（生物化学与分子生物学专业论文）蕺菜属资源rdna+its序列分析.pdf

蕺菜属资源r d n ai t s 序列分析 研究生：赵欢 导师：吴卫教授 摘要 蕺菜为三自草科蕺菜属( h o u t t u y n i ac o r d a t at h u n b ) 植物，具清热解毒、 消痈排脓、利尿通淋等功能。四川省为蕺菜的主要产区之一。据中国植物志 和四川植物志，蕺菜属植物仅蕺菜h o u t t u y n i ac o r d a t at h u n b 1 种：2 0 0 1 年， 祝正银和张士良在峨眉山发现蕺菜属新种峨眉蕺菜h o u t t u y n i ae m e i e n s i sz y z h u e ts l z h a n g 。该种在峨眉、乐山等地俗称白侧耳根，也作蔬菜和鱼腥草药用。 四川和重庆地区的蕺菜资源分布很广，遗传多样性较大，存在1 1 种不同细胞 型和2 种不同化学型。本研究对四川和重庆地区的2 3 份蕺菜属资源的核糖体d n a ( r d n a ) i t s 区序列进行分析，探讨其与蕺菜细胞型和化学型间关系。得到以下 主要结果： 1 对2 3 份蕺菜属资源进行r d n a i t s 序列分析，得到1 4 7 条i t s 序列，长度 范围为6 7 0 - - 一6 8 4 b p 。其中，i t s l 的长度变异范围为2 3 1 - - 一2 4 5 b p ， 5 8 s r d n a 和 i t s 2 的长度均分别为1 6 4 b p 、2 7 5 b p 。g c 含量在所测材料中为5 5 5 - - 一5 6 9 ， 平均值为5 6 4 ；其中，i t s l 区的变化范围为5 4 7 - 5 6 - 3 ，i t s 2 区为5 8 9 6 0 4 ，其平均值分别为5 5 8 和5 9 8 ；5 8 s r d n a 为5 1 2 5 2 8 ，平均值 5 1 8 。 2 在所测2 3 份蕺菜属资源材料的i t s 区( 含5 8 s r d n a ) 的1 4 7 条序列中，共 有4 8 个信息位点和1 3 6 个变异位点，分别占总序列的7 0 2 和1 9 9 。其中i t s l 具有2 2 个信息位点和5 6 个变异位点，分别占3 2 2 和8 1 9 ；i t s 2 有1 6 个信 息位点和4 0 个变异位点，分别占2 3 4 和5 8 5 ；5 8 s r d n a 有8 个信息位点和 1 6 个变异位点，分别占1 1 7 和2 3 3 。 3 除w 0 1 1 6 、w 0 1 1 0 0 、和w 1 0 0 3 7 的个别序列外，其余每份材料的各i t s 序列长度均相同。w 0 1 1 6 、w 0 1 1 0 0 和w 1 0 0 3 7 的个别i t s 序列长度的变异均 位于i t s l ，i t s 2 和5 8 s r d n a 均无长度上差异。w 1 0 0 3 7 的i t s l 长度在所测序 列中变化范围最大，为2 3 1 - 一2 4 5 b p 。其中，以w 0 1 3 7 7 的i t s l 长度最短 ( 2 3 l b p ) 。 4 所有蕺菜材料细胞型( 包括八b ，c ，d ，e ，f ，gh ，i ，j 和k ) 内g s 值分别为 0 0 0 5 6 、0 0 0 4 0 、0 0 0 9 6 、0 0 0 7 7 、0 0 0 9 1 、0 0 1 3 7 、0 0 0 9 2 、0 0 0 6 9 、0 0 0 9 3 、0 0 0 5 8 和o 0 0 8 9 ，平均值为0 0 0 8 2 。以染色体数目为8 2 的细胞型类内g s 值最大( 0 0 1 3 7 ) ， 其次是染色体数目为7 2 的细胞型( 0 0 0 9 6 ) ，染色体数目为5 4 的细胞型内g s 最小( o 0 0 4 0 ) 。 5 比较这1 1 种不同细胞型的i t s 序列可发现i5 8 s r d n a 序列高度保守， 而i t s l 和i t s 2 核苷酸序列变化较大。细胞型内i t s 序列变异比细胞型间变异小。 染色体数目小于7 2 的材料比染色体数目大于或等于7 2 的材料变异位点数目少。 进一步分析发现，不同细胞型蕺菜材料类间g s 值以染色体数目为3 6 和8 2 的细 胞型间最大，为0 0 1 4 9 ：以染色体数目为3 6 和5 4 的细胞型间最小，为0 0 0 5 1 。 6 以白苞裸裸蒴a f 2 0 3 6 2 8 为外分类群，根据蕺菜属资源i t s 序列遗传相似系 数，采用邻接法( n e i g h b o r i n gm e t h o d ) 进行聚类分析发现，基于r r s 序列划分的 类群与细胞型间存在一定关系，所有供试材料的i t s 序列可分为5 类。其中，a 类 包括除w 0 1 9 9 ，w 0 1 4 5 和w 0 1 7 1 # b 的所有材料，b 类材料染色体数大于或等于7 2 ： w 0 1 8 1 1 、w 0 1 8 1 3 和w 0 1 8 1 4 分别单独聚为一类。试验结果还表明，基于i t s 序列划分的类群与化学型间也存在一定关系。 7 聚类图表明，同一份材料的几个不同i t s 序列往往分布在不同的大类中， 故利用r d n ai t s 序列不能将2 3 份不同材料全部区分开，且峨眉蕺菜w 0 1 8 6 与染 色体数目为3 6 的蕺菜材料w 0 1 9 、w 0 1 2 2 和w 0 1 - 4 8 在i t s 序列上无显著差异。试 验结果还表明，蕺菜属资源根据r d n ai t s 区划分的类群同地理分布间相关不明 显。 关键词：蕺菜，种质资源，系统发育，i t s ，分子标记，细胞型，化学型 p h y l o g e n i cr e l a t i o n s h i po fh o u t t u y n i at h u n b b a s e do ni n t e r n a lt r a n s c r i b e ds p a c e r ( i t s ) s e q u e n c e so fn u c l e a rr i b o s o m a ld n a z h a oh u a n d i r e c t e db yd r w uw e i a b s t r a c t h o u t t u y n i ac o r d a t at h u n b b e l o n g st og e n u sh o u t t u y n i ao fs a u r u r a c e a e i th a s t h ef u n c t i o no fa n t i b a c t e r i a l ，a n t i - v i r u sa n dd i u r e s i s ，a n dc o u l de n h a n c eb o d y i m m u n i t y s i c h u a np r o v i n c ei so n eo ft h em a i np r o d u c i n ga r e a so fh c o r d a t at h u n b h c o r d a t ai st h eo n l ys p e c i e si nh o u t t u y n i at h u n b 。a c c o r d i n gt of l o r a er e i p u b l i c a e p o p u l a r i ss i n i c a ea n df l o r as i c h u a n i c a z h ue ta 1 ( 2 0 0 1 ) c l a s s i f i e da n e w s p e c i e sh e m e i e n s i sz yz h ue ts l z h a n gi nt h eg e n u sh o u t t u y n i ac o l l e c t e da te m e i m o u n t a i ni ns i c h u a np r o v i n c e i tw a sc a l l e dc o m m o n l ya sw h i t ey u x i n g c a o ，w h i c h w a sa l s ou s e da sv e g e t a b l ea n dh e r b ah o u t t y n i a ei ne m e ia n dl e s h a nr e g i o n s h o u t t u y n i a i sw i d e l ys p r e a di ns i c h u a na n dc h o n g q i n gr e g i o n so fc h i n a , i n c l u d i n giic y t o t y p e sa n d2c h e m o t y p e s t h e r ee x i s t e dp l e n t i f u lg e n e t i cv a r i a t i o n s a m o n gg e n u sh o u t t u y n i ag e r m p l a s mr e s o u r c e s i nt h i sp a p e r , w e r ea n a l y z e d t h e m a i nr e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 t h ep c rp r o d u c tl e n g t ho ft h ee n t i r ei t sr e g i o n s ( i n c l u d i n g5 8 s r d n a ) i n h o u t t u y n i aw a sf o u n dt o f l u c t u a t eb e t w e e n6 7 0 b pa n d6 8 4 b p t h el e n g t ho fi t s l v a r i e df r o m2 31t o2 4 5 b p ，w h i l et h a to fi t s 2w a su n i f o r m l y2 7 5 b pf o ra l la c c e s s i o n s t h eo v e r a l ll e n g t ho ft h e5 8 ss u b u n i to fa uh o u t t u y n i aa c c e s s i o n se x a m i n e dw a sa l s o u n i f o r m l y16 4 b p t h eg + cc o m p o s i t i o no ft h eh o u t t u y n i ai t sw e r es i m i l a r , w i t h v a r i a t i o nf r o m5 5 5 t o5 6 9 f o rt h ee n t i r es p a c e rr e g i o n ；f r o m5 4 7 t o5 6 3 f o r i t s1 f r o m51 2 t o5 2 8 f o r5 8 s ，a n df r o m5 8 9 t o6 0 4 f o ri t s 2 ，w i t ha n a v e r a g eo f5 6 4 ，5 5 8 ，51 8 ，5 9 8 ，r e s p e c t i v e l y 2 a l i g n m e n to ft h ee n t i r ei t ss e q u e n c e sf r o m2 3a c c e s s i o n sw e r ea n a l y z e d i t r e s u l t e di n6 8 4c h a r a c t e r s ，o fw h i c h4 3 p o s i t i o n s ( 7 0 2 ) w e r ep o t e n t i a l l y p h y l o g e n e t i c a l l yi n f o r m a t i v es i t e sa n d13 6p o s i t i o n s ( 19 9 呦w e r ev a r i a b l es i t e st h e i t s lr e g i o nh a d2 2i n f o r m a t i v es i t e s ( 3 2 2 ) a n d5 6v a r i a b l es i t e s ( 8 1 9 ) ，w h i l et h e i t s 2r e g i o nh a d1 6i n f o r m a t i v es i t e s ( 2 3 4 ) a n d4 0v a r i a b l es i t e s ( 5 8 4 ) t h e r e w e r e8i n f o r m a t i v es i t e s ( 1 1 7 ) a n d1 6v a r i a b l es i t e s ( 2 3 3 ) 3 t h el e n g t h so fa m p l i f i e df r a g m e n t sf r o me a c hi n t r a - i n d i v i d u a lt a x aa r es i m i l a r t oe a c ho t h e r , w i t ht h ee x c e p t i o no f w 0 1 1 6 、w 0 1 1 0 0 、a n dw 0 1 - 3 7 ，w h i c hr e s u l t e d f r o mt h ev a r i a t i o n si ni t s l t h eo v e r a l ls i z eo ft h ei t s 2a n d5 8 sr i b o s o m a lr n a g e n ei nw 0 1 1 6 、w 0 1 1 0 0a n dw 0 1 3 7w e r e ，r e s p e c t i v e l y , 2 7 5a n d1 6 4 b p s e q u e n c e a n a l y s i s o ft h ei t s1 a m o n gd i f f e r e n ts e q u e n c ei nw 0 1 - 3 7r e v e a l e ds e q u e n c e v a r i a b i l i t y , w i t hs i z e sr a n g i n gf r o m2 3 1t o2 4 5 b p w 0 1 - 3 7 - 9h a dt h es h o r t e s ti t s l l e n g t ha m o n gg e n u sh o u t t u y n i a ，n a m e l y2 31 b p ，i n d i c a t i n gt h ep r e s e n c eo fad e l e t i o n i nt h i sa c c e s s i o n 4 t h ea v e r a g ei n t r a c y t o t y p i c g e n e t i cs i m i l a r i t y ( g s ) v a l u e sw i t h i n 11 c y t o t y p e s ( i n c l u d i n g 八b ，c ，d ，e ，f ，gh ，i ，ja n di ( ) w e r e0 0 0 5 6 ，0 0 0 4 0 ，0 0 0 9 6 ， o 0 0 7 7 ，0 0 0 9 1 ，0 0 1 3 7 ，0 0 0 9 2 ，o 0 0 6 9 ，0 0 0 9 3 ，0 0 0 5 8 ，o 0 0 8 9r e s p e c t i v e l y , w i t ht h e a v e r a g eo fo 0 0 8 2 t h ei n t r a c y t o t y p i cv a r i a b l es i t e s ( 4 2 ) a n dt h ei n t r a c y t o t y p i c i n f o r m a t i v es i t e s ( 15 ) o fc y t o t y p ef ( c h r o m o s o m en u m b e ro f8 2 ) w e r et h eh i g h e s t t h ei n t r a c y t o t y p i cv a r i a b l es i t e s ( 15 ) a n dt h ei n t r a c y t o t y p i ci n f o r m a t i v es i t e s ( 4 ) o f c y t o t y p eb ( c h r o m o s o m en u m b e ro f5 4 ) w e r et h el o w e s t 5 a l i g n m e n to ft h e 11d i f f e r e n tc y t o t y p e sr e s u l t e di n6 8 4a l i g n e dc h a r a c t e r s ( w i t h o u tg a p s ) ac o m p a r i s o no f11d i f f e r e n tc y t o t y p e sr e v e a l e dt h a ti t ss e q u e n c eo f h o u t t u y n i aa c c e s s i o n sw i t ht h ec h r o m o s o m en u m b e rl e s st h a n7 2h a v el e s sv a r i a t i o n t h a nt h o s ew i t ht h ec h r o m o s o m en u m b e rm o r et h a n7 2 t h ea v e r a g eg sb e t w e e nh e m e i e n s i sa n d 且c o r d a t aa c c e s s i o n sb a s e do ni t sr a n g e df r o m0 0 0 51b e t w e e n c y t o t y p eba n da ( c h r o m o s o m en u m b e ro f 3 6 ) t oo 0 1 4 9b e t w e e nc y t o t y p ef a n d a 6 t h en e i g h b o r - j o i n i n gd i s t a n c em e t h o db a s e do nh o u t t u y n i ai t ss e q u e n c e s a n a l y s i sw i t ha f 2 0 3 6 2 8a so u t g r o u pt h ea c c e s s i o n si nt h i ss t u d yw e r ec l a s s i f i e da s t h r e es o l ea c c e s s i o ng r o u p sa n dt w ob i gg r o u p s ( g r o u paa n dg r o u pb ) b a s e do ni t s g r o u pbo n l yc o n s i s t e do fh o u t t u y n i aa c c e s s i o n sw i t ht h ec h r o m o s o m en u m b e r e 7 2 ，w h i l eg r o u pa c o n s i s t e do fa l m o s ta l lh o u t t u y n i aa c c e s s i o n s ，e x c e p tf o rw 01 9 9 ， w 0 1 - 4 5a n dw 0 1 - 7 1 ，t h ea c c e s s i o n sw 0 1 - 8 1 - 1 、w 0 1 - 8 1 - 3a n dw 0 1 - 8 1 4mt h i s s t u d yw e r ec l a s s i f i e da st h e r es o l ea c c e s s i o ng r o u p s t h i si n d i c a t e dt h eg r o u p sb a s e d o ni t sg s ，t os o m ee x t e n t ，a s s o c i a t e dw i t ht h ec h r o m o s o m en u m b e r , a l t h o u g hm o s t a c c e s s i o n s 、析mt h es a m ec h r o m o s o m en u m b e rw e r es e p a r a t e df r o me a c ho t h e r 7 o u rr e s u l to fp h y l o g e n e t i ca n a l y s i sc l e a r l yd e m o n s t r a t e dt h a th e m e i e n s i s a c c e s s i o n sc o u l dn o tc o m p l e t e l ys e p a r a t ef r o mhc o r d a t aa c c e s s i o n i tc o u l db e o b s e r v e dt h a tt h e r ew a sn os i g n i f i c a n tr e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h eh o u t t u y n i aa c c e s s i o n s i t sa n dt h e i rg e o g r a p h i c a ld i s t r i b u t i o n s t h eg e o g r a p h i cd i s t r i b u t i o no ft h ea c c e s s i o n s f r o mt h et w ob i gg r o u p sh a dn od e f i n i t eb o u n d a r y k e yw o r d s ：h o u t t u y n i a ；g e r m p l a s mr e s o u r c e s ；p h y l o g e n i cr e l a t i o n s h i p ，i t s ，c o n t e n t s ； c y t o t y p e s ，c h e m o t y p e s 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取 得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包 含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学 或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所 做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：赵弘7 ：、 关于论文使用授权的声明 谢年6 目w 日 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业 大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名：圣影久 1 导师签名：关7 - 洳g 年毛只归 ， 舢g 年舌只这i t 1 文献综述 蕺菜h o u t t u y n i ac o r d a t at h u n b 为三白草科( s a u r u r a c e a e ) 蕺菜属( h o u t t u y n i a ) 多年生草本植物，俗名鱼腥草，为常用中药之一【l 】。蕺菜始载于名医别录， 认为其具清热解毒，利尿消肿等功能。现代医学研究表明，蕺菜全草入药，性寒 味辛，有清热解毒、利尿消肿、祛痰止咳、镇痛化瘀等功效，尤其抗菌、抗病毒 作用明显【2 卅。现代药理研究表明，蕺菜具有抗病毒、抗菌、抗血小板凝聚作用， 可增强中性白细胞的吞噬功能，还具有平喘和利尿的作用【5 1 。 蕺菜除含有丰富的药用成分，其嫩叶及根茎还含充足的营养成分，是产地民 间的特味野菜。自国家卫生部正式确定为“既是药品，又是食品”的极具开发潜 力的资源之后，蕺菜的丌发利用及基础研究上有了突破性进展，并在制药、化妆 品、保健食品、保健饮料等领域开发出一系列的产品0 1 。此外，蕺菜还可用于 园林绿化】。 11 蕺菜研究概况 1 1 2 资源分布概况 蕺菜h o u t t u y n i ac o r d a t at h u n b ，多年生草本，高1 5 9 0 c m ，有特殊的鱼腥臭 气味。据中国植物志和地方植物志，蕺菜属仅蕺菜h o u t t u y n i ac o r d a t at h u n b 1 种。其广泛分布于亚洲东部和东南部的中国、马来西亚、印度、泰国、同本及 印度尼西亚等国，我国主要分布于西南、华南、中南及华东等地，四i l 为其主产 区之一。蕺菜常生长于海拔3 0 0 - - - 2 6 0 0 m 的山坡、f f t 埂及草丛中【1 2 j3 1 。2 0 0 1 年， 祝正银和张志良在四川峨眉山发现蕺菜属一新种峨眉蕺菜( h o u t t u y n i ae m e i e n s i s z y z h ue ts l z h a n g ) ，在当地俗称白鱼腥草、白侧耳根、青侧耳根，也作鱼 腥草药蔬兼用【1 4 】，早在唐代新修本草中就有“叶似养麦，肥地办能蔓生，茎 紫赤色，多生湿地，山谷阴处。山南江左人好生食之的记载。蕺菜( 鱼腥草) 从4 0 年代初开始进行人工栽培，逐渐发展成为种商品性蔬菜，目前在云南、 贵州、四川等地栽培较多。根据生物学特性及多年的资源普查，其在四川的主要 产地有力源、南江、巴中、隆昌、泸县、古蔺、合江、平昌、宣汉、达县、渠县、 简阳、安岳、威远、纳溪、江安、长宁、珙县、高县、筠连、屏山、宜宾、芦山、 汉源、石棉、名山、天全、荥经、雅安、峨眉、仁寿、青神等县市。人工种植入 药较集中的为雅安市，主要为鱼腥草注射液提供鲜草原料，其余地区人工种植主 要用作干草入药或作为食用蔬菜。 1 1 2 系统进化研究 三白草科是间断分布于亚洲北美的一个十分古老的残存小科，共4 属6 种， 中国产3 属4 种。其中，蕺菜属仅1 种，即鱼腥草。关于蕺菜属的系统演化研究， 梁汉兴等【15 】联系古地理、古气候和古植物等资料对三白草科4 属6 种的系统演化 关系进行研究，认为三白草科大约起源于早白至纪古北大陆东南部。其原始类型 可能与现代三白草属的形态大体相似，为一种多年生具根状茎的草本，花小、无 被、具苞片。白垩纪术期三白草的原始类群已完成它在古北大陆的迁移和扩散。 第三纪以后在东亚和北美分别形成两个分化中心。由于三白草科为喜温湿的亚热 带类群，第四纪冰川之后，它在欧洲和西亚的成员灭绝，从而形成东亚一北美间 断分布的格局。东亚现存四分之三的属并代表着科内从原始到进化的各个阶段， 是三白草科多样化中心和可能的起源地。其文中还认为，蕺菜为三白草科中较为 进化的类群，估计其在渐新世后期至第四纪初是十分繁荣的一支，在东亚地区广 阔的中原和南方分化了不少近缘种类，通过种间杂交及伴随的多倍化，出现了一 批无融合生殖的种宗。凭借杂种优势及无融合生殖对这种优势的保持，敢菜属曾 有过强大竞争力和广泛的适应性，在纬度和海拔的分布上都占了全科的优势。现 代的蕺菜是它无融合种宗的孑遗。 孟少武等【1 6 】对三白草科的比较胚胎学研究认为蕺菜属是三白草科最进化的 属。另外，部分学者对三白草科根茎解剖学、系统发育和起源、分子系统学与分 子地理学、裸蒴属及其近缘属( 包括蕺菜属) 的叶片表皮特征等进行了研究与分 析 1 7 1 引。杨玉霞等对采自四川、重庆、江苏等地蕺菜属的2 5 个不同居群间进行 了比较解剖学研究，发现蕺菜属不同居群间的根、地上茎、地下茎、叶等器官在 解剖结构上存在较大差异，但峨眉蕺菜与蕺菜解剖结构的种间差异不明显引。随 着分子生物学的发展，孟少武等【2 0 】利用5 8 s r d n a 序列对三白草科的系统发育进 2 行进一步的研究。结果表明，假银莲花属最早从三白草科分离出来，三白草和美 洲三白草是对姐妹群。由于5 8 s r d n a 序列变异位点比较少，所提供的信息量 不足，裸蒴、白苞裸蒴、蕺菜与三白草属间难以通过5 8 s r d n a 的序列进行分辨。 同时，孟少武等【2 1 】还利用线粒体m a r k 基因序列对三白草科的系统发育进行分析， 发现三白草科的一个单系，假银莲花属是蕺菜属的姐妹群，他们构成三白草科的 第一个分支，这一分支是裸蒴属和三白草属的姐妹群。以上研究主要是针对三白 草科不同属种间的系统演化关系进行的。 对于蕺菜属内资源问遗传关系的研究，吴卫等曾从四川、贵州、江苏等地收 集了大量蕺菜资源，结果发现这些资源的株高、茎叶颜色、叶片大小和形状以及 生物学产量、抗病性等均存在较大差异。细胞学方面，熊大胜等用去壁低渗染色 体制片方法，对蕺菜腋芽细胞染色体制片，发现鱼腥草为二倍体、染色体数目为 2 2 ；染色体核型公式为2 n = 2 x = 2 2 = 1 0 m + 1 0 a m + 2 t 幢引江年琼等曾对三白草和蕺菜 的核型进行分析，认为蕺菜属通过染色体非整倍性增加( x = 1 2 ) 和多倍化 ( 2 n = 8 x = 9 6 ) 进行演化，根据该属的高倍性，将其确定为科内较为进化的类群【2 3 1 。 梁汉兴等报道蕺菜染色体基数x = 1 2 ，可能是由假定的三白草科原始祖先的染色体 基数x = 1 1 经非整倍增加而产生的。植株倍性有二倍体和八倍体，是科内倍性水 平最高的一属1 2 制。吴卫等对四川和重庆地区9 0 余份材料根尖体细胞染色体数目的 研究发现，其染色体数目变化范围为3 6 1 2 6 ，且在花粉母细胞减数分裂二分体、 四分体和花粉粒形成初期具核穿壁现象，核物质的转移通过胞间连丝、接合孔和 接合管进行f 2 5 】。生化与分子生物学方面，吴卫等先后应用同工酶、廿d ( r a n d o m a m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ) 、r a m p ( r a n d o ma m p l i f i e dm i c r o s a t e l l i t ep o l y m o r p h i c d n a ) 、i s s r ( i n t e r - s i m p l es e q u e n c er e p e a t ) 及细胞质基因组p c r r f l p 等多种生 化与分子标记技术对蕺菜属种质资源进行检测，结果发现，蕺菜种质资源存在丰 富的遗传多样性，细胞质基因组的多态性远低于核基因组的多念性。随着染色体 数目增加，蕺菜资源过氧化物酶和酯酶谱带数有增加的趋势，酶谱类型也逐渐丰 富；过氧化物酶酶带数在纬度偏北地区相对较多，偏南地区相对较少，酯酶酶谱 在此范围内无地理分布差异。根据r a p d 遗传相似系数划分的类群主要同地理分 布有关，根据凡6 山但和i s s r 标记的聚类结果则与地理分布和染色体数目均相关。 四川瓮地中部的平原及四周丘陵和低山地区鱼腥草资源的遗传多样性相对较低， 越靠近笳周山区和边缘地带，遗传多样性越丰富。蕺菜栽培类群遗传多样性略高 于野生类群。基于细胞学以及多种分子标记技术的研究结果，吴卫等还对蕺菜资 源的系统演化关系进行了探讨。认为蕺菜种质资源的多倍体中，可能有早期通过 种间杂交及伴随的多倍化形成的古多倍体，也有后来经核穿壁现象形成的包括同 源多倍体、异源多倍体、同源异源多倍体在内的大量整倍性和非整倍性的多倍体。 并且，这些多倍体的起源可能在不同居群中独立地重复发生，使得蕺菜属种质资 源遗传多样性非常丰富。此外，峨眉蕺菜he m e i e n s i s 染色体数目为3 6 ，生化与 分子水平上的检测结果均表明，它与蕺菜hc o r d a t a 中染色体数目为3 6 的细胞型 间的遗传关系非常近，建议将其处理为蕺菜的一个变种【2 6 3 0 1 。 1 1 3 蕺菜的挥发油 挥发油成分是蕺菜的主要药效成分，对于蕺菜挥发油化学成分的研究，早在 1 9 2 1 年国外就报道过癸醛、月桂醛及甲基正壬酮等有效成分。接着又从其根茎 的精油中分离出抗菌物质癸酰乙醛。国内则始于刘永澄等采用g c m s 和t l c 进 行的研究，他们从蕺菜中分离出2 0 个组分，鉴定出了1 0 个化合物【3 。已有的 研究发现鱼腥草挥发主要成分有癸酰乙醛( 鱼腥草素) 、月桂醛，两者均有特异臭 气。还含蒎烯( a - p i n e n e ) 、莰烯( c a m p h e n e ) 、口月桂烯( p - m y r c e n e ) 、d 一柠檬烯 ( d 1 i m o n e n e ) 、乙酸龙脑酯( b o m y la c e t a t e ) 、甲基j 下壬酮( 2 u n d e c a n o n e ) 、癸酰乙醛 ( d e c a n o y la c e t a l d e h y d e ) 、癸醛( d e c a n a l ) 、月桂醛( d o d e c a n a l d e h y d e ) 、乙基癸酸酯 ( e t h y ld e c a n o a t e ) 、丁子香素( c a r y o p h y l l e n e ) 等【3 2 4 2 1 。此外，还含绿原酸、棕榈酸、 亚油酸、油酸和硬脂酸等。 蕺菜挥发油一般按中华人民共和国药典方法，用水蒸汽蒸馏提取。目前， 其挥发油的提取方法主要有水蒸汽蒸馏法、有机溶剂提取法、超临界c 0 2 萃取 法和闪蒸法等。不同的提取方法。蕺菜挥发油成分也有所差异。齐迎春等按中 国药典1 9 9 0 年版一部附录挥发油测定法甲法进行测定，结果栽培蕺菜全草挥 发油含量平均得率为0 0 3 4 ( v w ) ；野生者为0 0 3 8 ( v w ) t 4 3 1 。郝小燕等曾采用 水蒸气蒸馏和石油醚萃耿的方法分别提取黔产野生蕺菜的精油和净油，g c m s 的分析结果表明，两种方法所得到的成分不尽一致，精油成分有4 0 个，而净油 成分达4 8 个【4 4 】。曾虹燕等分别采用水蒸气蒸馏法、石油醚萃取法和超临界c 0 2 4 萃取法对购自湖南邵东的蕺菜干品挥发油进行过g c m s 分析，超临界c 0 2 萃取 法所的得挥发油得率最高，为1 7 6 4 ，癸酰乙醛与甲基正壬酮含量在不同方法 下的得率不同，超临界c 0 2 萃取含较多的癸酰乙醛，水蒸汽蒸馏含较多的甲基 正壬酮，石油醚萃取法中未发现癸酰乙醛和甲基正壬酮【4 5 1 。陈春燕等采用了闪 蒸气相色谱( f e g c ) 对蕺菜挥发性组分进行了分析，用质谱法鉴定了挥发性 物质的化学组成，和传统的水蒸汽蒸馏法进行了对比，该方法简单、快捷、可靠， 样品粉末可直接用于分析，不需要前处理过程，样品用量少m 】。此后，许多学 者纷纷采用不同的提取、检测方法，对提取的挥发油的化学成分结合g c m s 和 t l c 等方法进行分离鉴定并结合比色法、分光光度法、气相色谱法等对某些化 学成分的含量进行测定【4 7 - 5 5 1 。其中，以g c m s 和h p l c 法应用较多。 陈黎等分别对川产蕺菜鲜草地上、地下部分及阴干地上部分的挥发油成分 进行薄层色谱分析，结果发现，挥发油t l c 图谱斑点数目和清晰度不同，2 0 份 鲜草的地上部分大致呈现5 种类型，地下部分大致呈现3 种类型，1 9 份干草的 地上部分大致呈现4 种类型。鲜草地上和地下部分挥发油、鲜草与干草地上部分 挥发油在化学成分上均有较大差异，材料间挥发油成分差异以鲜草大于干草，地 上部分大于地下部分。陈黎等进一步采用c , - c m s 法从新鲜蕺菜地上部分共鉴 定出5 3 种成分，其含量占地上部分挥发油总量的9 9 3 3 。其中1 5 种成分存在 于所有供试的1 9 份来源于不同地区的样品中，总含量约占地上部分挥发油总量 的7 5 4 2 。这些成分分别是蒎烯、伊蒎烯、月桂烯、壬醛、壬醇、癸醛、癸 醇、乙酸龙脑酯、甲基正壬酮、十一烷醛、癸酸、月桂醛、十三烷酮、乙基癸酸 酯等。此外，多数样品含有莰烯、水芹烯、柠檬烯、癸酰乙醛等。从鲜蕺菜地下 部分共鉴定出3 8 种成分，其含量占地上部分挥发油总量的9 9 0 8 。其中2 3 种 成分存在于所有供试材料中，含量约占地上部分挥发油总量的9 6 9 8 ，分别是 蒎烯、p 蒎烯、月桂烯、柠檬烯、甲基正壬酮、癸酰乙醛、乙基癸酸酯、崖柏 烯、莰烯、水芹烯、松油烯、龙脑、乙酸龙脑酯、乙酸橙花酯、十二烷酮、丁子 香素、癸酰乙醛、乙基癸酸酯等，其中前7 种成分的含量相对较高。并且，根据 地上部分挥发油组成为依据，可将所有的供试材料划分为2 种化学型，即癸醛型 和月桂烯型。各材料所属化学型与其染色体数目相关性显著，与其地理分布相关 性不显著。蕺菜地上部分与地下部分挥发油成分差异显著，地上部分单萜含量较 低，非萜类直链碳氢化合物含量较高，地下部分则反之陆钉。黄春燕等对不同化学 型蕺菜不同器官挥发油化学成分进行了研究。结果表明，同一蕺菜材料不同器官 挥发油化学成分不尽一致，不同化学型蕺菜同一器官挥发油化学成分也存在着显 著差异嘲1 。整个生育期不同化学型蕺菜挥发油化学成分含量的动态分析结果表 明，各成分含量在所有材料中的变化趋势比较一致，但不同化学成分间动态变化 趋势不尽相同。单萜烃类成分中，除少数成分在个别材料的个别器官中含量积累 高峰期出现在5 月下旬，7 月和8 月左右外，其余在各器官中含量均随发育期呈 缓慢增加的变化趋势，以1 1 月1 日含量最高；非萜类酮类则随生育期先增加后 降低，以7 月左右含量最高。其余化学类型在整个生长发育期的动态变化比较平 稳j 5 。 1 2 核糖体d n ai t s 区在药用植物研究中的应用 在我国，人们对药用植物的研究有着悠久的历史。随着植物遗传学规律的发 现与应用，染色体的形态与数目用于系统学分析，植物大量次生代谢产物的分离 与鉴定结果用来探讨系统学意义，进一步加深了人们对药用植物的认识。现代分 子生物学技术的迅速发展，使以形态组织学、解剖学等客观指标为划分依据的传 统分类学得到补充，为药用植物的系统与进化研究提供了丰富而翔实的资料，为 解决分类学、系统发育、物种形成与进化等方面的难题提供了极为有力的技术途 径。中药用于疾病防治已有几千年的历史，但由于中药现代品质监控技术不足， 常常出现药材混淆代用、故意伪制的现象，严重影响中药的声誉，甚至危及人身 安全，建立健全完善的中药品质检测技术体系迫在眉睫。目前，越来越多的研究 者将i t s 应用于药用植物的鉴别中，为揭示药用植物的遗传差异和鉴定中药材品 种的道地性提供了新的方法和手段哺。 1 2 11 8 s 2 6 sr r n a 基因的基本结构 目前，核基因组序列在药用植物鉴定和品质研究中的应用主要集中在编码核 糖体r n a 基因n r d n a 重复区内。高等植物细胞核中n r d n a 是高等植物中的 r r n a 基因( r d n a ) 是高度重复的串联序列单位，1 8 s 、5 8 s 和2 6 sr d n a 联结在 一起，作为一个转录单位。5 s r d n a 位于非转- , i f n ( n t s ) 内，它将n t s 分为n t s l 和n t s 2 。1 8 s 2 6 s r d n a 在植物中有一至数个位点r 6 2 , 拷贝数可达5 0 0 - - - 4 0 0 0 0 ， 18 s 一2 6 s rd n a 基本结构由l8 sr d n a 、2 6 sr d n a 、5 8 sr d n a 和位于三者之问 的基因内转录间隔区( i t s ) 组成，其中i t s 区由被5 8 sr d n a 所分隔的i t s i 和i t s 2 两个片段组成饰。其转录物( t r a n s c r i p t ) 不加入成熟核糖体，只是部分地对n r d n a 的成熟起作用。目前，国内外学者已利用n r d n a 中的i t s 片段序列作为分子标 记，在药用植物鉴定和品质研究方面丌展了许多有益的工作。 1 8 s 2 6 s 核r d n a i t s 区在核基因组中高度重复，而且通过不等交换和基因 转换，这些重复单位问已经发生了位点内和位点间的同步进化，即不同i t s 拷 贝间的序列趋于相近或完全一致嘲1 ，且所受选择压力较小，碱基替换速率较快， 进化速度快，加上片段长度变异很小，i t s l 和i t s 2 的长度均不足3 0 0b p ，在绝 大多数被子植物中不足7 0 0b