（生物化学与分子生物学专业论文）虎纹镇痛肽i（hwapi）的镇痛活性及毒性研究.pdf

中文摘要中文摘要虎纹镇痛肽一i ( i i w a p i ) 是一种从虎纹捕鸟蛛( l e e l e n o c o s m i ah u 孵刀a ) 中分离得到的一种n - 型钙离子通道阻断剂。在期前镇痛活性研究的基础上，本实验对其镇痛活性和毒性作用做了进一步研究，其内容如下：一一、虎纹镇痛肽- i ( h w a p i ) 在不同给药途径中镇痛活性研究。本实验采用福尔马林致炎疼痛模型，分别用硬膜外5 0ug k g ，肌肉注射2 0 0 “g k g 和灌胃2 m g k g 三种给药途径，所作时一效曲线图，表明5 0ug k g 硬膜外给药镇痛效果明显优于另外两种途径。二、虎纹镇痛肽一i ( - i w a p - i ) 在蜜蜂毒致炎模型中的镇痛活性研究。本实验采用光辐射热测痛方法，蜜蜂毒致炎模型是一种不同于福尔马林模型的新型疼痛模型。用生理盐水做阴性对照，发现从1 0ug k g h w a p i 即有明显的镇痛活性( p 0 0 5 ) 。对血液中各种酶，蛋白质，胆固醇，总胆红素，非蛋白氮含量均无统计学意义的改变( p 0 。0 5 ) 。对心，肝，脾，肺，肾，大脑，睾丸，子宫，卵巢，胸骨均不引起器质性病理改变。综上所述，与生理盐水组对照，i i w a p - i 高，中，低剂量长期八周、十二周长期( 3 0 一4 4 次) 硬膜外给药对大鼠无明显毒性作用。关键词：虎纹镇痛肤i ( h w a p - i )硬脊膜外腔蜜蜂毒脚掌致炎蛛网膜下腔痛阈痛敏急性毒性慢性毒性a b sf i u c t +a b s t r a c tt h eh u w e n aa f l a lg e s i ap e p t i d e i ( t t w a p i ) isan e u r o t o x i cp e p t i d ew i t ht h ea n a l g e s i ca c t iv i t yis o l a t e df r o mt h ec r u d ev e f l o mo fc h in e s eb ir ds p i d e rs c 1 e n 3 c o s m ah u w e n a h w a p iisan - t y p ec a l c il l mi 0 1 1c h a n n e lb l o c k er ，w h ic hc a l le f f e c tt h er e l e a s eo fn e u r o tr a n s m i t t e rf r o mt h en e r v ee n d i n go fc h o l i n e r g i ca n dt h ea d r e n e r g i cs y n a p s e 1 t h es t u d i e so fa i l a i g e s i ca c t i v i t yo fh w a p - ig i v e nt h r o u g ht h r e ed i f f e r e n ta d n l i n is tr a t i o nm e t h o d si nc o n s c i o u sr a tsb vs n b c u t a n e o u si n j e c t i o no ff o r m a l i ni n t os n r f a c eo fh i n d p a w t h er e s u l tsi n d i c a t e de p i d n r a ls p a c ea d m in is t r a t i o i list h eb e s tw a yf o rh w a p it og i v ea n a l g e s i ce f f e c t t h eo t h e rt w oa d m i n is tr a t i 0 1 1m e t h o d sa t ep r o v e dt oh a v el e s sa n a l g e s i ce f f e c t 2 t h es t u d i e so fa - n a i g e s i aa c t i v i t yo fh w a p ii nr a t sb vs u b c u t a n e o u si n j e c ti 0 1 1o fb e ev e n o mi n t os u r f a c eo fh i n d p a w t h er e s u l tsi n d i c a t e dt h a tt i l eh y p e r a l g e s i ac a u s e db yb e ev e f l o mi n j e c ti o nw e r ea l1 e v i a t e db yh w a p if r o mt h ed o s eo f10hg k g ，2 5ug k g ，5 0 “g k gt o7 5 “g k gc o m p a r e dt on a t u r es a l i n ea n dt h e1 a t e n c yo ft h e r m a ls t i m u l u si ni n j e c t i o na r e aw a ss i g n i f ic a n t l yi n c r e a s e d ( p o 0 5 ) t h ed o s e e f f e c te l l r v ef i g u r si n d i c a t e dt h a tg d s 0o fa n a l g e s i ce f f e c to fh w a p 1w asa p p r o x i m a t e l y3 0ug k gi nt h er a tso fs n b c u t a n e o u sb e ev e n o mi n t os u r f a c e1 1 i n d p a w 3 t oi n v e s t i g a t et h ea c u t et o x i c it yo ft t w a p ig i v e nb yi n tr a t h e c a li n j e c t i o n ( j t ) 、as e r i a ld o s e so fh w a p 1w a sg i v e l l nc o hs c i o l lsr a t s t h el d s oo fi i w a p iisa p p r o x i m a e i 矿1垒型坠盟一14 8 “g k g ( i t ) t t a t u r es a li l l eh a db e e nu s e da sc o n t r o lg r o u p a tt h es a m eti ( 1 1 e 、t h es a l l l et estst n e r ed o n et os n x ii ia n dt h er e s u l tsi n d i c a t e dt h a tl d 5oo fs n x i i i ( i t ) isa p p r o x i m ar e l y2 0 0ug k g t h er e s u l tsi n d i c a t e dt h a ts l l x 1 1 1w i11b es a f e rt h a nh w a p - ii 1 1t h ec l i n i c 4 t oi r i v e 8 t ig a t et h ec h r o n i ct o x i c i t yo fi n a p ig i v e i lt h r o u g he p i d u r a ls p a c e ，t h er a tsw er eg i v e i lt l w a p if o rt h r e em o n t h so rt w om o i l t h s0 t h e rd a ya td i f f e r e n td o s e s i t s10 0 “g k g ，5 0 g k g 2 5i - tg k gr e $ p e c t i v e l y t l a l fo ft h er a tsw e r ek i l l e dt od ob l o o de x a m p l ea t l l a l y s isa n dp a t h 0 1 0 9 i c a lt e s tsa f t e rg i v e ni n a p if o rt 1 1 r e e1 1 1 0 l l t l l sa n dt h ea n o t l l e rh a l fo fr a tsw e r ek i11 e da f t e fg i v e i li t v a p if o rt w om o r t t h sa n ds t o p p e dg i v i n gh w a p if o ra n o t h e r1 4d a y s a 1lt h er e s l 1 1tsi l a d i c a t e dt h a ta 11k i r i d so ft iss u e sa n do r g a nsi 1 3r a tsg i v e l li i w a p if o rt h r e em o n t h sh a v e1 1 0e v i d e n tt o x ic it ye f f e c t k e yw o r ds ： t u c e n aa r i a l g e s i cp e p t i d e i ( i w a p i ) e p i d u r a ls p a c es u b c t l t a n e 0 1 1 sb e ev e n o l i ii 1 1 j e c ti o nh y p e r a l g e s i al a t e n c yo ft h e r n l f l 1s t i l l l i 1 1 i i sf l , c i i t et o x i c i t yi n tr a t h e c a li f l j e c t i o n ( i t )c h r o n i ct o x i c it y4第一章前言与综述1 1 疼痛概述疼痛是许多疾病的常见症状，可因机械、热，电及化学物质刺激机体组织，造成损伤，释放出致痛物质如舒缓激肽、5 一羟色胺或组织胺等，由传入神经末梢，经过脊髓、丘脑传到大脑皮层及边缘系统，从而产生痛反应。人体对疼痛刺激的反应不仅表现为痛的感觉，而且常常引起失眠或其他生理功能的紊乱，如恐惧、紧张、焦虑不安、肢体回缩等，剧烈的疼痛甚至可导致体克。镇痛药不仅能选择性地减轻或缓解疼痛感觉，又使因剧烈疼痛而引起的恐惧、紧张、焦虑不安等不愉快的情绪得到缓解。镇痛药物可分为阿片类镇痛药和解热镇痛药两类。阿片类镇痛药包括吗啡及其衍生物和与之有关的化学合成品，目前所有强效镇痛药基本上都属于此类。这些药物对于皮肤，粘膜等外表组织的疼痛，起因于肌肉、骨膜和关节等深部组织的疼痛都有效，对于腹腔内脏由于鼓胀引起的疼痛也能解除。该类药物中的天然药物和人工合成品表现有基本相似的作用机制，正由于这一共同的作用机制，它们都能特效的为纳络酮( n a l o x o n e ) 所对抗。解热镇痛药或抗炎镇痛药如阿司匹林、非那西丁、氨基比林及其衍生物，如保泰松，这些药物作为镇痛药应用不仅比前一类效力较弱，他们的作用更有选择性。解热镇痛药不能解除表皮皮肤的疼痛，不能提高针刺与灼热的痛阂，对于内脏的疼痛也无效，这类药物主要对于起源于肌肉，关节的疼痛，由于血管扩张产生的头痛以及发生于神经干的疼痛都能生效，特别对于发炎组织引起的胀痛有效。1 2 镇痛新药的研制开发镇痛药，需要发掘潜在的新作用机制，这就需要弄清楚疼痛信息的传递和处理。如前所述，在过去的四十年，有几个主要工作和发现，影响着疼痛研究的潮流。六十年代的最重要的工作是m e l z a c k和? a 1 1 的闸门控制学说，给皮神经电刺激是这一学说对疼痛治疗的一第一章静亩与缘逮个贡献。七十年代的重要发现是内源性吗啡样物质和内源性镇痛系统。八十年代的重要工作是疼痛系统的神经可塑性变化，尤其是中枢敏感化( c e n tr a 【s e n s i t i z a t i o n ) ，这一工作提出预防性用药( p r e e m p t i v e )的概念。而九十年代已接近尾声，但是哪些工作是疼痛研究中心最重要的，似乎还不明确，可以说分子生物学的广泛应用是九十年代的一个标志。受各时期的潮流的影响不同，疼痛研究的侧重点也不同，但镇痛药研究的基本思路不外乎有以下三点：1 选择一个或几个疼痛指标，观察各种处理措施对这些指标的影响。许多实验室里常用的指标是大鼠甩尾和家兔甩关的潜伏期，这些研究实际上是观察对基础痛闽的影响。如果先诱发炎症，炎症部位的痛闽降低，这称为炎性痛敏( h y p e r al g e si a ) ，这时观察的是对痛敏的影响。伤害性刺激能在脊髓背角以及脑内不同部位诱发放电，药物对痛诱发放电的影响也可以作为是一个观察指标。六十年代中期，i ，m e n d e l l 和p d w a l l 发现持续刺激c 一纤维，后一刺激比前一刺激引起更多的( 背角神经元) 放电，他们称这一现象为w i n d - u p ，作为观察药物的一个指标。八十年代中期开始，中枢敏感化成为一个重要观察指标，英国c j w o l f 和p d w a ll 最县开始这方面的研究”1 。所谓中枢敏感化指的是伤害性刺激不仅引起疼痛，还能使中枢兴奋性提高，同样的刺激会引起更严重的疼痛，非伤害性剌激也有可能引起疼痛2 寻找与疼痛信息传递和处理有关的物质。具体说来，目前较清楚的是c 纤维和 5 纤维与伤害性信息传递和处理有关。如果某一递质、神经肤、受体、离子通道、细胞内信息传导物质或基因转录因子只存在于这些细胞，显然可以作为发展镇痛药的目标。例如p 物质只存在于c纤维，降钙素基因相关肽( c g r p ) 存在于c 纤维和a6 纤维o 。这就不难理解为什么许多研究以p 物质和c g r p 为目标。1 克隆基因。在这里主要指用差别显示( o i f f e r e n t i a id is p l a y )技术寻找炎症或损伤条件下表达的基因。这三个途径中至关重要的是第一个，二、三途径只能提供侯选药第一章饼占与综进物。是否属于镇痛药须由第一途径来决定，日前3 - - 作做的较多或认为希望很大的有以下几个：1 n k i 受体阻断剂：p 物质”1 属于速激肽，同类还有神经激肽a 和b 。p 物质主要n k i 受体。n k i 受体能阻断中枢敏感化和w i n d l l p 及福尔马林实验晚期反应，但临床实验未显示镇痛作用。2 c g r p 受体阻断剂：目前仅有肽类拮抗剂c g r p 8 - 3 7 ，c g r p 受体似乎有数种亚型，因为没有良好的阻断剂，所以尚没有很多令人信服的资料。发展新镇痛药和纯基础研究不同，除具有镇痛作用外，还需要尽可能少的影响其他系统。c g r p 具有血管舒张作用“1 ，如果具有镇痛作用的c g r f 拮抗剂也对抗舒血管作用，就有可能引起严重的心血管反应( 如高血压和心绞痛) 。这是用c g r p 作为镇痛新药目标的忧虑。如果疼痛和心血管作用由不同亚型介导，则这一问题可以解决。3 缓激肽：该肽作为炎性介质早已熟知，具有重要的舒血管作用。近来发现缓激肽受体有两种亚型b 1 和b 2 。b 2 为构成性，介导其舒血管作用和非炎症时的功能。b l 为诱发性表达，介导其炎症时功能。b 1拈抗剂用于炎性痛，可以避免心血管副作用。4 n 一甲基一d 一门冬氨酸( n m o a ) 受体”：金身麻醉药氯胺酮为n n d a 受体阻断荆，但用小剂量( 不影响意识) 时无明显镇痛作用。n m d a 受体阻断剂能阻断中枢敏感化和w i n d u p ，也有报道能抑制痛诱发放电，提高炎症部位痛闽。但所用剂量一般均引起动物行为和运动异常，很难说是真正的镇痛作用。n m d a 受体有许多亚型，其中n r 2 b 受体亚型主要存在于c 纤维和a6 纤维( 脑内和脊髓其他部门也存在) ，有希望作为选择性较好的侯选药。5 代谢性谷氨酸受体：因工具药不多，资料有限，已知其能阻断中枢敏感化和w in d - u p ”1 。6 辣椒素( c a p s a i c i l l ) 受体”1 ：辣椒索在新生鼠能杀死绝大多数c纤维及其背根神经节脑体，在成年鼠能阻断c 纤维传导。电生理资料表明辣椒素“日b t “- , 奋c 纤维和a6 纤维。辣椒素的作用分两期，第一期苎二主苎重兰堡兰是兴奋c 和a6 纤维引起疼痛，第二期作用是使这些纤维失敏。s a n d o z医学研究所的l j r a n g 认为有可能分离这两相作用，从而发展一种新型镇痛药。他们已经合成了几种化合物，在动物实验具有良好的镇痛作用，据称巳开始了早期临床实验。最近辣椒素受体已被克隆，据分析还有其他亚型存在。已克隆的受体不能全部解释辣椒素的药理作用和受体结合位点分布。7 离子通道：英国伦敦大学的j w o o d 实验室克隆了河豚毒素不敏感的钠离子通道( t t x l e sit a n ts o d i u mc h a n m e l ) 这种钠通道主要存在于c 纤维，因此很可能和痛觉信息传递有关。同样受重视的是钙通道阻断剂，其中认为有希望的是n 和p q 型钙通道。芋螺毒素s n x i i i( 亦命名为( t ) 一c o n o t o x i n m v i i a ) 是是一种钙通道阻断剂”“”，是美国n e u r e x 公司目前正在研制的镇痛新药，已通过三期临床试验，进入f d a 审批阶段。8 嘌呤能受体：j w o o d 实验室克隆了一种c 纤维( 更确切的说是小纤维) 特异的嘌呤能受体。因为c 纤维- 9 伤害性信息传递的密切关系，所以人们认为这一受体是潜在的镇痛药开发目标。9 细胞因子和生长因子：这方面工作目前很多，神经生长因子( n g f )是其中一个代表。在发育过程中，大多数c 纤维和h5 纤维细胞需要有n g f 存在。在成年动物，p 物质和c g r p 的合成似乎仍需要有n g f 存在，给动物注射n g f 引起痛敏，注射n g f 抗体能减轻炎症痛，有些药物公司把抗n g f 药物作为镇痛药开发。1 0 前列腺素受体：非类固醇类抗炎药通过以致前列腺素合成而镇痛，前列腺素受体阻断剂应该起同样作用。如果弄清楚哪一种亚型介导痛觉信息传递和处理，则阻断这一亚型不但能镇痛，而且能避免非类固醇类抗炎药的许多副作用。这也是各药物公司研究的方向之一。苎二童堕重量竺笙1 1 乙酰胆碱受体：m 受体和n 受体激动荆都有一定的镇痛作用，但因乙酰胆碱受体分布广泛，一般认为开发无副作用或很少副作用的镇痛药希望不大。近来，s c i e n c e 上报道了a b b o t tl a b o r a t o r i e s 的化合物a b t 一5 9 4 具有很强的镇痛作用，人们对n 型激动剂的兴趣又重新燃起。a b t 一5 9 4 是e p i b a t i d i n e 的类似物。e p i b a t i d i n e 是从厄瓜多尔一种蛙的皮肤上提取的化合物，最初报道具有很强的镇痛作用。但很快就发现e p i b a t i d i n e 毒性很极大，镇痛剂量接近致死量。e p i b a t i d i n e 和a b t 一5 9 4 为n 一受体激动剂，据称a b t 一5 9 4 毒性较小，可能对中枢型h 一受体有选择性。且无阿片样成瘾症状。如能进一步改善。有希望成为新型镇痛药。需要指出的是，a b t - 5 9 4 虽没有阿片样成瘾或戒断症状，却很可能有烟碱( 尼古丁) 样成瘾和戒断症状。1 3 多肽类镇痛药物研究进展多肽类镇痛药有内源性和外源性药物两类。内源性镇痛药主要是阿片肽类药物，而外源性药物则来源于其它各种生物，包括真菌。下面将从两个方面分别讲述。一、内源性镇痛药的研究自l9 7 5 年发现脑啡肽以来，已发现2 0 几种内源性阿片肽。其中最主要的有三种，分别是脑啡肽( e n k a p h a i i n ) 、内啡肽( e n d o r p h i n )和强啡肽( d y n o r p h i n ) 。脑啡肽有甲硫氨酸脑啡肽( m e k ) 和亮氨酸脑啡肽( l e k ) 两种；强啡肽有强啡肽a 和强啡肽b 两种：而p 一内啡肽是研究得最为充分的内啡肤。它们是人体自身产生的具有阿片样镇痛活性的多肽，因而称阿片肽。阿片肽在体内作为内源性配基会与相应的受体结合从而产生镇痛作用。在体内存在三种阿片受体，分别是p ，k ，“受体。不同的配基与不同的受体亲和力不一样。脑啡肽主要与5 受体亲和，与u 受体亲和次之；强啡肽主要与k 受体亲和；内啡肽与，6 受体都发生亲和，但作用比较弱。而外源性吗啡则是“受体的强亲和配基。三种主要的内源性配基在体内起作用的部位不一样，内啡肽在脑内起作用，强啡肽在脊髓起作用，脑啡一苎二兰堕童量堡笙一- _ _ _ - - _ _ _ 一一肤在脑及脊髓中发挥作用”。临床上内源性配基发生作用主要通过电针刺激使神经系统释放阿片肽，产生镇痛效应。电针频率不一样则起作用的阿片肽及其阿片受体也不一样，如低频电针( 2 1 t z ) 刺激主要是脑啡肽与对应有强亲和力的6 受体结合产生镇痛作用，而高频电针( 1 0 0 t l z ) 则主要是强啡肽与对应有强亲和力的k 受体结合产生镇痛作用“”，而且长时间电针刺激会导致耐受，主要的机制在于体内同时存在阿片肽的拮抗剂。1 9 8 5 年日本k e n a k o 等发现了第一个抗阿片肽一血管紧张素一i i 【i “。八肽胆囊收缩素( c c k - 8 ) 是至今为止发现的体内最强的抗阿片肽镇痛物质1 1 1 。但目前关于c c k - 8 在痛觉调制中的作用，存在着两种不同的观点，一派认为c c k 一8 是拟阿片肽物质，因为在注射较大荆量的c c k - 8 时产生镇痛作用”“”，另一派则认为c c k - 8 是抗阿片物质，因为在接近生理剂量的c c k - 8 对抗阿片的镇病作用t i l l = 有报道促肾上腺皮质激素( a c t i ) 在脊髓水平可以抗阿片u ，6 受体介导的镇痛，不对抗k 受体所对抗的镇痛。推导a c t h 的这一可能不是直接发生在阿片受体上的对抗，而是在受体后c a m p 和c a 离子信使通路上与阿片相互作用的结果“。在各类阿片肽中，强啡肽的含量最高，主要参与痛觉的调制，此外在调节脊髓伤害性反应，运动功能以及脊髓损伤后的继发损伤过程中，强啡肽亦起者主要作用“”。大鼠鞘内注射强啡肽可引起后肢迟缓性瘫痪，并呈剂量依赖关系，其中强啡肽a ( 1 - 17 ) d y n 致瘫作用最强”。这可能是强啡肽不运用于临床的原因。1 9 9 0 年宋朝佑等报道了阿片肤中枢催产素在电针镇痛中的作用1 2 2 1ol9 9 2 年龚珊等发现电针对内脏痛有抑制作用，电刺激室旁核会产生加压素从而加强这一抑制效应”，1 9 9 5 年何润昌等进一步证实了催产素可能参与电针镇痛的中枢作用”。l9 9 8 年b r o w no c 实验发现在脊髓压迫致使颈和背部疼痛的狗脑脊液中催产素的含量较正常的狗高，而慢性痛的狗脑脊液中催产素的含量较急性疼痛的狗要高由此推及到人，并用于临床，发现鞘内给催产素对治疗低位背部痛有效达5 小时以上，推测鞘内给催产素可能成为外周镇痛的逻辑选择”。19 9 6 年d 、a m i c om 等报道了阿片肽内皮素经背部的外周导水管灰质注入，从1 p m 0 1 每只大鼠到4 p m o l 每只大鼠均能诱导抗伤害性反射，即具有镇痛作用，而且这种镇痛作用有剂量依赖性，能被n m d a 受体拮抗剂2 - - a p v 和m k - 8 0 l 所阻断1 。p 物质是一种争议颇多的脑肽。1 9 9 5 年边景檀报道脊髓中p 物质在低频时释放减少，中频和高频时释放增多有利于镇痛效应的实现”。1 9 9 7 年院怀珍等报道鞘内注射生长抑素可使痛阚提高，并可抑制p 物质引起的痛反应。大鼠足内注射福尔马林不仅引起痛反应还可使脊髓s p 样免疫反应物增加，而鞘内给生长抑素可抑制它们，说明生长抑素可通过抑制s p 及其引起的伤害性反应而产生镇痛作用2 盯。1 9 8 3 年从牛脑尾核和人嗜铬细胞分离得到阿片肽一甲八肽酰胺( m e t o m h a m i d e ，m e t5 - e n k e p h a li n a r 9 6 一a r 9 7 一、，8 1 8 - n h 2 ，m e t ) 2 ”。k o s t e r l i t z 等发现m e t 对阿片受体亚型具有强大的亲和力。1 9 8 6年许绍芬等用小鼠热板法和兔钾离子透入法发现m e t 对小鼠和兔的皮肤痛及兔的内脏痛都呈现良好的镇痛作用，从i c v e d 5 0 值来看，m e t 的镇痛作用略次于吗啡，作用时间也较短。推测可能因为m e t系肽类化合物，易被酶解失活，在体内破坏快，作用短，故未作为药物运用”。二、外源性镇痛药物的研究外源性多肽类镇痛药物在临床上有更广泛的研究。国内最早开发应用神经毒素作为镇痛药是广州中山医科大学的药理工作者，他们将眼镜蛇毒直接稀释，灭菌，制成眼镜蛇毒注射液，用于治疗血管神经性头痛，：- k 神经痛，坐骨神经痛，晚期癌症疼痛，慢性关节痛及各种慢性痛，均有良好的镇痛效果o ”。一苎二里堕! 量竺堡- 一国内研究得最为深入的要数东亚钳蝎毒。全蝎是钳蝎科昆虫东亚钳蝎的干燥虫体，1 9 8 6 年萧熙报道以金蝎虫入药，临床上治疗头痛，风湿痹痛等痛痘有显著的疗效。蝎毒( s c o r p i o i lv e n o m ) 是全蝎尾部毒腺分泌的蛋白质毒素，19 8 9 年刘崇明等首次报道用醋酸扭体法，辐射热甩尾法，电热板法等动物模型充分证明蝎毒粗毒对躯体痛，内脏痛有较强的抑制作用”。不久他们又发现蝎毒素一i i i ( t i t y u t o x i n i i i ，t t 一1 1 1 ) 具有比粗毒更强的镇痛作用。蝎毒素一ii i ( t it y u s t o x i n 一1 1 1 ) 是从东亚钳蝎毒中经过c m s e p h a d e xg - - 5 0 柱层析提取，再用s e p h a d e x g - 5 0 凝胶过滤纯化而成，小鼠光热甩尾法实验结果显示t t i i i ( o 4 2 4 m g k g )使痛阀提高四倍。利用小鼠扭体实验表明t t i i i 的镇痛作用较粗毒强三倍。而且实验发现中枢某些单胺类替质5 一t h 对t t - i i i 的镇痛作用是必不可少的”。1 9 9 6 年河南医科大学王永奎等用柱层析法将蝎粗毒分离为多个蛋白组分，经大鼠侧脑室注射筛选，结果初步确定了蝎毒一i v( s c o r p i o nv e n o m c o m p o t e n t s i v ，s v c - i v ) 具有中枢镇痛作用。实验用屈肌反射作测痛指标，s v c - i vi g k g 给药，5 - 20 分钟及9 0 1 2 0分钟可显著提高屈肌反射闽值，同时又使c 波潜伏期明显延长。用吗啡作阳性对照，结果显示s v c - i v 对大鼠屈肌反射抑制强于吗啡，推测可能是由于两者的内在机制不同。同时用热辐射甩尾反射测定大鼠痛阈的方法，观察并比较了东亚钳蝎毒素和吗啡的镇痛作用，结果表明：向侧脑室内注射2 “l 或肌肉注射0 0 5 m l ，浓度为0 0 t 蝎毒液的镇痛作用比相同给药途径，同浓度，同剂量吗啡的镇痛作用强，两者差异显著，( p o 0 1o 另外蝎毒的这种在肌肉注射后较短的时间内即可使大鼠痛阈明显提高，证明蝎毒可通过血脑屏障进入中枢神经系统产生镇痛作用。蝎毒的这种经外周给药途径并有效的实验为蝎毒将来作为新型镇痛药用于临床提供了理论依据。作为临床应用的前提，几乎同时河南医科大学的王成裕对蝎毒对神经系统的作用进行了实验，观察了s v c - - i v 对轻度结扎大鼠坐骨神经所产生的神经损伤的影响，发现s v c i v 能促进外周神经损伤的康复，并证明了s v c i v 对神经损伤康复的促进作用是由于其能改善神经损伤局部粗，细神经纤维的形态和功能”“。他们着力于开发一种叫蝎毒镇痛町( s c o r p j 0 1 1v c l 3 o l r la n ti d y n e t i n t u r e ，s v a t ) 的药物。它是济源产河南东亚钳蝎，经电刺激( 12 8 h z ，15 v ) 取毒，冷冻干燥，低温醇提取等步骤获得镇痛有效组分，供外涂用。结果显示蝎毒镇痛町外用对大鼠注射f o r m a l i n 引起的肌电发放，神经干结扎后自残率均有显著的抑制。并有一定的剂量效应关系，从而提示蝎毒镇痛町对急性，慢性躯体痛具有抑制作用，在临床上具有广泛的应用前景。同时他们发现蝎毒镇痛町外用，不但对大鼠急性躯体痛，慢性躯体痛有显著的抑制作用，并且有一定的促进神经再生之特殊功效”。外源性镇痛多肽不仅可来自动物，也可来自真菌。如云芝糖肽是从云芝( c o r i 0 1 u sv e rsi c 0 1 0 1 l e xt r iq u e l ，s t r a i n ：c o y 一1 )菌丝体中提取的一种糖肽( v o l y s a c c h a r i d e p e p t j d e ，简称p s p ) o ”：19 93 年胡月娟等发现用小鼠的扭体实验、热板法、家兔的钾离子透入皮肤实验等化学刺激和温热刺激引起的急性皮肤痛和内脏痛模型上具有镇痛作用”。19 9 6 年滕爱芬等用甲醛溶液致炎和鹿角莱胶致炎的急性痛模型，用佐剂性关节炎的慢性模型，发现云芝糖肽对急性和慢性的炎症性疼痛均具有明显的镇痛作用，用药后两小时镇痛作用消失。与哌替啶比较，云芝糖肽的镇痛作用较弱：持续时间较短。1 9 9 7d e n n is g 等分析紧张性的炎性疼痛的产生主要涉及脑干以上脑区，包括i n - j 脑，丘脑，下丘脑和大脑边缘系统。p s p 能激活下丘脑内侧基底部神经元，因此从免疫调制来说，p s p 激活下丘脑内侧基底部免疫的功能，从痛觉调制来说，p s p 可能激活包括下丘脑在内的内源性镇痛系统而发挥镇痛作用。云芝糖肽“”源于菌丝体，资源丰富，炎性疼痛模型接近临床，因而云芝糖肽表现出广阔的应用前景。四肽a s n a l a g l y a l a ( n a g a ) 是p 一促脂素( d - - l i p o t r o p i n )的一部分序列。t 9 8 2 年p a nx p ，1 9 8 5 年l i j i m am 在小鼠和兔子模型上发现了合成的n a g a 的镇痛作用”1 “1 。19 9 4 年，何成等报道，用钾离子透入致痛，大鼠辐射热甩尾测痛的方法发现n a g a 具有镇痛作用。大鼠辐射热甩尾实验中n a g a 能引起大鼠痛闽持续升高，并成剂量效应( 0 0 3 0 2 4 u m 0 1 r a t ) ，持续时间90 分钟。这一作用可被纳洛酮( i c v ，o 2 6 m g k g - 1 ) 翻转。ic v 甲硫氨酸脑啡肽抗血清或亮氨酸脑啡肽抗血清，能抑制n a g a 引起的镇痛作用。而i c v 强啡肽h l 一13 抗血清或p 内啡肽抗血清不影响n a g a 的镇痛作用，结果提示n a g a 的镇痛作用可能是通过内源性阿片受体起作用“”。19 8 5 年l is h n e rm 等报道了镇痛多肽蛙皮素( c e r 1 e t i d e ) 的临床实验结果。临床上对8 2 位胆管和肾脏急性痛病人进行肌肉注射，0 0 5 m g k g 的量与镇痛新( 2 一二甲丙烯基一5 ，9 一二甲基一2 羟苯并吗啡烷，一种镇痛药) 进行比较。其中5 6 位胆管绞痛病人反映蛙皮索镇痛可与镇痛新相娉美，而且副作用小。而2 6 位肾绞痛病人则认为蛙皮素不如镇痛新，因此实验进一步证明蛙皮素是胆管绞痛的首选药物”。绿臭蛙肽( t l is - t r p - a l a 1 1 e - g l y h is p h e 一t i t f 2 ) 是从中国绿臭蛙的皮肤中分离出来的一种八肽，它与韩蛙皮素具有非常相似的结构，是最小的自然界来源的内皮素( b o m b e s i n ) 样肽。内皮素是一种脑肽，在脑部的结合位点有海马、杏仁核、外周导水管灰质( f a g ) 、下丘脑等边缘前脑和中脑结构，内皮素对哺乳动物有各种各样的影响，内皮素外周导水管灰质给药用热板法和辐射热甩尾法均有镇痛效应。19 9 1 年朱兴族等报道大鼠脑室内注射绿臭蛙肽可引起镇痛，但纳络酮不能对抗绿臭蛙肽引起的镇痛作用，表明它不是通过阿片系统起作用，绿臭蛙肽引起的镇痛作用可以被选择性多巴胺受体d 2 拮抗剂一舒必利对抗，但选择性多巴胺受体d 卜s c h 2 3 3 9 0 对上述作用无明显影响，从而表明中枢神经系统中多巴胺系统d 2 受体可能参与绿臭蛙肽的镇痛作用”。在国外研究得最为深入的要数一芋螺毒素( - - c o n o t o x i n s ，0 3 一c t x ) 。自1 9 8 4 年叭i v e r a 等首次报道以来至1 9 9 7 年已从地纹芋螺( c o n u sg e o g r a p h us ) ，魔术家芋螺( c m a g u s ) ，浅纹芋螺( c s tr i a t l 1s ) 织锦芋螺( c t e x t i l e ) 中分离出12 种0 3 - - c t x 。过去- - c t x 在钙离子通道的研究中起极其重要的作用。其中从一种海中食鱼螺一魔术家芋螺中分离出来的m v l i a ( 原来文章中叫做c 1 )- c o n o p e p ti d e s ) 是一种2 5 ( c k g k g a k c s r l m y d c c t g s c r s g k c ) 肽，它属于可逆结合的n 一型电压敏感型钙离子通道阻断剂。实验发现多聚赖氨酸可抑制m v i i - a 与钙通道的结合。最初m v i i a 的鉴定方法是每千克小鼠脑内给药数微克到数百微克，毒性反应表现为震颤，有的死亡。m v i i 一 的溶液结构已用二维n m r 测定，有三对二硫键，与另一种地纹芋螺毒g v i - a 很相似”5 。m v t i - a 的构效关系己由n a d a s d i等系统研究，结果表明m v i i a 的4 个l y s 及两个ar g 碱性氨基酸的作用是不同的。l y s l 4 被a l a 取代后活性下降到1 4 或1 5 。l3 r s 2 4被取代后活性几乎无影响；h r g l0 、a r 9 2 l 被取代后活性显著下降，t y r l3 用p h e 取代活性下降到1 20 0 ，l e u l l 用a 1 a 取代活性下降到l 3 0 ，n 一端的氨基酸被酰化后活性下降显著，从而推出m v i i a的活性主要来自于t y r l3 、l e u l l ，带电荷的l y s2 、h r g l 0 、h r 9 2 1及n 端的氨基。同时发现m v i i a 的刚性结构是活性所必需的，n a d a s d i等选择性地将t y r l3 一h s p l4 断裂，造成其活性下降了9 9，m e t l2 - t y r l3 被糜乳蛋白酶切断后，活性几乎全部丧失u “。当已经发现了0 3 一c t x 的镇痛作用，但并未开发成临床药物时对已无药可医的病人进行实验。发现芋螺毒用于治疗顽固性疼痛具有特效，且不成瘾，据报道美国n e u r e x 公司在1 9 9 6 年已进行了3 0 0例临床实验，病人均是目前所有镇痛药无效者。将m v i i a 直接注入到病人的脊髓，能有效地阻止那里的神经继续传递痛感，由于m v i i a是直接作用于c a ”通道，而不需要第二信使或g 蛋白，因此不成瘾。m v i i a 的一个很大优点是只引起眼皮跳动，血压降低等副作用”“。m v i i a 在经过许多次的实验后证明具有明显的镇痛作用，大量合成并进入临床研究取名为s n x 1 1 i 。i9 9 6 年s s c o t t 等报道了s n x n l 作为一种n 一型电压敏感型钙通道阻断剂对大鼠福尔马林注射引起的第一相急性痛和第二相持续性疼痛均有良好的镇痛作用，s n x i i i 一次性剂量鞘内注射10 0 “g k g 对第二相持续性疼痛具有镇痛效果，但对第一相急性疼痛没有多大影响。s n x - i i i 一次剂量注射的给药方法有剂量依赖性，从3 0 至3 0 0ug 镇痛作用明显加强。另一实验结果还显示如果s n x l i i 以l0 0n g h r 鞘内连续7 2小时灌流，不仅抑制第二相持续性疼痛也明显的抑制了第一相急性疼痛，具有临床应用前景。同时s s c o t t 等还发现l n g h r ，l o n g h r ，1o o n g h r 连续7 天灌流对机械性痛敏的神经痛模型有明显的镇痛作用，具有明显的剂量依赖性”。i9 9 7 年d a w n m c g u ir e 等报道s n x i i i具有广泛的临床用途，包括抑制伤害性疼痛，神经性疼痛并对局部缺血引起的脑损伤有神经保护作用。1 9 9 7 年d a w n 以研究s n x i i i作为第一种n 一型电压敏感型神经钙通道阻断剂进入临床使用为目的，再一次证实了s s c o t t 的s n x i i i 抑制福尔马林引起的急性痛和持续疼痛的结论，其作用也比吗啡强，进一步的研究表明它对局部脑损伤的神经元有保护作用。多肽类镇痛药的研究在逐步深入，其镇痛效果与吗啡比较具有独特性不成瘾性为临床的进一步开发提供了广阔的前景。1 4 虎纹镇痛肽一i ( h w a p - i ) 研究简介虎纹镇痛肽一i ( ) n a p i ) 原名i i w t x 一1 ，是从中国珍稀毒蜘蛛虎纹捕乌蛛( s e l e n o c o s m i a 力f ，孵力a ) 粗毒中分离纯化的一种多肽类神经毒素它在虎纹捕乌蛛粗毒中占40 ，分子量为3 7 50 ，小鼠腹腔注射l d so 为0 7 m g k g ，该毒素能可逆地阻断小鼠膈神经膈肌的传导，10ug k g 的浓度大约15 分钟完全阻断，作用位点在突触前膜“l通过一级结构测定”。可知h w a p i 有3 3 个氨基酸残基其中六个胱氨酸，形成三对二硫键，其连接方式是卜4 ，2 - 5 ，3 - 6 ”，通过构像分析结果表明h w a p - i 天然构象采取的是一种紧凑而稳定的空间结构”。其二级结构包括3 段p 一折叠和5 个d 一转角，这种具有“三桥三叠”基本特征的空间构象广泛存在一芋螺毒素和多肽类抑制剂等富含二硫键的小分子量蛋白质中，是一种具有重要意义的分子构架。通过固相蛋白质合成技术合成3 3 个氨基酸残基，适 - 3 条件下还原复性，得到了和天然蛋白质相同生理活性的合成多肽，同时成功的合成了在原h w a p i 基础上改造的突变体，也表现了一定的生理活性“16 2 6 ”。在药理学研究方面膜片钳技术的进一步应用发现h w a p i 是一种有效的n 一钙离子通道阻断剂“”。鉴于钙离子通道阻断剂在镇痛药物开发方面的前景“川，接着在这方面做了大量的工作。大鼠硬膜外给药辐射热测痛法发现h w a p l 在1 0 dug k g ，18 0hg k g ，2 4 0 “g k g ，3 0 0 “g k g ，3 6 0ug k g 均有明显的镇痛作用，且有明显的时效和量效关系，用吗啡做阳性对照，发现h w a p i 和吗啡有完全不同的时效曲线，或者说是相互补充的。继硬膜外之后进行了蛛网膜下腔给药的对照研究，采用同样的测痛方法，h w a p i 在1 “g k g ，2 5 “g k g ，4ug k g ，5 “g k g 剂量下有明显的镇痛作用，与吗啡进行比较从分子量角度来说，h w a p i 镇痛效果有它独特的时效曲线及明显的镇痛优势。直接的大鼠尾部辐射热测痛是生理疼痛，为了进一步了解h w a p i 镇痛的范围，采用了病理疼痛模型即大鼠福尔马林脚掌致炎疼痛模型，它比生理辐射热模型要灵敏，且有明显的第一相快痛和第二相慢痛，h w a p i 从2 5 g k g 至7 5 “g k g 对两相痛都有明显的镇痛作用，尤其是对第二相慢痛”“。以上三个方面的实验都是同吗啡进行比较，但成瘾是吗啡的一个最大缺点“ ，我们对 i w a p - i 的是否成瘾性进行了一系列的实验：h w a p i 的镇痛耐受研究；h w a p - i 的身体依赖性研究。实验结果表明h w a p i 是一个对镇痛不耐受的药物，也没有身体依赖性”“。这是一个明显优越于吗啡的特点。基于以上的实验基础，本文作者在新的模型上对h w a p i 的镇痛作用进一步研究，对其给药途径作了比较，并对其急性毒性和长期毒性作了具体的验证。苎三主生塾堡堑些：! ! ! 坐! ：! ! 至旦丝堑堡堡堡堕塾墨生墼第二章虎纹镇痛肽一i ( h w a p 一1 ) 不同给药途径镇痛效果比较2 1 前言正确的给药途径是实现理想药效的关键因素之一。几乎所有的药物都是通过血液循环到金身最后到达靶器官，一般的金身性作用的小分子药物都是通过肌肉注射，口服，或者静脉滴注，对于一些局部伤口有外敷用药，虎纹镇痛肽一i ( h w a p i ) 是一种突触前膜的h 一型钙离子通道阻断剂，本身是一种只有3 3 个氨基酸残基的多肽，理论上不能口服，静脉注射的效果也必然受到影响。阻断中枢的痛觉传导，硬膜外和蛛网膜下腔给药应该是理想的给药途径。鉴于蛛网膜下腔在国内临床不具普遍性，硬膜外用药成了h w a p - i 在临床应用的首选途径。本实验用福尔马林致炎疼痛模型m 1 对h w a p - 1 在硬脊膜外腔( 5 0 g k g ) ，肌肉注射( 2 0 0 “g k g ) ，灌胃( 2 m g k g ) 三种给药途径对h w a p - i 的镇痛效果进行了比较。以寻求剂量适中、药效明显且稳定、安全系数大的最佳给药途径。结果发现硬膜外给药是一种给药剂量小，镇痛效果明显的给药方式。相信应用这种给药方式h w a p