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摘要 壳聚糖一羧甲基魔芋纳米微球作为蛋白多肽类药物载体的研究 摘要 本文通过静电复合的方法制备了载有模型药物牛血清白蛋白( b s a ) 的壳聚 糖一羧甲基魔芋( c s - c k g m ) 纳米微球。微球的制备工艺简单，载药条件温和， 在水溶液中有良好的分散性和稳定性。我们用粒径电位分析仪、红外光谱仪、 差示扫描热分析仪和透射电镜等仪器分析了空白微球和载药微球的物理化学性 质，并着重考察了c s c k g m 纳米微球对蛋白药物的体外释放情况。研究结果 显示，微球球形规整、表面光滑、粒度分布均匀，z e t a 电位为正值，而且可以 通过改变制备条件制得粒径从几十纳米到几百纳米大小不等的微球；药物的包 封率和载药量与载体材料的配比以及初始蛋白药物的投药量有密切关系；载体 材料的配比，释放介质的p h 值和盐离子强度等因素都会对药物的体外释放产 生影响。此外，我们还对比了c s c k g m 毫米微球的物理化学性质和对蛋白药 物的体外释放行为。最后c s c k g m 空白微球的体外溶菌酶降解实验表明，该 体系的降解机制属于本体降解。 通过以上的研究我们得到如下结论：本体系既具有p h 响应性又具有盐离 子敏感性，可以作为多肽蛋白类药物的载体材料，并能够对药物进行控制释放。 关键词：壳聚糖，羧甲基魔芋，纳米微球，蛋白药物，载体 壳聚糖一羧甲基魔芋纳米微球作为强白多肽类药物载体的研究 c h i t o s a n - c a r b o x y m e t h y lk o n j a c g l u c o m a n n a n n a n o s p h e r e s a s p r o t e i nd r u g c a r r i e r s j i a nd u ( a p p l i e d c h e m i s t r y ) d i r e c t e db yp r o f e s s o ry u x i n gp e n ga n dp r o f e s s o rc h e n g d o n gx i o n g a b s t r a c t c h i t o s a n - c a r b o x y m e t h y lk o n j a cg l u c o m a r m a n ( c s c k g m ) n a n o p a r t i c l e s ， w h i c ha r ew e l l d i s p e r s e d a n ds t a b l e i n a q u e o u ss o l u t i o n ，w e r es p o n t a n e o u s l y p r e p a r e d u n d e rv e r ym i l dc o n d i t i o n sv i ap o l y e l e c t r o w ec o m p l e x a t i o n b o v i n es e r l l m a l b u m i n ( b s a ) ，a sam o d e lp r o t e i nd r u g ，w a si n c o r p o r a t e d i n t ot h ec s - c k g m n a n o p a r t i c l e s t h ep h y s i c o c h e m i c a lp r o p e r t i e s o ft h e d r u g - f r e e a n db s a l o a d e d n a n o p a r t i c l e sw e r ei d e n t i f i e db y z e t a s i z e r3 0 0 0 ，f t - i r ，d s ca n dt e m t h er e l e a s e b e h a v i o ri nv i t r oo fb s af r o mt h en a n o p a r t i c l e sw a sa l s oi n v e s t i g a t e d i tw a sf o t m d t h a tt h ec s c k g mn a n o s p h e r e sw i t hs p h e r i c a la n ds m o o t hs u r f a c e ，s u i t a b l es i z e d i s t r i b u t i o na n dt h ep o s i t i v ez e t ap o t e n t i a lw e r eo b t a i n e d a n dt h ep a r t i c l e sr a n g e d i ns i z ef r o md o z e n st os e v e r a lh u n d r e dn a n o m e t e r s t h ee n c a p s u l a t i o n e f f i c i e n c ya n d d r u gl o a d i n ga r ed i f f e r e n ta c c o r d i n g t ov a r i e sc s c k g mr a t i o sa n da m o u n to fb s a u s e di nf o r m u l a t i o n t h ef a c t o r st h a tc a nh a v ea s i g n i f i c a n te f f e c to n t h eb s ar e l e a s e b e h a v i o rf r o mt h en a n o p a r t i c l e s ，w e r ed i s c u s s e di nt h i ss t u d y , s u c ha sc s c k g m r a t i o s ，p ha n di o n i cs t r e n g t ho fr e l e a s em e d i u m a l s o ，w ec o m p a r e dc s c k g m n a n o s p h e r ew i t hm i c r o s p h e r et h a td i a m e t e rw a sa b o u t1 5 m m i n v e s t i g a t i o n so n t h e h y d r o l y s i s o fc s - c k g mc o m p l e xb yl y s o z y m es h o w e dt h a tt h e h y d r o l y s i s m e c h a n i s mw a sb u l kd e g r a d a t i o n t h i sr e s e a r c h s u g g e s t e dt h a t t h ec s c k g mm a t r i c e sn o t o n l y e x h i b i t e d p h r e s p o n s i v ep r o p e r t i e s ，b u ti o n i cs t r e n g t h s e n s i t i v ep r o p e r t i e s ，a n dt h er e l e a s eo f a l b u m i nc o u l db er e g u l a t e db yt h ea p p r o p r i a t ec h o i c eo f e x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n sf o r t h ep r e p a r a t i o no fc s c k g m n a n o p a r t i c l e s t h i ss y s t e mm i g h tp r e s e n tap o t e n t i a la s p r o t e i nd r u gc a r r i e r s k e yw o r d s ：c h i t o s a n ，c a r b o x y m e t h y lk o n j a cg l u c o m a n n a n ，n a n o s p h e r e s ，p r o t e i n d r u g ，c a r r i e r s 2 引占 引言 在药物控制释放体系中，除药物本身外，药物载体也扮演着重要的角色。 一般来说，药物载体是由高分子材料来充当的，主要包括天然高分子材料和合 成高分子材料。这些材料按不同的功能分别应用于不同的控制释放体系中。 近几十年来，合成的可生物降解高分子材料作为药物控释载体的研究一直 非常热门，与不可降解的聚合物控释体系相比，它们具有以下优点： 1 ) 材料可被生物降解并被人体吸收； 2 ) 控释速率对药物性质的依赖性较小。控释速率主要由载体的降解速率 控制，从而使得对药物包覆量和几何形状参数的选择范围更广； 3 ) 释放速率更稳定。在扩散控释体系中，释放速率一般都会随时间而递 减。如果使用可降解材料作载体，随着材料的降解，药物的渗透速率加快，可 抵消扩散速率的降低。在理想的情况下，释放速率可维持恒定； 4 ) 更适合不稳定药物的释放要求。在不可降解释放体系中，药物的释放 是通过：水扩散至载体内部一药物溶解一溶剂扩散这一过程来实现的。而在可 降解体系中，由于载体的可降解性，药物释放无须通过这一较长的通路来实现， 一些不稳定药物( 如：多肽和蛋白质药物) 不致出现分解或集聚现象。 人工合成高分子材料虽然在蛋白质多肽药物应用方面已有诸多报道，但目 前仍有一些问题需要解决，如材料中痕量引发剂等杂质在生理相容性方面存在 一定的影响，连续使用易产生毒性；还有在制备过程中，有机溶媒的引入及强烈 搅拌等易造成药物失活等。目前，新型蛋白质多肽药物载体的研究热点逐渐转 移到天然可生物降解大分子材料的制备与研究上。 天然可生物降解聚合物在自然界中来源广泛，它们都有很好的分子识别能 力和生物活性。通常天然材料可以酶降解成为无毒的物质而被粘附细胞利用。 而且，这些材料与新生细胞和新生组织有很好的相容性，是理想的药物载体材 料。 我们课题组在国内外首次对壳聚糖一羧甲基魔芋聚电解质纳米微球作为 蛋白质多肽类药物载体的应用进行了系统的研究。天然多糖聚电解质纳米微球 药物释放体系以带有相反电荷的天然多糖壳聚糖和改性的魔芋( 羧甲基魔芋) 壳聚糖一羧甲基魇芋纳米微球作为蛋臼多肽类药物载体的研究 通过静电吸引自组装制备纳米药物粒子。由于其制备过程简单，载药条件温和， 能够最大限度的保持药物的生物活性。纳米尺寸和聚电解质复合物本身的特性 也决定了此类药物体系有良好的生物通透性，能够根据用药环境的变化，自我 调整对环境适应进行自动释药。这就使得药物生物利用度高，毒副作用小，不 仅可提高药品安全性、有效性、可靠性和患者的顺从性，还可解决其它制剂给 药可能遇到的问题，如药物稳定性低、低吸收或生物不稳定( 酶、p h 值等) 、药 物半衰期短和缺乏特异性、治疗指数( 中毒剂量和治疗剂量之比) 低和细胞屏障 等问题。 本文系统地考察了影响微球粒径大小和表面电荷的因素，微球对p h 的响应 性和离子的敏感性，以及溶菌酶对微球的体外降解行为。另外我们用牛血清白蛋 白作为模型药物，用上述聚电解质复合物为载体材料制成微球后考察其体外释 药，随着聚合物的降解，药物以扩散、溶蚀方式释放。通过调节聚合物摩尔比、 分子量、微球粒径、微球表面状态及内部结构、药物含量和改变释药环境等，可 以达到缓释或控释目的，为开发一种新型的蛋白质多肽药物释放体系提供参考依 据。 4 第一章聚电解质复台物作为蛋白质、多肽类药物载体的研究 第一章聚电解质复合物作为蛋白质、多肽类药物载体的研究 目前，肿瘤、艾滋病、肝炎等疾病严重影响着人类健康，有关方面的药物 研究成为药学研究的一个热门领域。其中，蛋白质、多肽类药物( 如肿瘤坏死因 子、白介素、胰岛素等) 以其疗效好、副作用低等突出优点受到了广大医务工作 者及患者的青睐。但相比于其它低分子量合成化学药物，多肽和蛋白质药物在 物理化学和生物化学性质方面又有许多不同之处，如( 1 ) 大多数肽类和蛋白质药 物很敏感，无论是采取皮下、肌肉、肠内、口腔、直肠、鼻腔等给药途径，它 们在给药部位就很容易被降解；( 2 ) 由于蛋白质在体内的半衰期很短，常常需多 次给药才能维持治疗所需的正常血药浓度；( 3 ) 与绝大多数低分子量合成药物相 比，蛋白质对其邻近环境非常敏感，邻近环境存在很多能使蛋白质变性或导致 蛋白质失活的因素；( 4 ) 每种蛋白质有决定其稳定性的独特的理化性质，因此需 要制定与之专门相适应的稳定措施。因此通常适用于普通药物的控制释放体系 不一定适合多肽和蛋白质药物的控制释放。尽管d n a 重组技术已使蛋白质、 多肽药物可以大量生产，但由于以上因素而大大限制了它们在临床上的应用。 在这种背景下，蛋白质和肽类药物控制释放体系在医学上的研究和应用日益 受到人们的重视。药物控制释放体系，是利用天然或合成的高分子化合物作为药 物载体或介质，制成一定的剂型【”，然后置于释放的环境中，载体中的生物活性 物质通过扩散或其它途径释放到环境中，从而达到治疗疾病的目的。随着现代医 学的高度发展，高分子材料广泛应用于医学领域，它作为药物控制释放的载体是 最热门的方向之一。高分子的药物控制释放体系与某些传统的给药方式相比，具 有长效、高效、低毒、缓释、选择性好、副作用小等优点。因而，药物载体高分 子材料的性质也就成为研究的焦点。 本章对为什么选择天然多糖类聚电解质材料作为多肽与蛋白质药物给药系 统载体材料，以及聚电解质复合物的制备工艺、影响因素及其应用进行了综述。 1 1 蛋白质多肽药物载体材料的选择 蛋白质多肽药物作为一类特殊的大分子药物，其载体材料必需具备几个基本 条件：首先要求无毒，安全性好；其次要能够与蛋白质药物以一种简单、可靠的 壳聚糖一羧甲基魔芋纳米微球作为蛋白多肽类药物戟体的研究 方式可逆性结合，即固定药物，这个过程不能影响蛋白质药物的生物活性；另外， 载体材料需要具备优良的生物相容性和生物可降解性，并且其降解速率可适当调 节：最后还要求载体材料具有良好的可加工性能，可在温和的条件下加工成各种 适当的形状【2 1 。 一般来说，药物载体是由高分子材料来充当的，这是由于高分子材料具有以 下优点 3 - 8 1 ：( 1 ) 分子量大，作为载体能使药物在病灶部位停留较长时间； ( 2 ) 药物在聚合物内能通过扩散或聚合物自身的降解达到缓释或可控释放的目的； ( 3 ) 可以把一些具有靶向作用或控制药物释放的功能性组分通过化学键合的方 式结合到聚合物表面；( 4 ) 选用可生物降解聚合物材料，能避免药物释放后载 体材料在人体器官组织内积聚，产生毒副作用。下面我们分别对合成高分子材料 及天然高分子材料作为蛋白多肽药物载体的应用作以简介。 1 2 合成高分子材料作为蛋白多肽类药物载体 合成高分子材料有非生物降解型和可生物降解型两种。非生物降解型材料包 括：聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙乙烯、聚酰胺等。生物降解型包括：聚酯，如聚乳 酸、聚乙醇酸和乳酸一乙醇酸共聚物等；聚酸酐，如聚苯氧基乙酸酐、聚苯氧基 戊酸酐等；还有聚原酸酯和聚磷酸酯等材料。其结构见表1 1 所示。非生物降解 材料必须经手术途径植入和取出，对局部组织有刺激，这不仅给病人带来痛苦， 而且也增加了患者的经济负担。而可生物降解型高分子材料在体内降解为乳酸、 羟乙酸，羟乙酸进一步降解为水和二氧化碳，除具有良好的生物相容性、无免疫 原性、安全性高外，合成聚合物还可以通过改变两单体比例及聚合条件调节聚合 物在体内的降解速度，从而达到延长药效的目的，故此类载体材料应用日益广泛 9 - 1 1 】。 合成高分子材料作为药物载体的制备方法大致可分为三类： 第一类为单体聚合法。单体聚合常采用界面缩聚的方法，即将单体溶于乙醇 中制成油相，表面活性剂和药物溶于水中制成水相，在连续搅拌下将油相缓缓滴 加至水相中即可得平均粒径为2 0 0 - - 4 0 0 n m 的微球。适合于单体聚合法的单体有 氰基丙烯烷酯，甲基丙烯酸烷酯，戊二醛等。用此种制各方法所得的微球颗粒小、 包药量高，但除聚氰基丙烯烷酯外，大多不可生物降解，而且制剂中残留有单体、 6 第一章聚电解质复合物作为蛋白质、多肽类药物载体的研究 寡单体、表面活性剂，纯化过程繁复。 表1 1 蛋白质、多肽微球释药体系的载体种类及结构 第二类是低温喷雾干燥法。将蛋白质、多肽药物及其稳定剂的粉末或冻干 品和聚合物载体材料的二氯甲烷均匀混合，混悬液经喷头以雾状喷至冰冻的乙 醇溶液中，后者的界面封以液氮。在- - 7 0 的温度下，乙醇将微球中的二氯甲 烷不断抽提，最后过滤去除乙醇，得到微球。这种方法得到的药物包裹率较高， 微球突释效应小，但其设备和工艺复杂，通常实验室无法采用【1 2 1 。 第三类是溶剂蒸发法。传统的溶剂蒸发( 0 ，w ) 制备方法是将聚合物载体材 料和药物溶于有机溶剂中，然后将其加入含有表面活性剂的水溶液，使油相和 水相充分接触、搅拌，然后将溶剂蒸发成为微球。但由于大部分蛋白质、多肽 类药物的脂溶性较差，所以在o w 制备过程中大量的药物会由有机相进入水相 直接溶解，从而使得微球中的载药量很低【1 3 】。为了克服这一弊病，w a n g 和 s t u r e s s o n 等人发明了一种无水体系( o o ) 包裹药物。先将聚合物载体材料( p l g a ) 和药物( 马来酸噻吗洛尔或牛白蛋白) 溶于有机溶剂( p o ：乙腈、二甲基酰亚胺) 7 壳聚糖一羧甲皋魔芋纳米微球作为蛋白多肽类药物载体的研究 中，然后将有机溶剂相逐滴加入含有表面活性剂芝麻油中，强力搅拌至有机溶 剂完全挥发得到微球。这种o o 无水体系包裹药物的方法虽然很大程度上减少 了蛋白质、多肽药物向连续水相的直接溶解，提高了包药量，但其油相难于完 全挥发，产品纯化困难并且微球容易团聚 1 4 - 1 6 】。后来，人们又逐渐发展出水 油水( w o w ) ，水油油( w o o ) ，水油油油( w o o o ) 等复乳体系制备微球， 其中又以w o w 体系最为常用。w o w 的制备方法是将聚合物载体材料和蛋 白质、多肽药物分别加入有机溶剂( 如乙酸乙酯，二氯甲烷) 和水中，然后将 水相加入有机相中，均化或超声振荡成初乳( w o ) ，初乳再转入含有表面活性 剂( 如p v a ) 的水溶液中，搅拌成复乳( w o w ) ，升高系统温度，除去有机 溶剂，即可得到微球u 7 - 2 0 1 。使用这种方法得到的微球尺寸较小，包药量较高， 并且所采用的有机相溶剂较易于完全挥发，虽然由于有机溶剂的使用和强力的 搅拌会造成蛋白质、多肽类药物的部分失活，但仍是目前最经典的微球制备方 法。 人工合成高分子材料虽然在蛋白质多肽药物应用方面已有诸多报道，但目 前仍有一些问题需要解决，如材料中痕量引发剂等杂质在生理相容性方面存在 一定的影响，连续使用易产生毒性；还有在制备过程中，有机溶媒的引入及强烈 搅拌等易造成药物失活等。目前，新型蛋白质多肽药物载体的研究热点逐渐转 移到天然可生物降解大分子材料的制各与研究上。 1 3 天然高分子物质作为蛋白多肽类药物载体 天然可生物降解聚合物在自然界中来源广泛，它们都有很好的分子识别能 力和生物活性。通常天然材料可以酶降解成为无毒的物质而被粘附细胞利用。 而且，这些材料与新生细胞和新生组织有很好的相容性，是理想的药物载体材 料。 1 - 3 1 胶原( c o l l a g e n ) 胶原蛋白( 或称胶原) 是一类存在于大多数哺乳动物机体组织中的纤维蛋 白，肌腱和骨等承重组织中更是富含胶原。胶原蛋白是具有独特结构的一种蛋 8 第一章聚电解质复合物作为蛋白质、多肽类药物载体的研究 白质，广泛存在于哺乳动物组织中，约占总蛋白质的3 0 以上。天然胶原是由 三条n 多肽链形成的三股螺旋结构，三股螺旋区为连续的o l y x y 重复序列。 g l y 代表甘氨酸，x 常为脯氨酸，y 常为羟脯氨酸或羟赖氨酸。胶原的序列排列 在异种间的区别很小，所以异体胶原( 如，牛胶原) 植入人体后只会产生很小 的免疫反应。由于其来源广泛，并具有生物可降解性、生物相容性和低免疫原 性，已广泛应用于药物载体系统和人造血管、瓣膜等组织工程领域。胶原可应 用于医药领域的一个主要原因在于它经过自聚和交联，可形成具有一定强度和 稳定性的结构，用弱酸水提取后可制成多种形式的药物载体系统。胶原的吸收 和活性物质的释放受所用的交联剂种类和数量的影响【2 2 1 。胶原释放系统主要包 括眼科用的胶原罩、烧伤和创伤用胶原海绵，与脂质体结合形成的用于药物释 放的复合物f 2 3 】以及透皮释放的控制材料口4 1 等。但在制备以胶原为载体的药物释 放系统中需加入交联剂，例如戊二醛、碳二亚胺、酰基叠氮化物等，使其不利于 用作蛋白多肽类药物载体瞄5 1 。 1 - 3 2 天然多糖 多糖是所有生命有机体的重要组分，在控制细胞分裂和分化、调节细胞生长 和衰老以及维持生命有机体的正常代谢等方面有重要作用。同时，多糖也具备上 述作为生物医用材料的基本要求，能够在生物体中酶解成易被活体吸收、无毒副 作用的小分子物质，不会残留在活体内，是一类生物降解吸收型高分子材料。采 用天然多糖作为药物载体，具有生物相容性好、制备条件温和及免疫原性低等优 点，受到越来越多研究者的重视。作为一类重要的生物高分子化合物，天然多糖 却长期未受到重视，发展较蛋白质、核酸晚得多。自8 0 年代以来，国外形成了甲 壳素( c h i t i n ) 、壳聚糖( c h i t o s a n ，c s ) 等多糖类生物医用材料的开发研究热潮。进 入9 0 年代，我国对甲壳素和壳聚糖资源的开发研究也越来越重视。壳聚糖、海藻 酸钠等天然高分子在固定化酶、药物控释载体、絮凝剂、人工透析膜、吸收缝合 线、伤口涂敷料、人造皮肤等生物医药方面己有广泛应用。 1 - 3 - 2 一l 壳聚糖( c h i t o s a n ，c s ) 甲壳素来源于生物体结构物质是一种天然高分子聚合物，化学名称为d 9 壳聚糖一羧甲基魔芋纳米微球作为蛋白多肽类药物载体的研究 f l ，4 ) 聚一2 一乙酰氨基d 葡聚糖，其结构如图卜1 。它是人体健康所必需的第六大 生命要素，对人体具有强化免疫，抑制老化，预防疾病，促使疾病痊愈和调节 生理机能等五大功能。壳聚糖是甲壳素脱乙酰化得到的产物，是天然多糖中唯 一的碱性多糖，其理化性质相对稳定，具有生物活性，与人体细胞有很强的亲 和力，可被体内的酶分解而吸收，对人体无毒性和副作用，加上良好的吸湿性、 纺丝性和成膜性，因而广泛地被开发利用，成为优良的生物医学、药学材料。 甲壳索( mcn ) 壳聚檐聪乙酰度 壳聚糖( m2n ) d = 一( m + n 。) x1 0 0 图1 1 甲壳素和壳聚糖结构示意图 近年来，关于壳聚糖作为微囊、微球的囊材或载体，已有相当多的报道，如 可用于激素类、抗生素、抗癌药、疫苗、抗原、活细胞等物质2 o l 。控制不同的 合成条件和方法，能得到不同乙酰化度和平均分子量的壳聚糖，在制剂辅料应用 中也有着不同的效果。对于用壳聚糖来辅助多肽和蛋白质类等生化物质的微囊 化，是正在发展又非常有前景的课题。利用壳聚糖所制得的微囊或微球可以增加 蛋白质、多肽类的药物稳定性，降低药物在体内的副作用，延长药物疗效。这对 于我国的新药研制，医药工业新辅料的应用提供了一个广阔思路 3 1 , 3 2 。 为满足医药不同需求，除制各降解衍生物外，一部分专家致力于甲壳素的 化学修饰p 3 。3 6 】，以扩大其在医学领域的适用范围，一部分专家则致力于医学实 用性更强的复合物系列研究，有关甲壳素与衍生物的关系在图1 - 2 和图1 3 中 做了简单描述。 1 0 第一章聚电解质复台物作为蛋白质、多肽类药物裁体的研究 曼苦铋芋蜀i ) 累电解质复台切 酶璺台铆 碘璺台蜘 随癌药l l ；i 薪 亚油酸复台铆 活 生炭复台舒 虾塑壳龋麓蒜 图1 2 甲壳素与衍生物的关系简图 恺擎蟛饰甍列1 见图1 3 图1 - 3 壳聚糖的化学修饰 ：叩舯k 蛳咿 吣吲 聃饥睡“ 一 p。叫， r；“n一， 、 一 、 幔 ， r， v、， ，、，隧 m 0 岫雌附坩 壳聚糖一羧甲基魔芋纳米徽球作为蛋白多肽类药物载体的研究 1 - 3 2 2 藻酸盐( a l g i n a t e s ) 藻酸是从褐藻中分离出来的一类阴离子型多糖，是由1 2 一l 一古洛糖醛酸( t 1 一l g u l u r o n i ca c i d ) 和b d 一露糖醛酸( b d - m a n n u r o n i ca c i d ) 组成的共聚物，如图 1 - 4 所示。各种阳离子可与其侧链上的羧基进行络合反应形成水凝胶。藻酸盐的 性质与甘露糖醛酸和古洛糖酸的含量有关系，较高的甘露糖醛酸具有免疫激活 性，而较高的古洛糖酸则具有免疫抑制活性。可溶于水，溶于乙醇、乙醚及其他 有机溶剂；不同分子量产品的粘度有差异。藻酸盐很早就被用于药物的添加剂、 伤口敷料和止血剂。近年来，海藻酸钠由于其稳定、无毒、成膜性或成球性较好， 它已经成为最常用的药物载体材料。海藻酸钠是一种聚阴离子高分子材料，可以 与聚阳离子壳聚糖通过静电相互作用，在海藻酸钠微囊表面复合一层聚电解质半 透膜。从而提高微囊的稳定性和载药量，并可调节药物释放速度。壳聚糖一海藻 酸钠微囊应用于多肽蛋白质控释近年来已引起相当重视口7 l 。 随c o o 卵h i 骛r 心车驴4蚴 i 霾汴心牵驴4 图1 4 海藻酸结构示意图 1 - 3 2 3 卡拉胶( c a r r a g e e n a n ) 卡拉胶是多糖家族中的重要一员，它从角叉菜、麒麟菜、杉藻及沙菜等多种 红藻中提取。这些物质不仅因来源丰富，而且由于可再生，无污染及具有备受人 们青睐的众多应用领域，所以早在6 0 0 多年前就有应用，2 0 世纪5 0 年代就有研究， 有着渊源的历史【4 2 1 ，并一直吸引着众多的研究者 4 3 , 4 4 1 。 卡拉胶是一系列既有共同骨架结构，又各有特征结构的物质。( 1 3 ) 与( 1 4 ) 交叉联接d 一半乳糖是卡拉胶的共同结构，因取代基的不同而分为众多类型， 图卜5 是w 一卡拉胶的结构图。因为它具有优良的热可逆凝胶化、抗蛋白凝结、亲 给 第一章聚电解质复合物作为蛋白质、多肽类药物载体的研究 水无毒等独特性能，成为卡拉胶中的佼佼者而倍受关注，在食品、化工和包装等 方面应用广泛。特别是近年来在医药和生物工程领域的应用，更引起人们广泛的 研究兴趣。 图i - 5k 一卡拉胶的结构图 i - 2 2 - 4 粘多糖( g l y c o s a m i n o g l y c a n s ) 粘多糖是普遍存在于动物体的细胞外基质中的一类无支链多糖，一般都含 有( 糖醛酸一氨基糖) 的重复结构。共有六种粘多糖：硫酸软骨素、硫酸皮肤 素、硫酸角质素、硫酸乙酰肝素、肝素、透明质酸。 除了上述所提到的多糖种类外，还有魔芋，右旋糖苷和肝磷脂等其它天然 多糖材料，在此不一一叙述。 由于天然多糖自身或经改性后大多带有离子型反应基团( 如表1 2 ) ，从仿 生角度出发的天然多糖聚电解质复合物药物载体应运而生。 表1 2天然多糖及其所带离子基团 天然多糖离子基团 壳聚糖( c h i t o s a n )一n h 3 + 甲壳素衍生物( c h i t i nd e r i v a t i v e s )一c o o ，- - o s o 。 藻酸盐( a l g i n a t e ) 一c o o 羧甲基纤维素( c a r b o x y m e t h y l - c e l l u l o s e ) - - c o o 透明酯酸( h y a l u r o n i ca c i d ) - - c o o 胶质( p e c t i n ) 一c 0 0 羧甲基魔芋( c a r b o x y m e t h y l k o n j a c ) - - c o o 软骨素硫酸盐( c h o n d r o i t i ns u l f a t e ) - - c o o ，一o s o 孓 右旋糖苷( d e x t r a ns u l f a t e ) - - o s o 斗 肝磷脂 ( h e p a r i n ) - - o s o 卡拉胶( c a r r a g e e n a n ) - - o s o 壳聚糖一羧甲基魔芋纳米微球作为蛋白多肽类药物载体的研究 1 - 4 天然多糖聚电解质复合物药物载体 聚电解质复合物( p o l y e l e c t r o l y t ec o m p l e x e s ，p e c ) 一般是指两种带有相反 电荷的大分子通过静电吸引力的相互作用所形成的大分子复合体。按形成复合 物的材料类型来划分，它可以分为聚阳离子一聚阴离于复合物、聚离子一两性 大分子( 如蛋白质等) 复合物及两性大分子一两性大分子复合物等。由于其具有 很多优异性，近二十年来聚电解质复合物得到了广泛的研究，并在环保、新型 膜材料、机械化学器件、模板聚合、蛋白质分离及分子自组装等领域得到了广 泛的应用 4 5 - 4 8 】。相对而言，聚电解质复合物在生物医学领域的应用则是近年来 的事。但由于聚电解质复合物的特殊性能，尤其是生命体内的很多复杂现象， 如基因信息的传递、酶的选择性和抗体一抗原作用等主要是基于生物大分子之 间的相互作用或者生物大分子与小分子化合物之间的相互作用。由于聚电解质 复合物在结构与性能上与生物大分子存在许多相似性( 如表面电荷、亲疏水性、 小分子物质的选择输运等) ，这有助于模拟生物体内的过程、实现一些特殊的功 能，因而聚电解质复合物在生物医学领域有着巨大的应用前景。 应用天然多糖聚电解质复合物作为蛋白多肽类药物载体，具有以下优点： 材料资源丰富，价格便宜，无毒，生物相容性好；载药工艺简单，条件温和，能 最大保持药物的活性和稳定性；在正常生理条件下可降解或溶解；具有对环境响 应的特性，可以对药物实现控制释放【4 9 4 。 1 - 4 1 聚电解质复合物的形成过程 一般认为，聚电解质复合物的形成过程是两步机理：首先是带有正电荷的聚 阳离子与带有相反荷电的聚阴离子互相接近，这是一个扩散控制过程：然后是已 经接近的聚电解质链段上相反电荷的中和过程，根据不同的需要来改变实验条件 从而制备出薄膜、微球、胶囊、纤维、海绵状物等不同形态的聚电解质复合物， 如图l 一6 所示。聚电解质复合物的形成过程与聚合物的结构、反应条件和反应体 系内的离子强度等因素有关。 1 4 第一章聚电解质复合物作为蛋白质、多肽类药物载体的研究 f o p p p o l y a r a 瀚 熨一g “渤 魁黟 彬、 o f t p o l y c a u o n ，j - ，7 、 、 c a p s u l e 擎莆 f i b e r 图1 6 聚电解质复合物的形成过程示意图 i - 4 2 分子结构因素对聚电解质复合物形成过程的影响 影响聚电解质复合物形成的空间因素有许多，如离子基团所处位置以及其电 荷密度和电离强度的影响等，主链的屏蔽效应、链的柔性、憎水性等也对复合物 形成有很大影响。另外还有聚合物分子量的影响。小分子复合物和聚电解质复合 物最主要的区别在于聚电解质复合物中分子之间存在协同相互作用，因此很明显 存在一个临界分子量，在此分子量以下大分子之间不可能产生协同相互作用。 1 4 2 一i 离子所处位置的影响 当聚电解质的离子基团分布在侧链上时，侧链的链长、类型和柔顺性对复 合物的结构、性能有不同程度的影响。若两主链均较刚硬，且离子基团均直接与 主链相连，则形成的侧一侧链型复合物也相应具有较为刚性的结构；而当一种离 子基团连在较为柔顺的长侧链上时，由于离子基团可自由移动，即使反离子聚合 物的电荷密度很低，也可与之形成可塑性网络。在复合物组成方面，发现侧一侧 辩撇 壳聚糖一羧甲基魔芋纳米微球作为蛋白多肚类药物载休的研究 链型不论在何种比率下混合都形成等摩尔比的聚电解质复合物。因为在复合过程 中中和了亲水部分电荷，增加了疏水性，因而生成了不溶于水的等摩尔组成的复 合物。主一侧链型复合物的组成则随反应条件改变。复合达等当点后，过量的侧 链聚合物上的反离子会从复合链的相反方向进攻主链暴露在溶剂( 水) 中离子的 另一面，而被吸附在这些电荷上，造成组成和构型发生变化导致逐渐形成水溶复 合物。 1 - 4 2 2 离子基团的电荷密度和电离强度的影响 聚电解质的电荷密度是指分子链上单位长度内离子基团的个数。研究结果表 明，不同电荷密度对聚电解质复合物形成及化学剂量比( 每摩尔阳离子基团消耗 阴离子基团的物质的量) 有很大影响，它决定了聚电解质复合物是可溶性的还是 聚盐沉淀。当两组分电荷密度变化时，所形成复合物的化学剂量比可在一定范围 内发生较大变化，随着任一组分的电荷密度的降低，化学剂量比逐渐增大。电荷 密度对复合物组成的影响受到离子基团的电离强度、聚电解质的浓度等因素的影 响。聚电解质可以根据其离子基团的离解常数分为强聚电解质和弱聚电解质。两 种强聚电解质混合时，一般形成有定化学配比的复合物，即使某一组分过量时， 过量的该组分仍保留在溶液中。一般认为弱聚电解质中离子基团只有离解后才会 与相应的带相反电荷的基团反应形成离子键，故电离强度的影响往往受到许多外 部因素的影响，女1 p h 值、离子强度、温度等。 1 - 4 - 3 反应条件对聚电解质复合物形成过程的影响 1 431 p h 值的影响 介质的p ：q 值是形成聚电解质复合物最重要的反应条件之一，因为h + 的活度 决定了聚电解质中离子基团的离解度( 尤其对于弱聚电解质) 和有效电荷密度。当 两个组分均为强聚电解质时，p h 值的影响较小。当至少有个组分为弱聚电解 质时，p h 值能够影响聚电解质复合物的组成和弱聚电解质的转化率。一般只有 在一个较窄的p h 值范围内，当弱聚电解质离解到最大程度时，两个组分才能形 第一章聚电解质复合物作为蛋白质、多肽类药物载体的研究 成具有一定化学配比的聚电解质复合物。在这个范围外，弱聚电解质的离解度非 常低，只能形成非等化学配比的聚电解质复合物。另外，p h 值能影响一些天然 高分子的构型，从而会导致这些天然高分子形成的聚电解质复合物的组成发生改 变。p h 值与电解质的离解度关系如下所示：q = 1 ( 1 0 9 “”9 “+ 1 ) 1 - 4 3 2 离子强度的影响 聚电解质溶液的离子强度是由聚电解质和小分子电解质的浓度共同决定 的。离子强度对复合物稳定性的影响则视以下两种作用的相对大小。( 1 ) 含离子 聚合物成盐化后，离子强度增加使得复合物形成更加紧密堆积的聚集态。( 2 ) 局部电荷密度增加对形成相互作用的电荷起了屏蔽作用，进而减少了两高分子 间的库仑力，导致复合物的凝聚态被破坏。在一个含有小分子电解质的聚电解 质溶液中，小分子离子由于聚电解质静电场的吸引，富集在聚电解质的周围， 使得聚电解质链段上电荷基团之间的屏蔽作用增加；聚电解质的离子基团与抗 衡离子之间形成的离子对数也增加，使聚电解质的有效电荷密度降低。在这两 种效应的影响下，大分子线团收缩，聚合物离子周围微环境内相同电荷的离子 的浓度增加，使聚电解质复合物的形成受到阻碍。在聚电解质复合物溶液中增 加小分子电解质的浓度，能使已形成的聚电解质复合物中的静电作用减弱，难 溶的聚电解质复合物可以在一定溶液中溶解，甚至进一步离解为原来的组分。 1 4 3 3 浓度和温度的影响 若两个组分均为强聚电解质时，它们能在相当宽的一个浓度范围内相互作用 形成聚电解质复合物。当其中至少有一个组分为弱聚电解质时，聚电解质浓度能 够影响弱聚电解质的离解度和有效电荷密度，从而影响复合物的组成。 某些聚电解质在不同温度下有不同的构象，因此温度对由这些聚电解质形成 的复合物的形态有一定的影响。 1 - 5 聚电解质复合物在多肽蛋白质药物缓释中的应用 目前，聚电解质复合物在多肽蛋白药物控释中的研究主要有两个方面。一是 壳聚糖一羧甲基魔芋纳米微球作为蛋白多肽类药物载体的研究 利用聚电解质复合物作为蛋白药物的控释载体( 3 5 要是聚电解质复合物微球) ，二 是把聚电解质一多肽蛋白药物复合物( 尤其是各种碱性生长因子) ，用于组织工程 中促进各种组织的生长。 1 - 5 1 聚电解质复合物微球 聚电解质复合物微球作为多肽蛋白药物缓释制剂载体，其制备过程非常温 和，有助于保持药物的活性。目前主要使用壳聚糖作为聚阳离子材料与聚阴离子 通过静电作用形成聚电解质复合物用于制备缓释微球，从而提高载药量和延长药 物释放时间。 胰岛素是治疗糖尿病的多肽类药物，其常规给药途径是注射法。但是该途径 为了达到胰岛素疗效的持续性，需要多次注射给药，这样不仅导致血液中胰岛素 浓度及血糖浓度不稳定，而且长期注射给药还产生胰岛素浮肿、低血糖反应、皮 下脂肪萎缩等副反应，使病人十分痛苦，因此注射法不宜长期临床给药。鉴于此， 国内外研究者正致力于开发研制其它便于使用的胰岛素非注射制剂，并己取得了 一定进展，出现了直肠给药系统、眼与鼻腔给药系统、舌下及口腔粘膜给药系统、 植入给药系统以及口服释药系到5 2 。5 6 】，其中口服释药系统载药量可变范围较宽， 给药方式最简单直接易行，且安全适用，因此其应用前景较大。但是口服释药系 统的胰岛素在通过胃肠道时，会由于胃酸的破坏、胃肠道酶的降解作用导致其生 物活性丧失及生物利用度降低。应用壳聚糖一海藻酸盐微囊技术制备了一系列胰 岛素微囊，并研究了不同反应条件如海藻酸钠浓度、壳聚糖浓度、壳聚糖分子量 及壳聚糖溶液p h 值对微囊的胰岛素包封率及其释放性能的影响。结果表明，海 藻酸钠浓度越高，微囊对胰岛素的包封率越高，在模拟小肠液中释放速率越低： 壳聚糖浓度越大，微囊的胰岛素包封率及其在模拟胃液中释放率越高，在模拟肠 液中释放达最大值所需时间越长；而随壳聚糖分子量减小，微囊在胃液中释放率 增高；壳聚糖溶液p h 值的变化对微囊的胰岛素包封率未造成明显影响。研究结果 证明，壳聚糖一海藻酸盐微囊法应用于胰岛素等肽类药物的包封，其制备简单快 速，胰岛素包封率很高。制备的微囊在模拟胃液中释放率较低，而在小肠液中迅 速释放，在l 小时内可达最大释放，从而免受胃酸和胃酶的分解。因此，壳聚糖 一海藻酸钠微囊有望用作胰岛素或其它肽类药物的口服制剂。 笫一章聚电解质复台物作为蛋白质、多肽类药物载体的研究 此外，k o f u j i 等5 8 1 用壳聚糖和硫酸软骨素复合物作为药物载体包载糖皮质 激素，通过与单独壳聚糖载体相比，发现复合物能够延长药物释放的时间，同时 还考察了复合物复合比例及壳聚糖脱乙酰度对药物释放的影响，表明此类材料可 以控制药物的释放，另外在小鼠体内实验，结果表明此类复合物是一种生物相容 性好的可生物降解载体材料。 熊成东等1 5 9 , 6 0 l 用壳聚糖和羧甲基魔芋为载体，牛血清白蛋白为模型药物，研 究了蛋白类药物体外释放，证明了此类药物载体既有p h 响应性又是离子敏感型 的载体材料。 肝磷脂6 1 , 6 2 和透明酯酸蚓等其它阴离子型多糖与壳聚糖的复合物作为蛋白 多肽药物载体也有报道。 1 5 2 聚电解质碱性生长因子复合物 生长因子是一类重要的多肽蛋白药物。但这类药物不仅昂贵，且在体内的半 衰期很短。所以非常有必要对其进行较长时间的缓释。但采用传统的方法则很难 解决这个问题。很多碱性生长因子( b f g f ，一般等电点大于9 0 ) 在生理条件下带 负电荷，可以与带正电的聚电解质通过静电作用形成聚电解质复合物。 m u n i r u z z a m m a m 6 4 , 6 5 用浊度滴定、肝素高效液相亲合色谱、等电点聚焦电 泳等研究了酸性明胶和b f g f 的相互作用，证实了它们可以主要通过静电作用力 形成聚电解质复合物。利用这种复合物就可能解决这类生长因子的缓释问题。 1 9 9 4 年t a b a t a 等1 6 6 】模拟b f g f 在细胞间隙中的存在方式，首次利用碳化二亚胺交 联的酸性明胶( 等电点5 0 ) 水凝胶作为b f g f ( 等电点9 6 ) 的控释载体，成功地实现 b f g f 较长时间的高活性释放。在生理条件下，带负电的明胶和带正电的b f g f 形 成了聚电解质复合物。在体内，随着明胶的酶解，b f g f 同步释放，可以非常有 效地促进血管的形成和组织肉芽的生长。此外，b f g f 明胶聚电解质复合物制 剂也能促进骨头的再生作用6 7 , 6 8 。动物实验表明，这种缓释制剂可以使在手术上 几乎不可能修复的头盖骨缺陷在1 2 星期后愈合。另外，肝素也可以与碱性生长因 子( t g f b 。) 形成聚电解质复合物，从而实现t g f 一1 3 ：的活性缓释。这种复合物 与胶原的混合溶液作为注射用组织再生的骨架材料，可以有效地促进成纤细胞的 募集和新的连接组织的产生 删。聚电解质一多肽蛋白质药物复合物除了在碱性生 壳聚糖一羧甲基魔芋纳米微球作为蛋白多肽类药物载体的研究 长因子缓释方面的应用外，在其他多肽蛋白质药物控释方面最近也有少量报道。 如利用d e a e d e x t r a n 与i n s u l i n f 眵成复合物来提高鼻腔给药药物的疗效【7 0 1 。 1 6 结论与展望 综上所述，在过去的几十年中人们对蛋白质、多肽药物进行了大量的改性 和释药研究。由于蛋白质类药物具有复杂的内部结构( 分为一级、二级、三级、 四级) ，制备过程中任何程度的变化都有可能导致蛋白质变性从而失活，所以与 一般的小分子化学药物相比，其改性和释药的要求和难点也更高。根据众多科 研工作者的研究，总结出较理想的蛋白质、多肽类药物给药体系应： 1 ) 最大限度的保持药物的生物活性，制备过程安全无毒： 2 )