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摘要 激光诱导荧光d n a 分析系统的研究 摘要 d n a 分析技术是从生物的分子基因水平揭示生物的特性，它为生命科学 研究提供了最有效、最便捷的技术和手段。因此，d n a 分析仪器的研究十分重 要，它是获取信息的源头和基础。本论文开展了激光诱导荧光d n a 分析系统的 相关理论和研制： 作，先后完成了两套检测系统的设计与构建。它们是基于微通 道毛细管电泳技术的现代光学检测系统，具有结构简单、性能良好、成本较低的 优点，分辨率达到l b p ，也就是单碱基分辨。灵敏度高，对标准d n a 样品 p g e m 一3 z f ( + ) h a ei i im a r k e r s 的检测限是2 4 x 1 0 。1 1 m o l l 。满足测序和短串联重复 序y ! j ( s h o r tt a n d e mr e p e a t ，s t r ) 分型对分辨率和灵敏度的要求。主要工作包括两大 部分：微通道毛细管电泳部分和激光诱导荧光检测部分。 电泳部分主要包括：对微通道内壁进行改性，以控制电渗流和抑制吸附：制 备性能良好的筛分介质能够对样品电泳分离；对涂层、灌胶、进样系统以及荧光 染料的选择进行优化，选用非交联的线性聚丙烯酰胺( l i n e a rp o l y a c r y l a m i d e ，l p a ) 作为涂层材料和可替换的筛分介质；测量得到的自制涂层管的电渗流淌度为 2 5 1 6 5 】0 - s i n 2 v 4 s 一，对电渗流的控制满足d n a 样品分离的要求；研究了电场 强度与迁移率的关系，得到电场强度与电泳电流的关系曲线；对于本筛分系统， 提出了一种新的o g s t o n 修正模型，从而能够简单、良好地解释实验结果；考察 了d n a 样品中不同长度的片段在不同浓度筛分介质中，随电场强度条件变化的 信号强度、展宽和分辨率的变化情况，优化筛分质浓度为4 l p a 。 检测部分设计为共焦光路，建立了分别以4 8 8 n m a r + 激光器和5 3 2 n m 固体激 光器为光源的两套系统，由激光器激发电泳到检测窗口的d n a 片段( 标记有荧光 染料1 ，发射的荧光信号由光电倍增管收集检测，激发光路和收集光路三维可调。 通过理论分析和实验优化本系统的设计：优化聚焦于微通道中的激发光斑大小， 增大聚焦到毛细管内径中的激发光斑尺寸，使光斑尺寸由最小的1 0 p m 增大到 5 0 1 - t m ( 充满了整个毛细管内径) ，光电倍增管接收到的荧光信号提高了2 3 倍，从 而提高系统的信嗓比和灵敏度；提出在聚焦物镜处加折射率匹配液的方法，加匹 配液后的荧光信号得到了增强，因而提高了荧光收集效率和灵敏度。通过理论和 实验分析阵列毛细管电泳技术中杂散光的强度与分布，激发光束直接照射到毛细 管的内径中一t l , 时，毛细管产生的杂散光强度是无毛细管的情况下的2 7 0 2 5 倍； 对不同内径的微通道毛细管进行比较，优化内径为5 0 p r n ：分析了不同间距的阵 列毛细管杂散光情况；所得结果对提高检测系统荧光收集效率、提高信噪比、采 取最佳扫描方式十分有意义。 关键词：激光诱导荧光检测，d n a 分析系统，微通道，毛细管电泳。 浙江大学博士生学位论文 s t u d i e so nt h el a s e ri n d u c e df l u o r e s c e n c ed n a a n a l y s i ss y s t e m a b s t r a c t d n aa n a l y s i si st h et e c h n o l o g yt or e v e a lt h eb i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i ci nm o l e c u - l a ra n dg e n e t i cl e v e l ；i ti st h em o s te f f e c t i v ea n dc o n v e n i e n tw a yf o rr e s e a r c hi nl i f e s c i e n c e s s o ，t h es t u d yo fd n aa n a l y z e ri sv e r yi m p o r t a n t ；i ti st h es o u r c eo ft h ei n f o r m a t i o n t h el a s e ri n d u c e df l u o r e s c e n c ed n aa n a l y s i ss y s t e mw a sr e s e a r c h e da n d d e v e l o p e d t w od e t e c t i o ns y s t e m sw e r ed e s i g n e da n ds e t u p ，w h i c hw e r et h em o d e m o p t i c a ld e t e c t i o ns y s t e m sb a s e do nm i c r o c h a t m e la n dc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s + t h c y w e r es i m p l e ，c o s te f f e c t i v e ，h i g hs e n s i t i v i t ya n dg o o dp e r f o r m a n c e s i n g l eb a s e p a i r c o u l db er e s o l v e da n dt h el i m i to fd e t e c t i o n ( l o d ) o fd n as a m p l e p g e m 一3 z f ( + ) h a ei i im a r k e r sw a s2 4 x1 0 - “m o l l w h i c hm e e tt h er e q u i r e m e n to f d n a s e q u e n c i n ga n ds h o r tt a n d e mr e p e a t ( s t r ) t y p i n g t h es y s t e mc o u l db ed i v i d e d i nt w op a r t s ：m i c r o c h a n n e lc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sa n dl a s e ri n d u c e df l u o r e s c e n c e d e t e c t i o n n ee l e c t r o p h o r e s i ss e c t i o ni n c l u d e dt h ew o r ka sf o l l o w s t i l ei n n e rw a l lo ft h e m i c r o c h a r m e lw a sm o d i f i e dt oc o n t r o lt h ee l e c t r o o s m o t i cf l o wa n dr e s t r a i na d s o r p t i o n t h eg o o dp e r f o r m a n c es i e v i n gg e lm e d i u mw a sp r e p a r e dt os e p a r a t et h es a m p l e s t h e p r o c e s s e so fc o a t i n g ，g e li n j e c t i o n ，s a m p l ei n j e c t i o na n dt h ef l o u o r e s c e c es e l e c t i o n w e r eo p t i m i z e d t h er e p l a c e b a l en o n c r o s s l i n kl i n e a rp o l y a c r y l a m i d e ( l p a ) w a ss e l e c t e dt ob ec o a t i n gm a t e r i a la n ds i e v i n gm e d i u m t h ee l e c t r o o s m o t i cf l o wm o b i l i t y ( e o f ) o fc o a t e dm i c r o c h a n n e lw a s2 5 1 6 5x1 0 8 m 2 v 一1 。s 1 w h i c hs u i t e dd n a s e p a r a - t i o n t h ec h a r a c t e r i s t i c so fm o b i l i t yw e r ei n v e s t i g a t e da n dan e wm o d i f i e do g s t o n m o d e lw a sa p p l i e d t h em o d e lw a ss i m p l ea n ds u i t a b l ef o rt h er e s u l t so fe x p e r i m e n t s 1 1 1 ee l e c t r i cf i e l ds t r e n g t hv e r s u sc u r r e n tc u r v ew a so b t a i n e d 1 1 l es i g n a li n t e n s i t y , b a n db r o a d i n ga n dr e s o l u t i o nw e r ea n a l y s e du s i n gd i f f e r e n ts i z e so fd n a f r a g m e n ti n d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fs i e v i n gm e d i u m t h eo p t i m a lc o n c e n t r a t i o nw a s4 l p a t h ed e t e c t i o ns e c t i o nw a sd e s i g n e do fc o n f o c a lo p t i c a lp a t h t w os y s t e m sw e r e s e t u pu s i n g4 8 8 n n a a r + l a s e ra n d5 3 2 n ms o l i dl a s e rr e s p e c t i v e l y t h el a s e re x c i t e dt h e d n a f r a g m e n t sl a b e l e dd y e sw h e nt h e ye l e c t r o p h o r e s e dt ot h ed e t e c t i o nw i n d o w f f l u o r e s c e n c es i g n a l sw e r ec o l l e c t e db yp h o t o m u l t i p l i e r ( p m t ) ；t h ee x c i t i n ga n dc o l l e c t i n go p t i c a ls y s t e mc o u l d b e3 da d j u s t e d t h ed e s i g nw a so p t i m i z e df o rm a x i m u m s i g n a li n t e n s i t yb ys i m u l a t i o na n de x p e r i m e n t s 1 1 1 es i z eo ff o c a ls p o ti nt h em i c r o c h a n n e lc a p i l l a r yw a so p t i m i z e d f l u o r e s c e n c es i g n a lw a se n h a n c e d2 - 3t i m e sw h e n a b g t 卧c t i n c r e a s i n gt h ed i a m e t e ro ff o c a ls p o tf r o m10 p mt o5 0 u m ( f u l lo ft h ei n n e rw a l lo f c a p i l l a r y ) ，t h r o u g hw h i c ht h es e n s i t i v i t ya n ds i g n a l n o i s er a t i o ( s n r ) w e r ea l s oi m p r o v e d at e c h n i q u eo fu s i n gr e f r a c t i v em a t c h i n gl i q u i dw a sp r e s e n t e d t h ef l u o r e s c e n c es i g n a l sw e r eb o o s t e du pa n dt h es i g n a lc o l l e c t i o ne f f i c i e n c yw a sa l s om e l i o r a t e d w h e nu s i n gt h i sm e t h o d t h ei n t e n s i t ya n dd i s t r i b u t i o no fs t r a yl i g h ti nc a p i l l a r ya r r y s y s t e mw e r ea n a l y s e db ys i m u l a t i o na n de x p e r i m e n t s w h e nt h ee x c i t i n gb e a m si l l u - n f i n a t e da tt h ec e n t e ro fc a p i l l a r i e s t h es t r a yl i g h tw a ss t r o n g e s ta n dw a s2 7 0 2 5t i m e s o ft h a tw i t h o u tc a p i l l a r y s t r a yl i g h tw a sc o m p a r e df o rc a p i l l a r i e sw i t hd i f f e r e n ti n n e r d i a m e t e r s ；t h eo p t i m u mv a l u ew a s5 0 u m t h es t r a yl i g h to fa r r a yw i t hd i f f e r e n ts p a c e s b e t w e e nc a p i l l a r i e sw a sa l s or e s e a r c h e d t h er e s u l t sa l la b o v ew e r eu s e f u lf o ri m p r o v i n gt h es i g n a lc o l l e c t i o ne f f i c i e n c y , s n ra n dt h em o d e s e l e c t i o no fs c a n n i n g k e y w o r d s ：l a s e ri n d u c e df l u o r e s c e n c ed e t e c t i o n ( l i f d ) ，d n aa n a l ) r s i s s y s t e m ，m i e r o e h a n n e la n dc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s 第一章绪论 第一章绪论 二十世纪下半叶以来，科学技术的进步日新月异，促进了分子生物学、分子 遗传学和生物化学的迅猛发展，使人类对生命的认识逐步从器官、细胞水平深入 到分子水平。1 9 5 3 年4 月2 5 日，美国科学家j a m e s w a s t o n 和英国科学家 f r a n c i s c o c r i c k ，在英国自然杂志正式提出d n a 分子的双螺旋结构模型， 使d n a 成为现代生物学与医学中最重要的研究内容之一。随着d n a 结构被阐 明，诞生一系列的d n a 检验技术并迅速在许多研究和应用领域发挥重要的作 用。 d n a 作为遗传信息的载体，是现代生物学、化学和医学中重要的研究对象。 随着2 0 0 0 年6 月人类基因组计划的初步完成进入后基因测序时代，促使人们对 基因检测的需求越来越大，对人类基因组的逐渐破译，使得人类对遗传信息进行 译码，绘就一张生命之图，人们的生活也发生巨大变化。d n a 的结构分析和测 试是基因工程首要解决的问题之一，它为生命科学研究提供了最有效、最便捷的 技术和手段。因此，d n a 分析仪器的研究显得十分重要，它是获取信息的源头 和基础。由于微通道毛细管电泳具有分离效率高、可实现自动化操作、便于定性 和定量工作等优点，激光诱导荧光检测具有高灵敏度及选择性，因此，基于微通 道毛细管电泳的激光诱导荧光检测技术广泛应用于d n a 分析，是目前d n a 分 析仪器发展的重要前沿。 本章首先介绍d n a 分析系统的研究状况和应用领域，从电泳分离原理和技 术引出平板凝胶电泳、毛细管电泳、微芯片电泳及微通道毛细管电泳的概念，并 介绍了电泳的几种检测方式的特点、发展及应用，如：紫外一可见光吸收、银染 检测方法、激光诱导荧光检测方法和表面等离子体激元共振检测法。通过对几种 电泳分离及检测方法的比较，确立了我们的工作重点和方向，给出了论文的研究 内容和主要创新点，最后对论文的总体架构进行了归纳和评估。 1 1d n a 分析系统的应用领域及现状 d n a 分析仪可广泛应用在临床遗传病、传染病和肿瘤的基因诊断，农业、 畜牧业的动植物育种以及司法鉴赳1 - 6 1 等领域。d n a 分析及配套技术的研究不仅 1 浙江大学博士学位论文 是一门科学，亦是一项高科技产业，是目前乃至未来生命科学领域中的核心分析 仪器之一。我国的d n a 序列分析研究处于国际先进行列，在基础研究领域，我 国是参加国际人类基因组测序计划的6 个国家之一，我国科学家率先发表了水稻 的基因图谱；依靠d n a 分析技术成功发现了2 0 0 3 年s a r s 病毒的进化规律7 ，剐， 成功地抗击了非典。d n a 分析仪具有极大的市场应用前景，在医疗卫生领域， 人类基因组计划完成后，美国最近启动了基因变异鉴别和基因诊疗工程，目的是 寻找出2 0 万个与人类疾病有关的变异基因，开发更有效、副作用更小的治疗药 物；在农业领域，美国有“国家植物基因组计划”，我国有“中国杂交水稻基因 组计划”，目的是获得重要农作物的遗传信息和功能基因，培育更好的优质高产 新品种；在司法鉴定领域，美国政府2 0 0 3 年投入1 0 亿美元用于法医d n a 鉴定 技术和设备的更新，我国目前也在积极筹建d n a 数据库；在国家安全领域，美 国耗资6 0 亿美元实施“生物盾牌计划”，目的是开发应对生化武器和其他危险病 原菌攻击的手段。上述领域都是以d n a 序列分析技术为基础，需要大量的d n a 分析仪器。目前国外d n a 分析仪主要为第三代自动化荧光毛细管凝胶电泳分析 仪，美国应用生物系统a p p l i e db i o s y s t e m sl n e ，( a b i ) 公司0 j 最早在1 9 9 5 年率 先推出3 1 0 型d n a 分析仪，其后，不断有新型号的产品问世。美国通用电气 g e 公司也推出m e g a b a c e7 5 0 和m e g a b a c e1 0 0 0 1 ，1 2 】等多种型号毛细管自动 d n a 分析仪，b e c k m a nc o u l t e r 公司也有相应的c e q2 0 0 0 ，c e q8 0 0 0 和c e q 8 8 0 0 【l3 l 产品，国内使用的d n a 分析仪主要是从这几大公司进口。d n a 分析仪 在我国的大中医院、司法、公安部门将逐渐普及，d n a 分析仪在数量众多的各 级科研单位、医院、血站、检验检疫、司法公安等部门的大规模应用也是必然的 趋势。 以d n a 分析仪及相关试剂为主要产品的公司在全球市场上获得了很大收 益：b e c k m a nc o u l t e r 公司在2 0 0 4 年销售额为2 4 亿美元，其中7 0 的销售额来 自临床诊断市场，3 0 来自生物医学研究市场；a b i 公司在2 0 0 6 财政年度销售 额超过2 0 亿美元；原销售额3 0 亿美元的安玛谣亚( a m e r s h a m ) 公司被g e 于2 0 0 4 年4 月成功收购，成为新成立的“g e 医疗生物科学”部门，新g e 医疗集团2 0 0 5 年的年销售额为1 6 0 亿美元。然而，我国的d n a 分析仪研发却大大落后于国际 第一章绪论 先进水平，现在还没有相关产品的出现，目前的d n a 分析仪全部依靠国外进口。 虽然国内也有研究机构在某些技术上开展了研究，但要形成最终的实用设备，仍 然有很多核心技术问题需要攻克。如果d n a 分析仪完全依赖进口，大多数机构 不仅在购买高价的国外设备时会面临严重的经济负担，在后续的使用过程中还要 长期承受国外仪器的相关耗材和试剂的高价垄断，这种状况在很大程度上限制了 国内d n a 序列分析技术的推广应用和持续发展。因此，研究和开发具有自主产 权、创新设计的d n a 分析仪是一项十分紧迫的任务，具有十分重大的意义。 1 2d n a 分析系统的研究概况 目前，d n a 分析系统主要是基于电泳分离基础上的检测技术1 1 4 _ 1 6 】。通过不 同长度d n a 片段的电泳分离可以实现多种目的的d n a 分析，如片段分离，d n a 测序【17 1 ，短串联重复序歹l j ( s h o r tt a n d e mr e p e a t s ，s t r ) 1 8 - 2 0 检测等功能。其中d n a 测序和s t r 检测都是基于d n a 的聚合链式反应( p o l y m c r a s cc h a i nr e a c t i o n ，p c r ) 对原始样品进行扩增标记实现的，d n a 分子是由大量脱氧核苷酸构成的双螺旋 形强极性链状分子，每个脱氧核苷酸包括碱基、脱氧核糖和磷酸基团三部分。其 中磷酸基团在弱碱性溶液中携带负电荷，因此可以利用来进行电泳分离。 适用于d n a 分析的电泳分离技术主要有平板凝胶电泳法、毛细管电泳法、 微芯片电泳及微通道毛细管电泳法。不同的电泳分离方式可以根据需要采用与其 相适合的检测方法，如：紫外可见光吸收法、银染法、激光诱导荧光检测法、 表面等离子体激元共振检测法等，其中灵敏度最高，应用最广的是激光诱导荧光 检测。 1 2 1 电泳分离原理与技术 电泳分离技术是d n a 分析的一个重要手段，它还可以应用于蛋白质分离、 糖分析、手性分离、单细胞分析等。将样品中的相关的化学物质拆解成纯的物质 称为分离，它是混合的逆过程。荷电粒子在外电场的作用下泳动的现象叫电泳 ( e l e c t r o p h o r e s i s ) ，不同长度的d n a 虽然具有不同的质量和带电量，但其荷质比 是相同的，电泳的分离过程是典型的差速运动过程，和赛跑一样，d n a 片段的 不同长度导致迁移阻力的差异，各组分在电场力的作用下以不同速度运动，从而 3 浙江人学博j j 学佗沦义 甜刮i b 泳谱图。图1 1 为d n a 电泳原理示意图，d n a 电泳时常用凝胶和聚合物 溶液为筛分介质，它具有电泳和分子筛的双重作用，使电泳的分辨力高。 n u d n a 一 爹n a n 滁a 一，n j o l 冬l1 1d n a 电泳原理图( d n a 和筛分介质聚合物相互作用使不同大j 、的片段分离) g i 1s c h e m a t i co fd n ae l e c t r o p h o r e s i s ( s i z eb a s e ds e p a r a t i o nd u et oi n t e r a c t i o no fd n a w i t hp o l y m e rs t r a n d s ) 1 平板凝胶电泳 i 板凝胶电泳中的支持物是多孔凝胶，主要在d n a 电泳巾作为一种固体支 ：j 是质，其密度取决于其浓度。一般为聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等，平板凝 仆爻1 f 泳分两类：水平平板型和垂直板型电泳，如图1 2 ： 图1 2 半板凝胶电泳装置( 左：水平型，右：垂直型) fi g 1 2t h ep l a t eg e le l e c t r o p h o r e s i sa p p a r a t u s ( t h el e f ti sh o r i z o n t a lt y p e ，t h er i g h ti sv e r t i c a l t y p e ) 琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶可以制成各种形状、大d , 币u - t l 隙度。琼脂糖凝胶分 离l ) n a 片段范围较广，彳i i 司浓度琼脂糖凝胶可分离长度从2 0 0 b p 至近5 0 k b 的 i ) n a 片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰 胲分离小片段d n a ( 5 5 0 0 b p ) 效果较好，其分辩力高，聚丙烯酰胺凝胶电泳很快， 可容纳相埘大黾的d n a ，但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚内烯酰胺凝胶一 股采用垂直装置进行电泳。 | - if m ，实验窒多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行d n a 电泳，一般包括 4 第一章绪论 以下几步： ( 1 ) 电极缓冲液制备：核酸分离一般用连续缓冲体系，常用的有 t b e ( 0 0 8 m o l 1t r i s h c ! ，p h 8 5 ，0 0 8 m o l l 硼酸，0 0 0 2 4 m o l 1e d t a ) 和 t h e ( 0 0 4 m o l lt r i s h c i 。p h 7 8 ，0 2 m o l l 醋酸钠，0 0 0 1 8 m o l le d t a ) 。 ( 2 ) 凝胶制备：用上述缓冲液配制o 5 一0 8 琼脂糖凝胶溶液，加热使之融 化，冷至5 5 c 时加入荧光染料溴化乙锭( e b ) 至终浓度为o 5j _ t g m l ，将其注入模子 中，厚度依样品浓度而定。注胶时，梳齿下端距玻璃板0 5 1 0 m m ，待凝固后， 取出梳子，加入适量电极缓冲液使板胶浸没在缓冲液下l m m 处。 ( 3 ) 样品处理及加样：溶解于t b e 或t h e 内的样品应含指示染料( 如：溴酚 蓝) 使样品集中，每齿孔可加样5 - 1 0 斗g 。 ( 4 ) 电泳：一般电压为5 1 5 v c m 。 ( 5 ) 分析与回收：电泳结束后在紫外灯下观察样品的分离情况；对需要的 d n a 分子或特殊片段可从电泳后的凝胶中以不同的方法进行回收。 一般而言，平板凝胶的长度受装置的限制不会很长，而且为了把所有的片 段都保留在凝胶板上，使得各片段之间的有效分离距离很小，不能很好分离，所 以平板凝胶电泳的分辨率和灵敏度都不够高。 由以上实验过程可知，采用平板凝胶电泳需要的时阃较长，若将电泳前的洗 板、铺胶、进样等辅助工作所需时间计算在内，则需时更长。而采用微通道毛细 管电泳耗时较少，因为毛细管电泳仪器可以实现高度自动化。 2 微通道毛细管电泳( m i c r o c h a n n e le a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，m c e ) 毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，c e ) 2 1 1 是一类以毛细管为分离通道、 以高电压直流电场为驱动力的新型液相分离技术，原理如图l _ 3 。它是瑞典科学 家h e n e n 首先提出的【捌，m i k k e r s l 2 3 1 等于1 9 7 9 年证实必需使用细毛细管才能提 高分离效率i 川。1 9 8 3 年后，h j e r t e n t 先后提出毛细管凝胶电泳和毛细管等电聚焦 法，它们不仅可以大幅度提高效率，而且可以实现自动化操作，便于定性、定量 工作。这些激动人心的结果，激发了关于c e 研究的热潮，分析仪器厂商也同时 卷入，随着商品仪器在1 9 8 8 年的迅速推出，c e 开始突飞猛进地发展。由于它有 分离效率高、快速、样品用量少、运行成本低、操作简便等特点，已成为分析化 浙江人学博士学1 t 论义 学领域。 1 发展最快的分离技术之一。c e 应用的范凼极广，小至尤机离了，人至 ，卜物分子，都可用c e 进行分离分析。 图1 3 毛细管电泳装置原理图 f i g 1 3s h e m a t i cd i a g r a mo fac ea p p a r a t u s 微芯片i u 泳1 2 5 - 2 7 1 是以分析化学为基础，以微机电系统技术( m i c r o e l e c t r o m e c h a n i c a ls y s t e m s ，m e m s ) j u 工技术为依托，将微型全分析芯片系统( m i c r ot o t a l a n a l y s i ss y s t e m s ，! a t a s ) 2 8 1 技术与集成化技术结合起来，把分析实验室的功能最 大限度地转移到便携的分析设备巾，甚至集成到几平方厘米大小的芯片上【2 圳。它 把采样、稀释、进样、分离、检测等功能集成在微芯片上【3 0 ，3 1 1 ，实现便携化、智 能性的操作，图1 4 是某些微芯片设计示意图。 幽1 4 微芯片示意图( a g i l e n t ，c a l i p e r ) f i g 1 4t h es c h e m eo f m i c r o c h i p ( a g i l e n t ，c a l i p e r ) 一个更为通俗的名称“芯片实验室( l a b o n c h i p ，l o c ) t 8 ，2 6 ，3 2 。5 1 已经被广泛 接受。它以其高效、快速、微量、易自动化等突出优点1 3 6 1 ，成为小十u ：纪牛物化学、 医药、食品、临床医学、法医刑侦、环境监测【3 7 。3 9 1 等领域迫切需求的重要分析工 具，足近几年来世界各国研究的热点。 第一章绪论 毛细管阵列( c a p i l l a r ya r r a ye l e c t r o p h o r e s i s ，c a e ) 或微阵列( m i c r o a r r y ) 电泳 1 a o - 4 6 1 ， 即将多根毛细管组成阵列或在芯片上制作出多个通道阵列进行高通量样 品分析。毛细管阵列电泳首先由m a t h i e s 等【4 7 1 在1 9 9 2 年提出，随后美国衣阿华 卅i 立大学y e u n g 等1 4 8 1 和同本同立公司中心研究室k a m b a r a 等根据研究的需要 分别研制出了不同的毛细管阵列电泳装胃。目前，市场上已经 h 现了多种向品化 的高效毛细管阵列电泳仪，例如a p p l i e db i o s y s t e m s ( a b i ) 公的p r i s m3 1 0 1 5 0 l 、 s p e c t r u m e d i x 公司的s p e c t r u m e d i xs c e 系列与h t s 系列等。这些商品化仪器主 要分为凝胶电泳( c g e ) , r l 毛细管区带电泳( c z e ) ，崩丁d n a 序列分析，价格较高。 近年来m e m s 技术取得了快速发展，一些著名大学正在研发基于m e m s 微 芯片的d n a 分析技术，如m h 的e h r l i c h l 5 l 5 2 1 小组和b e r k e l e y 的m a t h i e s l 5 3 1 小组 等。图1 5 是美国m i tw h i t e h e a di n s t i t u t e ，e h r l i c h f 5 4 1 小组研制的一种高性能多通 道微芯片电泳系统，图中( a ) 是微芯片没计图，包括右端16 通道的1 6 个双t 电 动进样池，左端所有通道紧密排列在起便于扫描( f h u r , g , - 头部分) ，总k 度为3 2 m m 。 ( b ) 中左卜| 部是完伞集中在一起的刚极，阴极部分在右卜- 部，每一通道都有很小 的样品池和样品废液池，每一通道的有效长度为2 0 c m 。但是，这些基j 二m e m s 微芯j i 的d n a 分析技术尚未获得广泛应用，山于产品性能并不明显优于基于毛 细管的d n a 分析仪，大型分析仪器公司也没有此类产品的报道，大挪分还处j ： 研发阶段。 、f l o d e 三墨= 薹薹薹墓蚕i ! ! ；： 烹舞季鐾藁鍪 。一j 一一 c a i h o d e s a n , p i e1 a s t c 图1 5 一种多通道微心i t - 门l 。的设汁劁 f i g 1 5ac a dd r a w i n go f t h ec h i pl a y o u t 吲内有清华大学1 55 1 、浙江人学盼珏58 1 、卜海交通大学俐、中科院大连化物 所【8 16 0 一6 4 】等单位开展m e m s 微芯片的制作和应用研究，主要在理论i ：研究了分子 7 se 雾一 浙江大学博士学位论文 水平的分离技术，没有看到相关产品的报道。综观国内外基于毛细管电泳或芯片 技术的微全分析系统的研究现状，虽然国内也有研究机构在某些技术，如：系统 的进样、分离、反应、检测等的一体化集成方面作了大量的探索工作，已取得了 重要进展，但要形成最终的实用设各，仍然有很多核心技术问题需要攻克。 不论是微芯片还是毛细管，都是利用毛细管电泳分离原理，都属于微通道毛 细管电泳( m i c r o c h a n n e lc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，m c e ) ，使样品在微通道内完成分 离与检测口9 ，5 9 , 6 5 1 。采用微通道毛细管电泳能避免平板凝胶电泳的绝大多数缺点。 首先，微通道毛细管电泳采用保留时间而不是迁移距离来确定各分离组分的大 小，所有的组分都必须迁移相同的距离，能更有效地使各组分分开。其次，毛细 管电泳可采用诸如激光诱导荧光检测器等更加灵敏的检测装置，使得检测灵敏度 也有一定程度的提高。第三，毛细管电泳的样品用量很少，一般为纳升级，可以 对样品进行浓缩后检测，进一步提高检测的灵敏度，尤其对于样品获得相对困难 的情况有很高的实用价值。 1 2 2 基于电泳的检测方法 基于电泳的检测方法主要有：紫外可见光吸收检测、银染检测、激光诱导 荧光l i f d 检测、表面等离子体激元共振s p r 检测法等。对检测方法1 6 6 1 有很多要 求，最基本且最重要的是：要求检测限( l i m i to f d e t e c t i o n ，l o d ) 低，对峰宽影响 小。电泳分析系统的功能和应用范围很大程度上依赖于电泳检测方法的性能和水 平。 1 紫外可见光吸收和银染检测方法 在众多的c e 检测方法中，紫外一可见光吸收检测方法趋于成熟，是最普遍使 用的一种方法。自1 9 8 1 年y a n g 6 7 l 设计出第一个在柱u v 吸收检测器后，许多人 将高效液相色谱( h i 曲p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y , h p l c ) 中的u v - 可见 光吸收器进行改造，并根据c e 本身特点进行u v 吸收检测器的设计【6 8 】。它主要 由光源、光路系统、信号接收和处理系统组成。u v - 可见吸收检测器一般采用汞 灯( 1 5 0 - 3 8 0 n m ) 、钨灯( 3 8 0 - 8 0 0 n m ) 或氘灯( 1 9 0 - 一6 0 0 n m ) 作为光源，用单色器或滤 光片选择波长，波长准确度在l n m 或更好。图1 6 为典型的u v 可见光检测器原 理图，除了可以固定单波长检测外( 如图1 6 中的上部分) ，还可以多波长检测或 r 第一市绪论 【一j 一编年罕多波长快速扫捕( 1 9 0 8 0 0 n m ，如图1 6 中的下部分) 进行u v - 可见光谱检 测。通常用光电倍增管( p m t ) 或光电_ 二极管( p d ) 作单道或快扫描检测器，也可用 光电二极管| j 乍列( p h o t o d i o d ea r r a y ) 检测器作多道检测，多道检测时复合波长的光 束通过毛细管后由光栅多色仪分光，成像在阵列检测器上。 差篙子蘸c-qlight f o c u s i n g s o t l r c e o p t i c s 。 q ll 掰 日 e 二舀日 b p h 0 1 0 d e 佗c t o r m 0 n ( ) ( = 1 1 r o n l a t o rj 掣己g 卧叭0 1 1 h 巾l i 2 o l y m e rl a y e r 。 n 口 口日 l i g h tf o c u s i n g s o u r c e o p t i c s 图1 6 开管熔融j 色细箭红梓检测示意图 g1 6s c h e m a t i cd i a g r a m sf o ro n c o l u m nd e t e c t i o nu s i n gaf u s e ds i l i c ao p e nt u b u l a rc o l u m n 这种方法般采用柱上检测( o nc o l u m nd e t e c t o n ) 方式，也可以采用柱后检测。 柱l ：检测简单方便，仅需在距微通道毛细管的出口端适当位置开检测窗，i k ) l 路 对准检测窗广i 巳可。自组装c e 系统时，可采用液相色谱紫外检测器，只需将流 动池固定架加以改造，使之适合毛细管穿过并固定即可。微通道毛细管内径小， 光程短，它的圆柱面类似短焦距柱面透镜，使入射的圆形光束通过后变成椭圆光 束，增加了收集凼难，此外还凶为严重的反射和折射损失入射功率，增加背景噪 声，因此光路设计直接影n 向检测灵敏度。在入射光方向加1 高品质石英或蓝毫石 聚光球镜，i - j 以提高灵敏度一个数量级以上，对峰宽影, i g j i j , 。山丁吸收检测器通 用性好，结构简单，加上商品吸收榆测器已达到较高性能，因此，u v 1 l j 见i 吸收 检测器是目前应用最广泛的一种c e 检测器。u v 检测的主要缺一i 在于紫外彳：吸 收的化合物灵敏度很低。 银染色法是一种非放射性同位素标记的检测方法，堪本原理是通过高灵敏度 ( ) 浙江大学博士学位论文 的银盐显色步骤来检测电泳后的凝胶条带，a r 与d n a 形成稳定复合物，然后 甲醛使a g + 还原成银颗粒，硝酸银等试剂可使聚丙烯酰胺凝胶上的d n a 及r n a 都染成黑( 棕) 褐色，可以在显色后的胶上直接读出，凝胶照相记录结果，干胶保 存。银染法灵敏度高，其缺点是特异性不强，容易造成很高的背景，染色的深浅 与d n a 碱性组成有关，与核酸含量不成正比，定量不准确。而且，核酸、脂多 糖、脂类、醣脂类化合物常会对银染染色的结果进行干扰。 2 激光诱导荧光( l a s e ri n d u c e df l u o r e s c e n c ，l i f ) 检测方法 l i f 具有灵敏度高、选择性好、响应速度快、线性范围宽等诸多优点【6 9 ，7 0 ， 已经成功地应用于衍生的金属离子、染料、氨基酸、d n a 等多种样品的检测， 目前商品化的微通道分析仪器中l i f 是唯一被采用的检测器。l i f 检测器是激光 诱导荧光检测技术的关键。它主要由激光器、光学系统和测光元器件组成。激光 器发射一定波长的激光，经过光学系统聚焦到检测点，使样品分子受激产生荧光 辐射，再由测光元件对辐射出的荧光进行检测。可以与用于屯泳或液相色谱的毛 细管柱或与微通道芯片直接联用。 由于毛细管电泳样品区带的超小体积导致的光程短，需要采用高灵敏度的检 测技术。l i f 因检测灵敏度高而成为毛细管电泳主要的检测方式。l i f 的局限性 在于绝大多数化合物自身没有荧光，需要用染料标记，可选择的激光波长较少， 且激光器比较昂贵。 荧光的产生原理：荧光现象从本质上来说是一种光致发光现象。当物质的原 子、分子、聚合物吸收了某一光谱区的电磁辐射，它的电子产生能级跃迁，跃迁 到高能电子态，然后又通过无辐射过程弛豫到一种激发态的最低振动能级，则最 低振动能级的电子回到基态时发射光子，通常把这种现象称为荧光。