（生物化学与分子生物学专业论文）结构域tt+apux21的研究.pdf

西南大学硕士学位论文摘要 摘要 本研究旨在通过试验发现 i ta p u x 2 1 的功能，即证明t ta p u x 2 l 是否确为有功能的碳水 化合物结合结构域( c a r b o h y d r a t e - b i n d i n gm o d u l e ，c b m 。这将为进一步研究t ta p u x 2 1 与碳水 化合物的化学键结合专一性，以及其与碳水化台物相互结合的机理打下前期基础。 以热产硫化氢高温厌氧杆菌( t h e r m o a e r o b a c t e r t h e o h y a r o s u l f u t i t u s ) 菌液为模板，用e x t a qh s d n a 聚合酶对t ta p u x 2 1 进行p c r 扩增。p c r 反应条件为：9 4 ( 2 预变性5 m i n ，然厨 按9 4 变性3 0 s ，5 5 退火4 5 s 。7 2 。c 延伸3 0 s ，进行3 0 个循环，最后7 2 延伸5 m i n 。扩增 产物经1 琼脂糖凝胶电泳。发现在约4 0 0 b p 处有一明显的特异扩增片段，与预期的片段大小 基本一致。 p c r 产物和表达载体p e t 2 1 a ( + ) f 至n d e i 、砌d i 双酶切后，混匀，加入t 4 d n a 连接酶， 1 6 ，连接1 6 h 。连接产物转化大肠杆菌d h 5 c t 感受态细胞。 从转化平板上挑3 个单菌落进行l b 液体培养；然后做菌液p c r ，进行阳性克隆的初步 筛选，结果显示：3 个单菌落均有一约4 0 0 b p 的特异片段，与预期的片段大小基本一致。取经 菌液p c r 筛选到的其中1 个阳性克隆培养液，进行d n a 测序鉴定，插入片段序列正确，获 得的重组d n a 命名为p e x 2 1 。接种转化有p e x 2 1 的菌种于l b 液体培养基中培养；然后提重 组质粒p e x 2 i 并将其转化到t u n e r 感受态细胞中。 挑p e x 2 l t u n e r 单菌落，接种于l b 液体培养基中，培养至o d 6 0 0 为o 6 - - 0 8 。加入i p t g ， 使终浓度为o 1 m m ，3 0 c ，1 3 0 r p m 继续培养5 h 。用同样方法诱导表达p e t 2 t a ( + ) t u n e r ，作 为对照。取菌体总蛋白和无细胞液( c e l l f r e ee x t r a c t ，c f e ) ，同时取未诱导的菌体总蛋白，进行 十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳( s o d i t n nd o d e e y l s u l p h a t e p o l y a c r y l a m i d eg e l e l e c t r o p h o r e s i s ，s d s - p a g e ) ，结果显示：p e x 2 1 t u n e r 经i p t g 诱导后，菌体总蛋白和c f e 在 分子量约2 0 k d a 处均有一条宽而明亮的蛋白质条带，与t t a p u x 2 1 融合蛋白的预期分子量近 似；而对照菌p e t 2 1 a ( + ) t u n e r 和来诱导的p e x 2 1 t u n e r 无此条带，说明获得了目的蛋白的高 效表达。 取2 0 r a l 诱导菌液，离心收获细菌细胞，裂解后将含融合蛋白的c f e 加入到t a l o n t m 树脂 中，进行金属离子亲和层析( m e t a li o n a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y m i a c ) 。分离纯化带组氨酸 标签的融合蛋白。取纯化产物做s d s p a g e 检验，结果显示：1 0 m m - 2 0 0 m m 咪唑洗脱液均为 单一蛋白质条带，与t t a p u x 2 1 融合蛋白的预期分子量近似，其中5 0 r a m 咪唑洗脱液和1 0 0 r a m 咪唑洗脱液的条带宽而明亮，说明5 0 i o o m m 咪唑洗脱液比较适合用于洗脱融台蛋白。 以多种碳水化合物为底物，通过非变性亲和电泳( n o n - d e n a t u r i n g a f f i n i t ye l e c t r o p h o r e s i s ， n d a e ) 来检验t t a p u x 2 1 是否能与水溶性碳水化合物结合，分定性分析和定量分析两种；通 过s d s p a g e 来检验t t a p u x 2 l 是否能与不溶性碳水化合物结合。 在两张聚丙烯酰胺凝胶中，对照胶无淀粉，试验胶含o 2 淀粉，以牛血清白蛋i 匀( b o v i n e s e r u m a l b u m i n b s a ) 作为对照蛋白，进行n d a e 的定性分析。结果显示：b s a 在两张凝胶中 的迁移距离相等，而t ta p u x 2 1 在试验胶中的迁移距离小丁_ 其在对照胶中的迁移距离。表明 t t a p u x 2 1 能与试验胶中的淀粉结合，使其迁移受到阻碍，从而导致迁移速度变慢，迁移距离 变小。同样方法表明t t a p u x 2 1 能与糊精、普鲁兰糖结合。 西南大学硕士学位论文 摘要 n d a e 的定性分析表明： i t a p u x 2 1 能与水溶性淀粉、糊精和普鲁兰糖结合，因此分别以 不同浓度的水溶性淀粉、糊精和普鲁兰糖为底物，进一步做n d a e 的定量分析检验t t a p u x 2 i 与它们结合能力的强弱。 分别以0 0 0 6 、0 0 1 2 、0 0 2 5 、o 0 5 0 和0 1 0 0 * o t j ( 溶性淀粉为底物，仍以b s a 作为 对照蛋白，做n d a e 定量分析。结果显示：b s a 在每一张凝胶中的迁移距离相等；而淀粉浓 度越高，t ta p u x 2 1 在凝胶中的迁移距离越小，表明其迁移受到的阻碍越大。以淀粉浓度c ( o 0 0 0 ) 为自变量( x ) ，t ta p u x 2 1 在对照胶中的迁移距离d 与其在试验胶中的迁移距离d 之差d d ( m m ) 为依变量0 ) ，对c 和d d 进彳亍直线回归分析。计算表明：两变量c 和 d d 存在显著的直线回归关系，直线回归方程为p = 2 1 7 6 + 0 1 9 2 x 。从回归系数可知：淀 粉浓度c 每增加o 0 0 1 ，迁移距离之差d - - d 增大01 9 2 m m ，因t ta p u x 2 1 在对照胶中的迁 移距离d 不变，故其在试验胶中的迁移距离d 减少o 1 9 2 r a m 。简而言之，淀粉浓度c 每增加 o 0 0 1 ，t t a p u x 2 1 在试验胶中的迁移距离d 减少0 1 9 2 m m 。 分别以0 , 0 0 6 、0 0 1 2 、0 0 2 5 、o 0 5 0 和o 1 0 0 糊精为底物，做n d a e 定量分析， 结果表明：糊精浓度c 每增加o 0 0 1 ，t t a p u x 2 1 在试验胶中的迁移距离d 减少o 1 1 i m m 。 分别以o 0 5 0 、o 1 0 0 、0 , 2 0 0 、o 3 0 0 和0 4 0 0 普鲁兰糖为底物，做n d a e 定量分 析，结果表明：普鲁兰糖浓度c 每增加0 0 0 1 ， i ta p u x 2 1 在试验胶中的迁移距离d 减少 0 0 2 5 m n a 。 综上所述，水溶性淀粉、糊精和普鲁兰糖浓度c 每增加0 0 0 1 ， i ta p u x 2 1 在试验胶中 的迁移距离d 分别减少0 1 9 2 m m 、0 1 1 1 m m 和0 0 2 5 m m ；表明t t a p u x 2 1 在试验胶中受水溶 性淀粉的阻碍程度最大，受糊精韵阻碍程度次之，受普鲁兰糖的阻碍程度最小；反应出n a p u x 2 1 与水溶性淀粉的结合能力最强，与糊精的结合能力次之，与普鲁兰糖的结合能力最弱。 分别以不溶性淀粉和不溶性木聚糖为底物，通过s d s - p a g e 来检验t ta p u x 2 1 是否能与 它们结合。取t t a p u x 2 1 蛋白，与不溶性淀粉混合，冰上孵育1 h ，漂洗数次，再经s d s 变性 处理后得样品，进行s d s - p a g e 检验。结果显示：s d s 处理获得的样品其泳道没有蛋白质条 带，表明t ta p u x 2 1 不能与不溶性淀粉结合。同样方法表明t ta p u x 2 1 不能与不溶性木聚糖 结台。 本研究通过试验发现：( 1 ) t t a p u x 2 1 能与水溶性淀粉、糊精和普鲁兰糖结合，与水溶性 淀粉的结合能力最强，与糊精的结合能力次之，与普鲁兰糖的结合能力最弱。( 2 ) i t a p u x 2 1 不能与不溶性淀粉和不镕性木聚糖结合。( 3 ) t t k p u x 2 ，, 是一个有功能的碳水化舍物结合结构 域，是一个功能性的c b m 3 4 。 关键词： c b m 3 4 非变性亲和电泳碳水化合物结合特性 西南大学硕士学位论文 a b s t r a c t 舞ii 置皇罡曩暖皇鼻量墨舅矗量量量璺葛s 曼曼舅曹目置皇量皇鼍鼍甚 a b s t r a c t t h i ss t u d yi st oi n v e s t i g a t ei f t ta p u x 2 1i saf u n c t i o n a lc a r b o h y d r a t e b i n d i n gm o d u l e ( c b m ) t h eo b t a i n e dd a t aw i l lh e l pt or e v e a lt h eb i n d i n gs p e c i f i c i t yb e t w e e nt ta p u x 2 1a n dc h e m i c a lb o n d s t h ef i n d i n g so ft h i ss t u d yw i l la l s oh e l pd of u r t h e rs t u d yt ou n d e r s t a n dt h ei n t e r a c t i o nm e c h a n i s m b e t w e e nt t a p u x 2 la n di t sl i g a n d s t ta p u x 2 1w a sa m p l i f i e df r o mt h e r m o a n a e r o b a c t e rt h e r m o h y d r o s u l f u r i c u sb yu s i n ge xt a qh s d n ap o l y m e r a s e t h et h e r m o e y c l ep a r a m e t e r sw e r ea sf o l l o w s ：】c y c l ea t9 4 cf o r5m i n u t e s ，3 0 c y c l e sa t9 4 cf o r3 0s e c o n d s ，5 5 f o r4 5s e c o n d sa n d7 2 。cf o r3 0s e c o n d s ，a n dlc y c l ea t7 2 f o r 5m i n u t e s t h ep c rp r o d u c tw a sa n a l y z e db y1 a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s i tw a sa p p a r e n t t h a tt h e r ew a sa na m p l i f i e df r a g m e n tw h i c hw a sa b o u t4 0 0 b pa n dw a ss i m i l a ri ns i z et ot h ee x p e c t e d o n e t h ep c rp r o d u c ta n dt h ee x p r e s s i o nv e c t o rp e t 2 1 a ( + ) w e r es i m i l a r l yd i g e s t e dw i t hr e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e sn d eia n dx h oia n dw e r el i g a t e dw i t ht 4d n a l i g a s ea t1 6 * cf o r1 6 h t h el i g a t i o n r e a c t i o nw a st h e nt r a n s f o r m e di n t od h 5 a ， t h r e es i n g l ec o l o n i e sw e r ep i c k e du pa n dc u l t u r e di nl u r i ab r o t h ( l b ) m e d i u m b a c t e r i a l c u l t u r ep c rw a st h e nc a r r i e do u tt oi d e n t i f yw h e t h e rt h e s ec o l o n i e sc o r r a l n e dt h er e c o m b i n a n t p l a s m i d a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i sd i s p l a y e dt h a ta l lo f t h r e es h o w e das p e c i f i cf r a g m e n tw i t ht h e e x p e c t e ds i z e o n eo f t h e mw a ss e n tt ob es e q u e n c e d s e q u e n c i n gd a t as h o w e dt h a ti tc o n t a i n e dt h e i n s e r t e df r a g m e n ta tc o r r e c ts i t e ，a n dm o r e o v e r , t h es e q u e n c eo f t h ei n s e r t e df r a g m e n tw a st h es a m e a st h a to f t ta p u x 2 1p u b l i s h e di no e n e b a n kr a c c e s s i o nn u m b e r ：m 2 8 4 7 1 ) t h er e c o m b i n a n tp l a s m i d w a sd e s i g n a t e d p e x 2 1 n ec o t is t r a i nd h 5 t tt r a n s f o r m e dw i t hp e x 2 1w a sg r o w ni nl b m e d i u m t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dp e x 2 1w a st h e ne x t r a c t e da n dt r a n s f o r m e di n t ot u n e r as i n g l ec o l o n yo fec o l it u n e rh a r b o r i n gp e x 2 1w a sp i c k e du p ，i n o c u l a t e di nl bm e d i u m a n dg r o w nt om i d e x p o n e n t i a lp h a s e ( o d 6 0 0 - - 0 6 旬- 8 ) t h ec u l t u r ew a st h e nc o o l e dt o3 0 ( 2 ，b e f o r e t h ee x p r e s s i o no ft ta p u x 2 1w a si n d u c e db ya d d i t i o no fi s o p r o p y l - b e t a d - t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e f i p t g ) t oaf i n a lc o n c e n t r a t i o no fo 1 m ma n di n c u b a t i o na t3 0 a n d1 3 0 r p mf o raf u r t h e r5 h s i m i l a r l y , t h eec o l it u n e rh a r b o r i n gp e t 2 1 a ( + ) w a sg r o w na n di n d u c e da s a n e g a t i v ec o n t r 0 1 s o d i u md o d e c y l s u l p h a t e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ( s d s p a g e ) w a sp e r f o r m e dt o a n a l y z et h et o t a lp r o t e i na n dc e l l f r e ee x t r a c t ( c f e ) o f 正c o i lt u n e rh a r b o r i n gp e x 2 1a n dp e t 2 1 a ( + ) w i t ha n dw i t h o u ti p t gi n d u c t i o n t h ed a t ad i s p l a y e dt h a tt h e r ew a saw i d ea n db r i g h tp r o t e i nb a n d i n l a n e s c o n t a i n i n g t h e t o t a lp r o t e i na n d c f e o f e e o t i t u n e rh a r b o r i n g p e x 2 1w i t h i p t g i n d u c t i o n ， w h i c hw a sa b o u t2 0 k d aa n dw s i m i l a ri ns i z et ot h ed e d u c e dm o l e c u l a rw e i g h to ft ta p u x 2l f u s i o np r o t e i n h o w e v e r , t h e r ew a sn ot h a tp r o t e i nb a n di no t h e rl a n e s i ti n d i c a t e dt h a tt h ee f f e c t i v e e x p r e s s i o no fi n t e r e s tp r o t e i nw a so b t a i n e d t h ec e l l sw e r eh a r v e s t e df r o m2 0 m li n d u c e dc u l t u r eb yc e n t r i f u g a t i o na n dl y s e db yl y s o z y m e t h ec f ew a st h e no b t a i n e db yc e n t f i f u g a t i o n t h ef u s i o np r o t e i nw i t hah i s t a gw a sp u r i f i e df r o m t h ec f eb ym e t a li o na f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y ( m i a c ) u s i n gt a l o n 7 ”r e s i n ( c l o n t e c h ) t h e i l l 西南大学硕士学位论文 a b s t r a c t 墨墨薯墨量寡皇舅i 皇量窜矗尊量| 置鼍曼皇置胃舅量鼍皇晕田曼量鼍量皇曼皇墨罡曼曼量皇篁墨曼| 董墨置置 p u r i f i e dp r o d u c t sw e r ea n a l y z e db ys d s - p a g e d a t ar e v e a l e dt h a tt h e r ew a sas i n g l ep r o t e i nb a n d i nl a n e sc o n t a i n i n ge l u a t ew i t l l1 0 - 一2 0 0 m mi m i d a z o l e w h i c hw a ss i m i l a ri ns i z et ot ta p u x 2 1 f u s i o np r o t e i n f u r t h e r m o r e ，t h ep r o t e i nb a n d so fe l u a t ew i t h5 0 m ma n d1 0 0 m mi m i d a z o l ew e r e w i d e ra n db r i g h t e r t h i sr e s u l ts h o w e dt h a te l u e n t w i t h5 0 1 0 0 m mi m i d a z o l ew a ss u i t a b l ef o r e l u t i n gt ta p u x 2 1f u s i o np r o t e i n i no r d e rt ot e s tw h e t h e r i ta p u x 2 1 p o s s e s s e sa f f i n i t yf o rs o l u b l ep o l y s a c c h a r i d a s ， n o n d e n a t u r i n ga f f i n i t ye l e e t r o p h o r e s i s ( n d a e ) w a sc a r r i e do u tu s i n gd i f f e r e n tc a r b o h y d r a t e sa s l i g a n d s b o t hq u a l i t a t i v ea n dq u a n t i t a t i v es o l u b l ep o l y s a c c h a r i d eb i n d i n ga s s a y sw e r ep e r f o r m e db y n d a e s d s - p a g ew a sc a r r i e do u tt od e t e c ti ft ta p u x 2 1h a s a f f i n i t y f o ri n s o l u b l e p o l y s a c c h a r i d e s q u a l i t a t i v es o l u b l es t a r c hb i n d i n ga s s a y sb yn d a ew a sp e r f o r m e di nt w op o l y a c r y l a m i d eg e l s ， t h ec o n t r o lg e lw i t h o u ts o l u b l es t a r c ha n dt h et e s tg e lw i t h0 2 s o l u b l es t a r c h b o v i n es e r u m a l b u m i n ( b s a ) w a su s e da san e g a t i v e ，n o n i n t e r a c t i n gc o n t r o l ，n d a ed i s p l a y e dt h a tt h em i g r a t i o n d i s t a n c e so fb s ai nt w og e l sw e r ee q u a l l yl o n g ，w h i l et h em i g r a t i o nd i s t a n c eo ft ta p u x 2 1i nt h e t e s tg e lw s h o r t e rt h a nt h a to ft ta p u x 2 1i nt h ec o n t r o lg e l i ti n d i c a t e dt h a tt h em o b i l i t yo ft t a p u x 2 1w a sr e t a r d e db yt h ep r e s e n c eo fs t a r c hi nt h et e s tg e la n dt ta p u x 2 1p o s s e s s e sa f f i n i t yf o r s o l u b l es t a r c h s i m i l a r l y , t ta p u x 2 1w a sp r o v e dt oh a v ea f f i n i t yf o rb o t hd e x t r i na n dp u l l u l a n q u a l i t a t i v es o l u b l ep o l y s a c c h a r i d eb i n d i n ga s s a y sb yn d a er e v e a l e dt h a tt ta p u x 2 1 p o s s e s s e sa f f i n i t yf o rs o l u b l es t a r c h ，d e x t r i na n dp u l l u l a n h o w e v e r , t ow h a te x t e n tt ta p u x 2 1h a s a f f i n i t yf o rs o l u b l es t a r c h , d e x t r i na n dp u l l u l a n ，q u a n t i t a t i v es o l u b l ep o l y s a c c h a r i d eb i n d i n ga s s a y s b yn d a ew a sc a r r i e do u t ，u s i n gd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fs o l u b l es t a r c h ，d e x t r i na n dp u u u l a na s l i g a n d s ，r e s p e c t i v e l y q u a n t i t a t i v es o l u b l es t a r c hb i n d i n ga s s a y sb yn d a ew a sc a r r i e do u t ，u s i n go 0 0 6 ，0 0 1 2 ， 0 0 2 5 ，0 0 5 0 a n do 1 0 0 s t a r c ha sl i g a n d s b s aw a su s e da san e g a t i v e ，n o n - i n t e r a c t i n gc o n t r 0 1 n d a ed a t ad e m o n s t r a t e dt h a tt h em i g r a t i o nd i s t a n c e so fb s ai ng e l sw i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n s o f l i g a n dw e r ee q u a l l yl o n g ，w h e r e a st h eh i g h e rt h ec o n c e n t r a t i o no f s t a r c hi nt h eg e lw a s ，t h es h o n e r t h em i g r a t i o nd i s t a n c eo f t ta p u x 2 1i nt h eg e lw a s ，t h em o r es t r o n g l yt h em o b i l i t yo f t ta p u x 2 1 w a sr e t a r d e db yt h ep r e s e n c eo fs t a r c hi nt h eg e l l i n e a rr e g r e s s i o na n a l y s i sw a sp e r f o r m e d ，t a k i n g f c 】( o ，0 0 0 ) a st h ei n d e p e n d e n tv a r i a b l e ( x ) a n d ( d d ) ( m m ) a s t h ed e p e n d e n tv a r i a b l e ( y ) ， w h e r e c 】i st h ec o n c e n t r a t i o no fs t a r c h ，da n dda r e t h em i g r a t i o nd i s t a n c em o v e db yt ta p u x 2 1i n t h ec o n t r o lg e la n dt h et e s tg e l ，r e s p e c t i v e l y c a l c u l a t i o nr e v e a l e dt h a tt h e r ei sas i g n i f i c a n tl i n e a r r e g r e s s i o nr e l a t i o nb e t w e e n 【c 】a n d ( d - 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4 签字日期：2 0 0 6 年5 月2 8 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名：谢曰包彬导师签名：潮认考 签字日期： 20 0 6 年5 月2 8 日 签字日期： 20 0 6 年5 月2 8 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位：塞查堂瞳 电话： 通讯地址：婆酉查宣查立邮编： 第1 章文献综述 1 1 多结构域碳水化合物活性酶 1 1 1 碳水化台物活性酶 碳水化合物活性酶( c a r b o h y d r a t e a c t i v ee n z y m e s ，c a z y ) 是一大类很重要的酶，分为糖苷 水解酶类、糖基转移酶类、多糖裂解酶类和糖酯酶类，具有降解、修饰及生成糖苷键的功能。 糖苷水解酶( g l y c o s i d eh y d m l a s e ) 能降解糖分子之间或糖分子与非糖分子之间的糖苷键； 糖基转移酶( g l y c o s y l w a n s f a r a s e ) 能催化糖基从供体分子转移到特定的受体分子，同时生成糖苷 键，二糖、寡糖和多糖的生物合成都需要糖基转移酶的参与；多糖裂解酶( p o l y s a c c h a r i