（生物学专业论文）国产乙酰异戊酰泰乐菌素对鸡猪支原体肺炎的试验观察.pdf

浙江人学硕士学位论文 国产乙酰异戊酰泰乐菌素对鸡猪支原体肺炎的试验观察 摘要 鸡毒支原体感染( c i d ) 是鸡常见的慢性呼吸道疾病，而猪支原体肺炎( m p s ) 则是由 猪肺炎支原体引起的一种以肺损伤为主的地方流行性疾病，药物防治和治疗是控制c r d 和 m p s 的主要手段。乙酰异戊酰泰乐菌素，常以酒石酸盐形式存在，是一种新的大环内酯抗生 一 索，无配伍禁忌，其杀菌效果好、耐药性、贮藏稳定性、残留问题符合欧盟标准，是兽曲中 为数不多的几种动物专用抗生素类药物之一，符合当前国际兽用药发展趋势。为了验证国产 乙酰异戊酰泰乐卣素对鸡猪支原体病的疗效，展开研究并取得相应结果如下： 一、乙酰异戊酰泰乐菌素可溶性粉能完全保护鸡对人工鸡毒支原体的攻击感染，保护率 1 0 0 ，治愈率达9 2 1 0 0 ；能显著降低鸡毒支原体引起的死亡率、气囊病变率、气囊损 伤程度和增重下降。国产乙酰异戊酰泰乐菌素可溶性粉在减少鸡只死亡、减少增重损失方面， 与进口产品相当。而国产乙酰异戊酰泰乐菌素可溶性粉高剂量组( 3 0 0 p p m ) ，可以完全清除 气囊感染。 二、研究表明：乙酰异戊酰泰乐菌素泰乐菌素预混剂能降低人工感染鸡毒支原体诱发气 囊炎的死亡率、气囊病变率、气囊病变和增重下降。乙酰异戊酰泰乐菌素在降低气囊病变率 和减少气囊病变上效果显著；其疗效与给药剂量呈正相关：感染后2 i 天时，国产乙酰异戊 酰泰乐菌素预混剂l o o p p m 、2 0 0 p p m 和3 0 0 p p m 以及进口乙酰异戊酰泰乐菌素预混剂2 0 0 p p m 组鸡气囊病变率和气囊病变计分减少率分别为6 0 、2 4 、8 、2 0 和5 54 、8 8 7 8 、 9 7 4 8 、8 7 0 6 。感染后2 l 天剖检结果与感染后1 4 天剖检结果相比，国产乙酰异戊酰泰 乐菌素预混剂3 0 0 p p m 剂量组气囊病变率从4 0 下降到8 ，气囊病变计分减少率从7 7 1 4 上升到9 7 4 8 ，支原体感染引起的慢性呼吸道疾病恢复期需要较长时间。试验结果表明 同剂量的国产乙酰异戊酰泰乐菌素预混剂和进口乙酰异戊酰泰乐菌素预混剂在降低气囊病 变率和减少气囊病变上效果相当。 三、无论是控制猪支原体肺炎特征性症状( 如气喘和干咳) ，减轻m p s 肺损伤率，还是 改善增重，提高生氏速度，国产乙酰异戊酰泰乐菌素与进口乙酰异戊酰泰乐菌素预混剂效果 均十分明显，比较试验证明_ 二者无明显著异。 关键词：乙酰异戊酰泰乐菌素、鸡毒支原体、猪肺炎支原体、鸡、猪 4 浙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t t r e a t m e n tt r i a l so fa c e t y l i s o v a l e r y lt y l o s i o na g a i n s t m y c o p l a s m o s i so fc h i c k e na n d s w i n e m y e o p l a s r n ag a l l i s e p t i c u mi n f e c t i o ni sac o m m o nc h r o n i cr e s p i r a t o r y d i s e a s e ( c 曲) i nc h i c k e n m y c o p l a s m a h y o p n e u m o n i a eo fs w i n e ( m p s ) i sal o c a le p i d e m i cd i s e a s em a i n l yd a m a g i n gt ot h el u n gc a u s e db y m y c o p l a s m ah y o p n e u m o n i a e t h em a j o r m e t h o dt oc o n t r o lt h e s e d i s e a s e ii s u s i n g m e d l c i n et o p r e v e n t a n dt r e a tt h ed i s e a s e a c e t y l i s o v a l e r y lt y l o s i o ni san e wa n t i b i o t i co ft h e m a c r o l i d e ”c l a s sw i t h t h ec h a r a c t e r i s t i c so fg o o de f f e c tt os t e r i l i z a t i o n ，l o w e rr e s i d u a la n d s t a b i l i t y a c e t y i i s o v a l e r y lt y l o s i o ni sag o o dv e t e r i n a r ym e d i c i n a lp r o d u c t a n dw i d e l yu s e d t h ea i mo ft h e s et r i a l si st od e m o n s t r a t et h ee f f e c to f a c e t y l i s o v a l e r y lt y l o s i o nm a d ei nc h i n ao nm y c o p l a s m o s i s 1 a c e t y l i s o v a l e r y lt y l o s i o nt a r t r a t ep o w d e rc o u l dt o t a l l yp r o t e c tt h e e x p e r i m e n t a li n f e c t i o nw i t hm y c o p l a s m a g a l l i s e p t i c u m t h ep r o t e c t i v e r a t ea n dc u r a t i v er a t ec o u l dr e s p e c t i v e l yr e a c h10 0 a n d9 2 一10 0 a c e t y l i s o v a l e r y lt y l o s i o nt a r t r a t ep o w d e rc o u l dd e c r e a s et h em o r t a l i t y r a t e ，p a t h o l o g i c a lc h a n g e s o fa i r - s a ca n dw e i g h tl o s sc a u s e d b y m y c o p l a s m a g a l l i s e p t i c u m a c e t y l i s o v a l e r y lt y l o s i o nt a r t r a t ep o w d e r m a d ei nc h i n ah a sas i m i l a re f f i c i e n c yt ot h a tm a d ea b r o a d t h ea i r - s a c i n f e c t i o nc o u l db e c o m p l e t e l ye l i m i n a t e du s i n gt h eh i g hd o s e 浙江大学硕士学位论文 ( 30 0 p p m ) a c e t y l i s o v a l e r y lt y l o s i o nt a r t r a t e 2 a c e t y l i s o v a l e r y lt y l o s i o np r e m i xh a st h ee f f e c tt or e d u c et h em o r t a l i t y r a t e ，p a t h o l o g i c a lc h a n g e so fa i r s a ca n dw e i g h tl o s sc a u s e db ya r t i f i c i a l i n f e c t i o nw i t hm y c o p l a s m a g a l l i s e p t i c u m a c e t y l i s o v a l e r y lt y l o s i o n h a sas i g n i f i c a n te f f e c to nr e d u c i n gt h ep a t h o l o g i c a lc h a n g e so fa i r - s a c w i t had i r e c tr a t i ot ot h ed o s a g e 21 d a y sa f t e ri n f e c t i o n ，t h er a t eo f p a t h o l o g i c a lc h a n g e so fa i r s a ca n dt h er e d u c i n gr a t eo ft h ea i r - s a cl e s s i o n s c o r eo ft h o s et r e a t m e n tg r o u p ( 1 o o p p m ，2 0 0 p p m ，30 0 p p m ) a n dd r u g c o n t r o lg r o u p ( 2 0 0 p p m ) a r er e s p e c t i v e l y6 0 ，2 4 ，8 ，2 0 a n d 5 5 4 8 ，8 8 7 8 ，9 7 4 8 ，8 7 0 6 c o m p a r i n gt h er e s u l to f2 1 t hd a y s a f t e ri n f e c t i o nt ot h eo n eo f14 t hd a y s ，t h er a t eo fa i r - s a cl e s i o nr e d u c e f r o m4 0 t o8 b u tt h er e d u c i n gr a t eo fa i r - s a cl e s i o ns c o r er i s e s f r o m7 7 14 t o9 7 4 8 t w ok i n d so fp r o d u c t sr d o m e s t i ca n d a b r o a d ) h a v eas i m i l a re f f i c i e n c y 3 i nc o n c l u s i o n ，a c e t y l i s o v a l e r y lt y l o s i o nh a st h es i g n i f i c a n ta b i l i t yt o c o n t r o lt h ec l i n i c a ls i g n so fm y c o p l a s m o s i so fs w i n e ，r e d u c et h ed a m a g e o ft h ed i s e a s e ，a n di m p r o v et h ew e i g h t t h er e s u l t a l s os h o wt h a tt h e e f f e c to ft h et w ok i n d so fp r o d u c t s ( d o m e s t i ca n da b r o a d ) a r eh i g h e f f e c t i v ea n dn od i f i e r e n t k e yw o r d s ：a c e t y l i s o v a l e r y lt y l o s i o n ，m y c o p l a s m ag a l l i s e p t i c u m ， m y c o p l a s m ah y o p n e u m o n i a e ，c h i c k e n ，s w i n e 6 塑坚查堂堡主兰垡丝兰 一 第一章支原体病综述 支原体( ：y c o p l n s m a ) 是柔膜体纲( m o l l i c u t 嬲) 支原体目( m y c o p l a s m a t a l e s ) 中的一类介 于细菌和病毒之间的原核微生物。1 8 9 8 年n o c a r d 首次从牛传染性胸膜肺炎病灶中分离出该种 病原体，开始了支原体及支原体病的研究，至今已有一百多年。早期的研究由于受诸多因素 的限制，研究进展缓慢，直至1 9 6 2 年c h a n o c k 及h a y f l i c k 在人工培养基上分离肺炎支原体获 得成功，支原体的研究才得以迅速发展。截至2 0 0 0 年分离出的支原体约达1 6 0 4 】，遍布世界 各地。支原体对人类及牛、羊、猪、鸡等生物的危害较大，另外实验动物及细胞培养中的支 原体污染对科研、医疗及生物制品生产可造成巨大损失。常见的动物支原体病原有猪肿炎支 原体、猪鼻支原体、猪滑液支原体、鸡败血支原体、鸡滑液支原体、牛丝状支原体丝状亚种、 牛生殖道支原体、羊肺炎支原体和无乳支原体等。对畜牧业上造成危害较大的支原体病主要 有：猪支原体性肺炎( 猪喘气病) 、鸡败血支原体感染( 鸡慢性呼吸道疾病) 、牛传染性胸膜肺 炎( 牛肺疫) 和山羊的传染性胸膜肺炎四类疾病“。近年来，我国已正式宣布消灭了牛传染 性胸膜肺炎，基本上控制了山羊胸膜肺炎，但猪支原体性肺炎h y o p n e u m o n i a e ，m h p ) 和鸡 败血支原体感染恤g a l l i s e p t i c u m ，搿功每年给我啻畜牧业造成的损失仍达几十亿元。目前， 国外结合免疫学、遗传学及分子生物学应用新技术、新方法对动物支原体病的诊断、免疫及 治疗方面进行了广泛深入地研究，国内在这些方面的研究也取得了一些可喜的进展，现将研 究情况简述如下。 1 1 病原学特性 1 1 1 形态学特征 由于支原体外围只有柔软的胞浆膜，故具有高度的多形性，其形态易受外界因素影响而 发生改变，如培养基及染色液的p h 变化、离子强度和渗透压的改变。故不论是在培养基中还 是在动物体内都没有一定的形态，有球形、椭圆形、丝状、棒状等不规则形态，以球形为常 见，可通过直径2 2 0 h m 的微孔滤膜。支原体在固体培养基上形成细小菌落，肉眼不易观察到， 在低倍显微镜f 大多数菌落呈煎蛋状，中心呈脐状隆起，基部陷入固体培养基内，边缘部分 扩散在培养基表面。少数支原体的菌落呈圆形隆起的颗粒状。”，支原体的菌落形态因其种型 不同而各具特征。猪肺炎支原体在液体培养物和肺触片中，以环形为主，也见球状、两极杆 状，新月状、丝状。鸡霉支原体通常为球形、卵圆形或梨形，细胞的端或两端具有“小泡” 极体，该结构与菌体的吸附性有关。 一 一一 塑垩查堂堡主兰焦堡苎一_ _ - _ _ _ _ _ _ - - _ - _ - - _ _ - - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ h _ 一 支原体细胞的超微结构很简单，无细胞壁，其细胞膜为厚度7 5 1 10n m 的3 层单位膜。 内层和外层由屯子密度高的蛋白质和糖类构成，中间层由电子密度稀薄的脂质构成。胞质内 含有数量颇多的核糖体，环状双股蹦a 分散在胞浆内，但不具有线粒体和高尔基体等。支原 体膜的外层常有绒毛( f i l 哪e n t ) 。猪肺炎支原体、尿解支原体等在胞模外有一层细绒毛，经 钉红染色后似一层英膜。 1 1 2 繁殖方式 支原体的繁殖方式一般为三均分裂，也有芽生、丝状断裂或由大的菌体一次释放出较多 的单体颗粒。多种支原体的胞质分裂落后于基因组的复制，两形成多核丝状。支原体的繁殖 方式可能与其种有关，但同一个种也可能因培养基条件、培养时间等不同而异，这也是缺乏 细胞肇类微生物韵繁殖特点。 l 1 3 抗原特性 支原体的主要抗原物质存在于细胞膜，主要成分为膜蛋白与糖脂。糖脂为半抗原，与蛋 白质结合后具有抗原性，是产生体液免疫的抗原物质，可产生生长抑制、代谢抑制和补体结 合抗体，除去脂质的糖蛋白抗原可引起细胞免疫，能抑制免疫豚鼠腹腔内巨噬细胞的移动及 引起皮肤变态反应。试验证明，肺炎支原体蛋白抗原分子为1 7 0 l ( d 的p 1 蛋白质具有抗原性及 免疫原性，对黏附及致病具有重要作用。故研究支原体蛋白抗原是了解支原体致病作用的重 要内容。”。 1 2 流行特点及其危害 在畜牧业方面，随着规模化养殖业的发展，支原体性传染病扩火蔓延造成了很大的损失； 在基础理论研究方面，由于支原体而致试验动物死亡，使试验失败；在病毒学和生物化学试 验中，j 泛使用的细胞培养及生物制品生产常因支原体污染而造成严重损失。由此可见，支 原体冈其分布，“、种类多，所造成的危害不可低估。 根据对全国2 0 个省、市的血清学调查发现，鸡群中鸡毒支原体阳性感染率接近8 0 ，鸡 慢- 胜呼吸道病已成为鸡场最难控制的疾病之一。根据流行病学调查，感染率平均为 7 0 一8 0 。各种年龄的鸡均可被感染，但成年鸡较幼龄鸡的抵抗力高：不同品种的鸡抵抗 力可能相似。除了某些s p f 鸡场外，可以说任何鸡场都受到支原体感染的困扰。除鸡外，很 多禽( 呜) 类也可感染不同的支原体株，但这些禽类在鸡支原体病发生中的作用尚不完全清 楚。支原体的传播方式主要通过空气传播。病鸡或带菌鸡通过呼吸、咳嗽，随粘液排出大量 塑垩_ 大兰堡主兰垡堡苎 支原体，这些支原体在空气中飘浮，健康鸡接触这些支原体将引起感染：另外一种重要的传 播方式是通过种鸡垂直传播，造成雏鸡体内带有支原体，或出壳后即成为弱雏；第三种传播 方式可能容易忽略，就是某些活疫苗中可能含有支原体，据报道，2 0 的新城疫i 系苗中污染 有败血支原体或滑液囊支原体1 。因为制作疫苗的鸡胚来自于普通的种鸡场，支原体没有很 好地净化，接种时很容易造成支原体人为地传播。还有在治疗疾病时使用的卵黄抗体，如果 灭活不彻底，也有可能污染支原体，造成支原体的人为传播。 发病率高，病程长，康复慢是本病的最大特点，一旦此病在鸡场出现，除了它本身造成 的危害外，还可诱发多种病毒和细菌性呼吸道疾病，使得疾病的预防控制变得更加复杂；由 下支原体缺乏细胞壁和很容易产生耐药性，一般药物治疗无效，即使是用有效的药物治疗， 也只是短期内有一定的效果，不能彻底根治，停药后又可复发。此病在我国的广泛流行给养 鸡业造成了难以估量的经济损失，是鸡健康的潜在杀手。 猪肺炎支原体能在猪肺中长期停留，治愈比较困难，因此本病的死亡率虽然不高，但由 于流行的广泛性、长期性和消耗性，所造成的经济损失仍然是巨大的。猪支原体性肺炎是一 种慢性的死亡率低而发病率高的疾病。其主要症状是饲料的利用率低，病猪增睦十分缓慢， 生k 停滞。我国白1 9 5 3 后，开始较大规模流行；1 9 5 5 年秋，浙江等地猪场大规模暴发此病， 流行地区渐渐扩火，对集体养猪和机械化养猪业的迅速发展威胁较大，而且这种流行的广泛 性、i 王= 驯性和消耗性所致的经济损失仍然是巨大的，大多数养猪国家均报道有此病的发生。 长期以来，该病是最常发生和经济意义重大的猪病之一。据估测，1 9 9 9 年全世界仅用于通过 疫苗防治猪支原体肺炎一项的费用就高达l ，l 亿英镑。1 。 1 。3 致病机理 过去对支原体致病机理多从病理组织学和细胞学方面进行研究。近年来，随着生物学技 术和分子免疫学的发展，发现支原体感染的致病机理除病原对宿主的直接侵入外，还有复杂 的免疫学机理。在研究支原体与各类宿主细胞间的作用中，发现支原体感染能产生广泛的异 常免疫反席，包括多克隆激活t 及b 淋巴细胞增殖，激活巨噬细胞、nk 细胞及细胞毒t 细 胞的溶细胞活力，并刺激免疫活性细胞产生某些细胞因子造成组织损伤。支原体多克隆激活 b 淋巴细胞增殖，产生特异性和非特异性抗体。特异生抗体对疾病恢复及防御起一定作用， 尤其是分泌性抗体对防御再感染起着重要作用。但增强的抗体反应亦可成为致病因素引起不 良结果，如肺炎支原体感染时i 啦反应也增加，出现i g e 介导的超敏反应，引起哮喘病的急洼 发作；抗体与抗原形成免疫复台物，沉积于关节或组织内，激活补体或巨噬细胞，引起炎症 反应。b 淋巴细胞的多克隆增殖还可产生非有关抗原的抗体，如肺炎支原体感染时产生的冷 凝集素，可引起免疫性溶血性贫血：产生的抗各种器官组织的自身抗体，可引起自身免疫性 9 浙江大学硕：i 学位论文 肺外并发症。另外，在b 淋巴细胞活化后，可产生趋化因子、f c 受体及免疫球蛋白酶，妨碍 抗原与抗体的结合改变抗体功能，导致炎症加强，产生病灶，阻甜疾病恢复，利于支原体 存活。支原体感染所造成的免疫系统损害可从试验动物淋巴细胞亚群的检测得到证明t 如某 些支原体感染引起机体细胞免疫功能下降其原因是由于机体抑制细胞功能增强，导致细胞 免疫功能减弱缄失衡，总t 淋巴细胞f 降，辅助t 细胞( t h ) 减少，抑制t 细胞( t s ) 增多， t h t s ( c d 4 c d 8 ) 比值下降，致使免疫调节发生混乱，因而表现出临床症状。支原体对宿主细 胞有特殊效应，如a l d r i d g e 等的研究认为，肺炎支原体在体内的致病性与淋巴细胞有丝分裂 之间有相互关系。近年来，发现关节炎支原体a r t h r i t i d i s ) 可以产生一种称为m a m 的超级 抗原，它可以直接结合在组织相容性复合体( m h c ) 的分子上而不需要抗原提呈细胞( a p c ) 的处 理。它可以激发鼠及人t 淋巴细胞增殖，激发t 淋巴细胞释放细胞网子，加强b 淋巴细胞分 泌抗体的活力，引起t 淋巴细胞介导的自身免疫性疾病，并发现m a m 能在鼠身上产生试验性 胶原性身免疫性关甘炎”】。因此。支原体感染的发病机理，很可能与超抗原的存在有关。综 上所述，支原体感染的发病机理是极为复杂的，有关问题还需进一步探讨。 1 4 临床症状与病理变化 1 4 1 鸡慢性呼吸道病 病初可见鼻液增多，流出浆性或粘性鼻液，鼻孔周围沾污明显，打喷嚏。分泌物增多时， 病鸡h 乎吸困难，张口呼吸，咳嗽和发出呼吸罗音。单纯的鸡毒支原体感染一般死亡率不高， 主要是慢性经过，因此雏鸡感染后，常常引起发育受阻，关节炎或者导致鼻窦炎，引起眼睑 肿胀，跟突出形成所谓的“金鱼凸眼”状甚至导致一侧或两侧跟萎缩或失明。成年鸡和肉 鸡症状没有雏鸡的明显，但产蛋鸡会发生产蛋量和蛋重下降。最重要的是，鸡群因感染该病 后免疫力f 降，此时若受到某些应激因素的作用，如环境卫生差、通气不良、饲料营养不全、 温度骤变、病毒或者细菌并发感染等，则症状会变得相当复杂，死亡率增高，雏鸡可达3 0 以上，成年鸡也会因病程的长短和严重程度而出现一定数量的死亡。剖检通常可见到鼻腔、 气管、气囊、肺以及鼻窦等呼吸系统的病理变化。若为单一的支原体感染，则为轻度的鼻炎 和眶f 窦炎，牿膜水肿、发炎，轱液增多或有灰白色于酪样物；肺部充血，有不同程度的肺 炎变化；胸腹部气囊膜浑浊、增厚，有黄色泡沫样液体，严重者呈现黄色或灰白色干酷样渗 出物。偶尔可见到炎症蔓延至眼部从而引起一侧或两侧限部肿大，内含灰黄色的干酪样物 质。对产蛋鸡而言，有时会出现输卵管炎。如果鸡在感染了支原体病后，并发其它细菌如埃 希氏人肠杆菌病或病毒病如肺病毒病，则临床症状和剖检病变会复杂化，容易导致误诊。 0 浙江大学硕士学位论文 1 4 2 猪喘气病 猪感染后发生慢性干咳，生氏受阻，发育迟缓，发病率高，死亡率低以及扩散缓慢，易 反复发作。但猪肺炎支原体易与其它病原如胸膜肺炎放线杆菌、猪繁殖与呼吸障碍综合征病 毒、肺炎巴氏杆菌等混合感染，使临床症状复杂化，而且有些感染猪菇不出现临床症状，因 此，通过临床症状只能怀疑猪或猪群患有喘气病。剖检病肺出现紫红色到灰色、白色的坚实 区，且多发生在肺心叶、中间叶和尖叶的腹面，隔叶盼前部常呈“胰样”、“虾肉样”病变， 肺膨胀不全，特别是在慢性病例中，切开病肺时感觉质地似肉状但并不十分坚硬、富有弹性。 ， 在疾病早期和中j i j 气管内通常有卡他性分泌物贮留，支气管淋巴结及纵隔淋巴结通常肿大。 如发生了巴氏杆菌、放线杆菌等细菌的二次侵入，则常引起化脓性肺炎。但这些病变是非特 异性的，其他疾病也可见到相似的病变，因此单凭肉眼诊断是不可靠的，要确诊还必须结合 其它诊断方法。 1 5 诊断方法 本病一年四季均可发生，但以寒冷的冬春季节多发。根据其流行特点、临床症状及剖检 病理变化常可作出初步诊断，但由于该病发生后。常继发其它细菌病或病毒病，故通常须进 行实验室确诊。目前，用于检测支原体的方法主要包括分离培养法、电镜法、血清学方法、 核酸探针法和p c r 法等。 1 5 1 分离培养法 分离鉴定是诊断本病最可靠的方法，也是最经典的方法。一般来说，支原体的体外分离 培养难丁细菌的分离培养。任桂珍用半固体培养基、液体、固体培养基( 传统培养法) 分离鉴 定支原体发现半固体培养法较传统培养法简便、快速、经济，且具有良好的敏感性和特异 性，而传统培养法则较费时，操作复杂，对技术要求高，只有条件较好的实验室才能进行。 1 _ 5 2 电镜检查法 由于支原体具有典型的形态结构，电镜检查法对各种支原体都适用。应用电镜检测支原 体，从取样到获得结果只需2 h 左右。只因设备昂贵、操作技术复杂，故电镜检查法的应用范 围有限”。 浙江大学硕士学位论文 1 5 3 【吐清学检测 在血清学检测方法中，生艮卸制试验、代谢抑制试验、表面荧光抗体技术等虽然特异， 但用丁检测和鉴定支原体较繁琐、费时：斑点免疫结合试验和e l i s a n 较灵敏、特晃、简便、 快速。尚永丰等应用斑点免疫结合试验对1 1 种支原体培养物和分离自3 6 个自感染细胞和污染 疫苗中分离的支原体培养物进行鉴定，结果与生长抑制试验、间接免疫荧光检测的结果完全 一致，证明斑点免疫结合试验为一种快速、简便和特异的血清学方法。杨百亮等建立的单克 隆抗体a c e l i s a 可检a ! u n 2 8 1 2 u g m l 的鸡毒支原体抗原。该法具有简单、灵敏、快速等优点， 从采样到获得结果只需6 h ，且检出率高于分离培养法，重复性良好。血清学方法虽然简单、 灵敏，但各支原体之间常有交叉反应”。 1 5 4 核酸探针检测 对r 支原体的检测，血清学方法简便易行，但对使用过疫苗的群体无效，两且像鸡毒支 原体与滑液支原体的共同抗原决定簇较多，用常规血清学方法不能区别，因而支原体的检测 一壹是实验室难度较大又颇为费时的工作。8 0 年代后期，国9 开展了鸡败血支原体芹| l 滑液支 原体种特异性核酸探针的研究。l e v i s h o n 等克隆到1 个6 k b 片段，它对鸡败血支原体各株均有 识别作用，而与滑液支原体及其他菌无交叉反应。用p 2 标记的探针检测人工感染鸡，1 n 后 在气管拭子中可检测出鸡败血支原体”。z h a o 等研制的滑液支原体种特异洼核酸探针能检 2 n g 鸡滑液支原体d n a ，而与鸡毒支原体d n a 无交叉反应。s t e m k e 将猪肺炎支原体d n a 的e c o ri 酶切片段随机克隆到m 1 3m p l 9 中，并用重组产物制成探针，可检测到约l o p g 的猪肺炎支原体 d n a 。但该探针不能检出气喘瘸病肺中的猪肺炎支原体d n a ，只有将病原培养增殖后方可检出 l 。a h r e n s 等将猪肺炎支原体基因文库中的1 个1 3 k b 的d n a 片段通过点杂交后检测猪、牛的 不同支原体，结果仅对猪肺炎支原体有特异性反应以3 5s 标记作探针可检出l o o p g 的猪肺 炎支原体d n a 。a b i v e n 等应用p b r 3 2 2 质粒h i n di i i 染色体片段构建了猪肺炎支原体的部分基 因组文库，并研制出了相应的探钟，用p ”标记后可检测出4 0 0 p g 的猪肺炎支原体d n a 。 f e r n a n d e z 等设计了2 个与鸡毒支原体和滑液支原体的1 6 sr r n a 可变区v 8 特异性互补的寡 聚核苗酸探针，通过放射性标记这种探针可以一次检出2 1 0 4 3 x 1 0 4 个支原体”。 检测支原体，核酸探针法比分离培养法快得多，比血清学方法更可靠，并可_ i = j 于早期感 染的检测，可检出1 09 9 水平的支原体d n a 量。但核酸探针杂交的各支原体间常有交叉反应， 易出现假阳性。该方法虽具有较高的敏感性，但仍需被检样品中有1 0 j m l 以上的支原体存在， 且试验条件苛刻，目前主要用于基因克隆和克隆产物的鉴定。 2 浙江大学硕士学位论文 1 5 5p c r 检测 随着对支原体分子生物学研究的深入及对1 6 sr r n a 和2 3 sr r n a 的了解，人们开始通过设 计合成与1 6 sr r n a 基因或其他基因序列特异结合的引物和其他类型引物来检测支原体。 1 5 5 1 应用特异性引物通过p c r 检测支原体 d u s s u t r g e t 等设计特异性引物，对5 种支原体1 6 sr r n a 基因中的一定片段进行p c r 扩增来 检测支原体。先用属间特异：陛引物对5 种支原体1 6 sr r n a 基因中的1 个7 1 7 b pd n a 片段进行扩 增，然后用种间特异性引物对1 6 sr r n a 基因的可变区进行扩增。这种方法一次可检出l o f g 的纯化的d n a ，通过改进的方法，制备了能与p c r 产物杂交的p ”标记探针，其检出率可提高1 0 倍，一次可检山l l o 个基因组拷贝“。琳芝勋等根据基因库中火鸡支原体的1 6 sr r n a 基因 序列，设计了1 对跨幅j , j 8 5 0 b p 的特异性引物，用这对引物对4 种禽株火鸡支原体标准株和6 种其他禽病原体进行p c r 扩增，结果4 种禽株火鸡支原体标准株均得到片段大小与预先设计一 致的p c r 扩增产物，而其他6 种禽病原体( 包括鸡毒支原体、滑液支原体) 的扩增结果均为阴性， 该p c r 能检出l o o f g 的火鸡支原体d n a “。 1 5 5 2 应用多重p c r 检测支原体 谢芝勋等根据鸡毒支原体和滑液支原体的基因文库，设计合成了分别与鸡毒支原体、滑 液支原体某段基因序列互补的2 对引物，用这2 对引物进行多重p c r 检测目的模板d n a 时，均同 时得到2 条大小与试验设计相符的7 3 2 b p ( 鸡毒支原体) 和2 0 7 b p ( 滑液支原体) 的扩增带，而对 其他8 种禽病原的扩增均为阳- 性。敏感性测定结果表明：该多重p c r 技术最低能同时检测出 l o o f g 的鸡毒支原体、滑液支原体d n a 模板量。 1 5 5 3 应用通用引物检测支原体 尹秋生等对1 2 支原体的1 6 sr r n a 和2 3 sr r n a 核酸序列以及两种r r n a 之间的间隔区核酸 序列进行了比较从中选择了两段高度重复的核酸序列，经p c r d e s n 分析合格后作为支原体 通用引物，一次p c r 扩增就能检出1 2 种支原体。用这对通用引物检测4 l 份临床标本、1 6 份细 胞培养物$ n 2 0 只大白鼠，阳性率分别为1 4 6 、4 3 7 、2 0 0 。证明用通用引物检测支原体 具有覆盖面广，可快速检测感染性人体、动物和细胞培养物的各种常见支原体，且不易发生 漏检“。 浙江大学预士学位论文 1 5 5 4 应用嵌套式p c r 检测支原体 s t e m k e 对嵌套式p c r 作了改进，使其敏感性提高到可检出1 个猪肺炎支原体d n a ；并可直 接检出肺中的猪肺炎支原体“。s t a r k 等利用新的嵌套式p c r ，成功地在实验室和野外条件f 检测山空气样品中的猪肺炎支原体。m a r i a 等根据猪肺炎支原体的1 6 sr r n a 设计了2 套种特异 r 眭嵌套式p c r 引物进行试验，得到了预期的结果，且与存在于猪乎吸道的其他种支原体无交 叉反应，说明该检测方法对从鼻拭子中检测猪肺炎支原体优于其它p c r 方法。 1 6 防治 目前对支原体感染的防治主要在于健康畜禽的建立、疫苗预防及药物治疗。 1 6 1 健康畜禽的建立 控制支原体的感染首先要做好建立无病群的工作。要达到这一目标，首先养殖场要有合 理的布局，良好的隔离平防疫、消毒制度，以及好的饲养环境；其次最好采用全进全出的饲 养模式；最后要控制人员流动。通过以上措施，可控制水平传播。经常性的检测，淘汰阳性 畜禽，使种毒禽保持不受支原体感染的健康状态，对控制支原体病是非常有益的。 1 6 2 疫苗预防 用药物治疗支原体病虽然有效，但不能清除带菌状态，临床上由于艮期使用或滥用抗菌 类药物，使得支原体耐药菌株也不断增加，给临床治疗带来困难，因此，疫苗免疫领域成为 不可忽视的领域。 1 6 2 1 猪肺炎支原体疫苗 目前世界上使j = | j 的胁p 疫苗仍以灭活疫苗为主，也有少数基因工程疫苗和弱毒苗。我国 从5 0 年代起，一些单位就相继开展了猪支原体肺炎灭活疫苗的研究，后因制出的疫苗免疫 效果不佳而纷纷f 马“6 】。中国兽药监察所于5 0 年代末开展了弱毒疫苗的研究，将支原体 菌株在兔体内连传7 0 0 多代，终于将一株强毒株猪肺炎支原体减毒致弱，培育出来了一株毒 力低，免疫原性好的疫苗制造株，并用该菌株生产出了三种类型的疫苗，即：大兔肺组织冻 干弱毒疫苗、乳兔肌肉冻干弱霉疫苗及鸡胚卵黄囊冻干弱毒疫苗。用该疫苗免疫接种了近 2 0 个地方品种的士种猪及外来品种的杂交猪，经过x 光胸部透视，称重比较，临床观察及 剖检等方法证明疫苗安全，对猪无副作用，免疫接种猪与非接种的健康猪同圈饲养，不发生 4 浙江大学硕士学位论文 交叉感染，经强毒攻击，8 0 的接种猪能完全保护肺组织不出现任何病变，免疫期可达1 2 个月。另外，江苏省农业科学院也研制成猪支原体肺炎株弱毒疫苗，对杂交猪安全，攻毒 保护率8 4 ，免疫期6 个月。但这两种疫苗必须注入肺内才能产生免疫效果。美国l e a n n 报 道给猪免疫良好的猪肺炎支原体亚单位疫苗，不但有效控制支原体肺炎的发生，而且有助于 减少其他如猪的繁殖与呼吸综合症的发生。 1 6 2 2 鸡毒支原体疫苗 。 目前厂泛使用的疫苗为油佐灭活苗及弱毒苗。油佐灭活莓能较好地防止鸡群气囊炎的发 生雨f 鸡蚩产餐的f 降，但免疫期短，产生免疫慢，同时还不能抵抗m g 在气管中定居，也不能 减少感染鸡气管中的m g 数量，而弱毒苗却能克服这些缺点l ”l 。t 3 本把6 2 5 0 株、法国将c p 株、美国将f 株、t s u 株及6 8 5 株制成疫苗应用。其中g 2 5 0 株、c p 株由于极度减毒，需要频 繁应用，但效果也不理想。f 株比野毒株致病性低，在鸡产蛋和被野毒m g 感染之前使用，可 降低商品蛋鸡的产蛋损失和种蛋中病原体的经卵传递。但f 株对鸡仍有一定毒力，特别是对 火鸡，它可以引起商品火鸡感染发病。t s 一1 1 和6 8 5 株的免疫效果与f 株相近，但毒力更低， 安全性更好，不会对邻近鸡群构成威胁。国内中国兽药监察所用弱毒株f 一3 6 制成的括疫苗免 疫接种鸡，不影响鸡体增重，不引起气囊损伤，接种鸡不表现任何临床症状，该疫苗接种鸡， 免疫保护率达8 0 ，免疫期可达9 个月”“4 。利用弱毒苗来控制m g 感染的效果是十分理想的， 它可能是采用混养方式的鸡场消灭m g 的有途途径。江苏省农科院对s 6 株进行克隆致弱得n s c 株，并对其免疫原性进行测定，近期免疫保护率在7 5 以上，尤其是免疫1 0 天后攻毒保护率 达8 0 。川鸡毒支原体培养物浓缩后灭活制成的油乳剂茁免疫接种可使鸡产生良好的免疫力， 在强毒攻击后，免疫组在免疫后1 、2 、3 个月的鸡气管中的支原体分离率分别较非免疫对照 组降低了7 8 、7 1 和3 9 。气囊炎发病程度分别较非免疫对照组下降了9 3 、8 6 6 和7 7 2 ， 头两个月的体重增加也分别比对照组高1 8 3 只和1 9 3 7 9 只，接种5 5 个月利6 5 个月后用强 毒攻击，免疫组的产蛋率在半个月内较攻毒前分别降低了o 卿7 ，而对照组则分别降低了 2 7 4 和2 6 j “1 。 1 6 3 药物治疗 支原体的结构和性质决定了抗支原体类药物具有以f 的特点：支原体最突出的结构 是没有细胞壁， 因此对作用于细胞壁生物合成的抗生素如b 一2 # j 酰胺类、万古霉素、环丝 氨酸及杆崮呔等完全不敏感：抗菌药物对支原体的抑制作用和抗其它细菌作用基本平行， 因此，常用丁支原体和其它细菌的并发感染；使用抗菌药物能不同程度的缓解动物支原体 疾病的临床症状，但一般都不能彻底根除，一旦停药，疾病还会复发；动物支原体在长期 浙江大学硕士学位论文 的药物治疗中，对磺胺类药、多粘菌素、利福平等药物出现普遍耐药现象；由于临床并发 感染及耐药性的山现，因此联合应用抗菌药物防治动物支原体病更具有理论和实际意义”1 。 1 6 3 1 大环内酯类抗生素 1 6 3 1 1 红霉素 宁宜宝( 2 0 0 0 ) 发现红霉素在体外对各种支原体都有较好的抑菌作1 | = j ，但在动物体内作用 不佳或根本不起治疗作用“。宁宜宝( 2 0 0 3 ) 利用氨苄青霉素硫氰酸红霉素可溶性粉剂进行的 鸡毒支原体体外抑菌试验和体内治疗试验表明：当培养基中药物浓度达n o 0 1 2 5 u g m l 时，能 有效地抑制试管中鸡毒支原体的生睦繁殖；饮水中药物浓度达1 1 2 0 u g m l l l g ，能有效地降低 感染鸡的死亡率，对提高感染鸡的增重有一定的作用，但在降低气囊损伤方面作用不明显， 所有感染鸡体l 内抗体检测均为阳性”。 1 6 3 1 2 泰乐菌素 对于动物支原体感染，较常使用的是泰乐菌素，对来源于鸡、猪、牛、兔等多种动物支 原体都有良好的抑制作用。用国产泰乐菌素预防猪喘气病，按1 3 m g k g 体重肌肉注射，每天2 次，连续7 天，结果保护率8 0 。酒石酸泰乐菌素能有效地抑制试管中鸡毒支原体的生长繁殖。 当饮水中药物浓度达i i j 2 5 0 m g l 以上时，能提高感染鸡的成活率；当饮水中药物浓度达到 5 0 0 m g l 以上时能降低气囊损伤，对提高鸡体增重也有一定的作用；当浓度达到1 0 0 0 m g l 时，则部分治疗的感染鸡体内检测不到鸡毒支原体抗体”。磷酸泰乐菌素对鸡毒支原体的抑 菌试验释1 人一l 诱发的鸡毒支原体病的治疗试验表明：当试管培养基中的药物浓度达到 00 0 1 6 u g m l 时便能抑制m g 的生跃繁殖；当饲料中的药物浓度达到i g k g 时，能完全阻止m g 引起的死亡，明显降低气囊病变程度并增加体重，但对降低血清中鸡毒支原体抗体的阳性率 作用不明显“。乙酰异戊酰泰乐菌素酒石酸盐是一种新型高效的大环内酯类抗生素，通过微 生物转化将泰乐菌素第3 位进行乙酰化和对其第4 位进行异戊酰化而获得，爱乐新可溶性粉为 乙酰异戊酰泰乐菌素酒石酸盐可溶性粉。研究表明，爱乐新比泰乐菌素有更高的抗菌和抗支 原体活力，而且对那些对其他抗生素和泰乐菌素有抗药性的支原体有效。爱乐新可溶性粉对 鸡毒支原体体外抑菌试验和体内预防与治疗试验显示：当预防组与治疗组饮水中药物浓度大 于1 2 5 u g m l 的试验各组均能明显地减少感染鸡的失重，提高感染鸡的存活率，大幅度降低气 囊的病理损伤，当治疗组饮水中药物浓度达到2 5 0u g m l 时，已完全没有气囊损伤。由于泰 乐菌素对照组的浓度为5 0 0u g m l ，为爱乐新试验组浓度的2 4 倍，而其作用效果相当于或 略低丁爱乐新组，说明爱乐新对鸡毒支原体的预防和治疗确实有比较好的效果，其作用要明 浙江大学硕士学位论文 显优于对照药物泰乐菌素酒石酸盐”2 i 。 优环霉素原粉对鸡毒支原体( 病) 进行的体内外的治疗、抑菌试验表明：当优环霉素在培 养基中有效药物浓度达n o0 6 2 5 u g m l 时，有效地抑制试管中m g 生长繁殖；当饮水中药物 浓度达u 2 5 0 u g m l b 寸，能一定程度上减少由于鸡毒支原体病引起的死亡，较明显地提高鸡体 增重，随着药物浓度的加大这种作用更加明显：当药物浓度达g u 5 0 0 u g m l 时，能较大幅度地 降低气囊损伤。然而，所有药物治疗组均不能彻底抑制体内人工感染的鸡毒支原体而使血清 学变为阴性反应 2 。 1 6 3 1 3 罗红霉素 本品的抗菌谱、对革兰氏阳性菌的作用、耐药性皆与红霉素相似，但对支原体、衣原体 的作用大大增强。本品对鸡毒支原体( b g 4 4 t 株) 的最小抑菌浓度为0 0 0 7 9 m g l ：以1 0 2 0 m g l 的浓度混饮给药治疗鸡毒支原体病，治愈率达8 1 3 一8 7 5 。罗红霉素不像红霉素那样易与 其他药物发生相互作用，对肝功能无明显影响。其消除半衰期为1 0 5 h ，临床上可减少给药 次数干剂量”。注意事项罗红霉素与红霉素存在着交叉耐药性；可与水溶性甲氧氨苄嘧 啶、盐酸麻黄碱配制成的复方制剂( 当罗红霉素与甲氧氨苄嘧啶配伍时，罗红霉素j _ j 量减少 约l o 倍，但可以得到更好的效果，提示罗红霉素与甲氧氨苄嘧啶合用有协同作用。 1 6 3 1 4 替米考星 替米考星具有同其他大环内酯类药物相似的抗菌活性，对畜禽支原体具有比泰乐菌素更 强的抗菌活性。j o