s f e r a s e ( o rt h i o l a s e ) ；( 6 ) t h r e ee n z y m e sp r o d u c i n gb u t y r y l - c o a ； ( 7 ) p y r u v a t e - f e r r e d o x i no x i d o r e d u c t a s e ；( 8 ) h y d r o g e n a s e ；( 9 ) l a c t a t ed e h y d r o g e n a s e ； ( 1o ) n a d - i n d e p e n d e n tl a c t a t ed e h y d r o g e n a s e 成巴豆酰辅酶a ，然后经丁酰辅酶a 脱氢酶催化形成关键的前体丁酰辅酶a 。丁 酰辅酶a 再在磷酸丁酰转移酶、丁酸激酶的催化下，最终生成丁酸。参与乙酞辅 酶a 到丁酸催化过程的酶对于丁酸产生十分重要，其中包括硫解酶、d 羟基丁酰 7 浙江理工大学硕士学位论文 辅酶a 脱氢酶、磷酸转丁酰酶和丁酸激酶等，只有这些酶在足够多的水平上时丁 酸才能合成，这些酶受到受到a t p 浓度和n a d h ：n a d 比率的影响，相对高的 细胞内a t p 浓度和相对低的n a d h ：n a d 比率刺激丁酸的生成【3 0 1 。 1 6 丁酸发酵研究进展 1 6 1 丁酸发酵工艺 丁酸发酵常用的发酵模式有分批发酵( b a t c hf e r m e n t a t i o n ) 、补料分批发酵 ( f e d b a t c hf e r m e n t a t i o n ) 、连续发酵( c o n t i n u o u sf e r m e n t a t i o n ) 、细胞循环发酵( c e l l r e c y c l ef e r m e n t a t i o n ) 等，萃取发酵( e x t r a c t i v ef e r m e n t a t i o n ) 和渗透萃取发酵 ( p e r t r a c t i v ef e r m e n t a t i o n ) 是有机酸发酵中常见的分离耦合发酵形式。表1 5 对 发酵模式在丁酸生产中的应用进行了一些总结。 分批发酵是将培养基一次性加入，产品一次性收获，与外界没有其它物料交 换的一种发酵方式，微生物生长按典型的生长曲线进行。分批发酵的优点是：工 艺操作简单；比较容易解决杂菌污染和菌种退化等问题；对营养物的利用效率较 高，可以有效降低产物抑制效应，产物浓度也比连续发酵要高。但是分批发酵要 耗费大量的人力物力，每次都要重新接种培养、清洗设备、灭菌，生产周期长， 生产效率低。丁酸分批发酵的应用较多，较早的研究是m i c h e l s e v i n t l 5 】利用 c t y r o b u t y r i c u m 游离发酵葡萄糖产丁酸，得到2 7 8g l 的丁酸，得率0 3 7g g ， 产率1 1 1g l 1 1 。v a n d a k 等用丁酸梭菌游离分批发酵蔗糖可产生4 5g l 丁酸， 产率0 9 0g l h 【3 l 】。 补料分批发酵也叫半连续发酵、半连续培养，流加发酵( f e d b a t c h f e r m e n t a t i o n ) ，它是以分批培养为基础，间歇或连续地补加新鲜培养基的一种发 酵方法。补料分批发酵与分批发酵相比，特点在于使发酵系统中维持很低的基质 浓度。低基质浓度的优点：可以除去快速利用碳源的阻遏效应，并维持适当的 菌体浓度避免在培养基中积累有毒代谢物，即代谢阻遏。与连续发酵相比，补 料分批发酵不需要严格的无菌条件，也不会产生菌种老化和变异等问题，因此， 其应用范围较广。h u a n g 3 2 】等在固定化发酵中以玉米淀粉为原料通过补料模式得 到了4 0g l 丁酸，得率0 5 g ，产率6 7 8g l l