（生物化学与分子生物学专业论文）绿色巴夫藻脂肪酸去饱和酶的研究.pdf

学位论文独创性声明 本人呈交的学位论文系在导师指导下所取得的研究成果。除 了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写的研究成果，也不包含为获得广东医学院或其他教育 机构的学位或证书所使用过的材料。 作者签名：元叁函氏日期：劲。7 6 垃 学位论文知识产权声明 本人在就读研究生期间所完成的学位论文及其相关成果，知识产 权归属学校。本人在毕业离校前会将有关的研究资料和结果全部上交 导师，离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或 成果时，署名单位仍然为广东医学院。学校可以将学位论文的全部或 部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文，可以公布( 包括刊登) 论文的全部或部 分内容。导师享有发表学位论文、申请成果和专利的权利。 注：保密的学位论文在解密后适用本声明。 作者签名：垂叁垄鱼日期：翟1 2 ：i ：! 至 聊签名：逝日期：碑! u 三 绿色巴夫藻脂肪酸去饱和酶的研究 中文摘要 【目的】 大量的研究证实，多不饱和脂肪酸对维系和调节细胞的正常生物学功能起 重要的作用。在多不饱和脂肪酸的生物合成中，脂肪酸去饱和酶起着关键的催 化和调控作用。本课题拟从富含多不饱和脂肪酸的海洋微藻中，运用r a c e - p c r 方法快速、简便的筛选和克隆脂肪酸去饱和酶基因，为进一步探讨多不饱和脂肪 酸的生物合成，脂肪酸去饱和酶的功能、机制及应用奠定基础 【方法】 1 采用g c - m s 技术分析6 种海洋微藻的脂肪酸含量和脂肪酸组成。 2 运用3 r a c e 方法，利用o l i g o ( a r ) 和基因特异性引物克隆与脂肪酸去饱 和酶基因具有一定同源性的候选基因片段 3 运用5 r a c e 方法。利用克隆并测序的3 r 末端的候选基因片段设计引物 克隆5 端序列。 4 运用o v e d a p - p c r 将候选基因3 嘴和5 ，端序列拼接成全长e d n a 序列 5 运用生物信息学方法分析候选基因同源性和蛋白的基本物理化学特性。 6 通过原核表达系统分析克隆基因的表达和蛋白功能活性。 【结果】 g c - m s 检测分析结果表明，6 种微藻的脂肪酸含量介于1 8 8 - 5 7 7 之间，其 中以绿色巴夫藻的脂肪酸最高，达到干重的5 7 7 绿藻纲( c h l o r o p h y c e a e ) 的 徽绿球藻和小球藻以1 6 ：0 、1 8 ：2 ( n - 6 ) 、1 8 ：3 ( 1 ”) 为主要的脂肪酸，而e p a 、d h a 可能含量因为极低或不含有而未能检出；金藻纲( c 7 5 i ，) j 印 雠韶) 的湛江等鞭 金藻和绿色巴夫藻 1 4 ：0 、1 6 ：0 、1 8 ：1 ( n - 外、1 8 ：3 ( n - 3 ) 、n 含量较高，湛江等 鞭金藻d h a 含量达到总脂的1 5 7 5 、绿色巴夫藻e p a 、d h a 的含量分别达到总 脂的2 3 9 5 和4 8 3 ；硅藻纲( b a c i l l a r i o p h y c e a e ) 的角毛藻和三角褐指藻中1 4 ：0 、 1 6 ：0 、1 6 ：1 、研- 蝤量都较高，其中角毛藻e p a 含量达到总脂的2 0 3 7 ，三角褐 指藻的即a 含量达到总脂的2 1 3 6 通过检测6 种经济微藻中不饱和脂肪酸的含 量和组成，可筛选出富含多不饱和脂肪酸的微藻，为本实验下一步的完成提供条 件。 在分析部分微藻和高等植物中已克隆的脂肪酸去饱和酶基因序列的基础上， 利用已知编码脂肪酸去饱和酶序列的相对保守片段设计引物，通过3 - r a c e f f 增 出了5 条未知功能的基因片段，经b l a s t 同源性分析，其中一条可能是候选的脂肪 酸去饱和酶基因，暂定名为b 5 3 8 。在获知了3 末端序列的基础上，设计两条距 离相差1 0 0 b p 左右的特异性引物进行5 - r a c e 扩增，对扩出的5 末端构建克隆， 经测序鉴定后，通过软件鉴定其正确性。利用o v e r l a p - p c r 将5 末端和3 末端连 成全长的c d n a 序歹l j 。序列分析发现，这一全长c d n a 序列包含一个长为1 1 6 1 b p 的o r f ，编码一条3 8 7 个氨基酸的蛋白质，其中蛋白分子量为4 3 6 4 k t l 等电点为 5 7 9 5 ，与蓖麻的d e l t a9 脂肪酸去饱和酶具有5 1 的相似度。 根据已知的蓖麻9 脂肪酸去饱和酶三维晶体结构，通过同源模建预测b 5 3 8 的三级结构及活性中心和底物结合部位。结果显示b 5 3 8 _ 三级结构的活性中心和 底物结合部位除1 个氨基酸不同外，其余2 1 个氨基酸都与蓖麻的9 脂肪酸去饱和 酶完全相同。由此可以推测，克隆出的基因很可能为可溶性的a c y i - a c p 9 脂肪 酸去饱和酶 通过s d s - p a g e 分析原核表达b 5 3 8 融合蛋白时，在6 0 k u 处出现了一条明 显变粗的条带，大小与理论值相符。通过b a n d s c a n 分析，b 5 3 8 3 8 的表达量达到 了总蛋白的3 6 7 ，b 5 3 8 7 8 达到了2 8 6 ，蓖麻的d e l t a 9 脂肪酸去饱和酶基因 的蛋白表达量达到了1 9 9 ，线虫f a t - 1 脂肪酸去饱和酶没有出现明显的诱导带。 w e s t e r n - b l o t t i n g 结果显示带有h i s 标签的四个蛋白都得到了表达。g g m s 检测 结果显示，绿色巴夫藻b 5 3 8 基因表达后导致的c 1 8 ：1 和c 1 8 ：3 的增加相对于对 照空载具有统计学意义的。考虑到原核表达的融合蛋白包含一个1 5 0 个氨基酸的 标签，所以该基因的功能还需进一步的分析。 【结论】 初步建立了一种简便、快速的微藻脂肪酸去饱和酶基因c d n a 快速筛选、 克隆和鉴定方案。筛选克隆出的脂肪酸去饱和酶基因之一( b 5 3 8 ) 很可能是一 种新发现的可溶性的a c y i - a c p 脂肪酸去饱和酶。 【关键词】绿色巴夫藻，脂肪酸去饱和酶。c d n a 末端快速扩增。原核表达， 气相色谱- 质谱联用 2 s t u d y o nf a t t ya c i dd e s a t u r a s ef r o m m a r i n em i c r o a l g a ep a v l o v av i r i d l s a b s t r a c t e o b j e c t l v e m a n yr e p o r t ss h o wt h a tp o t y u n s a t u r a l e df a t t ya c i d s ( p u f a ) h a v ei m p o r t a n t b i o l o g i c a la n dp h y s i d o g i c a lf - 酗o n 8 o nt h eh e a l t ho f h u m a n f a t t ya c i dd e s a t l a s e a sak e yc a t a l y s i sa n dr e g u l a t i o nf a c t o ra tb i o s y n t h e s i so f p u f a , i th a sp r o v o k e dal o t o fr e l a t i v er e s e a r c h e s , n o to n l yo rt h es t r u c t u r eo fd m a t u n s e , b u ta l s ot h ef i m c t i o n 雅dm e c h a n i s mo f i lt h i sr e p o r ti su s i n gr a c e - p c rt e c h n o l o g yt oc l o n ef a t t ya c i d d e s a t u r a s ef r o mm a r i n em i c r o a l g a ep a y o v a 眺w h i c hc o n t a i nh i 曲c o n t e n t so f p u f a ih o p et h i sw o r kw i l ls u p p l y 删d 鹪f o rc l o n i n gf a t t ya c md e s a t m a s ef r o m o t h e r 印豳a n d i tw i l ls u p p l yu s e f u ti n f o r m a t i o nf o rt i n , h a tr e a e m - c ho nb i o s y n t h e s i s o f p u f aa n df a t t ya c i dd a s a m r a s e m e t h o d s 1g c - m st od e t e c tc o n t e n to f 缸a n d f a t t ya c i d so f s i xm a r i n em i c r o a l g a e 2 u s i n g3 r a c e - p e r i st oc l o n ec a n d i d a t e dg e n eo ff a t t ya c i dd e s a t u m s e b ya n c h o r e dp r i m e r a n dg s p 3 a tt h eb a s i so f3 f r a g m e n ts e q u e n c e , u s i n g5 r a c e - p e ri st oc l o n e5 f r a g m e n t s e q u e n c eo f f a t t ya c i dd e s a t u r a s eg e n e 4 o v e r l a p - p e ri st ot i g a t e3 a n d5 f i a g m e mo fc a n d i d a t e df a t t ya c i d d e s a t u r a s eg e n e 5 u s i n gb i o i n f o r m a t i o ni n f t h o dt oa n a l y z et h eh o m o l o g yo fc a n d i d a t e df a t t y a c i dd e s a t u r a s ea n dt h ec b a r a c t 酋o f i t 6 u s i n gp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o ns y s t e mt oa n a l y z ee x p r 嘲o no fc a n d i d a t e d f a t t ya c i dd e s a t u n s eg e n ea n df u n c t i o no f i t r e s u l t s | g c - m sr e s u l t ss h o wt h a tf a n ya c i dc o n t e n t so f s i xm a r i n ei m c m x l g a ew h i c hi s 3 b e t w e e n1 8 8 - 5 7 7 o f d r ys a m p l e , a n d p a v l o v a v i r i d i sr e a c h 5 7 7 t h e m a i n f a t t y a c i dc o m p o n e n t so f n a n n o c h l o r o p s i sc - l d a t aa n dc h l o r e l l as p o f c h l o r o p h y c e a ei s 1 6 ：0 ，1 8 ：2 ( n - 6 ) ，1 8 ：3 ( n - 3 ) ；i s o c h r y s i sz h a n j i a n g g e n s i sa n dp a v l o v av i r i d i so f c h r y s o p h y c e a ei s1 4 ：0 , 1 6 ：0 , 1 8 ：l ( n - 9 ) ，1 8 ：3 ( n - 3 ) ，d h a ；c h a e t o c e r o ss p a n d p h a e o d a c o d u mt r i c o r n u t u mo f b a c i l l a r i o p h y c e a ei s1 4 ：0 , 1 6 ：0 , 1 6 ：1 e p a 1 1 ke p a c o n t e n t so f c h a e t o c e r o ss p a n dp h a e o d a c t y l u mt r i c o r n u t u mr e a c ht h e2 0 。3 7 a n d 2 1 3 6 o f 缸r e s p e c t i v e l y b a s e do na n a l y ma n dc o m p a r i s o no f s e v e r a lf a t t ya c i dd e s a t u r a s eg e n es e q u e n c e f r o ms o l n cm i e r o a l g a ea n dh i g h e rp l a n t , w ed e s i g np r i m e r so nt h ec o n s e r v a t i v eu x l u e a c e t oc l o n ec a n d i d a t c d f a t t y a c i dd s s a t u r a s e g e n cf r o m m a r i n em i c r o a l g a eb y r a c e - p c r t h r o u g h3 - r a c e ，w cg e tf i v eu n k n o w ns e q u e n c e s , a f t e ra n a l y s i so f h o m o l o g y , o n eo f t h e mi sc a n d i d a t e df a t t ya d dd e s a t u r a s eg e n e , n a m e db 5 3 8 b a s e d o nt h e3 f r a g m e n to fb 5 3 8 ，w ed e s i g nt w op r i m e r st oa m p l i f y5 f r a g m e n to fb 5 3 8 t 醯t o t a ls e q u e n c eo f c d n ac o n t a i na no r fo f1 1 6 1 b pw h i c he n c o d e $ a3 8 7a m i n o a c i d ss e q u e n c e , m o l e c u l m w e i g h to fp r o t e i ni s4 3 6 4k u , p ii s5 7 9 5 。a n dh a sa h o m o l o g y o f 5 1 w i t h c a s t o r b e e n 9 f a t t ya c i d d e s a t u r a s eg e n e b a s e do n k n o w n t h t e e - d i m e a s i o n a ls m l c a a 蟹o fc a s t o rb e a na9f a t t ya c i dd e s a t u r a s e , w ep r e d i c t o n a ls w t l c t u r eo fb 5 3 8b yh o m o l o g yc o n s t n t c t i o n w ea l s oa n a l y z et h e a c t i v i t ys t i e sa n ds u b s t r a t e - c o m b i n e ds i t e so f b 5 3 8 o n l yt w oa m i n oa c i d si sd i f f e r e n t o f a n2 3a m i n oa c i d sa tt h ea c t i v i t ya n ds u b s t r a t e - c o m b i n e ds i t e sb e t w e g nb 5 3 8a n d a c t i - a c p 9f a t t y a c i dd e 戤拄岫s e s ow ee s t i m a t et h a tb 5 3 8i sp o s s i b l ea a c y v a c p 9f a t t ya c i dd e s a t u r a s e , b u ti tn e e df t t g t h 盯r e s e a r c ho nt h ef t l n c f i o no f i t s d s 刚岖mr e s u l t ss h o wt h a te 嚣w e s s i o no ff u s e d - p r o t e i no fb 5 3 8 - 3 8r e a c h 3 6 7 o f t o t a lp r o t e i n , b 5 3 8 - 7 8r e a c h2 8 6 ，c a s t o rb e a n 9f a t t ya c i dd e s a t u r a s e r e a c h1 9 9 r m p e c t i v e l y w e s t e r n - b l o t t i n gr e s u l t ss h o wt h a th i s - t a gf u s e d - p r o t e i n h a sb e e ne x p r e s s e d g c ，m sr e s u l t ss h o wt h a tc 1 8 ：1a n dc 1 8 ：3o f p a v l o v av i r i d i s s b 5 3 8g e n eh a si n c r e a s e d c o n s i d e r e de x p t 删i n o t e i ni sf u s e dp r o t e i nw h i c hh a s8 1 5 0a m i n oa c i d st a g , w et h i n ki tn e e df i a x h e xa n a l y s eo f i t sf u n c t i o n 4 c o n e l u s i o n s l t h i se x p e r i m e n ti st oa p p r o a c has i m p l e , r a p i dm e t h o dt oc l o n ec a n d i d a t e df a t t y a c i dd e s a t u r a 辩g o n ef r o mp l a n t c l o n e dc a n d i d a w df a t t ya c i dd e m a w a s eg o n em a y b e an e ws o l u b l ea c y i - a c pd e s a t u r a s e k e yw o r d s p a v l o v av i r i d i s , f a t t ya c i dd e s a t l x t a s e , r a p i da m p l i f i c a t i o no f e d n ae n d s ，p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n ,- m s ， l 前言 1 1 研究背景 p u f a s 是指含有两个或两个以上双键的不饱和脂肪酸，它是机体生物膜 的重要组成成分，对维系和调节细胞的正常生物学功能起着重要的作用；也 是许多重要生物活性分子的前体，可被代谢转化为前列腺索、血栓素、自三 烯和脂氧素等重要生物活性分子，对细胞的趋化、炎症反应、血管的通透和 收缩等多种细胞功能有重要的调节作用【l 。因此，p u f a s 对人类的健康， 包括心血管的健康和疾病预防、胎儿生长发育、视网膜和大脑等神经系统的功 能和发育等，都有十分重要的影响 ( 1 ) 脂肪酸去饱和酶 脂肪酸去饱和酶是一类存在于所有动植物、能催化脂肪酸碳链脱氢形成c = c 双键、在p u f a s 生物合成中起关键作用的酶类大家族。脂肪酸的去饱和作用 是个需氧的氧化反应过程，以细胞色素b s ( c y t b 5 ) 或铁氧还蛋白( f e r r e d o x i n ) 作为电子供体，在n a d h 和n a d p h 存在的条件下，传递两个电子给氧分子。 该反应系统由3 种蛋白质：n a d h 细胞色素b 5 还原酶、细胞色素b 5 和 脂肪酸去饱和酶所构成。3 种蛋白质均嵌附在微粒体膜的外侧，n a d h 细胞 色素b 5 还原酶和细胞色素b 5 具有一个朝向细胞质的亲水端和一个朝向膜内 的疏水端，其中去饱和酶因对氰化物敏感，又称为氰化物敏感因子。 脂肪酸去饱和酶通常根据底物特异性、细胞内定位和引入双键的特 性来加以划分。 根据脂肪酸底物结合的载体不同可分为三类：( i ) 酰基脂去饱和酶 ( a c y l l i p i dd e s a t u r a s e ) 只在糖脂结合态的脂肪酸中引入不饱和键，在植物 叶绿体、真核微藻和蓝藻中绝大多数由这类酶催化的：( i i ) 酰基酰基载体 蛋白去饱和酶( a c y l a c pd e s a t u r a s e ) 只在酰基载体蛋白( a c p ) 结合态的脂 肪酸上引入第个双键，主要存在于植物的细胞质中：( i i i ) 酰基辅酶a 去饱和酶( a c y l c o ad e s a t u r a s e ) 只在辅酶a 结合态的脂肪酸中弓i 入不饱 和键，主要存在于动物、真菌、酵母中1 5 l 。 根据电子供体不同分为两类：( i ) 以n a d p h ：铁氧还蛋白氧化还原酶和铁氧 还蛋白作为电子供体，酰基载体蛋白硫酯作为底物进行脱氢，主要存在于细胞 6 质；( i i ) 以n a d h ：细胞色素( c y t b s ) 氧化还原酶和c y t b 5 作为电子供体催化复合 脂中的脂肪酸脱氢。一般存在于内质网、植物叶绿体膜和蓝细菌的质膜和类囊体 膜上t 6 1 。 按引入双键的方式可分为两类：一是羧基定向的，即 f r o n t - e n d 去饱和酶， 又称口型去饱和酶，根据嘣e r r y l 刀等的研究在蛋白序列的n 端含有细胞色素b 5 的血色素结合位点 m g a i g ) ，能在双键和羧基之间形成另一个双键，属于这 一类酶的有a 4 ，a 5 ，a 6 ，a g 脂肪酸去饱和酶；另一类是甲基定向的脂肪酸去 饱和酶，又称u 型去饱和酶，在已有的双键和甲基之问形成另一个双键，如a 1 2 和a 5 - 雕d 肪酸去饱和酶。 脂肪酸去饱和酶由3 0 0 - 4 5 0 个氨基酸组成，根据现有的研究，除a c y l - a c p 脂肪酸去饱和酶是可溶性的结构蛋白外，其它的都为跨膜结构蛋白。在跨膜 型结构的脂肪酸去饱和酶中，具有特征性的h x 3 4 h h 、h x 2 3 h h 、( h q ) x 2 3 h h 这3 个保守的组氨酸富集区，与一个二价铁离子结合形成酶的活性中 , o j s l 在第一个组氨酸富集区前有一约4 0 5 5 个氨基酸组成的跨膜区，另一 个是约5 0 个氨基酸残基组成的跨膜区，两跨膜区可在蛋白疏水区穿膜4 次1 9 1 。 两类酶的不同结构可见图l 。s a s a t a , r j t l 0 1 于2 0 0 4 年根据脂肪酸去饱和酶的拓扑 结构，将线虫、a 1 2 脂肪酸去饱和酶分成七段，分别为氨基端，羧基端，两 个跨膜区，h i 段、膜镶嵌蛋白区、h 2 段、第二个膜镶嵌蛋自区、h 3 段组成。将 这两个酶的七个区段分别做交叉重组，实验结果表明第二个膜镶嵌蛋白区是酶的 位置选择性和底物特异性的关键部位，而且羧基端对维持酶活具有重要意义。 i f i gi s t r u c t u r eo ff a t t ya c i dd e s a t u r a s e 图i 脂肪酸去饱和酶的结构l l l l 7 1 6 9 脂肪酸去饱和酶的三维晶体结构 2 跨膜型脂肪酸去饱和酶的拓扑结构 ( 2 ) 多不饱和脂肪酸的生物合成 在包括微藻在内的植物界【1 2 1 ，p u f a s 的生物合成大多是从油酸开始( 图2 ) 。 油酸在1 2 脂肪酸去饱和酶的催化下形成亚油酸( l a ；18 ：2 6 9 圮) 可直接进o 6p u f a s 代谢途径，在0 6 脂肪酸去饱和酶和脂肪酸延长酶的交替作用下，生成包 括y 亚麻酸( g l a ；1 8 ：3 6 6 ，9 1 2 ) 、花生四烯酸( a a ；2 0 ：4 a s , 毛i i , 4 ) 在内的0 6 p u f a s ； 亚油酸，可进一步在1 5 脂肪酸去饱和酶催化下形成o 亚麻酸( a l a ；18 ：3 t * 9 1 工蛄) 而进入3p u f a s 代谢途径，在3 脂肪酸去饱和酶和脂肪酸延长酶的交替 作用下，产生链长为2 0 或2 0 个碳以上的长链( ) 3p u f a s ：分别为二十碳五烯酸 ( e p a ；2 0 ：5 6 。，i i 1 4 1 7 ) 、二十二碳六烯酸( d h a ；2 0 ：6 矾7 1 1 - 1 3 坻1 9 ) 等。同时， a a 和e p a 还可通过一个a 9 延长酶、a 8 脂肪酸去饱和酶、a 5 脂肪酸去饱和 酶的途径合成。 1 8 ：0 ( d l l a ) f i g2 t h eb i o s y n t h e s i sp a t h w a yo f p o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d s 图2多不饱和脂肪酸的生物合成途径 1 8 ：0 。o c t a d e c a n o i c a c i d ( 十八碳饱和脂肪酸) ； 1 8 ：1 6 9 o c t a d e c e n o i ca c i d ( 十八碳一烯酸) ； l s ：2 螅旺， l i n o l e i ca c i d ( 十八碳二烯酸) i 1 8 ：3 6 6 t 。”， f - l i n o l c n i ca c i d ( | r - 亚麻酸) ；2 0 ：3 朋”，d i h o m o t - l i n o l e n i c 8 a c i d ( 多不饱和脂肪酸吖亚麻酸) 2 0 ：4 a ，。”，a r a c h i d o n i ca c i d ( 花生四烯酸) ；2 0 ：2 叫。tc i c o s a d i c n o i c a c i d ( = 千碳二烯酸) ； 1 8 ：3 酗12 ，”，弘l i n o l e n i ca c i d ( 。八碳三烯酸) ；1 8 ：4 6 “。2 r ”，s t e a r i d o n i ca c i d ( - p 八碳四烯酸) # 2 0 ：4 “, 1 1 1 4 1 7 ，e i c o s a t c t r a e n o l ca c i d ( = 十碳四烯酸h2 0 ：5 “7 ，c i c o s a p e n t a e n o i c a c i d ( = 十碳五烯酸，e p a ) ； 2 0 ：3 4 l l l t 盯，e i c o s a t r i c n o i ca c i d ( = 十碳三烯酸) ；2 2 ：5 6 7 ，“1 t 坻悖， d o c o s a p c n t a e n o i c 喇d 二十二碳五烯酸) ； 2 2 ：6 聃 7 o 1 1 悖，d o c o s a h c x a e n o i c 盯i d i 二十二碳六烯酸， d h a ) 2 2 ：6 订d h a ) 的合成可通过4 脂肪酸去饱和酶催化2 2 ：4 “转化为2 2 ：5 和2 2 ：5 转化，b 2 2 ：6 一( d h a ) 但近年来认为2 2 ：4 “和2 2 ：5 q 的转化可以通过 另外的间接途径实现。2 2 ：5 - ，可先经碳链延长形成2 4 ：5 ”，再经a 6 脂肪酸去 饱和酶催化生成2 4 ：6 “，后者再经逆转化作用形成2 2 ：6 。3 f 。g e i g e r i l 习也对 2 2 ：4 “转化为2 2 ：5 “提出了相似的间接途径，这种合成途径又称为s p r e c h e r p a t h w a y 另外一条备选的d h a 生物合成途径是在海洋原生生物 s c h i z o c h y t r i u m 6 p 被鉴定，类似子多聚乙酰合成酶途径( p k s ) 6 j 合成p u f a 。 s p r e c h e rp a t h w a y a t - d o n g a ” 2 4 ：s n j j i 一 a k d t s a t u r a s e i i 2 1 ：矿哪副”嘲 争o x i d a t i o a 2 0 ：s 蛳l i 1 | ，1 7 e p a ) la c e l o n g a s e l z 2 ：s 7 j 也l t 件 i a 枷嘲似憎舯 ：如拇dha)pks(dll 2 2 ：6 娜l ”拇() - 。， 图3d h a 的合成途径 f i g3b i o s y n l l , 端i sp a t h w a yo f d h a 2 0 ：5 6 ”。e i c o s a p e n t a e n o i c 扯i d ( 二十碳五烯酸，e p a ) ：2 2 ：5 6 m 强坻挣。d o c o s a p e n t a e a o i ca c i d ( 二 十二碳五烯酸) ；2 2 ：6 7 - o + 1 3 ”，d o c o s a h e x a e n o i c 们i d ( 二十二碳六烯酸，d h a ) ；2 4 ：5 6 9 ，2 1 甜， 2 4 ：6 6 + 。2 ，p _ o x i d a t i 蛐，p 氧化 包括人类在内的哺乳动物虽然也能合成饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸，由于 缺乏1 5 及6 1 7 等3 脂肪酸去饱和酶，所以不能在机体内将0 6p u f a s 转化 为) 3p u f a s 。机体所需的3p u f a s 只能从食物中摄取；或者说只能分别以食 物来源的亚油酸和a 亚麻酸等必需脂肪酸为底物，通过u6 和u3p u f a s 代谢途 径来合成各种相应的6p u f a s 和【) 3p u f a s 。 ( 3 ) 微藻脂肪酸去饱和酶基因的克隆和表达调控 海洋微藻约占海洋生物物种的4 0 8 6 资源丰富；海洋微藻脂类分析研究表 明：大多数海洋微藻中的脂肪酸含量都很高，在r o e s s l e r ( 1 9 9 0 ) 列举的1 5 种微 9 藻中，大部分的总脂占体重7 以上；某些特殊种类的微藻中c a ) 3 多不饱和脂肪 酸的量可达其总脂的3 0 5 0 。海洋微藻的脂肪酸组成相对动物来说要简单得多； 有些微藻e p a 含量很高而d h a 含量很低。因此，通过微藻研究脂肪酸去饱和酶 具有重要意义。 1 9 9 0 年w a d a 1l 等从蓝藻s y n e c h o c y s t i ss p p c c 钌中克隆到a 1 2 脂肪 酸去饱和酶基因，并在抗寒性能差的蓝藻：a n a c y s t i s n i d u l a n s 中实现成功表达， 从而使后者的抗寒性能增强。迄今为止，已从多种富含多不饱和脂肪酸的海 洋微藻中克隆到脂肪酸去饱和酶，而且其中一些p u f a s 去饱和酶基因已通过 转基因的方法在大肠杆菌、酿酒酵母、拟南芥、油菜等获得成功表达。 1 9 9 4 年t o s h i os a k a m o t o 】等，分别从多变鱼腥藻和s y n e c h o c y s t i ss p p c c 葩叩聚球藻中克隆出a 9 脂肪酸去饱和酶，并成功在大肠杆菌中实现功 能表达。i t o h 等1 9 9 8 年从红藻中分离出a 9 脂肪酸去饱和酶基因( c m f a d g ) ， 编码的蛋白c 端含有细胞色素b 5 结构域，推测其可能在内质网而不在质体 中起作用。这种9 - 脂肪酸去饱和酶只存在于植物和微藻，具有酵母酰基- c o a 去饱和酶的特性。 2 0 0 3 年，d o m e r g u ef l 吲等从三角褐指藻p h a e o d a c 钞l u mt r i c o r n 口t u m 克隆出 a 1 2 脂肪酸去饱和酶基因( p t f a d 2 、p t f a d 6 ) ，将a 1 2 脂肪酸去饱和酶n 端序 列和g f p 基因在三角褐指藻中融合表达，从而确定这两种去饱和酶分别是微 粒体和质体的脂肪酸去饱和酶。 通过将上述基因在酿酒酵母和蓝藻s y n e c h o c o c c u s 中异源表达，发现这 两类脂肪酸去饱和酶对底物偏好不同，来自微粒体的a 1 2 脂肪酸去饱和酶能 特异作用于油酸( 1 8 ：l 矗9 ) ，合成m 6p u f a s ( 1 8 ：i 。l g t 2 ) ；而来自质体的脂肪酸去 饱和酶只能以1 6 ：l a 7 作为底物。将油菜籽的质体a 1 2 脂肪酸去饱和酶也同时 在酿酒酵母和蓝藻中表达后，发现它对1 8 ：1 a 9 和1 6 ：1a 7 都具有高活性。因 此，推测微粒体的脂肪酸去饱和酶更可能参与e p a 的生物合成，而质体的脂 肪酸去饱和酶可能来源予原核生物，倾向于催化合成1 6 ：3 矗6 9 1 2 。 2 0 0 4 年，a p i r a d e eh 2 0 l 等从蓝藻的螺旋藻中分离到a 1 2 脂肪酸去饱和酶 基因，并在大肠杆菌中实现功能表达。另外，将来自其它微藻的6 和9 脂 肪酸去饱和酶基因在大肠杆菌系统中表达时a 9 脂肪酸去饱和酶基因能表达 1 0 出具有功能活性的蛋白，而6 脂肪酸去饱和酶基因活性则被抑制。推测不 同微藻的不同脂肪酸去饱和酶可能有各自特异的辅助系统；说明大肠杆菌具 备螺旋藻中使a 9 、a 1 2 脂肪酸去饱和酶起催化作用的辅助因子，大肠杆菌中 的辅助系统不能有效辅助螺旋藻的6 脂肪酸去饱和酶发挥其催化作用 1 2 研究目的 1 2 1g c m s 分析6 种海洋微藻中多不饱和脂肪酸含量和组成 1 2 2r a c e - p c r 克隆新的脂肪酸去饱和酶全长c d n a 序列 1 2 3 运用生物信息学方法对序列结构和功能进行分析和预测 1 2 4 原核表达系统检测候选脂肪酸去饱和酶的表达和功能活性 1 3 研究内容 1 3 16 种海洋微藻中多不饱和脂肪酸的研究 1 3 2 运用3 和5 e d n a 末端快速扩增p c r ( 黜虻b p c r ) 扩增候选脂肪酸去 饱和酶基因的全长c d n a 序列 1 3 3 通过与数据库中脂肪酸去饱和酶c d n a 序列信息进行同源性比较分析 新基因序列信息 1 3 4 运用原核表达系统对候选脂肪酸去饱和酶基因进行研究 第一部分g c - m s 检测6 种海洋微藻脂肪酸 单细胞海洋微藻因其含有丰富的蛋白质和淀粉，通常作为双壳类软体动物和 鱼、虾类等幼体的良好食料。而海洋微藻体内高含的多不饱和脂肪酸也引起了广 泛的关注。本文参考康景轩【2 1 1 等的简便方法，测定了6 种湛江地区典型的海洋经 济微藻，即微绿球藻( n a n n o c t d o r o p s i sc u l a t a ) , 小球藻( c h l o r e l l a 咧、湛江等 鞭金藻( 1 s o c h r y s i sz h a n f i a n g g e n s i s ) 、绿色巴夫藻( p a v l o v a 恸耐动、角毛藻 ( c h a e t o c e r o se 刚、三角褐指藻( p h a e o d a c t y l u mt r i c o r n u t u m ) 的脂肪酸和多不饱 和脂肪酸的含量、种类组成，以期达到对单细胞海洋微藻所产生的多不饱和脂肪 酸的含量和种类进行比较分析。 2 1 材料与方法 2 1 1 主要仪器 气相色谱( g c 1 7 a ) 一质谱( m s q p 5 0 0 0 ) 联用仪日本岛津公司 d b - - w a x 毛细管柱( 3 0 m 0 2 5 m m x 0 2 5 t t m )美国j & w 公司 o m e g a - - w a x 毛细管柱( 3 0 m x 0 2 5 m m x 0 2 5 p r o )美孱j w 公司 b s 型三用水箱北京医疗设备厂 $ 0 - - 2 b 低速台式离心机上海安亭科学仪器厂 a e - - 2 4 0 型电子分析天平 m e t t l e r - - t o l e d o 仪器公司 g b 2 0 0 2 型电子分析天平m e t t l e r - - t o l e d o 仪器公司 微量移液器 法国c _ h l s o n 公司 普通氮气湛江氧气厂 2 1 2 主要试剂 1 4 b f j m e o h 3 7 种组分脂肪酸甲酯类( f a m e ) 混标 1 4 种组分脂肪酸甲酯类( f ：a m e ) 混标 十七碳饱和脂肪酸标准品 无水甲醇 正己烷 美国s i g m a 公司 美国s u p e l c o 公司 美国s i g m a 公司 美国s i g m a 公司 国产分析纯 国产分析纯 2 1 3 方法 1 微藻培养 实验选用的为湛江地区的6 种经济海洋微藻，分别是微绿球藻、小球藻、湛 江等鞭金藻、绿色巴夫藻、角毛藻、三角褐指藻，藻种由广东海洋大学藻种室提 供，培养液采用湛水1 0 7 1 9 号配方，藻种按1 0 接种量在25 0 0m l 的锥形瓶中 1 6 8 ( 光照，黑暗) 的环境中培养，培养温度为2 0 - j ：2 。 2 微藻脂肪酸的抽提和甲酯化一步法嘶翻 样品中的脂肪酸在b f 3 作催化剂的条件下，与甲醇反应，生成相应的脂肪酸 甲醑，经气相色谱分离并测定。 取一定体积藻液，3 0 0 0 f r a i n 离心1 0 m i n ，消毒淡水清洗2 3 次，经冷冻干燥， 低温( 4 ) 保存。干燥的藻泥用玻璃匀浆器匀浆后。取5 m g 左右，加l m l 正 己烷，1 0 0 l 内标c j t o ( 0 2 m g m l ) ，l m l1 4 的三氟化硼( b o r o n t r i f l u o r i d e ，b f 3 ) 甲醇( m e t h a n o l ，m e o o ，充氮气密封。1 0 0 c 水浴4 0 r a i n 。冷却至室温后，加入l m l 三蒸水，3 0 0 0 r p m 离心5 m i n ，吸取上层溶液，在n 2 下浓缩。供气相色谱一质谱 联用分析。 3 气相色谱一质谱联用检测分析 定性分析：在相同的色谱条件下，分别与c 4 c 2 4 脂肪酸甲酯混合标准中各组 分的保留时问进行比较，与样品中各组分的保留时间进行比较定性。 定量分析：在一定操作条件下，分析组分i 的质量( n i l ) 或其浓度与检测器 的响应信号( 色谱图上表现为峰面积a i 或峰高h i ) 成正比，这就是色谱定量分 析的依据。 设定仪器检测程序m c 4 ( 详细的m c 4 气相色谱质谱参数和程序见附录三) ， 色谱柱为d b w a x 毛细管柱，载气为氦气，柱前压为4 3 9 k p a ，柱流速为 0 7 m l m i n ，注射器温度为2 6 0 0 ，接口温度为2 3 0 0 c ；色谱柱初始温度为1 0 0 ，保持1 0 m i n 后，以1 5 r a i n 的速度升至2 2 0 c 保持1 3 0 m i n ，再以1 0 c r a i n 升至2 5 0 c 保持1 5 m i n 。进样方式为分流进样，分流比为2 0 ：1 。 2 2 结果 2 2 1 微藻的形态结构 图4 绿色巴夫藻4