（生物化学与分子生物学专业论文）昆虫病原线虫共生菌中pirb基因的克隆与表达.pdf

论文题目： 专业： 硕士生： 指导老师： 昆虫病原线虫共生菌中p i r b 基因的克隆与表达 生物化学与分子生物学 陈榕 庞义教授 摘要 在昆虫线虫共生菌p o t o r h a b d u s 1 u m i n e s c e n s t t 0 1 的基因组中，有两个同源 基因座，p h 4 0 9 3 p l u 4 0 9 2 和p l u 4 4 3 7 p l u 4 4 3 6 ，它们的表达产物对小菜蛾与尖音库 蚊的幼虫有很强的口服毒性。这一类基因座的表达产物，被命名为p h o t o r h a b d u s i n s e c tr e l a t e d ( p k ) a 署i b 。其中的p k b 蛋白被认为可能具有保幼激素酯酶( j h e ) 的活 性，可以干扰昆虫在发育过程中的形变。 本研究用p c r 方法从实验室保存的3 4 个昆虫病原线虫共生菌株中扩增到了 两f 。p i r b 基因。将这两个基因连接至i j p g e x 载体上，并在大肠杆菌中进行诱导表 达，得到了g s t 与p i r b 的融合蛋白。由于该融合蛋白以不溶的包涵体形式存在， 不具有p 抽蛋白的活性。所以对它进行了复性、提纯，并酶切掉了融合蛋白中的 g s t 接头得到了可溶的p k b 蛋白。用p k b 蛋白对三种鳞翅目昆虫棉铃虫、斜纹夜 蛾以及甜菜夜蛾的二龄幼虫进行了口服毒力测定，发现p i r b 蛋白对以上三种试虫 均没有毒性。这一结果说明p i r b 蛋白单独表达可能没有杀虫活性。但由于本次研 究中使用的生测试虫种类不足，因此这一结果还有待进一步证实。 关键词：昆虫病原线虫共生菌，p i r b 基因，g s t 融合蛋白 t i t l e ：c l o n m g a n d e x p r e s s i o n o fp i r bf r o mt h e s y m b i o t i cb a c t e r i a o f e n t o m o p a t h o g e n i cn e m a t o d e s m a j o r ：b i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l a rb i o l o g y n a m e ：c h e nt o n g s u p e r v i s o r ：p a n gy ip r o f e s s o r a b s t r a c t p h o t o r h a b d u sl u m i n e s c e n si st h es y m b i o t i cb a c t e r i ao ft h ee n t o m o p a t h o g e n i c n e m a t o d e ( e p n 、h e t e r o r h a b d i t i sb a c t e r i o p h o r a p 1 u m i n e s c e n st t 0 1g e n o m e c o n t a i n st w ol o c i ，p i n4 0 9 3 - p l u4 0 9 2a n dp i n4 4 3 7 - p l u4 4 3 6 ，w h i c he n c o d ep r o t e i n s w i t ho r a li n s e c t i c i d a la c t i v i t ya g a i n s tb o t hp l u t e l l ax y o s t e l l aa n dc u l e x p i p l e n sl a r v a e t h ep r o t e i n se n c o d e db yt h e s el o c iw e r en a m e dp h o t o r h a b d u si m e c tr e l a t e df p i t ) p r o t e i n sa a n db ，r e s p e c t i v e l y t h ea m i n oa c i ds e q u e n c eo fp i r bi ss i m i l a rt ot h e j u v e n i l eh o r m o n ee s t e r a s e i nt h ep r e s e n ts t u d y ，t w op i r bg e n e sw e r eo b t a i n e db yp e rf r o mt w os t r a i n so f e p ns y m b i o t i cb a c t e r i ai s o l a t e di o c a n y t h e yw e r el i g a s c dt op l a s m i dp g e x ，a n d t h e ne x p r e s s e di ne c o l ia s ( g s l ) f u s i o n p r o t e i n t h ee x p r e s s e dp r o t e i n se x i s t e da s i n c l u s i o nb o d ya n dw e r ei n s o l u b l e t h e yw e r er e n a t u r e d ，p u r i f i e d ，a n dt h e nt h eg s t w a sr e m o v e df r o mt h ef u s i o np r o t e i n s t h eo r a lt o x i c i t yo ft h er e s u l t e dp i r bt ot h e s e c o n d - i n s t a rl a r v a eo f h e l i c o v e r p aa r m i g e r a ，s p o d o p t e r ae x i g u aa n ds p o d o p t e r a l i t u r aw a st e s t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ep i r bh a v en oo r a lt o x i c i t yt oa l li n s e c t s t e s t e d ，i n d i c a t i n gt h a tp k ba l o n gm a yh a v en oi n s e c t i c i d a la c t i v i t y f u r t h e rs t u d yi s n e e d e dt oc o n f i r mt h i sc o n c l u s i o nb e c a u s eo n l yt h r e es p e c i e so fi n s e c tw e r et e s t e d k e y w o r d ：e n t o m o p a t h o g e n i cn e m a t o d e s ，s y m b i o t i cb a c t e r i a ，p i r b g e n e ，g s tf u s i o np r o t e i n 中山大学硕士学位论文陈榕 昆虫病原线虫共生蕾中p i r b 基因的克隆与表达 缩略词 a m pa m p i c f l l i n 氨苄青霉素 b pb a s e p a i r 碱基对 e c o l ie s c h e r i c h i ac o l i 大肠杆菌 i p t g i s o p r o p h y lt h i o - b d g a l a c t o s i d e 异丙基硫代- b d 半乳糖苷 k d ak i l o d a l t o n 千道尔顿 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 多聚酶链式反应 s d ss o d i u md o d e c y ls u l p a t e 十二烷基硫酸钠 s d s p a g e s d s - p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i ss d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 r p m r a t ep e rm i n u t e 每分钟转速 e d t ae t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 gg r a v i t y 离心力或g r a m 克 a a a m i n oa c i d 氨基酸 h h o u r 小时 m i l l m i n u t e 分钟 s e cs e c o n d 秒 m i n o 扎摩尔升 l l i t r e 升 d d h 2 0d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r 双蒸水 e b e t h i d i u mb r o m i d e 溴化乙锭 e p n e n t o m o p a t h o g e n i on e m a t o d e 昆虫病原线虫 g s t g l u t a t h i o n es t r a n s f e r a s e 谷胱甘肽转移酶 中山大学硕士学位论文陈榕 昆虫病原线虫共生蕾中p i r b 基因的克隆与寰选 翮舌 转基因抗虫植物是近年来生物技术发展所带来的一项有效的害虫防治新技 术。当前几乎所有成功地在转基因抗虫作物中转入的均为苏云金杆菌( b a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s ，b t ) 6 _ 内毒素基因。虽然6 内毒素有多种类型并对多种昆虫及其 它有害生物( 如植物病原线虫) 有较强的毒性，但已有多篇文献报道害虫对西 及转所基因抗虫作物产生了抗性。克隆新的杀虫毒素基因以开发新型抗虫植物， 有助于延缓害虫对转b t 基因抗虫作物的抗性压力，扩大转基因抗虫作物的抗虫 谱。 昆虫病原线虫共生菌是存在于昆虫病原线虫( e n t o m o p a t h o g e n i cn e m a t o d e s ， e p n s ) 肠道内与之互惠共生的细菌。这类细菌随其共生线虫进入昆虫体内后， 会在虫体内分泌杀虫毒素，在短时间内使昆虫致死。由于昆虫病原线虫共生菌杀 虫毒素具有高效、杀虫谱广的优点，已受到科学家的广泛关注。对这类杀虫毒素 的深入研究有助于将其基因转入植物，或者构建高效表达系统生产杀虫毒素直接 应用于害虫防治。 昆虫病原线虫共生菌p h o t o r h a b d u s 1 u m i n e s c e n st t 0 1 基因组全序列的测定 ( d a c h a ue t a l 2 0 0 3 ) ，使人们对昆虫病原线虫的基因组组织结构有了清楚的了 解，大大推动了其基因功能、蛋白结构、应用前景等方面的研究。其中的p l u 4 0 9 3 - p l u 4 0 9 2 基因座，因为其表达产物极高的杀虫活性引起了科学家们的注意。后来 这一基因座中的两个基因分别被命名为脚慵和b 。在d a c h a u e t a ( 2 0 0 3 ) 的研 究中，分别用完整的和缺失了p i r b 的p i r 基因座表达产物对小菜蛾以及尖音库蚊 的二龄幼虫进行了口服毒性测试。发现完整的表达产物具有很强的毒性，而缺失 了p i r b 的表达产物没有毒性。因此可以断定p i r b 对于p f r 表达产物的毒性是必 要的。 本文采用传统的基因克隆与表达方法对p i r b 基因表达产物的杀虫活性进行 了研究。结果发现其对棉铃虫、斜纹夜蛾以及甜夜蛾的二龄幼虫都没有口服毒性。 p i r b 蛋白可能没有杀虫活性。这个结论还有待于更多生铡实验结果的证实。 中山大学硕士学位论文陈榕 昆虫病原线虫共生菌中p i r b 基因的克隆与表达 第一章昆虫病原线虫共生菌杀虫毒素的研究进展 1 1 引言 昆虫病原线虫共生菌是存在于昆虫病原线虫( e n t o m o p a t h o g e n i cn e m a t o d e s , e p n s ) 肠道内的一类细菌，革兰氏染色阴性，属肠道杆菌科( e n t e r o b a c t e r i a c e a e ) ( t h o m a s p o i n a r1 9 7 9 ) 。现已描述的共生菌有两个属异杆菌属 ( x e n o r h a b d u s ) 和发光杆菌属( p h o t o r h a b d u s ) ，其中，x e n o r h a b d u s 与斯氏属 线虫( s t e i n e r n e m a ) 共生，p h o t o r h a b d u s 与异小杆属线虫( h e t e r o r h a b d i t i s ) 共 生( p o i n a r1 9 9 0 ) 。由于线虫一共生菌复合体具有杀虫能力强、杀虫谱广的优点， 已成为引人注目的新型生物杀虫剂( k a y a ，e t a l 1 9 9 3 ) 。共生菌与线虫的共生关 系可以概括为：共生菌存在于线虫的肠道内，线虫携带共生菌进入寄主昆虫体内， 并将共生菌释放到昆虫的血腔中；线虫保护共生菌不受寄主免疫反应的影响；共 生菌在昆虫血腔内繁殖，产生毒素和抑菌物质，导致昆虫患败血症，而在4 8h 内死亡：共生菌能分解营养物质，提供线虫繁殖发育所需的营养；同时共生菌产 生的抗菌素，能抑制其它杂菌的侵染，为线虫的生长、发育和繁殖提供理想的环 境( b o e m a r e ，e ta 1 1 9 9 6 ) 。图1 1 为两类共生菌的共生线虫生活史示意图 ( f f r e n c h - c o n s t a n t ，e ta 1 2 0 0 3 ) ： 图1 - 1 两类共生菌的共生线虫生活史 f i g 1 - 1l i f ec y c l e so fb a c t e r i u m - n e m a t o d e ss y m b i o s e s 2 中山大学硕士学位论文陈榕 昆虫病原线虫共生蕾中# i r b 基因的克矗与襄达 斯氏线虫和异小杆线虫的生活史及携带共生菌的形式明显不同，斯氏线虫在 寄主体内第一代是雌雄异体，其共生菌x e n o r h a b d u s 存在于线虫肠道内的一个特 殊囊状结构内( v e s i c i c s ) ：异小杆线虫在寄主体内第一代是雌雄同体，其共生 菌p h o t o r h a b d u s 则直接存在于线虫肠道内( b i r d ，e t 以1 9 8 8 ；p o i n a r1 9 9 0 ) 。 昆虫病原线虫对害虫有很强的致病力，其中起关键性作用的是共生菌( 蒲蛰 龙1 9 9 4 ) 。共生菌分泌产生的多种抗菌素，有很强的抑菌活性。这一切使得共 生菌的研究越来越为人们所重视。人们对共生菌的认识也远远超出了原有水平 _ 细菌与线虫的共生关系”；现在许多学者已认识到：昆虫病原线虫共生菌是 一种亟待开发的、既能杀虫又能防病的生物资源。 1 2 昆虫病原线虫共生菌 随着共生菌有益功能越来越多地被发现，对这些有益功能的开发日益受到科 学家的重视。基于国内对这类细菌研究基础薄弱的现实，首先对一些基本知识及 当前的研究热点介绍如下： 1 2 1 分类地位 昆虫病原线虫共生细菌属杆菌目、肠杆菌科( a k h u r s t1 9 8 3 a , 1 9 8 3 b ；a g u i l l e r a e ta l1 9 9 3 ) ，但它们是一特殊的肠杆菌科细菌，因为这些细菌呈硝酸还原酶阴性。 x e n o r h a b d u s 为过氧化氢酶阴性：p h o t o r h a b d u s 为过氧化氢酶阳性，而且能产生 荧光物质。在人的伤口处曾分离到p h o t o r h a b d u s ，但是经权威医院的临床观察， 发现从伤口处分离到的p h o t o r h a b d u s 在正常条件下对人没有致病性( f a r m e r ，e t a l 1 9 9 0 ；c o k p l c o t o 。e ta l1 9 8 9 ；g e r r a r d2 0 0 3 ) ：而且通过d n a - d n a 杂交实验表 明这些菌株明显不同于其它与昆虫病原线虫共生的p h o t o r h a b d u s 属细菌 ( a k h u r s t1 9 9 6 ) 。过去，曾经把共生菌的两个属并为一个属一娩埔口触u ( a k h u r s t1 9 8 3 a ，1 9 8 3 b ，1 9 8 8 ) ：直到1 9 9 3 年，b o c m a r e 根据d n a - d n a 杂交实验 结果及细菌生物学特性的不同，将共生菌分为两个属：和斯氏线虫共生的定为 x e n o r h a b d u s 属，和异小杆线虫共生的定为p h o t o r h a b d u s 属。其中，x e n o r h a b d u s 中已定名的有5 个种：丑n e m a t o p h i l u s 、置p o i n a r 矗、xb o v i e n i i 、盖b e d d i n g i i 、 zi a p o n i c u s 、x b u d a p e s t c n s i s 、x c h c r s f i 、x i n n e x i 和x s 玷t 缸雕i i i ；所有的 p h d f d ， 4 b d u s 归为个种珊d t n r 口6 d 嬲l u m i n e s c e n s 。a k h u r s t ( 1 9 9 0 ) 认为 3 中山大学硕士学位论文陈榕 昆虫病原线虫共生蕾中p i r b 基因的克陆与裹达 只l u m i n e s c e n s 是一个多种类群，可能包含4 - - 5 个种。最近p h o t o r h a b d u s 属被分 成3 个种( f i s c h e r l e ，甜a 1 1 9 9 9 ) ：只l u m i n e s c e n s 、p t e m p e r a t a 和只a s y m b i o t i c a ， 其中p _ l u m i n e s c e n s 又分成3 个亚种，分别是l u m i n e s c e n s 、a k h u r s t i i 和l a u m o n d i i 。 pa s y m b i o t i c a 分为两个亚种，p a s y m b i o t i c as u b s p a s y m b i o t i c a 和p a s y m b i o t i c a s u b s p a u s t r a l i s 。在肠杆菌科中，x e n o r h a b d u s 和p h o t o r h a b d u s 的建立历史较短， 对于昆虫病原线虫共生菌的分类仍需进行深入、系统的研究。 1 2 2 型变 型变( p h a s ev a r i a t i o n ) 是共生菌的一个重要特性。同种共生菌的不同变型代 谢途径的不同及型变对线虫产量和质量的影响，使得共生菌的型变成为近年来的 研究热点。昆虫病原线虫共生菌的型变最初被描述为两型现象，邵报据其在琼脂 培养基上产生两种形态的菌落，及它们吸收染料能力的不同，定为初生型和次生 型( a k h u r s t1 9 8 0 ) 。型变对于许多细菌而言，是一个常见的特征，如沙门氏菌 ( s a l m o n e l l as p p ) 、奈瑟氏菌( n e i s s e r i as p p ) 已发现此特征( s i l v e r m a n1 9 8 3 ) 。 细菌的型变是一个可逆的转变过程，通常发生在主要抗原如鞭毛蛋白的变化上， 此类抗原能使细菌免受寄主防御反应、避开噬菌体的侵染( r o b e r t s o n , e ta 1 1 9 9 4 ) 。而昆虫病原线虫共生菌的型变，不同于上述一般细菌，它的型变与免受 寄主防御反应及噬菌体的侵染无关( a k u r s t1 9 9 2 ，1 9 9 4 ) 。 关于共生菌的型变，过去曾有人认为是污染的结果，但通过两型共生菌d n a 图谱分析证明，两型菌具有1 0 0 的同源性( a k h u r s t ，e t a t 1 9 9 4 ) ，因此初生型 和次生型菌是相同的菌株，只是在培养过程中表现出不同的菌落形态特征和生理 生化特征而已。对于x e n o r h a b d u s 而言，这种型变是可逆的，即初生型菌可以转 变为次生型菌，次生型菌在一定条件下也可转变为初生型菌( a k h u r s t ，e t a 1 1 9 9 2 ) ；而对于p h o t o r h a b d u s 而言，次生型菌不能转变为初生型菌( h u r t b e r t ，e t a 1 1 9 8 9 ) 。 昆虫病原线虫共生菌的两型菌除了在菌落形态上有很大不同之外，它们之间 的生理生化( b o e m a r e ，耐a 1 1 9 8 8 ；g e r r i t s e n1 9 9 2 ) 、细胞表面的超级结构( b r e h e l i n 1 9 9 3 ) 特征也有明显区别。初生型菌具备的一些生理生化特性：如能吸收染料、 分泌蛋白酶和脂酶、产生胞内晶体蛋白、抑菌物质、色素及荧光素( 荧光素只对 4 中山大学硕士学位论文 陈榕 昆虫病原线虫共生蕾中p ，坩基因的克隆与衷达 p h o t o r h a b d u s 而言) ，次生型菌皆不具备或仅有少量的上述代谢物产生( b i c a i 【l e v ， 甜以1 9 8 8 ) 。初生、次生型菌的主要区别特征为：( 1 ) 菌落形态：在营养琼脂 ( n a ) 培养基上，初生型菌菌落透明、凸起，次生型菌菌落半透明、平坦；初生 型荫菌落直径比次生型菌菌落大( a k h u r s t1 9 8 0 ，1 9 9 0 ；b o e n l a r c ，t h a i c r1 9 9 7 ) ( 2 ) 运动性：初生型菌在n a t a 培养基上培养时表现出群游习性；次生型菌在 琼脂培养基本上没有运动能力( b o e m a r e ，e ta 1 1 9 9 0 ) ，这是因为次生型菌细胞 缺乏鞭毛蛋白的合成系统，因而不能形成鞭毛：a ( g i v a u d a n1 9 9 5 ) 。两型菌问运动性 的差异，表明这些共生菌对共生线虫的适应性方面存在着差异；也正是由于初生 型菌能形成鞭毛，次生型菌不能形成鞭毛，所以初生型菌能较次生型菌更好地占 领线虫肠道的特定部位，从而被线虫所携带。( 3 ) 吸收染料的能力：在n b t a 上，初生型菌能吸收培养基中的溴百里酚蓝，而使菌落变成蓝色；次生型菌则不 能吸收溴百里酚蓝，故菌落为红色( i k h u r s t1 9 9 0 ) 。( 4 ) 代谢产物：初生型菌 能产生蛋白酶、脂酶、磷酸脂酶、抗生素、胞内蛋白晶体等；次生型菌则不能产 生( b o e m a r e1 9 9 7 ) ，( 5 ) 粘着性：初生型菌对昆虫血细胞的粘着力很强，次 生型菌不能粘合血细) 抱( m o u r a u x1 9 9 5 ) 。( 6 ) 呼吸强度：初生型菌的呼吸酶活性较 弱，次生型菌的呼吸酶活性较强，所以初生型菌的呼吸强度比次生型菌的呼吸强 度弱( s m i g i e s k i1 9 9 4 ) 。( 7 ) 对营养物质的需求：初生型菌和次生型菌的生长 发育需要不同的营养因子，对维生素及氨基酸种类有不同的需求( b o e m a r c , e t a 1 1 9 9 0 ) 。从上述比较可以看出，共生菌的初生型和次生型萤在菌落型态及生理生 化特征等方面都有很大的差异，二者存在着不同类型的代谢途径。 侵染期线虫只携带初生型菌，次生型菌则出现在初生型菌的体外培养物中。 二者在生理生化方面有明显的区别，初生型菌能为线虫提供更好的生长、发育、 繁殖条件。线虫和初生型菌一起培养时，其产量明显高于与次生型菌一起培养时 的产量( a k h u r s t ，e t a l 1 9 9 0 ) 。而且，当初生型菌和次生型菌共同和线虫培养时， 只有初生型菌能被线虫携带。造成这些明显差异的可能原因是：( 1 ) 次生型菌 不能象初生型菌那样产生许多酶类，如蛋白酶、脂酶、磷酸酶等，因而不能很好 地分解培养基，不能为线虫提供充分的营养； ( 2 ) 许多次生型菌产生的抗生素 量很少，从而在线虫生长发育过程中，不能象初生型菌那样抑制其它微生物的生 长：( 3 ) 次生型菌细胞缺乏鞭毛蛋白的合成系统，不能形成鞭毛，而初生型菌 5 中山大学硕士学位论文陈榕 昆虫病原线虫共生蕾中p ，r 污基因的克隆与衰达 能形成鞭毛，这样初生型菌能更好地占据线虫肠道的特定空间，从而能被线虫携 带。由此可看出，在生长过程中，尽量防止共生菌的型态变异，将有助于提高昆 虫病原线虫的产量和质量。 s m i g i c l s k i ( 1 9 9 4 ) 研究发现：经过一段时间的饥饿后，次生型菌在补充营 养后2 4h 内开始恢复生长，而初生型菌在1 4h 以后才开始生长，由此可见， 次生型菌比初生型菌能更为有效地吸收利用营养物质，这也就使得次生型菌在昆 虫体外环境中，有更大的能力同其它微生物竞争。实验表明：初生型菌能更好地 适应昆虫体内环境，也许这样能更好地分解昆虫体内的营养物质，从而为线虫所 利用；次生型菌则更适应于体外的其它环境。 研究表明，环境压力的胁迫作用能诱导细菌的型变。在培养基中没有n a c l 的情况下，发光杆菌能产生型变( k r a s o m i l - o s t e f f e l d ，e t 以1 9 9 4 ) ；将两个属的 共生菌在厌氧微生物的发酵罐中培养也能产生型变。这些实验虽不能阐明型变的 机制，但由此可以推断：共生菌的型变是对环境压力的一种适应性反应。 共生菌型变的产生及其产生的机制一直是科学家的兴趣所在。在研究型变的 初期，有些学者认为型变产生的原因可能是丢失了一种噬菌体或质粒，但是实验 研究证明，这种假设不成立：x e n o r h a b d u s 的次生型菌能转交为初生型菌；而且 两种变型之间质粒没有差异( l e c l e r c , e ta 1 1 9 9 1 ) ；只l u m i n e s c e n s 的两种变型 均有发光基因也“基因( w a n g , e ta 1 1 9 9 1 ) ，而且脂酶的合成调控是在翻译 后水平上迸行的( w a n g , e ta 1 1 9 9 3 ) ，这些均表明两型菌在转化中未丢失遗传 物质。有些学者认为，型变的产生可能是由于一些主要d n a 重组造成的。但是， a k h u r s t ( 1 9 9 2 ) 等通过x e n o r h a b d u s 的两种变型的r f l p 分析，发现次生型菌中 并没有d n a 重组现象的发生。j o y c ee t 以( 2 0 0 3 ) 最新的研究发现，p t e m p e r a t a k 1 2 2 中的h e x a 基因对维持该菌株的次生型状态发挥重要作用。对p t e m p e r a t a k 1 2 2 次生型h e x a 基因插入突变后，许多初生型菌的生理特征如产生抗生素、胞 外酶、荧光素又重新恢复，说明该基因在共生菌型变中发挥着重要作用。 型变一直是共生菌研究的一个热点，但型变产生的机制仍不明了。揭示其中 的奥秘，能进一步阐明线虫和共生菌的互惠共生关系，对线虫的商品化生产具有 重要的指导意义。 6 中山大学硕士学位论文阵榕昆虫病原线虫共生蕾中p l r b 基因的克麓与裹达 1 2 3 专一性 共生菌与线虫间存在某种程度的专一性。在自然条件下，一种线虫只能与一 种共生菌共生( a l d a u s t1 9 8 2 ，1 9 8 3 a ：a k h u r s t1 9 9 0 ) 。然而一种共生菌可与几种 线虫共生，例如共生菌x b o v i e n i i 可与s f e l t i a e 、s k r a u s s e i 、s a f f i n i s 、s i n t e r m e d i a 等几种线虫共生。所有斯氏线虫均与x e n o r h a b d u s 共生；所有异小杆线虫均与 p h o t o r h a b d u s 共生。共生菌与线虫的共生关系如表1 2 所示。 表1 - 1 部分昆虫病原线虫共生菌种类及其相关寄主线虫 t a b l e1 - 1s y m b i o t i cr c t a t i o n s h i p sb e t w e e nb a c t e r i as p e c i e sa n de p n s b a c t e r i as p e c i e s e p n s 工n e m a t o p h i l u s 丑j a p o n i c u s 丑b o v i e n i i s t e i n e r n e m ac a r p o c a p s a e k u s h i d a i s f e l t i a e ( = b i b i o n 训 & k r a u s s e i s a 历n i s s 访t e r m e d i a & c u b a n u r a s g l a s e r i p 1 u m i n e s c e n ss u b s pa k h u r s t i i h i n d i c a p 1 u m i n e s c e n ss u b s pl a u m o n d i i h b a c t e r i o p h o r ag r o u ph p 8 8 7 中山大学硕士学位论文陈榕 昆虫病原线虫共生菌中p i r b 基因的克隆与表达 线虫与共生菌专一性表现在两个方面：共生菌对线虫基本营养的提供和侵染 期线虫携带共生菌的能力。在共生菌对线虫基本营养方面只体现出一定程度的专 一性。在斯氏线虫和异小杆线虫中，没有一种线虫可以与自身共生的共生菌以外 的所有共生菌起进行单菌培养( a k h u r s t1 9 8 3 a ) 。虽然舟h 缸e 可以同5 种 其它斯氏线虫的共生菌成功地进行单体培养，但是该线虫不能在只有 p h o t o r h a b d u s 的培养基中生长：另外，对于某些种类的线虫而言，其所需的最佳 营养也不是由它的天然共生菌提供的。例如在富脂的培养基上，sg l a s e r i i 与x b o v i e n i i 培养时，比与xn e m a t o p h i l u s 及自身的共生菌培养时繁殖速度更快 ( d u n p h y ，e ta l1 9 8 8 ) 。目前，关于共生菌为其共生线虫提供的基本营养种类尚 不清楚；但有点是可以肯定的，在无菌环境下，线虫不能生长或繁殖量很低。 侵染期线虫对其肠道内共生菌的携带、保持具有高度的专一性。尽管某些斯氏线 虫能与非昆虫病原线虫共生菌的细菌在体外繁殖，但线虫并不将这些细菌留在肠 道内，而且对其它斯氏线虫共生菌的保持力也是十分有限的( a k h u r s t1 9 8 3 a ) 。 由此可见线虫有很强的选择其天然共生菌的能力，它只将天然共生菌保留在肠道 内。这一专一性在& c a r p o c a s a e x n e m a t o p h i l u s 之间体现得尤为明显，在 c a r p o c a p s a e 侵染期线虫体内不存在其它任何线虫的共生菌( d u n p h y ，e t a l 1 9 8 8 ) 。 1 2 4 致病性 侵染期线虫携带共生菌进入寄主体腔，一般在侵入后5h 就可在寄主昆虫的 血腔内测到释放出共生菌，而这些共生菌通常会使昆虫在4 8h 内死l = ( a k h u r s t d u n p h y1 9 9 3 ) a 多数昆虫病原线虫共生菌被引入寄主血腔后都有很强的致病力。但由于不同 昆虫对线虫的抵御反应和能力不同，共生菌对不同昆虫的致病力也存在差异 ( a k h u r s t1 9 8 6 ) 。但总起来可以认为，昆虫病原线虫共生菌对昆虫有极强的致病 力，因为将共生菌注射到大蜡螟体内，一般l d s o 为1 5 个细胞( a k h u r s t1 9 8 0 ) 。 昆虫病原线虫共生细菌的致病性主要集中在以下几个方面：共生菌对昆虫的防御 机制所做出的免疫反应；共生菌产生的对昆虫有杀伤作用的内毒素和外毒紊及一 些胞外酶等。 8 中山大学硕士学位论文陈榕 昆虫病原线虫共生中p i r b 基因的克隆与襄达 1 2 5 共生菌的免疫反应 除了突破寄主的结构障碍，有效的昆虫病原物必须能抵制寄主的防御反应。 对于一般昆虫病原物而言，主要有以下几种对策：忍受寄主的防御反应：避免寄 主的免疫系统的识别和反应；破坏或抑制寄主免疫系统对异物的识别和防御。昆 虫被线虫侵染后，能进行细胞抵御，其血细胞产生吞噬作用及包被作用；另外昆 虫还可以进行体液防御，即产生一些杀菌蛋白、杀菌肽及各种酶( g i l l e s p i e1 9 9 0 来抵御线虫共生菌的侵染( t r e n c z e c1 9 9 8 ) 。针对寄主昆虫这些不同的防御 机制，共生菌会产生不同的免疫反应，归纳起来有以下几类：( 1 ) 共生菌能忍 受和破坏寄主的体液包被。虽然最初共生菌被昆虫的血细胞包被，但随后共生菌 使血细胞丧失活性，从而能继续在昆虫的血腔中迅速繁殖( d u n p h y ，日a 1 1 9 8 5 ； b r e h e l i n 。e t a l 1 9 9 0 ) 。( 2 ) 共生菌能避开寄主免疫系统的识别和防御。有些共 生菌侵入寄主昆虫体内，既没有血细胞对共生菌的包被和溶解，也没有凝集块的 形成( b r e h e l i n1 9 9 0 ) 。( 3 ) 共生菌能抑制寄主酚氧化酶的活性，从而阻止了 寄主血细胞的黑化过程，细菌细胞壁的组分脂多糖( l p s ) 能起到这一作用 ( d u n p h y , e t a l1 9 8 8 ) 。( 4 ) 阻止或抑制寄主昆虫杀菌肽的产生。昆虫被线虫 共生菌侵染后，能产生杀菌肽，以抵御线虫共生菌的侵入。线虫能产生一种 诱导酶抑制因子，这种抑制因子有保护共生菌的作用( g o t z1 9 8 1 ) 。& c a r p o c a p s a e d d 1 3 6 品系能产生一种丝氨酸蛋白酶，该酶能破坏昆虫分泌的杀菌肽( a k h u r s t 1 9 9 3 ) 。( 5 ) 共生菌能抵御寄主昆虫分泌的溶菌酶、蛋白酶、脂酶等酶类，这 些酶促使昆虫血细胞粘附在共生菌的周围，溶解和破坏细菌，然后共生菌能破坏 这一作用而迅速繁殖( d u n p h y w e b s e r1 9 9 1 ) 。 共生菌的外膜特性和其免疫反应有关。d u n p h y ( 1 9 9 4 ) 报道：通过化学诱 变的方法得到的zn e m a t o p h i l u s 菌株，对大蜡螟的致病性降低。研究发现，突变 株的细胞外膜特性发生了很大的变化，如疏水性增强，u s 含量增多，表面阳离 子电荷减少及外膜蛋白( o m p ) 含量降低等。另外。研究发现，改变野生型的 细胞外膜特性，也能降低其对寄主昆虫的致病性。而对于p h o t o r h a b d u s 而言， 通过化学诱变产生的突变株，其细胞的外膜特性也发生了很大的变化，它的疏水 性增强，血细胞的粘着力增强，外膜蛋白含量减少。l p s 含量增加，从而使突变 株同野生型相比杀虫活力增强( d u n p h y1 9 9 5 ) 。由此可见，p h o t o r h a b d u s 细胞 9 中山大学硕士学位论文陈榕 昆虫病原线虫共生菌中p i r b 基因的克隆与裹达 外膜在共生菌免疫机制中的作用可能不同于砌d 抽4 m 淞。从对以上两个属共生 菌的研究结果可以看出，共生菌的细胞外膜与抵御昆虫免疫反应有关，二者问的 关系有待于进一步研究，外膜蛋白的研究将有助于揭示其中的奥秘。 1 2 6 线虫及其共生菌的安全性 利用线虫防治害虫，一般采用的方法是在害虫的生境中释放大量的侵染期线 虫，因而必须考虑线虫及其共生菌对高等动物及人的安全性问题。 p o i n a re ta l ( 1 9 8 2 ) 首次报道了昆虫病原线虫共生菌对温血脊椎动物的影响。 他们以鸡和小白鼠作为供试动物，采用皮下注射的方法，以活的共生菌细胞感染， 结果试验动物无任何病状表现，由此证明共生菌对鸡和小白鼠均无致病作用。 o b e n d o r f e t a l ( 1 9 8 3 ) 将共生菌显b o v i e n i i 通过口服、皮下注射、呼吸道及皮肤 接触，对家兔、猪、小白鼠进行安全性检测，没有发现这种共生菌对被检测的动 物有侵染性、致病性和毒性。其它几种共生菌的菌株通过皮下注射、皮肤接触的 方式在小白鼠身上进行检测，也未发现发生任何不良反应( k e r m a e c ，e t a l1 9 9 1 ) 。 在田问进行的安全性检测，结果表明线虫对植物、蚯蚓、蜗牛均没有毒害 ( c a p i n e r a ，e t a l 1 9 8 2 ：b o e m a r e1 9 9 6 ；b a t h o n1 9 9 6 ) 。只是在特别高的使用浓 度时，线虫能侵染蜘蛛、长足蚊、伪蝎( p o i n a r ，e ta 1 1 9 8 5 ) 。 在国内，王进贤等( 1 9 8 3 a ，1 9 8 3 b ) 进行格氏线虫( g l a s e r i ) 对小白鼠、 家兔的安全性测试，结果显示经口服、腹腔注射后，家兔和小自鼠的行为、取食 等方面均无异常现象，全部实验动物均未发病或死亡，线虫进入动物体内不久便 死亡，且被动物体消化后排出体外。用格氏线虫对与人相近的高等动物_ 弥猴 进行安全性试验，结果发现线虫经口服进入猕猴消化道后，不能在其中存活，线 虫死亡并在短期内随粪便排出体外( 王进贤1 9 8 4 ) 。 根据上述国内外试验结果，可以认为线虫一共生菌复合体对环境和人畜是安 全的。由于线虫对寄主昆虫的主动搜索能力，目前，这种生物组合已广泛应用予 防治各种隐蔽性钻蛀害虫和地下害虫( g a u g l e r , e ta 1 1 9 9 0 ) 。 1 3 共生菌产生的毒素及毒素基因 1 0 中山大学硕士学位论文陈榕 昆虫病原线虫共生菌中p i r b 基因的克隆与表达 转基因抗虫植物是生物技术发展带来的一项有效的害虫防治技术。1 9 9 8 年， 全世界已有9 个国家种植转基因抗虫作物，m 抗虫玉米种植面积达1 4 5 0 万h m 2 ， b t 抗虫棉种植面积达2 5 0 h m 2 。我国从1 9 9 8 年开始种植m 抗虫棉，当年种植面积 约3 0h m 2 。1 9 9 9 年华北地区矾抗虫棉的种植面积己达总种植面积的5 0 以上( 刘 艳珍1 9 9 9 ) ，预计b t 抗虫玉米也将大面积种植。转基因抗虫作物已取得了巨大的 经济效益和社会效益。当前几乎所有的转基因抗虫作物转入的均为苏云金杆菌 ( b a c i l l u st h u r i n g g i e n s i s ，b t ) 6 - 内毒素基因。虽然& 内毒素有多种类型并对多 种昆虫及其它有害生物( 如植物病原线虫) 有较强的毒性( s c h n e p f , e t a 1 9 9 8 ) ， 但已有多篇文献报道害虫对默及转b t 基因抗虫作物产生的抗性( m c g a u g h e y 1 9 8 5 ，1 9 9 8 ) 。因此寻找b t 替代毒素已经成为一项重要的工作。对昆虫病原线虫 共生菌杀虫毒素及其它杀虫活性物质的深入研究将有助于将其基因转入植物，或 者构建高效表达系统直接应用于生产。 1 3 1t c ( t o x i c - c o m p l e x ) 毒素 许多昆虫病原线虫共生菌发酵液离心后所得上清液都具有较高的杀虫活性 ( b o w e n1 9 9 8 ；g u o1 9 9 8 ) 。目前对从p 1 u m i n e s e n sw 1 4 品系中分离的高分子量 蛋白毒素已有了较为深入的研究。 g u oe ta i ( 1 9 9 8 ) 从p 1 i m i n e s c e n sw 1 4 的发酵液中分离出了分子量在7 0 0 9 0 0 k d a 之间的杀虫活性物质。这种杀虫活性物质经过高温或蛋白酶k 处理后， 杀虫活力会降低或消失，说明该杀虫活性物质是一种蛋白质。 b o w e ne ta 1 ( 1 9 9 8 a ，t 9 9 8 b ) 先用超滤及d e a e 离子交换层析的方法对p 1 u m i n e s e n sw 1 4 发酵液粗提，然后用h p l c 的方法对粗提物纯化，得到4 种毒素 蛋白( t o x l nc o m p l e x , t o ) f 分别称为t c a ，t c b ，t c c ，t e d ) ，s d s p a g e 表明 每种t c 又由多个多肽组成之后分别用各成分饲喂烟草天蛾m a n d u c as e x t a 的 初孵幼虫，各成分之间具有显著的杀虫活性差异，其中t e a ，t